CN110628878B - 提高数字核酸扩增动态范围的ewod系统和方法 - Google Patents

Abstract

一种对介质上电润湿(EWOD)装置中的种类进行数字定量的方法，包括以下步骤：将样品体积输入EWOD装置；将稀释剂体积输入EWOD装置；进行电润湿操作以从样品体积产生第一样品液滴；对EWOD装置内的第一样品液滴进行扩增处理；测量样品液滴的开启值；将测量的样品液滴的开启值与用于数字定量的靶标开启值进行比较；根据测量的样品液滴开启值与靶标开启值的比较计算稀释因子；进行电润湿操作以从样品体积中提取第二样品液滴；进行电润湿操作，根据稀释因子用稀释剂体积稀释第二样品液滴，形成稀释的第二样品液滴；并对稀释的第二样品液滴进行数字定量，以定量样品体积中种类的初始浓度。

Description

提高数字核酸扩增动态范围的EWOD系统和方法

技术领域

本发明一般涉及有源矩阵介质上电润湿(AM-EWOD)装置和数字测定扩增技术，例如数字核酸定量、用于蛋白质生物标记定量的ELISA、用于酶转换定量的酶学测定以及用于表型分型和基因分型的基于细胞的测定。特别地，本发明涉及数字核酸扩增技术。更具体地，本发明涉及在AM-EWOD或EWOD装置上进行数字扩增测定(例如数字核酸扩增技术)的系统和方法。

背景技术

介质上电润湿(Electrowetting on dielectric,EWOD)是一种众所周知的技术，用于通过施加电场来操作液滴。有源矩阵EWOD(Active Matrix Electro-wetting-On-Dielectric,AM-EWOD)是指在包含晶体管的有源矩阵阵列中实现EWOD，例如通过使用薄膜晶体管(thin film transistor,TFT)。因此，它是用于芯片实验室技术的数字微流体技术的候选技术。对该技术的基本原理的介绍可以在“Digital microfluidics:is a truelab-on-a-chip possible？”,R.B.Fair,Microfluid Nanofluid(2007)3:245-281中找到。

图1以横截面示出了传统EWOD装置的一部分。该装置包括下基板10，其最上层由导电材料形成，该导电材料被图案化以便形成多个阵列元件电极12(例如，图1中的12A和12B)。给定阵列元件的电极可以称为元件电极12。包括极性材料(通常也是含水的和/或离子的)的液滴14被限制在下基板10和顶部基板16之间的平面中。可以通过间隔物18在两个基板之间实现的合适间隙，并且可以使用非极性周围流体20(例如油)来占据未被液滴14占据的体积。设置在下基板10上的绝缘体层22将导电元件电极12A，12B与第一疏水涂层24分开，其中液滴14以由θ表示的接触角26位于第一疏水涂层24上。疏水涂层由疏水材料(通常但不一定是含氟聚合物)形成。

在顶部基板16上是第二疏水涂层28，液滴14可以与第二疏水涂层28接触。介电电极30介于顶部基板16和第二疏水涂层28之间。

接触角θ的定义如图1所示，由固体与液体(γ_SL)、液极与非极性周围流体(γ_LG)和固体与非极性周围流体(γ_SG)界面之间的表面张力分量的平衡决定，并且在没有施加电压的情况下满足杨氏定律(Young’s law)，该方程由下式给出：

在操作中，称为EW驱动电压的电压(如图1中的V_T、V₀和V₀₀)可以从外部施加到不同的电极上(例如，分别为参比电极30、元件电极12，12A和12B)。所产生的电力有效地控制疏水涂层24的疏水性。通过将不同的EW驱动电压(例如V₀和V₀₀)设置为施加到不同的元件电极(例如12A和12B)上，液滴14可以在两个基板10和16之间的横向平面中移动。

以下描述EWOD装置的示例构造和操作。US6911132(PamμLa等人，2005年6月28日公布)公开了一种二维EWOD阵列，用于控制液滴在二维中的位置和移动。US6565727(Shenderov，2003年5月20日公布)进一步公开了用于其他液滴操作的方法，包括液滴的分离和合并，以及不同材料的液滴的混合。US7163612(Sterling等人，2007年1月16日公布)描述了通过使用非常类似于AM显示技术中采用的电路布置，如何使用基于TFT的薄膜电子器件来控制来对EWOD阵列的电压脉冲的寻址。

US7163612的方法可以称为“有源矩阵介质上电润湿”(AM-EWOD)。

使用基于TFT的薄膜电子器件来控制EWOD阵列有几个优点，即：

·电子驱动电路可以集成到下基板10上。

·基于TFT的薄膜电子器件非常适合于AM-EWOD应用。它们生产成本低廉，因此可以以相对低的成本生产相对大的基板面积。

·采用标准工艺制造的TFT可以设计为在比标准CMOS工艺制造的晶体管高得多的电压下工作。这很重要，因为许多EWOD技术需要施加超过20V的电润湿电压。

EWOD液滴操作装置是用于化学/生物化学反应自动化的非常理想的平台。这些装置可以在需要复杂液滴温度分布的液滴中进行化学/生物化学反应或系列反应。可能需要在不同温度下进行不同的反应步骤。EWOD装置的许多应用需要改变样品/试剂液滴(以及通过将它们组合在一起而产生的产物)的温度以促进所需的化学或生物化学反应。许多这些反应方案要求在系列反应中的不同时间将液滴带到多个不同的温度。许多反应方案要求液滴在时间上进行热循环，在某些情况下经历许多这样的热循环。

需要在EWOD装置中在许多反应循环中进行精确温度控制的反应方案的重要实例是通过聚合酶链式反应(PCR)的基于液滴的核酸扩增。PCR是用于核酸扩增的众所周知的反应方案。EWOD装置上的常规PCR方法包括通过进行多次连续稀释(和终点分析)直至达到最佳样品浓度来稀释样品。以下教导了这些方法的实例：US9091649(Pollack等人，2015年7月28日公布)；US2013/0288254(Pollack等人，2015年10月31日公开)；WO2015/063767(Shapiro等人，2015年5月7日公开)；WO2016170109(Kwang，2016年10月27日公开)和US9539573(Hadwen等人，2017年1月10日公布)。这些现有方法耗时，使用大量试剂，并且当根据典型用法在EWOD装置上进行时占据相当大的空间。

先前的方法证明了如何通过以下方式凭经验确定数字方案：(a)进行多次连续稀释，(b)在每次稀释中扩增100-1000个分区(partition)，以及(c)确定哪个连续稀释产生终点分析中的数字输出。然后可以由使用者将剩余的样品手动稀释至正确的浓度，并且用于分析绝对定量的更多数量的分区，例如在上文引用的WO2016170109中公开的。然而，这些现有的方法尚未针对在EWOD或AM-EWOD装置上进行而优化。

生物学测定定义为定量样品容器中生物实体的浓度或活性的测定，可以使用例如吸收光谱法、荧光光谱法或非光学方法进行读数。(ref)在数字测定中，将生物实体分配到许多小容器中，这些容器可以是乳液中的液滴或物理隔离的室。每个容器中的生物实体的数量是离散数(0，1，2，3，4......)。在数字测定期间，每个分区被单独评估并且结果为0(分区中没有生物实体)或1(分区中存在至少一个生物实体)。在分区数量大的情况下，描述特定分区包含特定数量的生物实体的离散概率分布的二项分布可以通过泊松分布和用于精确计算生物实体数量的零的数量来近似，因此得到在分配之前的原始样品浓度。没有必要对生物实体进行极限稀释，并且分区可以包含多达4或5个生物实体，尽管在较高负载下噪声较大。

不基于EWOD技术的各种数字PCR系统是可商购的，并且通常将～20-25μL的样品分成496至5,000,000个分区。数字PCR定量的最佳浓度为每个分区平均0.7到1.6个拷贝，因此，对于给定样品体积，拥有的分区越多，系统的动态范围越大，无需用户手动改变样本浓度。目前商购的数字PCR平台基于(a)油包水乳液或(b)物理分区。基于乳液的系统倾向于具有用于产生乳液的第一设备(油相中的分区)，用于进行PCR热循环的第二设备，以及用于获取分区的荧光图像并赋予其一个正值或负值第三设备。物理分区系统使用诸如通孔或印在基板上的腔室之类的技术物理地创建分区。

然而，传统的数字PCR系统具有显著的缺陷。传统系统通常要求用户凭经验找到正确的样品浓度。通常，这采取并行或串行运行多个实验的形式，其中每次运行将样品稀释10倍，直到获得数字化样品结果。如果样品太浓，则所有分区都是阳性的，并且不能获得关于样品浓度的定量信息。就时间和试剂而言，这是一种浪费的方法。传统系统也是低效的，并且可能需要多个装置来执行反应方案的不同阶段。

发明内容

本发明描述了用于提高样品浓度的动态范围的系统和方法，样品浓度可以EWOD装置上使用数字测定扩增技术，例如数字核酸扩增技术(包括数字PCR)来定量。数字PCR和其他数字扩增方法计算模板DNA起始浓度未知的样品的稀释因子，以产生用于定量的数字化结果。本发明特别适用于对用于数字PCR应用的样品进行高比例稀释。

本领域需要一种核酸扩增技术，其能够：

·准确定量小于10pg/μL的核酸样品浓度。

·使用少于1μL的总样品体积进行样品定量步骤，留下更多样品体积用于分析。

·使用数字核酸扩增技术确定绝对定量样品所需的最佳稀释因子。

还需要一种数字核酸扩增技术，其：

·仅使用一台设备。

·可以将样本定量步骤集成到更复杂的工作流程中，从而简化用户实验方案。

·通过数字核酸扩增以用于定量的正确比例自动稀释样品，无需任何用户干预。

·自动分配所述最佳稀释样品用于数字核酸扩增。

·自动定量核酸样品的绝对浓度。

还需要一种数字核酸扩增技术，其：

·可以自动识别阳性分区和阴性分区。

·对所述阳性分区和阴性分区进行分类。

·支持对所分类的阳性分区和阴性分区进行样本提取，以进行进一步的下游处理。

·通过提供不同的区域来减少或消除交叉污染的可能性，用于：(a)样品浓度的定量，(b)样品稀释，和(c)核酸扩增的样品分区。

本发明通过计算单一的最佳稀释因子，简化了高比例稀释并建立适合于数字核酸扩增分析的浓度的过程。这减少了(a)所用试剂的体积，和(b)在EWOD装置上进行稀释所需的总面积。在减少得到第一个结果的时间方面具有优点，并且可以通过提高最终结果的准确性来提供进一步的优点。关于EWOD装置上的数字核酸扩增应用，本发明能够使用少至100-2,000个液滴以数字核酸扩增形式分析宽范围的初始样品浓度。这改善了EWOD装置的动态范围，否则会由于在任何时间可以容纳在装置上的相对少量的液滴而受到限制。能够在最小占地面积内进行少量高比例稀释的需要实现了简单、低通量的数字核酸扩增系统。

因此，本发明的一个方面是增强的介质上电润湿(EWOD)装置和在EWOD装置中进行数字测定扩增技术的相关方法。在示例性实施方案中，该方法可以包括以下步骤：将包含感兴趣的分子种类(species)的样品体积输入EWOD装置；将稀释剂体积输入EWOD装置；进行电润湿操作以从样品体积中提取第一样品液滴；对EWOD装置内的第一样品液滴进行扩增；测量样品液滴的开启值(例如，高于阈值的荧光)；将测量的样品液滴的开启值与预期支持样品中分子种类的数字扩增的总体积靶标开启值进行比较；根据测量的样品液滴的开启值与靶标开启值的比较计算稀释因子；进行电润湿操作以从样品体积中提取第二样品液滴；进行电润湿操作，根据稀释因子用稀释剂体积稀释样品液滴，形成稀释的样品液滴；并进行数字扩增测定以定量样品体积中分子种类的浓度。

因此，本发明的另一方面是增强的介质上电润湿(EWOD)装置和在EWOD装置中进行数字核酸扩增技术的相关方法。在示例性实施方案中，该方法可包括以下步骤：将含有核酸样品的样品体积输入EWOD装置；将稀释剂体积输入EWOD装置；进行电润湿操作以从样品体积中提取第一样品液滴；在EWOD装置内的第一样品液滴上进行核酸扩增；测量样品液滴的开启值(例如循环阈值(Ct)或阳性检出时间(time to positive)(Tp))；将测量的样品液滴的开启值与预期支持随后的核酸样品的数字扩增的靶标开启值进行比较；根据测量的样品液滴开启值与靶标开启值的比较计算稀释因子；进行电润湿操作以从样品体积中提取第二样品液滴；进行电润湿操作，根据稀释因子用稀释剂体积稀释样品液滴，形成稀释的样品液滴；并进行数字核酸扩增以定量样品体积中核酸样品的初始浓度。

本发明的另一方面是一种存储程序代码的非瞬时性计算机可读介质，该程序代码由处理装置执行，用于控制施加到介质上电润湿(EWOD)装置的元件阵列的阵列元件上的致动电压，以对元件阵列上的液滴进行液滴操作，程序代码可由处理装置执行以进行在EWOD装置中进行数字扩增技术的方法的步骤。

根据本发明的另一方面，微流体系统包括介质上电润湿(EWOD)装置，其包括配置成接收一个或多个液滴的元件阵列，该元件阵列包括多个单独的阵列元件；以及控制系统，其配置成控制施加到元件阵列的致动电压，以进行对于液滴的操作，以进行用于进行数字核酸扩增技术的方法。多个热控制元件可以沿着EWOD装置位于不同的空间位置，并且其中控制系统包括热控制单元，该热控制单元配置成控制多个热控制元件的温度以产生沿着EWOD装置位于不同空间位置的多个热区。在示例性实施例中，控制系统控制施加到元件阵列的致动电压以形成单独的区域，包括用于制备第一样品液滴的样品制备区，在第一样品液滴上进行核酸扩增的第一扩增区，以及进行数字核酸扩增的数字扩增区。样品制备区，第一扩增区和数字扩增区在空间上对应于不同的热控制元件。

本领域普通技术人员将理解，本发明的原理不限于数字PCR测定，并且本发明的原理与生物学中的数字测定完全兼容，例如数字核酸定量、用于蛋白质生物标记定量的ELISA、用于酶转换定量的酶学测定以及用于表型分型和基因分型的基于细胞的测定。

进行数字核酸测定以定量核酸序列的浓度。含有靶DNA、聚合酶链式反应(PCR)试剂和荧光探针的样品用商业系统分区以产生1000至1000万个分区。然后将分区热循环至少30次。扩增含DNA分区中的DNA，分区变为发荧光。在无DNA的分区中没有DNA扩增，这些液滴不会发荧光。用泊松统计分析非荧光分区的比例以计算目标DNA浓度。

