CN111569958A - 通过使用ewod器件进行扩散的分子分离 - Google Patents

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Abstract

一种操作电介质上电润湿(EWOD)器件的方法执行微流体扩散分离。该方法包括以下步骤：将样品液滴输入到EWOD器件中，其中样品液滴包括颗粒的混合物，颗粒包括彼此不同的第一颗粒和第二颗粒；将收集液滴输入到EWOD器件中；执行电润湿操作以使样品液滴与收集液滴接触；在初始时间，启动颗粒分离工艺，通过该工艺将一部分样品液滴引入到收集液滴中，其中第一颗粒以不同于第二颗粒的速率移动穿过收集液滴；以及在从初始时间起的一段时间间隔之后，执行电润湿操作以从收集液滴中分割出离开液滴，其中离开液滴具有比在初始时间样品液滴中第一颗粒相对于第二颗粒的浓度高的第一颗粒相对于第二颗粒的浓度。

Description

通过使用EWOD器件进行扩散的分子分离
技术领域
本发明涉及液滴微流体器件，更具体地涉及有源矩阵电介质上电润湿(AM-EWOD)器件，以及涉及在使用EWOD器件进行蛋白质组学和基因组学分析中所使用的样品的处理和分离方法。
背景技术
电介质上电润湿(EWOD)是用于通过施加电场来操控流体的液滴的公知技术。有源矩阵EWOD(AM-EWOD)是指例如通过使用薄膜晶体管(TFT)，在包含晶体管的有源矩阵阵列中实现EWOD。因此，它是用于芯片实验室技术的数字微流控的候选技术。对该技术的基本原理的介绍可以在以下文献中找到：“Digital microfluidics：is a true lab-on-a-chippossible？”，R.B.Fair，Microfluid Nanofluid(2007)3：245-281。
图1是描绘示例性的基于EWOD的微流体系统的图。在图1的示例中，微流体系统包括读取器32和盒34。盒34可以包含微流体器件(例如AM-EWOD器件36)以及(未示出)常规的进入器件的流体输入端口和电连接。流体输入端口可以执行将流体输入到AM-EWOD器件36中并在器件内产生液滴的功能，例如通过由电润湿控制的从输入储液器进行分配。如以下进一步详细描述的，微流体器件包括被配置成接收输入的流体液滴的电极阵列。
微流体系统还可以包括控制系统，其被配置成控制施加到微流体器件的电极阵列的致动电压，以执行对流体液滴的操控操作。例如，读取器32可以包含被配置成控制电子器件38的这种控制系统和可以存储任何应用软件和与该系统相关联的任何数据的存储设备40。控制电子器件38可以包括被配置成执行与AM-EWOD器件36的控制有关的各种控制操作的合适的电路和/或处理设备，例如CPU、微控制器或微处理器。
在图1的示例中，提供了针对传感器液滴性质的外部传感器模块35。例如，可以将本领域中已知的光学传感器用作用于感测液滴性质的外部传感器，其可以被并入可以位于EWOD器件附近的探针中。合适的光学传感器包括相机设备、光传感器、电荷耦合器件(CCD)和类似的图像传感器等。附加地或备选地，传感器可以被配置成作为驱动电路的一部分被并入每个阵列元件中的内部传感器电路。这种传感器电路可以通过检测阵列元件处的电性质(例如阻抗或电容)来感测液滴性质。
图2是以透视图描绘示例性AM-EWOD器件36的附加细节的图。AM-EWOD器件36具有下部基板组件44，在下部基板组件44上设置有薄膜电子器件46。薄膜电子器件46被布置成驱动阵列元件电极48。多个阵列元件电极48被布置在电极或元件二维阵列50中，其具有N行乘M列的阵列元件，其中N和M可以是任何整数。可以包括任何极性液体并且通常可以是含水的液滴52被封装在由间隔物56分开的下部基板44和顶部基板54之间，但是应当理解，可以存在多个液滴52。