数字蛋白质测定可用于使用ELISA定量样品中的蛋白质，特别是血清样品中的低丰度生物标记蛋白质(ELISA是一种广泛使用的技术，用于检测可与抗体结合的任何蛋白质)或用于定量具有酶活性的酶。

基于细胞的数字测定涉及通常通过将细胞分配到含有荧光底物的分区中进行酶促扩增检测以在分区中封装离散数目的细胞并测量细胞表型和基因型的特征，例如细胞分泌物、细胞表面生物标记、细胞代谢物等。

参考以下说明书和附图，本发明的这些特征和进一步的特征将是显而易见的。在说明书和附图中，详细公开了本发明的特定实施例，其表示可以采用本发明的原理的一些方式，但是应该理解，本发明的范围不受相应的限制。相反，本发明包括落入所附权利要求的精神和术语内的所有改变、修改和等同物。关于一个实施例描述和/或示出的特征可以在一个或多个其他实施例中以相同方式或以类似方式使用，和/或与其他实施例的特征组合或代替其他实施例的特征。

附图说明

图1是描绘传统EWOD装置的横截面图。

图2是描绘根据本发明实施方案的示例性基于EWOD的微流体系统的图。

图3是以示意性透视图描绘根据本发明实施方案的示例性AM-EWOD装置的图。

图4是描绘图3的示例性AM-EWOD装置的一些阵列元件的横截面的图。

图5A是描绘当存在液滴时在元件电极处呈现的电负载的电路表示的图。

图5B是描绘当不存在液滴时在元件电极处呈现的电负载的电路表示的图。

图6是描绘根据本发明的实施方案的图3的示例性AM-EWOD装置中的薄膜电子器件的示例性布置的图。

图7是描绘根据本发明实施方案的阵列元件电路的示例性布置的图。

图8是描绘根据本发明实施方案的包括热控制元件的示例性微流体系统的图。

图9是描绘图8的微流体系统的图，其示出了EWOD通道内的液滴的示例性位置。

图10是描绘每20μL含有10⁶到10²个拷贝的一系列标准样品的扩增曲线的图。

图11是描绘图10的系列的扩增曲线的示例性标准曲线的图。

图12是描绘根据本发明实施方案的示例性数字核酸扩增系统的图。

图13A、图13B和图13C是描绘用于在EWOD装置中产生多个温度区域的热控制元件的不同示例性配置的图。

图14A、图14B、图14C、图14D、图14E、图14F、图14G、图14H和图14I是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的示例性方法的步骤的进展的图。

图15A、图15B、图15C、图15D和图15E是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案以确定合适的稀释因子的示例性方法的第一部分的步骤的进展的图。

图16A是描绘可用于确定对应于原始样品的Ct阈值Ct1的荧光强度曲线的实例的图。

图16B是描绘可用于确定来自图16A的原始样品的稀释样品的Ct阈值Ct_-稀释的荧光强度曲线的实例的图。

图17A、图17B、图17C、图17D、图17E、图17F、图17G、图17H、图17I和图17J是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的另一示例方法的步骤的进展的图示，该方法包括确定反应效率。

图18A是说明包含样品材料和被动参比染料的分区的典型实时扩增曲线的图。

图18B是描绘已经在数字PCR反应方案中扩增的许多分区的终点样品和被动染料荧光值的图。

图18C是描绘与图18B中相同的分区的相对荧光的图。

图19A、图19B、图19C、图19D、图19E、图19F、图19G和图19H是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的另一示例性方法的步骤的进展的图，该方法包括使用与核酸样品中的多个靶部分相关的多个引物。

图20是描绘用于定量样品体积中靶核酸浓度的示例性方法的流程图。

图21A、图21B、图21C、图21D、图21E、图21F和图21G是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的另一示例性方法的步骤的进展的图，该方法包括使用内部参比靶标进行更准确的测定。

具体实施方式

现在将参考附图描述本发明的实施方案，其中相同的附图标记始终用于表示相同的元件。应该理解，附图不一定按比例绘制。

图2是描绘根据本发明实施方案的基于微流体系统的示例性EWOD的图。在图2的示例中，测量系统包括读取器32和盒34。盒34可以包含微流体装置，例如EWOD或AM-EWOD装置36，以及常规的进入设备的(未示出)流体输入端口和电连接。流体输入端口可以执行将流体输入AM-EWOD装置36并在装置内产生液滴的功能，例如通过从电润湿控制的输入贮液器分配。如下面进一步详述的，微流体装置包括配置成接收输入液滴的电极阵列。

微流体系统还可以包括控制系统，该控制系统被配置为控制施加到微流体装置的电极阵列的致动电压，以对液滴进行操纵操作。例如，读取器32可以包含配置为控制电子器件38和存储装置40的控制系统，其可以存储与系统相关的任何应用软件和任何数据。控制电子器件38可以包括被配置为执行与AM-EWOD装置36的控制有关的各种控制操作的合适电路和/或处理设备，例如CPU、微控制器或微处理器。

在它们的功能中，为了实现本发明的特征，控制电子器件可以包括整个控制系统的一部分，该部分可以执行体现为存储装置40内的控制应用程序的程序代码。如何对控制系统进行编程以操作和执行与存储的控制应用程序相关的逻辑功能，对于计算机编程领域特别是电子控制装置的应用程序编程领域的普通技术人员来说是显而易见的。因此，为了简洁起见，省略了关于特定编程代码的细节。存储装置40可以被配置为非瞬时性计算机可读介质，如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)或任何其他合适的媒介。而且，虽然代码可以由控制电子器件38根据示例性实施例执行，但是这种控制系统功能也可以通过专用硬件、固件、软件或其组合来执行，而不脱离本发明的范围。

控制系统可以配置为执行以下一些或全部功能：

·定义适当的定时信号以操纵AM-EWOD装置36上的液滴。

·解释表示由与AM-EWOD装置36相关联的传感器或传感器电路测量的传感器信息的输入数据，包括计算AM-EWOD装置36上的液滴的位置、大小、质心和周长。

·使用计算的传感器数据来定义适当的定时信号，以操纵AM-EWOD装置36上的液滴，即以反馈模式起作用。

·提供图形用户界面(GUI)的实现，其中用户可以编程诸如液滴操作(例如移动液滴)、测定操作(例如执行测定)的命令，并且GUI可以将这些操作的结果报告给用户。

·根据本发明的实施例，并且如下面进一步详细描述的，控制系统可以包括被配置为控制EWOD信道内的EWOD装置的温度的热控制单元，以适合于给定的反应方案。

在图2的示例中，可以提供外部传感器模块35用于感测液滴特性。例如，可以采用本领域已知的光学传感器作为用于感测液滴特性的外部传感器。合适的光学传感器包括相机设备、光传感器、电荷耦合器件(CCD)和图像类似图像传感器等。或者，传感器可以配置为内部传感器电路，作为每个阵列元件中的驱动电路的一部分。这种传感器电路可以通过检测阵列元件处的电特性(例如阻抗或电容)来感测液滴特性。

控制系统，例如通过控制电子器件38，可以提供和控制施加到微流体装置36的电极阵列的致动电压，例如所需的电压和定时信号，以执行液滴操纵操作并感测AM-EWOD装置36上的液滴。控制电子器件还可以执行应用软件以生成和输出用于液滴感测和执行感测操作的控制电压。读取器32和盒34在使用时可以电连接在一起，例如通过连接线42的电缆，尽管可以使用提供电通信的如本领域普通技术人员所知的各种其他方法(例如无线连接)。

图3是以示意性透视图示出根据本发明实施方案的示例性AM-EWOD装置36的附加细节的图。AM-EWOD装置36具有下基板44，薄膜电子器件46设置在下基板44上。薄膜电子器件46布置成驱动阵列元件电极48。多个阵列元件电极48布置在电极或元件阵列50中，具有X×Y阵列元件，其中X和Y可以是任何整数。可以包括任何极性液体并且通常可以是含水的液滴52被包围在由间隔物56隔开的下基板44和顶基板54之间，但是应当理解，可以存在多个液滴52。

图4是描绘图3的示例性AM-EWOD 36设备的一些阵列元件的横截面的图。在图4中描绘的AM-EWOD装置的部分中，该设备包括以横截面示出的一对阵列元件电极48A和48B，其可用于图3的AM-EWOD装置36的电极或元件阵列50中。该装置配置类似于图1中所示的传统配置，AM-EWOD装置36进一步包括设置在下基板44上的薄膜电子器件46，下基板44通过间隔件56与顶基板54分离。下基板44的最上层(可以认为是薄膜电子器件层46的一部分)被图案化，以便实现多个阵列元件电极48(例如，阵列元件电极的具体例子是图4中的48A和48B)。术语元件电极48在下文中可以指与特定阵列元件相关联的物理电极结构48，并且还指直接连接到该物理结构的电路的节点。参比电极58在图4中示出为设置在顶基板54上，但参比电极可替代地设置在下基板44上以实现面内参比电极几何形状。术语参比电极58在下文中也可以指物理电极结构以及直接连接到该物理结构的电路的节点中的两个或任一个。

同样类似于图1的传统结构，在AM-EWOD装置36中，可以使用非极性流体60(例如油)来占据未被液滴52占据的体积。绝缘体层62可以设置在下基板44上，将导电元件电极48A和48B与第一疏水涂层64隔开，其中，液滴52以θ表示的接触角66位于第一疏水涂层64上。疏水涂层由疏水材料(通常但不一定是含氟聚合物)形成。在顶基板54上是第二疏水涂层68，液滴52可以与之接触。参比电极58介于顶基板54和第二疏水涂层68之间。

图5A示出了在存在液滴52的情况下元件电极48和参比电极58之间的电负载70A的电路表示。液滴52通常可以被模型化为并联的电阻器和电容器。通常，液滴的电阻将相对较低(例如，如果液滴包含离子)并且液滴的电容将相对较高(例如，因为极性液体的相对介电常数相对较高，例如，如果液滴是含水的，则为～80)。在许多情况下，液滴电阻相对较小，使得在用于电润湿的感兴趣的频率下，液滴52可以有效地用作电短路。疏水涂层64和68具有可以被模型化为电容器的电特性，并且绝缘体62也可以被模型化为电容器。元件电极48和参比电极58之间的总阻抗可以通过电容器近似，电容器的值通常由绝缘体62和疏水涂层64和68的贡献所支配，并且对于典型的层厚度和材料，数值可以在皮法(pico-Farad)数量级。

图5B示出了在不存在液滴的情况下元件电极48和参比电极58之间的电负载70B的电路表示。在这种情况下，液滴成分由代表非极性流体60的电容的电容器代替，该电容器占据顶基板和下基板之间的空间。在这种情况下，元件电极48和参比电极58之间的总阻抗可以由电容器近似，该电容器的值由非极性流体的电容支配，并且通常很小，为飞法(femto-Farad)数量级。

出于驱动和感测阵列元件的目的，电负载70A/70B整体上起到电容器的作用，其值取决于在给定元件电极48处是否存在液滴52。在存在液滴的情况下，电容相对较高(通常为皮法)，而如果不存在液滴，则电容较低(通常为飞法)。如果液滴部分地覆盖给定电极48，那么电容可以近似表示液滴52对元件电极48的覆盖程度。

图6是描绘根据本发明实施方案的图3中示例性AM-EWOD装置36中的薄膜电子器件46的示例性布置的图。薄膜电子器件46位于下基板44上。元件阵列50的每个阵列元件51包含用于控制相应元件电极48的电极电位的阵列元件电路72。集成行驱动器74和列驱动器76电路在薄膜电子器件46中还实现了将控制信号提供到阵列元件电路72。阵列元件电路72还可以包含用于检测阵列元件位置中存在或不存在液滴的感测能力。集成传感器行寻址78和列检测电路80还可以在薄膜电子器件中实现每个阵列元件中的传感器电路的寻址和读出。

还可以提供串行接口82以处理串行输入数据流并便于将所需电压编程到阵列50中的元件电极48。电压供应接口84提供相应的电源电压、顶基板驱动电压和如本文进一步描述的其他必要的电压输入。即使对于大阵列尺寸，也可以相对地减少下基板44与外部控制电子器件之间的多个连接线86、电源和任何其他部件。可选地，串行数据输入可以部分并行化。例如，如果使用两个数据输入线，对列驱动器电路76进行微小修改，则第一个可以为1至X/2列提供数据，第二个为(1+X/2)至M列提供数据。这样将数据编程到阵列的速率增加，这是液晶显示器驱动电路中使用的标准技术。

通常，包括薄膜电子器件46的示例性AM-EWOD器件36可以如下配置。AM-EWOD装置36包括上述参比电极58(其可选地，可以是平面内参比电极)和元件阵列50上的多个单独阵列元件51，每个阵列元件51包括阵列元件电极48和阵列元件电路72。相关地，AM-EWOD装置36可以被配置为执行用于驱动阵列元件以通过控制施加到多个阵列元件上的电润湿电压来操纵阵列上的液滴的方法。施加的电压可以通过如图2所述的控制系统的操作来提供，该控制系统包括控制电子器件38和存储在存储装置40上的应用和数据。每个阵列元件51处的电润湿电压由阵列元件电极48和参比电极58之间的电势差限定。控制给定阵列元件处的电润湿电压的方法通常包括通过控制系统的操作向阵列元件电极48提供电压和向参比电极58提供电压的步骤。

图7是描绘根据本发明实施方案的存在于每个阵列元件51中的阵列元件电路72的示例性布置的图。阵列元件电路72可以包含具有输入启动(ENABLE)、数据(DATA)和致动(ACTUATE)的致动电路88，以及连接到元件电极48的输出。阵列元件电路72还可以包含液滴感测电路90，其可以与元件电极48电连接。通常，液滴感测电路90的读出可以由一个或多个寻址线(例如RW)控制，这些寻址线对于阵列的同一行中的元件可以是共用的，并且还可以有一个或多个输出，例如OUT，其对于阵列的同一列中的所有元件可能是共用的。

阵列元件电路72通常可以执行以下功能：

(i)通过向阵列元件电极提供电压来选择性地致动元件电极48。因此，存在于阵列元件51处的任何液滴可以通过电润湿效应致动或解除致动。

(ii)在阵列元件51的位置处感测液滴的存在或不存在。感测手段可以是电容、光学、热或一些其他手段。使用阻抗传感器电路作为阵列元件电路的一部分，可以方便有效地采用电容感测。

包括阻抗传感器电路的阵列元件电路72的示例性配置在本领域中是已知的，并且例如在背景技术部分中引用的US8653832和共同受让的英国申请GB1500261.1中详细描述，这两个申请通过引用合并于此。这些专利文献包括如何致动液滴(通过电润湿)以及如何通过电容或阻抗传感装置感测液滴的描述。通常，电容和阻抗感测可以是类似的，并且可以在阵列中的每个元件处同时或几乎同时执行。通过处理来自这种传感器的返回信息(例如，在读取器32的存储装置40中的应用软件中)，上述控制系统可以实时地或几乎实时地确定存在于元件阵列50中的每个液滴的位置、大小、质心和周长。如结合图2所述，传感器电路的替代方案是提供外部传感器(例如，传感器35)，例如可以用于感知液滴属性的光学传感器。

常用的PCR方法包括在不同温度下进行部分反应方案。因此，本发明使用EWOD装置中温度的增强控制来优化发生液滴操纵和反应的EWOD通道中的温度。申请人于2017年5月30日提交的申请序号15/607,940中提供了包含增强的温度控制的示例性EWOD装置的完整描述，其内容通过引用结合于此。出于说明目的，本文提供了这种描述的一部分。应当理解，以下是示例，并且可以采用EWOD装置内的任何合适的温度控制。

图8是描绘根据本发明实施方案的示例性微流体系统100的图，其包括控制系统102和定义EWOD通道106的EWOD装置104(尤其可以是AM-EWOD装置)。图9是描绘图8的微流体系统100的图，其示出了EWOD通道106内的液滴108的示例性位置。非极性流体110(例如油)可用于占据未被液滴108占据的体积。EWOD装置可以包括由间隔物116分开的第一(顶)基板组件112和第二(底)基板组件114，其限定EWOD通道106。为了简化相关特征的说明，省略了EWOD装置组件的各个层。因此，第一和第二基板组件可以包括结合的基板、绝缘层、电极层和形成EWOD装置的相关结构，例如关于图3-7描述的各种部件。图8和9还示出了用于将流体输入EWOD通道的代表性流体输入结构118。输入结构的各种配置在本领域中是已知的，因此可以采用任何合适的输入结构。

如上所述，微流体系统100还包括控制系统102。控制系统102可以被配置为与结合图2描述的控制系统相当，包括可以执行程序代码的控制电子器件，该程序代码体现为包含在非瞬时性计算机可读介质或存储装置中的控制应用程序。控制系统102可以包括EWOD控制单元122，其具有控制电子器件和CPU处理设备，用于通过控制施加到EWOD装置的阵列元件的致动电压来控制EWOD装置上的液滴的移动。控制系统102还包括热区控制单元124和多个热控制元件。在所描绘的示例中，示出了沿着EWOD装置定位在不同的空间位置的两个热控制元件126和128。应当理解，可以在给定装置中采用任何合适数量的多个热控制元件，可适用于特定的微流体操作。类似于EWOD控制单元122，热区控制单元124包含控制电子器件和CPU或处理设备，用于控制热控制元件的温度以在EWOD装置内产生不同的温度控制区。热区控制单元的控制电子器件同样可以类似地执行程序代码，该程序代码体现为包含在热区控制单元内的非瞬时性计算机可读介质或存储装置内的热控制应用程序。

根据需要并且由热区控制单元124根据任何所需的反应方案确定，热控制元件126和128能够主动加热、冷却或加热和冷却EWOD装置。加热和/或冷却可以通过任何已知的机制实现。例如，加热可以通过焦耳加热或电阻加热，并且冷却可以通过珀耳帖效应进行，如本领域中已知的用于加热和冷却的那样。EWOD装置内的EWOD通道106的区域在本文中称为热区，其温度由其中一个热控制元件控制。例如，在图8和9中，第一热控制元件126可操作以控制EWOD通道内的第一热区127的温度，第二热控制元件128可操作以控制EWOD通道内的第二热区129的温度。因此，基于热控制元件的相应位置，第一和第二热区127和129位于沿着EWOD装置的不同空间位置。同样，可以采用任何合适数量的多个热控制元件，其控制位于沿着EWOD装置的不同空间位置的相应数量的热区中的温度。

液滴呈现液滴所在的任何热区的温度。由于液滴的微小尺寸，在液滴和热区之间发生快速温度均衡。在图9的示例中，液滴108位于第一热区127中，因此呈现由第一热控制元件126控制的第一热区127的温度。通过施加适当的致动电压，液滴108可以移动到第二热区129，并且因此呈现由第二热控制元件128控制的第二热区129的温度。

EWOD控制单元122将致动电压施加到EWOD装置的阵列元件，以将液滴从一个热区移动到另一个热区。热区控制单元124和EWOD控制单元122被组织成一起工作以配置动态控制的热区，所述热区可以根据EWOD装置的通道内的液滴的位置改变通道中的温度。可以利用液滴位置传感器(例如，使用图3的外部传感器35或基于感测液滴阻抗的图7的液滴感测电路90)读出EWOD通道中液滴的位置，其可以被集成到EWOD液滴操纵装置中。通过结合EWOD装置的通道中温度的空间和时间控制，优化执行给定的生化/化学反应或反应序列所需的温度曲线，并进而优化热区的数量和尺寸。包含液滴位置传感器(一个或多个)进一步增强了系统，因为液滴位置的反馈控制可用于确定执行热区温度变化的时间。

热控制元件126和128可以布置成与EWOD装置的一个基板层热接触，例如布置在外表面上或布置在内部作为EWOD装置的基板层的一部分。在图8和9的示例中，热控制元件都位于第二(底)基板114的外表面上，但是可以采用定位热控制元件的各种其他配置，如申请序号15/607,940所教导的那样。

EWOD装置的各个部分的热控制可以与EWOD装置的不同部分的液滴操纵控制相结合，以进行本发明的方法。在示例性实施方案中，根据指定的或预设的负载循环(dutycycle)和/或基于实际的实时感测的液滴特性，控制系统以预定的时间、速率和持续时间，以适当的顺序将适当的致动电压施加到相关的阵列元件。以这种方式，通过使用应用于EWOD元件阵列的不同部分的间歇致动模式，可以在EWOD装置阵列的不同部分处进行不同的液滴操纵操作。例如，在申请人于2017年3月31日提交的申请序号15/475,410的申请中描述了将间歇致动模式应用于EWOD装置阵列的不同部分的细节，其内容也通过引用并入本文。

结合本EWOD系统、装置和方法，采用以下定义：

样品液滴：含有已知或未知浓度的感兴趣的分子种类的液滴体积；在某些情况下，样品液滴可能不含任何感兴趣的分子种类。感兴趣的分子种类可以在溶液中游离，附着在珠子上或附着在样品液滴所在的表面上。在数字测定中，一些样品液滴包含感兴趣的分子种类，从而形成阳性液滴，而其他样品液滴不包含感兴趣的分子种类，从而形成阴性液滴。

流体操作：通过电润湿力对液滴或多个液滴进行的操作，例如，移动、分裂、分配、混合、浓缩和/或加热。

提取：从源体积中提取或提取液体的一部分或液滴。

本发明的方面涉及进行数字核酸扩增技术的方法，包括例如数字聚合酶链式反应(PCR)方案。作为PCR的说明，ThermoFisher Scientific’s Real-time PCR Handbook(https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTec h/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019861-Update-qPCR-Handbook-bra nding-Americas-FLR.pdf.)描述了与PCR反应方案相关的常用术语。

对于实时PCR，也称为qPCR，建议每个实时PCR反应使用10-1,000个拷贝的模板核酸。这相当于～100pg-3.3ng基因组DNA，或由1pg-100ng总RNA产生的cDNA。传统上使用260/280nm的UV吸光度测量来估计DNA样品的浓度。该测量比在本领域中是公知的。对于DNA，通常认为～260/280的比例为～1.8时是“纯的”，对于RNA，通常认为比例为～2.0时是“纯的”。报道的使用微量体积UV分光光度计定量的下限为2ng/μL，含有10ng/μL DNA的样品仅读取到实际浓度的5％以内。

基于荧光的测量比吸收测量更敏感，并且已知Qubit荧光计将浓度低至10pg/μL的样品中的DNA定量至实际浓度的12％以内，含有10ng/μL DNA的样品被准确读取到实际浓度的1％以内。这在Invitrogens’Technical Note中关于“Comparison of fluorescence-based quantitation with UV absorbance measurements–Qubit fluorometricquantitation vs,spectrophotometer measurements”(2014)中进行了描述。假设150bp的dsDNA分子，10pg/μL DNA样品浓度相当于约6.2×10⁷个拷贝/μL。对于每个典型的qPCR反应，DNA起始浓度为1-1×10⁶个拷贝/μL，优选为10-1×10⁵个拷贝/20μL，用于生成标准曲线的qPCR标准样品覆盖5-5×10⁴个拷贝/μL的范围。

Qubit和标准UV吸光度测量都不能定量在1-1×10⁶个拷贝/μL的范围内的DNA浓度。相反，在使用这些方法进行浓度估计之前，必须将DNA扩增至可检测水平。此外，在Qubit上定量样品浓度所需的样品体积在1-20μL之间，UV分光光度法有时甚至需要更大的体积。这显著大于使用EWOD平台时用于浓度定量的体积，例如，1-500nL，从而留下更多样品用于分析。

以下列出了与实时PCR或qPCR结合使用的定义。这些定义取自上面引用的ThermoFisher。

基线：qPCR反应的基线是指荧光强度几乎没有变化时的早期PCR循环(通常在第3-15个循环之间)中的低水平信号或噪音。

阈值：基线设置在此“背景”之上但不高到包括相对于基线信号的统计学显著增加。实时PCR系统通常自动将阈值设置为基线荧光标准偏差的10倍。然而，阈值的值可以设置为PCR的指数期中的任何点。

阈值循环(Ct)：阈值循环Ct是荧光强度超过阈值的PCR循环数。Ct值用于计算样品中核酸的初始浓度，因为Ct值与起始浓度成反比。假设反应100％有效，10倍稀释系列将具有相隔约3.32个循环的Ct值。

标准曲线：可以使用已知初始模板核酸浓度的稀释系列来建立标准曲线，然后使得能够计算具有未知核酸浓度的样品的浓度。标准曲线通常绘制y轴上的Ct值和x轴上DNA或RNA的起始量。斜率、y截距和相关系数值提供关于PCR反应性能的信息。

效率：100％的PCR效率对应于标准曲线中-3.32的斜率，由下面的方程1a和1b控制。扩增效率为2或100％意味着模板核酸在每个热循环后加倍。

效率＝10(-1/斜率) (方程1a)

Y-截距：标准曲线中的y-截距对应于反应检测的理论极限。虽然理论上可以使用qPCR检测靶标的单个拷贝，但是更经常将2-10范围内的拷贝数指定为可以可靠定量的最低水平。

以下定义与等温核酸扩增技术结合使用：

阳性检出时间(Tp)：荧光强度超过阈值的时间。通常，阈值设定为基线荧光标准偏差的10倍，但可以设定为扩增期的任何点。

更一般地，“开启”是指荧光超过阈值的点，通常是基线荧光标准偏差的～10倍，并且可以表示阈值循环(Ct)或阳性检出时间(Tp)，这取决于正在进行的扩增测定的类型。Ct和Tp值对应于每体积分子的浓度，因此“开启”也可以定义为每体积分子的拷贝数，例如，拷贝数/20μL、拷贝数/μL和/或拷贝数/分区。

使用每20μL 10⁶到10²个拷贝的一系列标准样品的一组典型的扩增曲线如图10所示，示例标准曲线如图11所示。标准曲线通常具有以下格式：

y＝-mx+c (方程2)

其中m是线的梯度，c是y轴截距，x是样品浓度的对数，y是Ct值。

为了从PCR(qPCR)获得定量或半定量数据，必须与样品同时运行一组校准标准品。在每个实验中没有足够的标准样品组，只能得到样本浓度的近似值。这部分地是由于PCR试剂的批次间变化。

为了获得最佳PCR，反应混合物通常必须循环通过三个离散温度35至45次。示例性反应方案可以包括以下过程步骤，例如在95℃下使双链DNA变性；在55-60℃使引物与ssDNA退火；和在70-75℃获得新DNA链的最佳延伸。在一些实施例中，可以使PCR反应混合物通常循环35至45次，其中，在95℃使双链DNA变性，并且在55-60℃进行退火和延伸步骤。

引物是长约18-22个碱基对的DNA短链。它们用作DNA复制的起始点，并且它们在用于扩增的模板DNA链上定义感兴趣的区域或靶标。可以使用不同的引物来扩增DNA样品内的不同靶标或感兴趣的区域。在传统的qPCR 96孔板实验中，将DNA样品移液到96个孔中的每个孔中，并将不同的靶标引物移液到每个孔中，以便可以针对多达96个不同靶标筛选单个DNA样品。

PCR准备好的液滴或PCR样品液滴通常包含待扩增DNA样品所需的所有试剂。反应可包括主混合物(mastermix)、引物、探针和待扩增的DNA样品。对照液滴或不含任何DNA样品的对照液滴通常含有扩增核酸所需的所有试剂但不含任何样品。对照液滴可包括主混合物、引物和探针。

除了DNA开始之外，也可以从RNA开始并进行逆转录以产生互补DNA，然后可以扩增。逆转录PCR可以作为单步或两步过程进行。

与包括在不同温度下的反应步骤的反应方案相反，可以替代地进行用于核酸扩增的等温反应方案。存在等温扩增技术，其在固定温度下进行DNA扩增而不是如在传统PCR中使用的那样在95℃和60℃之间多次热循环样品。常见的等温技术包括重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)和切口酶扩增反应(NEAR)。

本发明的系统和方法可以与本领域已知的任何合适的读出格式结合。读出机制可包括嵌入染料、水解探针和杂交探针。仪器可以设计成与单个光波长兼容，或者包括多路复用能力，其中可以激发、检测和监测两个或更多个不同波长。嵌入染料包括但不限于SYBRGreen I、LC Green、LC Green Plus、Resolight、EvaGreen、Chromofy和SYTO 9。用于水解探针的常见荧光团包括但不限于FAM、JOE、VIC、HEX、TAMRA、Cy3.5、Cy5和ROX。用于杂交探针的共同供体/受体对包括但不限于荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/Dabcyl、荧光素/QSY7和荧光素/QSY9染料。

数字PCR通过将样本分成多个分区来绝对定量样本，并使用离散泊松统计来计算基于扩增分区(称为阳性分区)与不扩增分区(称为阴性分区)数量的浓度。

在数字测定的背景下，泊松分布给出了概率p，即基于每个分区的平均浓度v.λ，给定分区中存在k个靶标分子，其中v是分区体积(μL)，λ是体积浓度(分子/μL)。

在数字PCR中，任何具有k>0分子的分区被鉴定为阳性。如果k＝0，那么方程3简化为方程4，给出了给定分区不包含任何靶标分子且分区为阴性的概率p。

p＝e^-(v.λ) (方程4)