图3是描绘穿过图2的示例性AM-EWOD 36器件的一些阵列元件的横截面的图。在图3中所绘的AM-EWOD器件的一部分中，该器件包括以横截面示出的可以在图3的AM-EWOD器件36的电极或元件阵列50中使用的一对阵列元件电极48A和48B。AM-EWOD器件36还包含设置在通过间隔物56与上部基板54分开的下部基板44上的薄膜电子器件46。下部基板44的最上层(可以被认作薄膜电子器件层46的一部分)被图案化，使得实现多个阵列元件电极48(例如，图3中阵列元件电极的具体示例是48A和48B)。术语元件电极48可以在下文中被理解为指代与特定阵列元件相关联的物理电极结构48，以及也指代直接连接到该物理结构的电路的节点。在图3中示出了参考电极58，其设置在顶部基板54上，但是备选地，参考电极可以设置在下部基板44上，以实现平面内参考电极几何形状。术语参考电极58也可以在下文中被理解为指代物理电极结构和直接连接到该物理结构的电路的节点这两者或这两者中的任一个。
在AM-EWOD器件36中，可以使用非极性流体60(例如，油)来占据未被液滴52占据的体积。可以在下部基板44上设置绝缘体层62，其将导电元件电极48A和48B与第一疏水涂层64分开，液滴52以由θ表示的接触角66位于第一疏水涂层64上。疏水涂层由疏水材料(通常是但不必须是，含氟聚合物)形成。在顶部基板54上是第二疏水涂层68，液滴52可以与其接触。参考电极58插入在顶部基板54和第二疏水涂层68之间。
液滴的接触角θ如图3中所示的定义，由固液(γSL)、液气(γLG)和非离子流体(γSG)界面之间的表面张力分量的平衡来确定，并且在不施加电压的情况下满足杨氏定律，等式由下式给出：
Figure BDA0002382870740000031
在操作中，被称为EW驱动电压的电压(例如，图3中的VT、V0和V00)可以从外部施加到不同的电极(例如，分别施加到参考电极58、元件电极48A和48B)。由此有效建立的所得电力控制疏水涂层64的疏水性。通过布置将不同的EW驱动电压(例如，V0和V00)施加到不同的元件电极(例如，48A和48B)，可以将液滴52在两个基板之间的横向平面中从一个电极(48A)移动到另一个电极(48B)。
图4A示出了在存在液滴52的情况下的元件电极48和参考电极58之间的电负载70A的电路表示。通常可以将液滴52建模为并联的电阻器和电容器。通常地，液滴的电阻会相对较低(例如，如果液滴包含离子)，而液滴的电容会相对较高(例如，因为极性液体的相对介电常数相对较高，例如，如果液滴是含水的，则约为80)。在许多情况下，液滴电阻相对较小，使得在用于电润湿的感兴趣的频率下，液滴52可以有效地起电短路的作用。疏水涂层64和68具有可以被建模为电容器的电性质，并且绝缘体62也可以被建模为电容器。元件电极48和参考电极58之间的总阻抗可以由如下电容器来近似：该电容器的值通常由绝缘体62的贡献以及疏水涂层64和68的贡献起决定性作用，并且对于典型的层厚度和材料而言，该值可以是皮法(pico-Farad)量级的。
图4B示出了在不存在液滴的情况下的元件电极48和参考电极58之间的电负载70B的电路表示。在这种情况下，液滴组件由表示占据顶部基板和下部基板之间的空间的非极性流体60的电容的电容器替代。在这种情况下，元件电极48和参考电极58之间的总阻抗可以由如下电容器来近似：该电容器的值由非极性流体的电容起决定性作用并且通常很小，处于飞法(femto-Farad)量级。
为了驱动和感测阵列元件的目的，电负载70A/70B实际上总体起电容器的作用，其值取决于在给定元件电极48处是否存在液滴52。在存在液滴的情况下，电容相对较高(通常为皮法量级)，而如果不存在液滴，则电容较低(通常为飞法量级)。如果液滴部分地覆盖给定电极48，则电容可以近似地表示元件电极48被液滴52覆盖的程度。