在每个分区具有相同体积的系统中，分区总数n中的阴性分区数b可以用作对p的估计，因此可以从已知浓度估计预期结果(方程5)，或观察到的结果可用于计算预期浓度(方程6)。

b＝n.e^-(v.λ) (方程5)

结合本EWOD系统、装置和方法，使用以下定义：

数字定量：从多个分区中识别哪些分区对于感兴趣的分子种类是阳性的，哪些是阴性的。可以计算阳性分区和/或阴性分区的数量。基于阳性分区的数量和阴性分区的数量，使用离散泊松统计，数字定量可用于计算样本的浓度。

图12是描绘根据本发明实施方案的示例性数字测定扩增系统150的图。为了进行荧光测量，系统150可以包括用于发射如上所述的测量光的光源152，以及用于检测接收到的来自反应液滴的光以用于执行本领域已知的荧光测量的成像器153。可以通过成像控制器154来控制和分析光源和成像器的操作。

光源、成像器和成像控制器可以与微流体系统组合以进行数字核酸扩增，例如数字PCR。根据上述图2-9所描述的系统，微流体系统可以被配置为基于EWOD或AM-EWOD的系统。对于如图12所示的一般参考，微流体系统可以包括EWOD控制器156，其可以与上述控制系统相当地配置，其控制结合到EWOD装置157中的电润湿元件阵列的致动。作为结合到这种控制器中的控制应用程序的一部分，可以提供用于进行扩增操作的计算机和算法158，并将其存储在非瞬时性计算机可读介质或存储装置中。计算机和算法158还可以存储靶标开启值、参考或靶标开启值、标准曲线数据和/或校准曲线数据。可以根据需要访问、存储和/或输入这些值。系统可以访问这些开启值，以根据需要帮助计算稀释因子。微流体系统还包括温度控制器160和多个热控制元件(T-元件)。在所描绘的实施例中，示出了两个热控制元件162和164，但是应当理解，可以在给定的装置中采用任何合适数量的多个热控制元件，以适合于特定的微流体操作。温度控制器160包含控制电子器件和CPU或处理装置，用于控制热控制元件的温度以在EWOD装置内产生不同的温度控制区域，如申请序号15/607,940中所述。另外，尽管成像控制器154、EWOD控制器156、计算机和算法158以及温度控制器160在图12中被示为单独的元件，但是应当理解，可以将多个控制组件组合成单个控制系统组件。

图13A-13C是描绘用于在EWOD装置中产生多个温度区域的热控制元件的不同示例性配置的图。在这些实施例中，包含致动元件的EWOD阵列的EWOD盒166以块形式表示，如虚线所示。实线描绘了多个热控制元件的定位，由此每个热控制元件可用于在一部分EWOD阵列中产生相应的温度区域。在图13A的实施例中，存在三个热控制元件168，其对应于盒166的EWOD阵列中的三个温度区域；在图13B的实施例中，存在六个热控制元件170，其对应于EWOD阵列中的六个温度区域；在图13C的实施例中，存在十二个热控制元件172，其对应于EWOD阵列中的十二个温度区域。热控制元件的数量和所得到的热控制区域代表温度控制的精度与装置的复杂性之间的权衡，并且可以采用任何合适数量的热控制元件。

下面描述的数字PCR的示例性方法采用图13C的12元件配置作为说明。

在下面描述的用于数字核酸扩增的示例性反应方案(包括数字PCR)中，以下是与EWOD装置配置和操作相关联的一组示例性参数。应当理解，以下是说明性的，并且可以根据特定情况进行调整。典型的EWOD装置可以具有316×130个TFT像素，其中每个TFT像素为210μm×210μm并且单元间隙为130μm。这相当于41,080个像素，因此这种EWOD装置可以容纳最大体积～235μL的液滴。例如，可用的液滴尺寸可以是1×1、2×1、2×2或3×3像素或相当的，并且可以在2到3个像素的液滴之间分配间隙。根据这些液滴排列和EWOD阵列的大小，可以计算与数字扩增方案相关的液滴数量和每个分区的体积。另外，主要描述了关于采用PCR和数字PCR扩增技术的本发明的实施方案，但本发明不限于这些技术，并且可以与多种核酸扩增技术一起使用。其他合适的扩增技术包括等温扩增技术。

图14A-14I是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的示例性方法的步骤的进展的图。出于说明的目的，图14A以简化的方式示出了EWOD盒180的初始准备。应当理解，EWOD盒180具有与上述EWOD装置的实施例相当的结构。

通常，如下面进一步详述的，在完整的数字PCR反应方案中，反应方案的第一部分是确定第一样品液滴的合适稀释因子，如图14B-14F所示。然后，反应方案的第二部分利用计算的稀释因子稀释第二样品液滴，并通过分配稀释的样品液滴进行数字PCR，如图14G-14I所示。另外，尽管下面主要结合PCR扩增处理描述数字扩增处理，但是应当理解，可以采用类似的原理来使用除PCR之外的替代扩增处理进行数字扩增和分析，包括例如等温扩增处理。

在图14A-14I的实施例中，图14A是描绘包括EWOD阵列的EWOD盒180的图，其中已经输入了样品体积182和四个稀释剂体积184。示例性样品体积182包括具有进行扩增处理的靶标部分的核酸样品(例如，DNA)、引物、探针和主混合物。稀释剂体积184可以用于稀释样品体积，如下文进一步描述的，并且包括与样品体积182中的浓度相同但缺少核酸样品的引物、探针和主混合物。图14B是描绘如何操作EWOD盒180以产生用于数字PCR反应方案的不同阶段的不同致动区域的图。不同的致动区域可以包括样品制备区186、第一核酸扩增区188和废物区190。EWOD盒180还可以被操作以产生数字扩增区192，其中例如可以进行数字PCR。可以通过在数字PCR反应方案的不同阶段期间致动不同组的EWOD元件来产生不同区域，并且在下面描述在每个区域中执行的操作，如同描述了数字PCR反应方案中的不同步骤。

在如图14B所示的反应方案的第一步中，EWOD盒180的电润湿操作用于从样品体积182中将第一样品液滴194提取到样品制备区186中。在该特定实施例中，产生来自样品体积182的第一样品液滴194相当于整个样品制备操作(可以如下面的实施例中所示进行另外的制备操作)。由于在该阶段不需要进一步的样品制备，在反应方案的第二步中，样品液滴194移动到第一扩增区188中，如图14C所示。

图14D是描绘示例性EWOD盒180的图，其中EWOD阵列覆盖在多个热控制元件196上。该实施例采用上面图13C所描述的12元件配置。如果第一排热控制元件表示元件1-6，第二排热控制元件表示元件7-12，则第一扩增区188定位成对应于三号热控制元件，在图14D中标识为元件196-3。在数字PCR的第三步骤中，可以对第一扩增区188内的第一样品液滴194进行扩增处理。因为样品液滴194位于热控制元件196-3上方，所以这种热控制元件可以独立地控制以使样品液滴194在95℃和60℃之间循环以进行PCR扩增处理。每次将热控制元件196-3(并因此将样品液滴194)冷却至60℃时，拍摄荧光图像并继续热循环过程，直到荧光值大于预定阈值，这允许确定阈值循环Ct。循环次数可以变化，并且不需要PCR中常见的完整35-45个循环，并且一旦可以计算Ct值就可以停止热循环。剩余的热区，即对应于196-3以外的热控制元件的热区，可以保持在给定热区内任何试剂的最佳温度，或者可以保持在室温。

图14E是描绘荧光强度曲线的实施例的图，其示出了与该实施例相关的代表性计算。如本领域普通技术人员所知，荧光强度曲线构成荧光强度与样品循环数的函数关系，并用于确定开启值，在此处可通过荧光测量检测到样品液滴中的DNA。靶标开启值Ct_靶标是总体积开启值，其被确定以在分配总体积时支持后续数字PCR定量。靶标开启值Ct_靶标和单个拷贝的阈值荧光Ct_单个可以是先前实验产生的保存值，和/或可以从正在进行的实验中得出。还绘制了样品液滴的荧光强度曲线，由此确定样品液滴的Ct值。一旦通过样品液滴的荧光强度曲线确定了Ct值，就可以通过将Ct值输入保存在系统的计算机上的反应的参考标准曲线方程(例如与图11相当的)来估计样品液滴的浓度。使用方程7，稀释因子可以通过比较样品浓度与靶标样品浓度来计算，当样品被分配时该靶标样品浓度将支持后续数字PCR定量。

稀释因子＝效率^(Ct_靶标–Ct) (方程7)

对于100％有效的反应，方程7中的“效率”是2。

Ct值对应于浓度，例如拷贝数/20μL。使用(a)系统用于数字定量所用的分区数量，(b)每个分区的体积和(c)用于数字PCR定量的最佳浓度范围相当于每个分区约0.7-1.6个拷贝的知识来计算靶标开启值Ct_靶标。一旦进入数字体系，包含单个DNA拷贝的每个分区的开启值是Ct_单个。

例如，假设样品的体积浓度为每20μL 1000个拷贝，具有开启值Ct。该系统设计用于使用100个分区进行数字定量分析，每个分区的体积为0.2μL。将数字定量的最佳浓度范围设为每个分区约0.7-1.6个拷贝，可以计算出总体积需要每20μL具有(0.7*100＝)70和(1.6*100＝)160个拷贝。将靶标浓度设定为每个分区1个拷贝，靶标总体积浓度相当于每20μL(1*100＝)100个拷贝。因此，原始样品必须稀释10倍，以便将浓度从每20μL 1000个拷贝降低到每20μL 100个拷贝。稀释的样品将具有Ct_靶标的开启值。然后将稀释的样品分成100个分区。泊松统计可用于计算100个分区中的63个为阳性，而在包含单个DNA分子的那些分区中，开启值将为Ct_单个。

应理解，本发明的微流体系统是完全自动化的。因此，电润湿操作和必要的计算都由控制系统和计算机执行，而无需用户干预。

如图14F所示，然后将使用PCR扩增的第一样品液滴194移动到废物区190中，从中可以从EWOD盒180中除去样品液滴194。然后第三热控制元件196-3的温度可以恢复到与其他热控制元件相同的温度，优选在15-25℃之间的温度。

因此，图14B-14F示出了数字PCR反应方案的第一部分，系统由此自动确定适当的稀释因子。图14G-14I示出了反应方案的第二部分，由此该稀释因子随后被系统使用，再次自动地进行数字核酸扩增，例如数字PCR。

图14G是描绘使用EWOD盒180的数字PCR的样品制备步骤的图。具体地，EWOD盒180的电润湿操作用于从样品体积182中将第二样品液滴198提取到样品制备区186中，同时从一个或多个稀释剂体积184产生的稀释剂液滴200。产生的稀释剂液滴200的体积足以通过使用方程7计算的稀释因子稀释第二样品液滴198。如图14H所示，使用必要的液滴操作的组合，例如用于例如移动、脉冲、捏合(kneading)、分裂和重新合并的液滴操纵技术，使用电润湿力将第二样品液滴198和稀释剂液滴200混合到样品制备区186内的稀释样品液滴202中。

如图14I所示，一旦稀释样品液滴202已经完全混合，稀释样品液滴202可以通过电润湿力分成多个分区204，其能够通过数字核酸扩增(例如数字PCR)定量稀释样品液滴202。数字核酸扩增的最佳浓度通常为每个分区约0.7-1.6个拷贝。将样品分成多个分区204，并将分区移入数字扩增区192。数字扩增区192优选地排除第一扩增区188，以便可以避免任何可能的污染问题。在优选的实施方案中，将所有的稀释样品液滴202分成用于定量的分区204。然后可以设定热控制元件196的热控制元件4-12以使所有分区在95℃和60℃之间热循环。在示例性实施例中，热控制元件196的热控制元件1-3保持在室温，或15-25℃之间的指定温度，或者以与其他热控制元件相同的方式在95℃至60℃之间热循环。在典型的PCR约35-45个循环后，可以将阳性和阴性分区的数量计数为数字PCR分析的一部分。然后，上述方程3-6提出的泊松统计可用于定量(a)稀释样品液滴浓度，并因此(b)原始样品液滴浓度。

在完成数字PCR反应方案和分析之后，可以丢弃或提取分区液滴204用于进一步反应。在一个示例性实施例中，EWOD盒180是一次性的，并且整个盒可以与分区液滴一起丢弃并且由替换EWOD盒180替换。

图15A-15E是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的示例性方法的第一部分的步骤的进展的图，所述第一部分构成确定适当稀释因子的变化。图15A-15E与图14B-14F具有相似性，其中描述了用于计算适当稀释因子的步骤的进展。因此，这些图中的相同部件用相同的附图标记表示。原则上，图15A-15E的实施例的不同之处在于：存在另外的制备步骤，即稀释用于计算稀释因子的第一样品液滴。例如，如果样品体积有限，或者样品体积特别珍贵，或者怀疑样品体积高度浓缩，则可在初始确定Ct值之前进行稀释步骤以减少用于稀释因子测定步骤的样品量。

在图15A-15E的实施例中，图15A是描绘包括EWOD阵列的EWOD盒180的图，其中已经输入了样品体积182a和四个稀释剂体积184a，类似于前一实施方案。同样，实施例样品体积182a包括具有进行扩增处理的靶表部分的DNA、引物、探针和主混合物。稀释剂体积184a可用于稀释样品体积182a，并包括与样品体积182a中相同浓度的引物、探针和主混合物，但缺乏DNA。在如图15A所示的反应方案的第一步中，EWOD盒180的电润湿操作用于将第一样品液滴194a从样品体积182a提取到样品制备区186中。在该特定实例中，还使用电润湿力将稀释剂液滴181分配到样品制备区186中。如图15B所示，然后使用电润湿力将液滴194a和181混合并合并到初始的稀释样品液滴185中，从而与图14G所述相当地进行液滴操纵操作。如图15C所示，一旦样品液滴182a和稀释剂液滴181充分混合并合并到初始的稀释样品液滴185中，初始的稀释样品液滴可以分成许多较小的稀释的子液滴187，或者可以从初始的稀释样品液滴185分配单个子液滴187。

图15D是描绘示例性EWOD盒180的图，其中EWOD阵列覆盖在多个热控制元件196上(类似于图14D)。该实施例再次采用图13C所述的12元件配置。如图15D中进一步所示，单个或任选多个子液滴187通过电润湿力移动到第一核酸扩增区188中，其中热控制元件196-3用于使液滴在95℃和60℃之间热循环，从而与前一实施方案相当地进行PCR扩增处理。每次将液滴冷却至60℃时，获取荧光图像并继续热循环过程，直到荧光值大于预定阈值，这允许确定阈值循环Ct。循环次数可以变化，并且不需要PCR中常见的完整35-45个循环，并且一旦可以计算Ct值就可以停止热循环。剩余的热区，即对应于除196-3之外的热控制元件的区域，可以保持在给定热区内的任何试剂的最佳温度，或者可以保持在室温。

图15E是描绘荧光强度曲线的实施例的图，其示出了与该实施例相关的初始稀释样品液滴187的代表性计算，以确定这种液滴的阈值循环Ct1。如上所述，能够进行后续数字PCR定量的靶标循环数Ct_靶标和/或等效浓度，以及单拷贝的阈值荧光的开启值Ct_单个可以是先前实验产生的已知值。为清楚起见，此处也绘制了初始稀释样品液滴的荧光强度曲线。一旦通过稀释样品子液滴的荧光强度曲线确定了Ct1值，就可以通过将Ct1值输入到保存在系统计算机上的反应的参考标准曲线方程中来估计样品的浓度。然后可以通过使用上面的方程7将稀释样品浓度与后续数字PCR分析所需的靶标浓度进行比较来计算稀释因子。因此，参考图15E，系统然后使用保存的反应参考方程和测量的Ct1值来计算(a)稀释样品的浓度，和(b)原始样品的浓度(鉴于已知原始样品稀释因子)。然后，原始样品的Ct可以在方程7中与Ct_靶标一起使用以计算样品的最佳稀释倍数，其中Ct_靶标是用于支持后续数字PCR定量的靶标浓度。稀释因子旨在将样品稀释至等于通常～0.7-1.6个拷贝/分区的最佳浓度。

然后，系统可以基于计算的稀释因子(与上面的图14G-14I所述相当)进行数字PCR以上。系统通过计算的稀释因子自动稀释原始样品以进行数字PCR定量，并将稀释的样品分成正确数量的分区。将分区移入数字PCR区192。在一个示例性实施方案中，将所有稀释的样品分成用于定量的分区。然后可以设定热控制元件4-12以使所有分区在95℃和60℃之间热循环。通常在35-45个循环之后，可以计数阳性和阴性分区的数量，然后可以使用泊松统计(方程3-6)来定量(a)稀释的样品，并因此(b)原始样品浓度。

在另一个示例性实施方案中，稀释因子的确定可以通过结合图14系列步骤和图15系列步骤来进行，其基本上提供了对计算的稀释因子的双重检查。通常，该实施方案包括在初始计算稀释因子之后的另外的PCR步骤，以确认在进行全数字PCR定量之前稀释的样品处于用于数字PCR定量的正确浓度范围。

首先，执行图14B-14E所述的过程以计算第一稀释因子。图16A是描绘荧光强度曲线的实施例的图，该荧光强度曲线可用于确定对应于原始样品的第一Ct阈值Ct1，类似于图14E所示。接下来，执行图15A-15D的过程，以确定稀释的样品液滴的另一个Ct阈值Ct_-稀释。图16B是描绘可用于确定Ct_-稀释的荧光强度曲线的实施例的图。

一旦通过图16B的荧光强度曲线确定了Ct_-稀释，就可以将Ct_-稀释与靶标浓度的Ct(Ct_-靶标)进行比较，这将支持后续数字PCR定量。如果Ct_-稀释和Ct_-靶标适当地接近，例如在1-3个循环内，则系统将自动进行样品分配和数字PCR热循环，如上面的图14G-14I所描述和描绘的(并且当如图15系列图所描述的那样最初稀释样品时进一步如上所述)。相反，如果Ct_-稀释和Ct_-靶标相隔超过三个循环，并且指示稀释样品的浓度高于用于数字PCR定量的最佳浓度，则可以整合另一个稀释步骤。如果Ct_-稀释表明稀释样品的浓度低于数字PCR定量的最佳浓度，则分区仍然可以进行，因为数字PCR可以定量至单拷贝数。

在初始稀释样品液滴实际上不含模板DNA的情况下，例如，如果是阴性分区，则可以重复上述过程，直到从稀释样品中提取阳性分区为止。另外和/或替代地，系统可以被编程为从初始稀释样品分配子液滴阵列并在第一扩增区188中同时处理它们，并且如上所述分析阳性分区的Ct值。在某些示例性实施方案中，可以分析1-100个子液滴，或者可以分析1-50个子液滴或1-20个子液滴以利用较少的原始样品。

图17A-17J是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的另一示例性方法的步骤的进展的图，包括确定反应效率。在这样的实施方案中，在估计初始样品体积的浓度之前计算PCR反应的效率，特别是如果通常已知反应效率低的话。初始样品可以是DNA样品，或从RNA样品逆转录的互补DNA。通常，为了测量效率，优选的实施方案包括10倍稀释并检查相对于反应的参考方程的反应效率并确定是否存在任何不一致。可以考虑效率和每个分区的靶标拷贝数来计算一系列稀释因子，并且极值之间的稀释因子是合理的起始点。

在图17A-17J的实施例中，图17A是描绘包括EWOD阵列的EWOD盒180的图，其中已经输入了样品体积182b和四个稀释剂体积184b，类似于前面的实施方案。在如图17A所示的反应方案的第一步中，EWOD盒180的电润湿操作用于将第一样品液滴194b从样品体积182b提取到样品制备区186中。在该特定实施例中，还使用电润湿力将稀释剂液滴181b分配到样品制备区186中。如图17B所示，然后使用电润湿力将液滴混合并合并到初始稀释样品液滴185b中，从而与上面的图14G所述相当地进行液滴操纵操作。优选地，在该实施例中，稀释样品液滴185b是1比10，1比100或1比1000的稀释。如图17C所示，一旦样品液滴182a和稀释剂液滴181b充分混合并合并到初始稀释样品液滴185b中，初始稀释样品液滴可以分成一个或多个稀释样品子液滴187b，或者从稀释样品液滴185b分配单个子液滴187b。

如图17D所示，通过电润湿力将单个或任选多个子液滴187b移动到第一核酸扩增区188中，并且将第二样品液滴183b分配到PCR样品制备区186中。图17E是描绘示例性EWOD盒180的图，其中EWOD阵列覆盖在多个热控制元件196上。该实施例再次采用上面图13C描述的12元件配置。然后将第二样品液滴183b移入第一核酸扩增区188，其中热控制元件196-3用于使样品液滴和稀释的子液滴在95℃和60℃之间热循环，从而与先前实施例中相当地进行PCR扩增处理。

在该实施方案中，每当第一扩增区188处于60℃时进行光学测量，并且针对第二样品液滴183b和子液滴187b绘制相对于循环数的荧光强度，这些图描绘于图17F的图表。如在这样的图中所见，测量每个液滴的Ct，其中Ct1对应于样品液滴187b，Ct2对应于稀释的子液滴187b。一旦确定了Ct1和Ct2值，就停止热循环并使用方程1计算反应效率。然后系统使用保存的反应参考方程和测量的Ct1和Ct2值来估算(a)稀释样品和(b)原始样品的浓度。然后可以将原始样品的Ct1与用于数字PCR定量的最佳浓度的Ct以及方程7中计算的反应效率一起使用，计算样品定量的最佳稀释因子。然后，将第二样品液滴183b、稀释样品液滴185b和子液滴187b通过电润湿力移动到废物区190，如图17G所示。

然后，系统可以与前面的实施例所述相当地基于计算的稀释因子进行数字扩增，例如数字PCR。图17H是描绘使用EWOD盒180的数字PCR的样品制备步骤的图。具体地，EWOD盒180的电润湿操作用于将另一样品液滴198b从样品体积182b提取到样品制备区186中，同时从一个或多个稀释剂体积184b产生稀释剂液滴200b。产生的稀释剂液滴200b的体积足以通过使用上述方程7计算的稀释因子稀释第二样品液滴198b。如图17I所示，电润湿力用于混合并将第二样品液滴198b和稀释剂液滴200b合并到样品制备区186内的稀释样品液滴202b中。

如图17J所示，一旦稀释样品液滴202b已经完全混合，稀释样品202b可以通过电润湿力分成多个分区204b，其能够通过数字PCR定量稀释样品液滴202b。在最终的数字测定中，数字核酸扩增的最佳体积浓度相当于每个分区～0.7-1.6个拷贝。靶标开启值旨在处于最佳范围内。将样品分成分区204b，并将分区移入数字PCR区192。在优选的实施方案中，将所有稀释样品液滴202b分成用于定量的分区204b。然后可以设定热控制元件196的热控制元件4-12以使所有分区在95℃和60℃之间热循环达所需的循环次数。阳性和阴性分区的数量可以作为数字PCR分析的一部分计算，并且然后利用上述方程3-6所述的泊松统计定量(a)稀释样品液滴浓度，并因此(b)原始样品液滴浓度。

在另一个实施方案中，进行归一化处理以说明与进行PCR无关的荧光变化。用于归一化的另外和/或替代方法包括归一化为被动参比染料，以便可以补偿非PCR相关的荧光变化。通常使用诸如ROX的被动染料并存在于样品液滴中。这对于更容易区分阳性分区和阴性分区特别有用，从而降低了分配假阳性和/或假阴性分区的可能性。使用以下计算进行归一化(normalization)。

在基本归一化处理中，在完成数字PCR扩增后，计算每个分区的相对荧光，并设置阈值以区分阳性分区和阴性分区。图18A是说明包含样品材料和被动参比染料的分区的典型实时扩增曲线的图。图18B是描绘已经在数字PCR反应方案中扩增的多个分区的终点样品和被动染料荧光值的图。绝对荧光强度存在变化，这可能是由于不均匀的光学照射、次优的热梯度和其他非PCR相关的变化。在这种情况下，难以设置容易区分阳性分区和阴性分区的阈值。

通过应用方程8解决了这个难题。具体地，图18C是描绘使用方程8计算的相同分区的相对荧光的图。如图所示，阳性和阴性分区之间的区别现在更加明显。因此，可以设置阈值，其容易且正确地从阴性分区识别阳性分区，从而消除了图18B中所示的难题。

图19A-19H是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的另一示例性方法的步骤的进展的图，包括使用与DNA样品内的多个靶标部分相关的多个引物。图19A-19H示出了针对四种不同引物靶标筛选的单个DNA样品的示例性测定方案，其在单个EWOD装置(例如EWOD盒180)上处理。每个靶标可具有相同或不同的读出机制，并且可以具有或不具有相同的荧光激发和发射波长。

图19A是描绘EWOD装置180的图，其中输入了DNA样品输入体积210，四个靶标输入体积212、214、216和218，以及定量靶标输入体积220。电润湿元件可以被致动以便形成样品制备区222、第一核酸扩增区224、数字PCR区225和废物区226。四个靶标输入体积各自包含PCR扩增所需的主混合物、引物和探针，但是引物靶向DNA样品输入体积210中DNA链上的不同区域。尽管在该实施例中使用了四个靶标输入体积，但是可以采用任何合适数量的靶标输入体积。定量靶标输入体积220包含针对定量靶标进行PCR扩增所需的主混合物、引物和探针，其可用于测量Ct值并估计原始样品的浓度。

在如图19B所示的初始准备步骤中，从样品输入体积210分配第一样品液滴228，并且从定量靶标输入体积220分配定量液滴230，其用于确定适当的稀释因子。将这些液滴移动到第一核酸扩增区224中。如图19C所示，将第一样品液滴228和定量液滴230混合并在第一扩增区224内合并以形成扩增液滴232。重新参考示出热控制元件的12元件配置的附图，对应于第一扩增区224的热控制元件在该示例中是元件4。控制这种热控制元件以使扩增液滴232在95℃和60℃之间热循环以进行PCR扩增处理。每当第四热控制元件处于60℃时进行光学测量，并且与前面的实施例中相当地绘制相对于循环数的荧光强度。因此，图19D是描绘用于确定DNA样品的Ct值的荧光强度的图。一旦荧光值大于预定阈值并且可以确定Ct值，则停止热循环，并将扩增的液滴232移动到废物区226，如图19E所示。

然后系统使用保存的用于反应的参考Ct_-靶标和来自图19D的测量的Ct值来估计原始DNA样品的浓度。然后可以将原始样品的Ct与方程7中用于数字PCR定量的靶标浓度的Ct_-靶标一起计算样品定量的稀释因子。

如图19E进一步所示，系统通过电润湿力自动地将四个样品子液滴234、236、238和240分配到样品制备区222中。如图19F所示，根据前一步骤中计算的稀释因子，分别用四个靶标输入体积稀释样品子液滴以产生四个相应的稀释样品/靶标组合242、244、246和248。如图19G所示，四个稀释样品/靶标组合中的每一个都被分成多个分区并通过电润湿移动到数字PCR区225中。同样，数字PCR区225优选地排除第一扩增区224，从而可以避免任何可能的污染问题。

如图19H所示，在优选实施例中，每一个稀释样品/靶标组合242、244、246和248都被分成相应的分区250、252、254和256以进行定量。为了进行数字PCR，重新参考示出热控制元件的12元件配置的附图，然后可以设置热控制元件1-3以使包含靶标212的所有分区250在95℃和60℃之间热循环；然后可以设定热控制元件4-6以使包含216的所有分区252在95℃和60℃之间热循环；然后可以设定热控制元件7-9以使包含靶标214的所有分区254在95℃和60℃之间热循环；然后可以设置热控制元件10-12以针对包含靶标218的样品使所有分区256在95℃和60℃之间热循环。通常在35-45个循环之后，可以计算阳性和阴性分区的数量。然后可以使用泊松统计(方程3-6)绝对地定量相对于样品DNA的每个靶标部分的原始样品浓度。可以使用少至218个液滴来定量每个样品/靶标组合。

应该理解，上述示例性实施方案并不意味着是限制性的。各种实施方案可以与不同的EWOD平台技术组合和使用。本领域技术人员将认识到，使用本文所述的一般原理，任何数量的不同测定区域可以实现期望的结果。例如，在一些情况下，DNA样品可以与引物、探针和主混合物分开分配，然后可以在第一扩增阶段之前将其混合在EWOD装置上。实施例列于但不限于下表I。

表I

本发明的原理也适用于其中核酸输入是RNA的反应方案。使用逆转录(RT)步骤从RNA制备互补DNA。然后进行核酸扩增。RT和PCR的试剂可以在一步RT-PCR方案中混合，或分两步加入。两步方案添加RT试剂并在添加用于扩增的PCR试剂之前进行逆转录。对于一步RT-PCR方案，上表I中的主混合物将被一步RT-PCR主混合物替代。