US7,163,612(Sterling等人，2007年1月16日颁发)描述了可以如何通过使用与有源矩阵显示技术中采用的电路布置非常相似的电路布置来用基于TFT的薄膜电子器件控制电压脉冲到EWOD阵列的寻址。US7,163,612的方法可以被称为“有源矩阵电介质上电润湿”(AM-EWOD)。使用基于TFT的薄膜电子器件控制EWOD阵列有若干优点，即：
·电子驱动器电路可以集成到下部基板上。
·基于TFT的薄膜电子器件非常适合AM-EWOD应用。它们的生产便宜，因此可以以相对较低的成本生产相对较大的基板面积。
·与以标准CMOS工艺制造的晶体管相比，以标准工艺制造的TFT可以被设计成在高得多的电压下工作。这很重要，因为许多EWOD技术要求施加超过20V的电润湿电压。
图5是描绘图2的示例性AM-EWOD器件36中的薄膜电子器件46的示例性布置的图。薄膜电子器件46位于下部基板44上。元件阵列50的每个阵列元件51包含用于控制相应的元件电极48的电极电势的阵列元件电路72。也在薄膜电子器件46中实现集成的行驱动器74和列驱动器76电路，用于将控制信号提供给阵列元件电路72。阵列元件电路72还可以包含用于检测阵列元件的位置中存在或不存在液滴的传感器能力。还可以在薄膜电子器件中实现集成的传感器行寻址78和列检测电路80，用于寻址和读出每个阵列元件中的传感器电路。
还可以提供串行接口82，以处理串行输入数据流并且便于将所需电压编程到阵列50中的元件电极48。电压供应接口84提供相应的供应电压、顶部基板驱动电压和其他必要的电压输入，如本文进一步描述的。即使对于大阵列大小，也可以相对减少下部基板44与外部控制电子器件、电源和任何其他组件之间的连接线86的数量。可选地，串行数据输入可以部分并行化。例如，如果使用两条数据输入线，则在对列驱动器电路76进行微小修改的情况下，第一条数据输入线可以为列1至X/2提供数据，第二条数据输入线可以为列(1+X/2)至M提供数据。以此方式，增加了数据可以被编程到阵列的速率，这是液晶显示驱动电路中使用的标准技术。
图6是描绘存在于每个阵列元件51中的阵列元件电路72的示例性布置的图，其可以用作图5的薄膜电子器件的一部分。阵列元件电路72可以包含致动电路88，其具有输入ENABLE(使能)、DATA(数据)和ACTUATE(致动)以及连接到元件电极48的输出。阵列元件电路72还可以包含液滴感测电路90，其可以与元件电极48电连通。通常地，液滴感测电路90的读出可以由对于阵列的同一行中的元件可以是公共的一条或多条寻址线(例如，RW)控制，并且还可以具有对于阵列的同一列中的所有元件可以是公共的一个或多个输出(例如OUT)。
阵列元件电路72通常可以执行以下功能：
(i)通过向阵列元件电极提供电压来选择性地致动元件电极48。因此，存在于阵列元件51处的任何液滴可以通过电润湿效应被致动或解致动。
(ii)在阵列元件51的位置处感测液滴的存在或不存在。感测的方式可以是电容性或阻抗性的、光学的、热学的或以其他某种方式的。使用集成的阻抗传感器电路作为阵列元件电路的一部分，可以便利且有效地采用电容性或阻抗性感测。
已经描述了控制AM-EWOD器件以感测液滴并执行期望的液滴操控的各种方法。例如，US2017/0056887(Hadwen等人，2017年3月2日公开)描述了使用电容检测来感测试剂的动态性质，作为用于确定测定输出的方法。此公开结合了集成阻抗传感器电路，该集成阻抗传感器电路被具体地并入每个阵列元件的阵列元件电路中。因此，已经尝试将图6的集成阻抗感测电路90优化到阵列元件结构中，特别是作为阵列元件电路72的一部分。具有集成的致动和感测电路的AM-EWOD器件的示例在例如申请人的以下共同转让的专利文件中进行了描述：US8,653,832(Hadwen等人，2014年2月18日颁发)；US2018/0078934(Hadwen等人，2018年3月22日公开)；US2017/0076676(Hadwen，2017年3月16日公开)；以及US8,173,000(Hadwen等人，2012年5月8日颁发)。可以与包括任何合适的集成阻抗感测电路90的任何合适的阵列元件电路72结合采用在当前申请中描述的增强的操作方法。