本领域普通技术人员还将理解，本发明的原理不限于数字PCR测定，并且本发明的原理与生物学中的数字测定完全兼容，例如数字核酸定量，用于蛋白质生物标记定量的ELISA，用于定量酶转换的酶测定和用于表型分型和基因分型的基于细胞的测定。

本领域普通技术人员将进一步理解，本发明的原理与等温qPCR技术和等温数字PCR技术完全兼容。在反应循环期间，等温技术不需要在95℃和60℃之间的传统热循环。相反，等温扩增在固定温度下进行。在本发明中，等温技术所需的固定温度可由EWOD系统中的盒下方的可编程热控制元件提供。本发明与等温技术兼容，包括但不限于重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)、滚环扩增(RCA)和切口酶扩增反应(NEAR)。

在等温方法中，监测相对于时间的反应荧光强度，而不是像在PCR中那样在“每个循环”监测反应荧光强度。样品荧光大于给定阈值的时间称为“阳性检出时间”或Tp值。不同浓度的样品产生不同的Tp值。使用标准样品，例如已知浓度的样品，可以针对一系列样品浓度建立Tp值。然后可以以类似于qPCR中“Ct”相对于“样品浓度”的方式确定“Tp”和“样品浓度”之间的相关性。

本领域普通技术人员将进一步理解，本发明的原理与数字蛋白质测定完全兼容。数字蛋白质测定可用于使用ELISA定量样品中的蛋白质，特别是血清样品中的低丰度生物标记蛋白质(ELISA是一种广泛使用的技术，用于检测可与抗体结合的任何蛋白质)或定量具有酶活性的酶。

本领域普通技术人员将进一步理解，本发明的原理与基于数字细胞的测定完全兼容。通常通过将细胞分配到含有荧光底物的分区中进行酶促扩增检测，基于数字细胞的测定涉及在分区中封装离散数目的细胞并测量细胞表型和基因型的特征，例如细胞分泌物、细胞表面生物标记、细胞代谢物等。

为了概述本发明的一般原理，图20是描绘用于定量样品体积中靶DNA浓度的示例性方法的流程图。示例性方法和任何相关子步骤可以被编程到结合到EWOD系统中的控制系统和基于计算机的元件中，例如，参照图2、8和12所在先描述的控制元件。该方法的步骤可包括以下步骤：

(1)对从初始样品体积分配的样品液滴进行扩增；(2)测量样品液滴的开启值(例如Ct、Tp、拷贝数/20μL、拷贝数/μL或拷贝数/分区)；(3)将测量的开启值与支持后续数字核酸定量的靶标开启值(例如0.7-1.6个拷贝/分区)进行比较；(4)根据测量的开启值和靶标开启值计算稀释因子；(5)用计算的稀释因子自动稀释一部分样品体积；(6)将稀释的样品部分自动分成多个分区；(7)对分区进行数字扩增处理；(8)计算阳性和阴性分区的数量；和(9)使用泊松统计定量初始样本的浓度。在以下实施例中进一步量化本发明的原理。

实施例1：对液滴进行qPCR测量以确定样品浓度和稀释因子

将大约1μL未知浓度的DNA样品加载到EWOD装置上。使用电润湿从样品中分离出2×2滴(0.0229μL)并转移到扩增区。在每个热循环后测量液滴的荧光，并且在系统控制软件中记录和分析作为PCR循环数的函数的荧光强度。当荧光信号的强度放大到阈值以上时，自动计算样品的Ct值。将未知浓度样品的Ct值与保存在系统计算机上的反应参考数据库进行比较。Ct值用于使用反应进行的参考标准曲线估计原始样品的浓度。

在该实施例中，对于给定的反应，测量未知起始样品的Ct值为21。对于所述给定反应，系统计算机包括以下参考关系：

Y＝-3.3x+34.8

其中y是Ct值，x是DNA浓度的对数(拷贝数/20μL)。

对于Ct值为21的样品，未知样品的浓度估计为每20μL约15,199个拷贝(或每μL756个拷贝)。鉴于已知系统将20μL的最终样品体积分成873×0.0229μL的分区，并且数字PCR的最佳浓度通常在每个分区1-1.6个拷贝之间，系统可以计算出靶标样本浓度为在要分析的20μL中有873到(873*1.6＝)1,396个拷贝(43.62-69.6个拷贝/μL)。上述参考标准曲线方程可用于计算在24.4和25.1之间的Ct_{靶标数字PCR浓度}。

假设反应效率为100％，例如，DNA浓度在每个PCR循环中加倍，因此方程中的效率为2，靶标拷贝数为每个分区1.6个拷贝(Ct＝24.4)，所需的稀释因子为：

稀释因子＝效率^(Ct_靶标-Ct)

＝2^(24.4-21)

＝2^3.4

＝10.55

然后，系统可以基于最小液滴尺寸(0.0229μL)计算最佳稀释剂量。在这些情况下，每个0.0229μL样品液滴需要10.55*0.0229＝0.241595μL＝>0.241595-0.0229＝0.218695μL稀释剂。如果必须处理20μL，则需要20/0.241595＝82.78个重复的该基本单位；82.78*0.0229＝1.895μL样品和82.78*0.218695＝18.10μL稀释剂。鉴于10μL近似等于42×42像素液滴，则可以混合两个平行的10μL最终稀释体积以实现数字化所需的20μL，例如，将0.9475μL样品的两个平行稀释液稀释到(10-0.9475＝)9.0525PCR试剂中。

稀释后，浓度为每个分区约1.6个拷贝。使用泊松统计，数字PCR输出将使873个分区中的696个为阳性，而873个分区中的177个为阴性。在这个实施例中，仅需要超过盒的2/3来容纳873个分区以进行热循环，使大约另外1/3专用于样品制备和稀释。

数字定量步骤识别哪些分区是阳性的，哪些是阴性的。在一个方面，数字定量步骤计算阳性分区的数量和/或阴性分区的数量。在此实施例中，总共873个分区中有696个阳性分区和177个阴性分区。

在另一方面，泊松统计(方程3-6)用于计算稀释样品液滴的浓度。使用0.0229μL的分区体积和551个阳性分区，322个阴性分区，稀释样品浓度λ计算为69.68个拷贝/μL。

在另外的方面，稀释样品液滴的浓度(通过泊松统计计算)可以与稀释因子数据一起使用以计算初始样品的浓度。在这种情况下，初始样品浓度将计算为69.68*10.55＝735个拷贝/μL，或14,702个拷贝/20μL。另外和/或可选地，靶标拷贝数可以设置为每个分区1个拷贝(Ct＝25.1)。假设反应效率为100％，例如，每个PCR循环后加倍，因此方程中的效率为2，所需的稀释因子为：

稀释因子＝效率^(Ct_靶标-Ct)

＝2^(25.1-21)

＝2^4.1

＝17.15

然后，系统可以基于最小液滴尺寸计算最佳稀释比，在这种情况下假设为0.0229μL。

另外和/或替代地，稀释因子可以如下计算：

稀释因子＝测量的样品中每μL的拷贝数/用于数字PCR的每μL的靶标拷贝数

＝756/43.62

＝17.33

差异主要是由于各个计算中的舍入误差。在这种情况下，每0.0229μL样品液滴需要17.15*0.0229＝0.392735μL＝>0.392735-0.0229＝0.369835μL稀释剂。如果必须处理20μL，则需要20/0.392735＝50.92个重复的该基本单位；50.92*0.0229＝1.166μL样品和50.92*0.369835＝18.83μL稀释剂。鉴于10μL近似等于42×42像素液滴，则可以混合两个平行的10μL最终稀释体积以实现数字化所需的20μL，例如，将0.583μL样品的两个平行稀释液稀释到(10-0.583＝)9.417μL PCR试剂中。

稀释后，浓度为每个分区约1个拷贝。使用泊松统计，数字PCR输出将使873个分区中的551个为阳性，而873个分区中的322个为阴性。在这个实施例中，需要超过1/3来容纳873个分区以进行热循环，使大约另外1/3专用于样品制备和稀释。另外和/或替代地，靶标拷贝数可以被设置为每个分区1到1.6个拷贝之间的任何值(Ct＝24.4和25.1)，或者更广泛地，设置为每个分区0.7到2.5个拷贝之间的任何值，或者甚至更广泛设置为每个分区0.002和9个拷贝之间的任何值，其中使用873个0.0229μL体积的分区。

数字定量步骤识别哪些分区是阳性的，哪些是阴性的。在一个方面，数字定量步骤计算阳性分区的数量和/或阴性分区的数量。在此实施例中，总共873个分区中有551个阳性分区和322个阴性分区。

在另一方面，泊松统计(方程3-6)用于计算稀释样品液滴的浓度。使用0.0229μL的分区体积和551个阳性分区，322个阴性分区，稀释样品浓度λ计算为43.55个拷贝/μL。

在另一方面，稀释样品液滴的浓度(通过泊松统计计算)可与稀释因子数据一起使用以计算初始样品的浓度。在这种情况下，初始样品浓度计算为43.55*17.15＝747个拷贝/μL，或14,938个拷贝/20μL。

实施例2：低效反应

第一样品液滴显示Ct1为21，样品的10倍稀释液的Ct2为24.5。反应效率如下：

效率＝10^(1/(Ct2-Ct1))＝10^(1/Δn)

＝10^(1/24.5-21)

＝10^(0.2857)

＝1.93

系统计算机具有针对特定反应的数字PCR定量的靶标浓度的参考Ct值，Ct_靶标＝25.0。然后可以如下计算稀释因子：

稀释因子＝效率^(Ct_靶标-Ct)

＝1.93^(25-21)

＝1.93^4

＝13.87

另外和/或替代地，如果系统数据库具有反应的参考方程，则系统可以通过估计初始样品的浓度并且知道用于数字PCR定量的最佳拷贝数范围是多少来计算靶标稀释因子。示例参考标准方程是：

Y＝-3.5x+36

其中y是Ct值，x是DNA浓度的对数。

然后系统可以计算初始样品的浓度；大约19,307个分子/20μL或965个拷贝/μL。鉴于已知系统将20μL的最终样品体积分成873×0.0229μL的分区，并且数字PCR的最佳浓度在每个分区1-1.6个拷贝之间，系统可以计算出靶标样品浓度是在要分析的20μL中有873到(873*1.6＝)1,396个拷贝(43.62-69.6个拷贝/μL)。考虑到计算的反应效率，上述反应的参考方程可用于计算在25.0和25.7之间的Ct_靶标。

稀释因子＝效率^(Ct_靶标-Ct)

＝1.93^(25-21) ＝1.93^(25.7-21)

＝1.93^(4) ＝1.93^(4.7)

＝13.87 ＝21.98

实施例3：EWOD上的稀释以使用有限数量的液滴扩展数字PCR的动态范围。

考虑一个例子，其中20μL被分成873个液滴并在EWOD平台上分析，并且样品和稀释剂/PCR扩增试剂都储存在EWOD装置上。应用泊松统计并假设您需要20％或更多的液滴为阴性以获得最佳结果，那么873×0.0229μL的分区(或36×0.0229μL的分区，总计10μL)将允许样品达到待定量的～70分子/μL的体积浓度。这相当于每20μL 1,400个分子。动态范围可以计算如下：

对数数量＝log(70)–log(1)＝1.845-0＝1.85

为了扩展平台的动态范围，可以在EWOD装置上进行样品稀释。10μL稀释剂/PCR试剂占据42×42个像素。允许的最小分区是2×2个像素，或0.0229μL。如果～6,825个像素(例如105×65像素或类似的)的区域专用于稀释样品，则可以实现0.0229μL至10μL或437倍稀释的最大样品稀释度。这意味着一旦考虑稀释因子，数字定量的最大体积样品浓度为437*70＝30,590个分子/μL(相当于每20μL约6×10⁵个分子)。系统的动态范围是：

对数数量＝log(30,590)-log(1)＝4.486-0＝4.49

考虑到盒的容量，系统可以使用另外的10μL稀释剂/PCR试剂进行进一步437倍稀释，考虑两个稀释因子，使得可以数字定量437*30,590＝13,367,830个分子/μL(相当于每20μL约2.7×10⁸个分子)。系统的动态范围计算如下：

对数数量＝log(13,367,830)-log(1)＝7.126-0＝7.13

进行两次稀释以得到20μL用于分配的稀释样品，例如，进行两次2×10μL稀释步骤。

可根据需要进行更多次稀释。

EWOD系统的动态范围现在大于将～25μL分成500万个分区的数字PCR系统的动态范围。

实施例4：突变体:野生型比例1:1000

在特定样品中，突变体:野生型的比例为1:1000。为确保对最终结果的置信度，研究人员决定必须至少确定5个突变体。因此，采用EWOD装置将给定的输入样品体积数字化为(a)最佳数字PCR浓度，和(b)足够数量的分区以检测5个突变体。对于平均含有～5个突变体的样品，它还含有～5000个野生型分子。这导致在分析样品中需要至少5005个分子。

qPCR定量步骤可以寻找野生型(显性)和突变体(如果样品已经充分稀释)的扩增。对于突变体:野生型为1:1,000的情况，系统知道，为了检测至少5个突变体，野生型必须以约5000个分子/20μL(250个分子/μL)存在。因此，在这种情况下的稀释因子是在确定使野生型降至250分子/μL所需的稀释度。

对于数字PCR，估计在0.7-1.6个拷贝/分区之间是最佳浓度。采用两个端值，在(5005/0.7＝)7,150个分区和(5005/1.6＝)3,128个分区之间进行分析。假设样品处理体积为20μL，这相当于介于2.8nL和6.4nL之间的分区体积。EWOD平台使用105μm×105μm的像素，单元间隙为75μm。每个像素的体积为0.827nL，因此2×2像素的最小液滴尺寸将支持3.3nL的分区体积。有效区域的占位面积为632×260＝164,320个像素。

如果每个2×2液滴在其与其最近邻居之间需要2个像素的空间，那么每个2×2液滴需要16个像素。因此，可容纳的最高密度分区将是164,320/16＝10,270个分区。如果盒的3/4专用于扩增分区，则可以容纳最多7,702个液滴。剩余的1/4有效区域将专用于样品制备和第一qPCR定量步骤。盒上的20μL体积将占据约156×156个像素的区域，并分为6,060×3.3nL的分区。

使用泊松统计，对每20μL含有5000个野生型分子的20μL样品(相当于250个分子/μL)进行数字PCR，然后6,060个3.3nL的分区将产生2,656个阴性分区，3,404个阳性分区和250个分子/μL的测量的λ。混合物中将有5个突变分子(相当于0.25个分子/μL)，产生5个阳性分区。