在化学/生化反应领域，微流体扩散是用于根据生物颗粒的流体动力学半径来分离生物颗粒的公知技术(Weigl&Yager，Science，1999)。微流体扩散分离的常规实现在微通道中采用层流，由此，可混溶流体和颗粒的不同层可以在微通道中彼此相邻地流动，而没有除了通过扩散以外的任何混合。小颗粒扩散快于大颗粒，这允许按大小分离颗粒。US9,952,222(Yates等人，2018年4月24日颁发)描述了一种微流体器件，其中首先通过微流体扩散筛分大小来分离颗粒，然后再将它们收集进行分析。微流体扩散分离的应用包括对生物分子(例如DNA和蛋白质)的分析。
用于通过扩散执行分离的传统微流体器件通常依赖于提供两种液体的连续流动的流，这两种液体沿其流动的通道长度保持分离。一种流体包含感兴趣的材料，另一种流体通常是缓冲剂。在沿通道长度的任何给定点处，流体可以被认作相对于彼此是“静态的”，并且扩散跨流体之间的液-液界面发生。因此，需要足够体积的样品以维持通过微通道的连续流动，直到通过跨液-液界面的扩散已获得足够量的目标颗粒为止。
发明内容
由于执行微流体扩散分离的常规微流体系统采用如上所述的连续流体流动通道，因此尚未有效地开发使用EWOD或AM-EWOD器件执行微流体扩散分离。与AM-EWOD器件相比，常规微流体扩散分离系统体积大并且需要大量的样品和缓冲液才能完成足够的扩散分离。
本发明涉及操作EWOD或AM-EWOD器件执行基于液滴的微流体扩散筛分大小和分离方法的系统和方法。在示例性实施例中，操作EWOD/AM-EWOD器件的方法包括以下步骤：(a)使用EWOD器件形成包含样品的液滴和具有预定形状和体积的收集液滴；(b)通过由EWOD器件产生的电润湿力控制样品液滴和收集液滴，以使样品液滴和收集液滴接触并合并或形成液滴界面双层(DIB)；(c)通过由EWOD器件产生的电润湿力保持合并/DIB液滴，以使颗粒能够从样品液滴扩散到收集液滴中；以及(d)在经过扩散时段之后，通过从收集液滴中分解出子级分(sub-fraction)液滴而从收集液滴中分离出分割液滴。
收集液滴可以被进一步分离成多个液滴以分级扩散颗粒。另外，可以通过在样品液滴和收集液滴之间提供热梯度、电梯度或其他梯度来增强扩散。包含分离颗粒的所得液滴可以在EWOD器件上或在EWOD器件外进一步处理和分析。与采用层流体流动通道的常规配置相比，使用EWOD器件的电润湿工艺执行微流体扩散分离提供了使用较少缓冲剂和样品材料的更高效的过程。
因此，本发明的一个方面是一种操作电介质上电润湿(EWOD)器件执行微流体扩散分离方法的方法。在示例性实施例中，该方法包括以下步骤：将样品液滴输入到EWOD器件中，其中样品液滴包括颗粒的混合物，所述颗粒包括彼此不同的第一颗粒和第二颗粒；将收集液滴输入到EWOD器件中；执行电润湿操作以使样品液滴与收集液滴接触；在初始时间，启动颗粒分离工艺，通过该颗粒分离工艺将一部分样品液滴引入到收集液滴中，其中第一颗粒以不同于第二颗粒的速率移动穿过收集液滴；以及在从初始时间起的一段时间间隔之后，执行电润湿操作以从收集液滴中分割出离开液滴，其中离开液滴具有比在初始时间样品液滴中第一颗粒相对于第二颗粒的浓度高的第一颗粒相对于第二颗粒的浓度。该方法可以由执行存储在非暂时性计算机可读介质上的程序代码的AM-EWOD控制系统来执行。
执行电润湿操作以使样品液滴与收集液滴接触可以包括将样品液滴与收集液滴合并，并且分离工艺包括样品液滴扩散到收集液滴中。可以以最小化样品液滴和收集液滴的体扰动和对流混合的方式执行这种合并。备选地，执行电润湿操作以使样品液滴与收集液滴接触可以包括在样品液滴和收集液滴的界面处形成液滴界面双层(DIB)，并且分离工艺包括第一颗粒或第二颗粒跨DIB的选择性移动。分离工艺可以包括在收集液滴内或在样品液滴与收集液滴之间施加梯度(例如，电压梯度)，以增强颗粒分离。
参考以下描述和附图，本发明的这些和进一步的特征将变得显而易见。在说明书和附图中，已经详细公开了本发明的特定实施例，其指示可以采用本发明的原理的一些方式，但是应当理解，本发明的范围不被相应地限制。而是，本发明包括落入所附权利要求书的精神和术语内的所有改变，修改和等同物。关于一个实施例描述和/或示出的特征可以在一个或多个其他实施例中以相同的方式或以类似的方式使用，和/或与其他实施例的特征组合地或替代地使用。
附图说明
图1是描绘示例性的基于EWOD的微流体系统的图。
图2是以透视图描绘示例性AM-EWOD器件的图。
图3是描绘穿过图2的示例性AM-EWOD器件的一些阵列元件的横截面的图。
图4A是描绘当存在液滴时在元件电极处呈现的电负载的电路表示的图。
图4B是描绘当不存在液滴时在元件电极处呈现的电负载的电路表示的图。
图5是描绘图2的示例性AM-EWOD器件中的薄膜电子器件的示例性布置的图。
图6是描绘用于AM-EWOD器件的示例性阵列元件电路的图。
图7是描绘根据本发明的实施例的示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(d)的序列。
图8是描绘根据本发明的实施例的另一示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(c)的序列并且示出了嵌套分离处理。
图9是描绘根据本发明的实施例的另一示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(d)的序列并且使用被修改为在液滴上施加电压的AM-EWOD器件。
图10是描绘根据本发明的实施例的另一示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(d)的序列并且与荧光染料样品的分离结合。
图11是关于图10的步骤(d)的从收集液滴中划分出的分割液滴的荧光强度的图形表示。
图12是指示图11的图表中的各分割液滴的编号的图。
图13是描绘根据本发明的实施例的另一示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(d)的序列并且采用液滴界面双层。
具体实施方式
现在将参考附图描述本发明的实施例，其中相同的附图标记始终用于指代相同的元件。应当理解，附图不一定按比例绘制。
本发明涉及操作EWOD或AM-EWOD器件执行基于液滴的微流体扩散筛分大小和分离方法的系统和方法。在示例性实施例中，操作EWOD/AM-EWOD器件的方法包括以下步骤：(a)使用EWOD器件形成包含样品的液滴和具有预定形状和体积的收集液滴；(b)通过由EWOD器件产生的电润湿力控制样品液滴和收集液滴，以使样品液滴和收集液滴接触并合并或形成液滴界面双层(DIB)；(c)通过由EWOD器件产生的电润湿力保持合并/DIB液滴，以使颗粒能够从样品液滴扩散到收集液滴中；以及(d)在经过扩散时段之后，通过从收集液滴中分解出子级分液滴而从收集液滴中分离出分割液滴。收集液滴可以被进一步分离成多个液滴以分级扩散颗粒。另外，可以通过在样品液滴和收集液滴之间提供热梯度、电梯度或其他梯度来增强扩散。包含分离颗粒的所得液滴可以在AM-EWOD器件上或在AM-EWOD器件外进一步处理和分析。