实施例5：比例因子

在一些实施方案中，优选确保阳性分区液滴的数量在分区总数的0.0001-90％、0.001-80％或0.01-50％之间。本发明可用于计算确保最小或优选数量的阳性分区的稀释因子。

例如，未知起始样品液滴的Ct值测量为21。对于所述给定反应，系统计算机对样品具有以下的参考方程：

Y＝-3.3x+34.8

其中y是Ct值，x是DNA浓度的对数。对于以Ct值为21测量的样品，未知样品的浓度估计为每20μL约15,199个拷贝(或每μL 756个拷贝)。假设最小液滴体积为0.0229μL，则20μL样品可以分成最多(20/0.0229＝)873个分区。

在该特定实施例中，终端用户要求分区总数的40％为阳性，例如，(0.4*873＝)349个液滴为阳性。使用泊松统计，可以计算出这需要平均浓度为446个分子/20μL(或22.3个分子/μL)。使用参考方程，446个分子/20μL的Ct值为26.06。假设反应效率为100％，则稀释因子计算如下：

稀释因子＝效率^(Ct_靶标-Ct)

＝2^(26.06-21)

＝2^5.06

＝33.4

或者，假设反应是100％有效的，稀释因子可以计算为大约15,199/446＝34.08。在数字PCR扩增后，该稀释将提供所需的～40％阳性液滴(349个阳性液滴)和524个阴性液滴。

知道分区体积和阳性和阴性分区的数量使得稀释样品的浓度可以使用泊松统计(方程3-6)来计算。给定0.0229μL的分区体积，包含349个阳性分区和524个阴性分区的873个总分区，稀释样品浓度λ计算为22.29个拷贝/μL。

在另一方面，稀释样品液滴的浓度(通过泊松统计计算)可与稀释因子数据一起使用以计算初始样品的浓度。在这种情况下，初始样品浓度计算为22.29*33.4＝744个拷贝/μL，或14,890个拷贝/20μL。

实施例6：在没有标准样品的情况下计算标准曲线

在一些实施例中，可能没有存储在系统上或以其他方式可由系统访问的参考方程，用于从测量的Ct值自动确定拷贝数。在这种情况下，假设已知单拷贝开启的近似Ct值，可以计算参考方程。

所述步骤包括对初始样品进行至少两次，优选至少三次，10倍稀释，并扩增液滴直至确定每个液滴的Ct值。如果已知单个拷贝液滴的Ct值，则可以通过将线拟合到Ct值对DNA浓度对数的曲线图来计算参考方程。例如，基于探针的测定可能在循环27.5处具有预期的单拷贝开启。然后，所得到的参考方程可用于确定样品的初始浓度，并因此确定如前述实施例的稀释因子。在更进一步的实施方案中，可以包括或确定反应效率，并相应地修改标准曲线方程。

实施例7：使用数字PCR最小化定量所需的分区数

在一些实施方案中，可以通过将20μL处理成873个分区(每个体积为0.0229μL)来精确定量样品。然而，使用更小的体积精确定量样品也是可行的，例如仅2-3μL。

下面的表II显示了如何使用具有不同处理样品体积的数字PCR处理来定量具有～10个拷贝/μL(每个分区约0.23个拷贝)的样品的实施例。通常，处理的总体积越小，与计算的样品浓度相关的误差越高。但是，如果用户只需要将样本定量到<5％的准确度，那么系统可以通过处理少至3μL来计算。如果处理4μL或更多，则可以实现与实际浓度相差<2％的误差。这导致必须处理的样品量从标准的20μL减少到3或4μL。

TableⅡ

因此，本发明进一步使得有机会最小化分区的数量，并因此最小化定量所需的样品体积，这将有助于最大化可在单个装置上定量的样品的数量。在计算样品浓度之后，系统可以使用泊松统计来计算给定精度(与实际的误差％)内所需的最小分区数，以及可用于数字PCR处理的样品和/或稀释样品体积。本领域普通技术人员将理解，样品分区的数量取决于若干因素，包括但不限于样品浓度、分区的数量和体积、可用样品的体积、可用稀释剂的体积、任何稀有和丰富等位基因的比例等。

实施例8：多路复用

上述实施例1-7均与多路复用兼容，由此可以在单个盒中使用数字PCR定量不同的样品和靶序列组合。继之前的实施例之后，可以处理两个10μL样品/靶标组合而不是单个20μL样品。两个或更多个样品/靶序列组合可以是(a)相同的样品但不同的靶序列，(b)不同的样品和相同的靶序列，(c)不同的样品和不同的靶序列，或(d)多个重复的相同的样品/靶标序列组合。本领域普通技术人员将进一步理解，如果盒的最大容量是20μL，一个×20μL，两个×10μL，三个×6.67μL，四个×5μL，五个×4μL等，样品/靶标序列组合可以并行处理。

下面的表Ⅲ显示了如何使用数字PCR针对多达5个不同的靶序列对具有～10个拷贝/μL(每个分区约0.23个拷贝)的样品进行定量的实施例，每个具有与实际浓度相差<2％的误差。

Table III

实施例9：熔融分析

在数字PCR定量步骤后，实施例1-8都与熔融分析完全相容。在某些优选的实施方案中，熔融曲线和/或高分辨率熔融曲线可以通过将所有热控制元件从95℃以<1℃的梯度、优选<0.5℃的梯度、更优选<0.1℃的梯度逐渐冷却至60℃。从熔解曲线获得的指纹提供了关于每个扩增的液滴的含量的进一步信息，这在识别稀有等位基因或者针对多个不同的靶序列运行样品时特别有用。

实施例10：设置基线并计算阈值

用于自动确定扩增产物的Ct值的阈值可以通过以下方式计算：

·使用对照液滴，例如含有PCR所需的所有试剂但没有核酸样品的液滴。对照液滴的荧光不应随扩增而变化。在对照液滴荧光这种情况下，阈值通常设定为基线荧光标准偏差的10倍。

·对于含有非高浓度核酸样品的液滴，例如Ct值>15，基线通常可以在1至12的循环之间，其中荧光强度的变化很小。将阈值设置为这些循环之间荧光值的标准偏差的合适倍数，例如，×10。

·对于含有被动参比染料的液滴，可将阈值设置为被动参比染料荧光标准偏差的合适倍数。

本领域普通技术人员将理解，基线不必是基线标准偏差的10倍，并且可以相应地进行修改以考虑诸如所使用的读出染料、背景荧光、光学照明的均匀性等因素。当使用对照液滴确定基线和阈值时，对照液滴将遵循与样品液滴相同的PCR制备和PCR热循环，并在流程中适当的点处移至废液中。

实施例11：归一化为参考对照

图21A-21G是描绘构成根据本发明实施方案的进行数字PCR反应方案的另一示例性方法的步骤的进展的图，包括使用内部参比靶序列进行更准确的测定。内部参比或“管家”靶序列可用于更准确地确定所分析的反应的初始样品浓度和/或效率。这些参比靶序列可用于样品特异性归一化，归一化处理控制异常值并补偿例如参比靶序列之间表达水平的差异。最常见的归一化技术是“双ΔCt”，也称为“ΔΔCt”方法，或“Pffafl”方法，这两种方法都是本领域技术人员所熟知的并且由以下方程式控制。

ΔΔCt＝ΔCt_{(靶标样品)}-ΔCt_{(参比样品)}

ΔΔCt＝(Ct_{(t靶标基因，靶标样品)}-Ct_{(参比基因，靶标样品)})-(Ct_{(靶标基因，参比样品)}-Ct_{(参比基因，参比样品)})

其中：

Ct(_{靶标基因，靶标样品})＝靶标样品中靶标基因的Ct值；

Ct(_{参比基因，靶标样品})＝靶标样品中参比基因的Ct值；

Ct(_{靶标基因，参比样品})＝参比样品中靶标基因的Ct值；

Ct(_{参比基因，参比样品})＝参比样品中参比基因的Ct值。

在某些情况下，ΔΔCt方法可用于验证EWOD装置上样品稀释的准确性。优选地，探针将用作读出机制。

图21A描绘了EWOD盒180，其中输入了(靶标基因，靶标样品)体积260，(参比基因，靶标样品)体积262，(靶标基因，参比样品)体积264，(参比基因，参比样品)体积266和四个稀释剂体积268。来自每个(靶标基因，靶标样品)体积260，(参比基因，靶标样品)靶标262，(靶标基因，参比样品)体积264和(参比基因，参比样品)体积266的液滴通过电润湿力分配到样品制备区186中。每个体积含有用于进行PCR扩增的必需试剂。分配的液滴分别由附图标记270、272、274和276识别。如图21B所示，这种液滴移动到第一扩增区188中。如图21C所示，与前面的实施方案类似，第一扩增区188的位置与第三热控制元件196-3相对应，并且这种热控制元件用于使样品和参比液滴在95℃和60℃之间热循环以进行PCR，图21D。在PCR扩增后，这些液滴通过电润湿力移动到废物区190(参见图21E)。

图21D是描绘荧光强度曲线的实施例的图，其示出了与该实施例相关的代表性计算。在每个循环的60℃退火/延伸步骤期间拍摄荧光图像，直到可以建立ΔCt_{-靶标样品}和ΔCt_{-参比样品}，如图21D所示。各个Ct值可用于计算稀释因子，使得可以使用数字核酸扩增技术定量四个基因/样品输入中的每一个。稀释剂体积268含有PCR扩增所需的所有试剂。

参照图21E，第二样品液滴从原始体积分配到样品制备区186中，在图21E中分别标识为样品液滴280、282、284和286，以及来自稀释剂体积268的相应的稀释剂液滴288。如图21F所示，将各样品液滴混合并与各稀释剂液滴合并，形成相应的四个基因/样品组合290、292、294和296。如图21G所示，将四个基因/样品组合中的每一个分配并通过电润湿移动到数字扩增区192中进入相应的分区300、302、304和306。进行数字扩增处理，例如数字PCR，并且系统自动确定对于四个基因/样品组合中的每一份，哪些分区是阳性和阴性的，并且使用与先前实施方案类似的泊松统计定量每个浓度。

实施例12：RT-PCR

本发明的实施方案和实施例可用于逆转录qPCR和数字PCR测定。在这些实施例中，起始样品是RNA样品。使用逆转录(RT)步骤从RNA制备互补DNA。然后进行PCR。RT和PCR的试剂可以按照一步RT-PCR方案混合，或分两步加入。两步方案添加RT试剂并在添加用于扩增的PCR试剂之前进行逆转录。用于样品稀释、样品分配、归一化和多路复用的方法大致保持与先前在实施例1-11和图14-21的各种实施方案中所述的相同。

实施例13：等温扩增

本发明的实施方案和实施例与等温扩增技术兼容。对于使用等温扩增的应用，可以对系统中的热控制元件进行编程，以将样品分区加热到工作流程中正确位点处的等温扩增所需的固定温度。等温反应通常在37-70℃之间进行，这取决于所用的等温扩增处理的类型。

在等温方法中，监测相对于时间的反应荧光强度，而不是像在PCR中那样在“每个循环”监测反应的荧光强度。样品荧光大于给定阈值的时间称为“阳性检出时间”或Tp值。不同浓度的样品产生不同的Tp值。使用标准样品，例如在已知浓度的样品，可以针对一系列样品浓度建立Tp值。然后可以以类似于qPCR中相对于“样品浓度”的“Ct”的方式确定“Tp”和“样品浓度”之间的相关性。

对于给定的反应，Tp和样品浓度之间的关系将存储在系统内部，以便可以计算最佳稀释因子。另外和/或替代地，对于给定的反应，用于数字核酸定量的优化Tp值将存储在本发明的系统计算机上，以计算所需的稀释因子。

例如，将～1μL未知浓度的DNA样品加载到EWOD装置上。使用电润湿从样品中分离出2×2液滴，0.0229μL，并转移到第一扩增区。测量液滴的荧光作为时间的函数并由控制系统分析。当荧光信号的强度放大到阈值以上时，自动计算样品的Tp值。将未知浓度样品的Tp值与存储在系统计算机中的最佳Tp值和/或反应参考方程进行比较。然后使用这些数据计算待使用数字核酸扩增技术定量的样品的稀释因子。

在一个实例中，对于给定的反应，测量未知起始样品的Tp值为11分钟。对于所述给定的反应，系统数据库具有以下参考方程：

Y＝-2.5x+22.5

其中y是Tp值(分钟)，x是DNA浓度的对数(拷贝数/20μl)。

对于测量的Tp为11分钟的样品，浓度可以计算为～39,811个拷贝/20μL，或～1,991个拷贝/μL。为了最佳的数字核酸扩增，靶标浓度为～0.7-1.6个拷贝/分区。鉴于此，对于特定配置，系统将最终样品体积20μL分配为873×0.0229μL的分区，并假设数字PCR的靶标最佳浓度设置为每个分区约1个拷贝，系统可以计算出在将要分析的20μL中，最佳样品浓度约为873个拷贝。稀释因子可按如下方式计算：

稀释因子＝39,811/873

＝45.6

实施例14：扩增样品的分选、汇集和提取

在本发明的实施方案和实施例中，扩增的分区可以被鉴定为阳性或阴性。然后，系统可以对液滴进行分类并将它们汇集成“阳性”和“阴性”体积，移动分区并根据需要通过电润湿将它们合并。然后可以通过提取端口提取合并的体积以进行进一步的下游分析。

在这个实施例中，是否使用泊松统计来定量样品浓度是可选的；在某些情况下，仅仅识别哪些分区是阳性的哪些是阴性的就足够了。

因此，本发明的一个方面是增强的介质上电润湿(EWOD)装置和在EWOD装置中进行数字测定扩增技术的相关方法。在示例性实施例中，对介质上电润湿(EWOD)装置中的物质进行数字定量的方法包括以下步骤：将样品体积输入EWOD装置；将稀释剂体积输入EWOD装置；进行电润湿操作以从样品体积产生第一样品液滴；对EWOD装置内的第一样品液滴进行扩增处理；测量样品液滴的开启值；将测量的样品液滴的开启值与用于数字定量的靶标开启值进行比较；根据测量的样品液滴开启值与靶标开启值的比较计算稀释因子；进行电润湿操作以从样品体积中提取第二样品液滴；进行电润湿操作，根据稀释因子用稀释剂体积稀释第二样品液滴，形成稀释的第二样品液滴；并对稀释的第二样品液滴进行数字定量，以定量样品体积中物质的初始浓度。该方法可以单独地或组合地包括以下特征中的一个或多个。

在该方法的示例性实施方案中，第一样品液滴通过电润湿力移动到样品制备区中，并且进一步通过电润湿力移动到第一扩增区中，其中，在第一扩增区中对第一样品液滴上的感兴趣的种类进行扩增，并且第一扩增区与样品制备区是分开的。

在该方法的示例性实施方案中，该方法还包括当第一样品液滴在样品制备区中时，使用电润湿力用一部分稀释剂体积稀释第一样品液滴以形成初始稀释的样品液滴，并移动初始稀释的样品液滴进入第一个扩增区，对初始稀释的样品液滴进行扩增。

在该方法的示例性实施例中，进行数字扩增包括使用电润湿力将稀释的第二液滴分成多个分区，所述分区移动到与样品制备区和第一扩增区分开的数字扩增区中。

在该方法的示例性实施例中，EWOD装置包括荧光测量装置，并且使用荧光强度曲线确定样品液滴的开启值。

在该方法的示例性实施方案中，进行数字扩增包括通过检测相对于样品体积中包含的参比染料的荧光的荧光来进行归一化处理。

在该方法的示例性实施例中，进行数字扩增包括：将稀释的样品液滴分成多个分区；在多个分区上进行扩增处理；计算阳性分区和阴性分区的数量；并使用泊松统计来定量样品体积中种类的初始浓度。

在该方法的示例性实施例中，该方法还包括添加比例因子以确保阳性分区的比例在0.01％-90％之间。

在该方法的示例性实施方案中，该方法还包括确定第一样品液滴的扩增处理的反应效率以计算稀释因子。

在该方法的示例性实施方案中，确定反应效率包括以下步骤：进行电润湿操作以从样品体积中提取另一个样品液滴；对EWOD装置内的另一个样品液滴进行扩增；测量另一个样品液滴的第二个开启值；使用开启值和第二开启值确定反应效率；并且使用反应效率来计算稀释因子，所述反应效率用于将测量的样品液滴的开启值与靶标开启值进行比较。

在该方法的示例性实施例中，该方法还包括将多个靶标输入体积输入到EWOD装置中，该EWOD装置具有与样品体积中的多个相应靶标相对应的相应引物；进行电润湿操作以从对应于多个靶标输入体积中的每一个的样品体积中提取相应的子样品液滴；进行电润湿操作以根据稀释因子用各自的靶标输入体积稀释子液滴，以形成多个相应的稀释样品/靶标体积组合；并对稀释样品/靶标体积组合进行扩增处理，以定量样品体积中各种类上的各个靶标的初始浓度。

在该方法的示例性实施例中，该方法还包括将定量体积输入到EWOD装置中；将第一样品液滴和定量液滴从定量体积分配到EWOD装置的区域中，并将所述液滴混合在一起以形成扩增液滴；对扩增液滴进行扩增处理；测量扩增液滴的开启值；将测量的扩增液滴的开启值与靶标开启值进行比较；并且基于所测量的扩增液滴的开启值与靶标开启值的比较来计算稀释因子。

在该方法的示例性实施方案中，样品体积含有核酸种类，EWOD装置包括多个热控制元件，并且对第一样品液滴进行的扩增处理和/或数字扩增是聚合酶链式反应(PCR)核酸扩增。

在该方法的示例性实施例中，开启值是样品液滴的阈值循环值(Ct)。

在该方法的示例性实施方案中，样品体积含有核酸种类，并且对第一样品液滴进行的核酸扩增和/或数字核酸扩增是等温核酸扩增。

在该方法的示例性实施例中，开启值是样品液滴的阳性检出时间值(Tp)。

在该方法的示例性实施方案中，样品体积含有蛋白质种类。

在该方法的示例性实施方案中，样品体积含有细胞种类。

在该方法的示例性实施例中，样品体积包括输入到EWOD装置中的多个样品体积，包括(靶标基因，靶标样品)体积、(参比基因，靶标样品)体积、(靶标基因，参比样品)体积和(参比基因，参比样品)体积，该方法还包括：进行电润湿操作以从多个样品输入体积中的每一个中提取相应的子样品液滴；对EWOD装置内的子样品液滴进行核酸扩增；测量子样品液滴的ΔCt_{-靶标样品}和ΔCt_{-参比样品}；并根据测量的ΔCt_{-靶标样品}和ΔCt_{-参比样品}计算稀释因子。(图21系列，权利要求15-16)

在该方法的示例性实施例中，该方法还包括进行电润湿操作以从多个样品体积中的每一个中提取第二相应子样品液滴；进行电润湿操作以根据稀释因子用稀释剂体积稀释第二子液滴，以形成多个相应的基因/样品组合；对基因/样品组合进行数字核酸扩增，以定量多个样品体积中各基因/样品组合的初始浓度。

本发明的另一方面是一种微流体系统，包括介质上电润湿(EWOD)装置，该装置包括配置成接收一个或多个液滴的元件阵列，该元件阵列包括多个单独的阵列元件；控制系统，被配置为控制施加到元件阵列的致动电压，以进行对于液滴的操纵操作，从而进行根据任何实施方案的种类数字定量方法。该系统还可以包括位于沿着EWOD装置的不同空间位置的多个热控制元件，至少一个热控制元件的温度相对于时间是可变的；其中，控制系统包括热控制单元，该热控制单元被配置为控制多个热控制元件的温度，以产生位于沿着EWOD装置的不同空间位置的多个热区。

在微流体系统的示例性实施例中，控制系统控制施加到元件阵列的致动电压以形成单独的区域，包括用于制备第一样品液滴的样品制备区，对第一样品液滴进行扩增处理的第一扩增区，以及进行扩增处理的数字扩增区；其中样品制备区、第一扩增区和数字扩增区在空间上对应于不同的热控制元件。

本发明的另一方面是一种存储程序代码的非瞬时性计算机可读介质，该程序代码由处理装置执行，用于控制施加到介质上电润湿(EWOD)装置的元件阵列的阵列元件上的致动电压，以对元件阵列上的液滴进行液滴操作，该程序代码可由处理装置执行，以执行根据任何实施例的在EWOD装置中进行数字扩增技术的方法的步骤。

尽管已经关于某个或多个实施方案示出和描述了本发明，但是本领域技术人员在阅读和理解本说明书和附图时可以想到等同的改变和修改。特别是关于由上述元件(部件、组件、装置、组合物等)执行的各种功能，用于描述这些元件的术语(包括对“手段”的引用)旨在对应(除非另有说明)执行所述元件的指定功能的任何元件(即，功能上等同的)，尽管在结构上不等同于在本发明示例性的一个实施方案或多个实施方案中执行功能的所公开的结构。另外，虽然上面仅针对若干实施方案中的一个或多个描述了本发明的特定特征，但是这样的特征可以与其他实施方案的一个或多个其他特征组合，如果这对于任何给定或特定的应用可能是期望的和有利的。

工业适用性

所描述的实施方案可用于提供增强的AM-EWOD装置和EWOD装置操作。EWOD装置可用于提供增强的核酸扩增技术，用于增加样品浓度的动态范围，所述样品浓度可使用数字核酸扩增技术(例如数字PCR和等温扩增技术)在EWOD装置上定量，并且可以适用于DNA或RNA扩增技术。AM-EWOD或EWOD装置可以构成芯片实验室(lab-on-a-chip)系统的一部分。此类装置可用于操纵、反应和感测化学、生物化学或生理学材料。

Claims (24)

1.一种对介质上电润湿(EWOD)装置中的种类进行数字定量的方法，包括以下步骤：

将样品体积输入EWOD装置；

将稀释剂体积输入EWOD装置；

进行电润湿操作以从样品体积产生第一样品液滴；

对EWOD装置内的第一样品液滴进行数字扩增处理；

测量样品液滴的开启值；

将测量的样品液滴的开启值与用于数字定量的靶标开启值进行比较；

根据测量的样品液滴开启值与靶标开启值的比较计算稀释因子；

进行电润湿操作以从样品体积中提取第二样品液滴；

进行电润湿操作，根据稀释因子用稀释剂体积稀释第二样品液滴，形成稀释的第二样品液滴；和

对稀释的第二样品液滴进行数字定量，以定量样品体积中种类的初始浓度。

2.权利要求1的方法，其中第一样品液滴通过电润湿力移动到样品制备区中，并且进一步通过电润湿力移动到第一扩增区中，其中，在第一扩增区中对第一样品液滴上的感兴趣的种类进行扩增，并且第一扩增区与样品制备区是分开的。

3.权利要求2的方法，还包括当第一样品液滴在样品制备区中时，使用电润湿力用一部分稀释剂体积稀释第一样品液滴以形成初始稀释样品液滴，并将初始稀释样品液滴移动到第一个扩增区中，以对初始稀释样品液滴进行扩增。

4.权利要求3的方法，其中进行数字扩增包括使用电润湿力将所述稀释的第二液滴分成多个分区，所述分区移动到与所述样品制备区和第一扩增区分开的数字扩增区中。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述EWOD装置包括荧光测量装置，并且使用荧光强度曲线确定所述样品液滴的开启值。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中进行数字扩增包括通过检测相对于样品体积中包含的参比染料的荧光的荧光来进行归一化处理。

7.权利要求1-4中任一项的方法，其中进行数字扩增包括：

将稀释的样品液滴分成多个分区；

对多个分区进行扩增处理；

计算阳性分区的数量和阴性分区的数量；和

使用泊松统计来定量样品体积中种类的初始浓度。

8.权利要求7的方法，还包括添加比例因子以确保阳性分区的比例在0.01％-90％之间。

9.权利要求1-4中任一项的方法，还包括确定第一样品液滴的扩增处理的反应效率以计算稀释因子。

10.权利要求9的方法，其中确定反应效率包括以下步骤：

进行电润湿操作以从样品体积中提取另一个样品液滴；

对EWOD装置内的另一个样品液滴进行扩增；

测量另一个样品液滴的第二个开启值；

使用开启值和第二开启值确定反应效率；和

使用反应效率计算稀释因子，该反应效率用于将测量的样品液滴的开启值与靶标开启值进行比较。

11.权利要求1-4中任一项的方法，还包括：

将多个靶标输入体积输入到EWOD装置中，所述EWOD装置具有对应于样品体积中的多个相应靶标的相应引物；

进行电润湿操作以从对应于多个靶标输入体积中的每一个的样品体积中提取相应子样品液滴；

进行电润湿操作以根据稀释因子用相应靶标输入体积稀释子液滴，以形成多个相应稀释样品/靶标体积组合；和

对稀释样品/靶标体积组合进行扩增处理，以定量样品体积中种类的相应靶标的初始浓度。

12.权利要求11的方法，还包括：

将定量体积输入EWOD装置；

将第一样品液滴和定量液滴从定量体积分配到EWOD装置的区域中，并将所述液滴混合在一起以形成扩增液滴；

对扩增液滴进行扩增处理；

测量扩增液滴的开启值；

将测量的扩增液滴的开启值与靶标开启值进行比较；和

基于测量的扩增液滴的开启值与靶标开启值的比较来计算稀释因子。

13.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品体积含有核酸种类，所述EWOD装置包括多个热控制元件，并且对第一样品液滴进行的扩增处理和/或数字扩增是聚合酶链式反应(PCR)核酸扩增。

14.权利要求13的方法，其中所述开启值是所述样品液滴的阈值循环值(Ct)。

15.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品体积含有核酸种类，并且对第一样品液滴进行的核酸扩增和/或数字核酸扩增是等温核酸扩增。

16.权利要求15的方法，其中所述开启值是所述样品液滴的阳性检出时间值(Tp)。

17.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品体积含有蛋白质种类。

18.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品体积含有细胞种类。

19.权利要求1-4中任一项的方法，其中：

样品体积包括输入EWOD装置的多个样品体积，包括(靶标基因，靶标样品)体积、(参比基因，靶标样品)体积、(靶标基因，参比样品)体积和(参比基因，参比样品)体积，该方法还包括：

进行电润湿操作以从多个样品输入体积中的每一个中提取相应的子样品液滴；

对EWOD装置内的子样品液滴进行核酸扩增；

测量子样品液滴的ΔCt_{-靶标样品}和ΔCt_{-参比样品}；和

根据测量的ΔCt_{-靶标样品}和ΔCt_{-参比样品}计算稀释因子。

20.权利要求19的方法，还包括：

进行电润湿操作以从多个样品体积中的每一个中提取第二相应子样品液滴；

进行电润湿操作以根据稀释因子用稀释剂体积稀释第二子液滴，以形成多个相应的基因/样品组合；和

对基因/样品组合进行数字核酸扩增，以定量多个样品体积中相应的基因/样品组合的初始浓度。

21.一种微流体系统，包括：

介质上电润湿(EWOD)装置，包括配置成接收一个或多个液滴的元件阵列，该元件阵列包括多个单独的阵列元件；和

控制系统，配置成控制施加到元件阵列的致动电压，以进行对于液滴的操纵操作，以进行根据权利要求1-20中任一项的进行种类的数字定量的方法。

22.根据权利要求21的微流体系统，还包括：

多个热控制元件，位于沿着EWOD装置的不同空间位置，至少一个热控制元件的温度随时间变化；

其中，控制系统包括热控制单元，该热控制单元配置成控制多个热控制元件的温度，以产生位于沿着EWOD装置的不同空间位置的多个热区。

23.根据权利要求21-22中任一项的微流体系统，其中所述控制系统控制施加到所述元件阵列的所述致动电压以形成单独的区域，所述单独的区域包括用于制备第一样品液滴的样品制备区，对第一样品液滴进行扩增处理的第一扩增区，以及进行数字扩增的数字扩增区；

其中样品制备区、第一扩增区和数字扩增区在空间上对应于不同的热控制元件。

24.一种存储程序代码的非瞬时性计算机可读介质，所述程序代码由处理装置执行，用于控制施加到介质上电润湿(EWOD)装置的元件阵列的阵列元件上的致动电压，用于对元件阵列上的液滴进行液滴操作，所述程序代码可由处理装置执行以进行以下步骤：

将样品体积输入EWOD装置；

将稀释剂体积输入EWOD装置；

进行电润湿操作以从样品体积产生第一样品液滴；

对EWOD装置内的第一样品液滴进行扩增处理；

测量样品液滴的开启值；

将测量的样品液滴的开启值与用于数字定量的靶标开启值进行比较；

根据测量的样品液滴开启值与靶标开启值的比较计算稀释因子；

进行电润湿操作以从样品体积中提取第二样品液滴；

进行电润湿操作，以根据稀释因子用稀释剂体积稀释第二样品液滴，形成稀释的第二样品液滴；和

对稀释的第二样品液滴进行数字定量，以定量样品体积中种类的初始浓度。

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