再次参照图1，图1示出了功能上实施本发明的特征的整体微流体系统，控制电子器件38可以包括整体控制系统的一部分，其可以执行体现为存储在存储设备40内的控制应用的程序代码。对于计算机编程领域(特别是用于电子控制器件的应用编程领域)的普通技术人员来说，将显而易见的是如何对控制系统进行编程以操作和执行与存储的控制应用相关联的逻辑功能。因此，为了简洁起见，省略了关于特定编程代码的细节。存储设备40可以被配置为非暂时性计算机可读介质，例如，随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)或任何其他合适的介质。而且，尽管代码可以由根据示例性实施例的控制电子器件38执行，但是这样的控制系统功能也可以经由专用硬件、固件、软件或其组合来执行，而不脱离本发明的范围。
控制系统可以被配置成执行以下某些或所有功能：
·定义适当的定时信号以操控AM-EWOD器件36上的液滴。
·解释表示由与AM-EWOD器件36相关联的传感器或传感器电路测量的传感器信息的输入数据，包括计算AM-EWOD器件36上液滴的位置、大小、质心、周长和颗粒成分。
·使用计算出的传感器数据定义适当的定时信号，以操控AM-EWOD器件36上的液滴，即以反馈模式动作。
·提供图形用户界面(GUI)的实现，由此用户可以对命令进行编程，例如液滴操作(例如，移动液滴)、测定操作(例如，执行测定)，并且GUI可以将此类操作的结果报告给用户。
控制系统(例如，经由控制电子器件38)可以提供和控制施加到微流体器件36的电极阵列的致动电压，例如所需电压和定时信号，以执行液滴操控操作并且感测AM-EWOD器件36上的液滴。控制电子器件还可以执行应用软件，以产生和输出用于液滴感测和执行感测操作的控制电压。
可以使用关于图1至图6描述的结构和器件(例如，包括任何控制电子器件和电路、感测能力以及包括执行存储在非暂时性计算机可读介质上的计算机应用代码的任何处理设备的控制系统)来执行本文描述的与增强的微流体扩散分离有关的各种方法。下图示出了微流体扩散分离的各种方法，这些方法尤其可以由执行存储在非暂时性计算机可读介质上的程序代码的AM-EWOD器件控制系统来执行。
因此，本发明的一个方面是一种操作电介质上电润湿(EWOD)器件执行微流体扩散分离方法的方法。在示例性实施例中，该方法包括以下步骤：将样品液滴输入到EWOD器件中，其中样品液滴包括颗粒的混合物，所述颗粒包括彼此不同的第一颗粒和第二颗粒；将收集液滴输入到EWOD器件中；执行电润湿操作以使样品液滴与收集液滴接触；在初始时间，启动颗粒分离工艺，通过该颗粒分离工艺将一部分样品液滴引入到收集液滴中，其中第一颗粒以不同于第二颗粒的速率移动穿过收集液滴；以及在从初始时间起的一段时间间隔之后，执行电润湿操作以从收集液滴中分割出离开液滴，其中离开液滴具有比在初始时间样品液滴中第一颗粒相对于第二颗粒的浓度高的第一颗粒相对于第二颗粒的浓度。该方法可以由执行存储在非暂时性计算机可读介质上的程序代码的AM-EWOD控制系统来执行。
作为本发明原理的示例性实现，用于蛋白质组学或基因组学分析的样品的制备通常可以包括将感兴趣的样品与一种或多种将样品消化或部分消化成元素、碎片或颗粒的试剂初始混合。可以对这些颗粒进行进一步的下游分析，例如质谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、琼脂糖凝胶电泳分析、聚合酶链反应、等温核酸扩增、下一代测序或其他化学或生化分析。在进行下游分析之前，将碎片化的样品分离成离散的隔室通常可以得到改进的分析结果。本发明提供了基于有源矩阵-电介质上电润湿(AM-EWOD)技术的样品处理和制备器件，以执行这种样品制备。
在示例性实施例中，通常可以具有约40,000个独立可寻址元件的阵列的AM-EWOD器件被用来制备用于下游分析的样品。图7是描绘根据本发明的实施例的示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(d)的序列。因此，图7表示使用AM-EWOD器件选择性地分离和分隔颗粒混合物的工艺。
如图7的步骤(a)描绘的，在AM-EWOD器件内的第一位置处输入或以其他方式产生样品液滴2。样品液滴包含物种的混合物，该物种包括将被分离以在下游工艺中进一步分析的较小颗粒6和较大颗粒4。如本文所使用的，颗粒可以选自任何合适的或传统上已知的颗粒或珠；例如：乳胶珠、顺磁珠、胶体固体(例如，银、金)、细胞(原核或真核的)或诸如酶、核酸、抗体、蛋白质或其他此类可区分实体的生物物种，其可以被视为可从聚合物或混合物中分离的“离散”元素。通常地，可以在随后的反应方案或工艺中利用可以构成颗粒4或6的任何实体。在其中期望执行微流体扩散分离的典型示例中，混合物例如可以表示胰蛋白酶消化的蛋白质的碎片或部分碎片，或者混合物可以表示不同长度的核酸碎片。可以通过执行电润湿操作以从位于EWOD器件内的源液滴中制备样品液淌来实现输入样品液滴。例如，可以通过在EWOD器件内将源样品与试剂混合来制备样品液滴，该试剂将源样品消化成第一颗粒和第二颗粒。这种样品制备的非限制性示例包括蛋白质的蛋白酶消化、肽的肽酶消化或核酸的核酸酶消化。
图7的步骤(a)还描绘了在AM-EWOD器件内的第二位置处输入或以其他方式产生的收集液滴8。收集液滴8包含含水流体，物种4和6的混合物将被分离到该含水流体中。样品液滴2可以具有由AM-EWOD器件的电润湿力产生的大致矩形的轮廓，尽管也可以使用具有至少一个直边缘的其他形状。收集液滴8通常相对于也由AM-EWOD器件的电润湿力产生的样品液滴2是细长的，并且收集液滴8具有至少一个直边缘，用于与样品液滴2接触和合并而不引起各液滴内含物的搅动。收集液滴8的细长构造具有通过允许沿收集液滴8的长度从样品液滴2扩散而有利于分离的长宽比，并且还提供了当从收集液滴8中形成子液滴时便于分割的形状，如以下进一步详细描述的。
图7的步骤(b)描绘了样品液滴2与收集液滴8的接触，这是在AM-EWOD反应协议或脚本的控制下实现的。这样的反应协议或脚本通常包含一系列命令，这些命令将控制电子器件配置成选择性地致动AM-EWOD器件内的必需阵列元件，以控制器件阵列内液滴的移动。器件阵列内的每个阵列元件可以被选择性地致动，以允许目标液滴的受控移动。如步骤(b)所示，首先可以使样品液滴2和收集液滴8足够接近，使得每个液滴的各弯月液面接触但不融合。因此，包括颗粒4和6的物种混合物保留在样品液滴2内。
图7的步骤(c)描绘了一系列时间进程事件，其表示颗粒混合物从样品液滴2内扩散到收集液滴8中。在初始时间t0，通过AM-EWOD器件的操作，各液滴2和8被融合或合并以形成合并液滴9，使得不会在每个液滴内发生流体的块体移动。一旦形成合并液滴9，合并液滴9下方的AM-EWOD阵列元件仍然被致动以保持合并液滴9的形状并且减轻合并液滴9的可能漂移，否则可能引起合并液滴内的液体对流混合。换句话说，执行合并工艺以防止任何明显的对流混合。在合并的初始时间t0，颗粒4和6的混合物通常保留在样品液滴2的先前范围所占据的体积内。当合并液滴9保持位置和形状时，颗粒4和6发生从样品液滴2的先前范围到收集液滴8的先前范围中的扩散，但是由于颗粒大小(即，流体动力学半径)的差异而扩散速率有所不同。例如，时间t1表示颗粒最初分离到由收集液滴8先前占据的体积中。颗粒通过扩散过程移动，该扩散过程通常由菲克定律规定的布朗运动原理控制。按照这样的原理，与较大颗粒相比，较小颗粒倾向于通过扩散更快地迁移。因此，到时间t2，与较大颗粒4相比，更大比例的较小颗粒6已经朝向合并液滴9的远端迁移。特别地，朝向合并液滴9的与样品液滴2所处的位置相对的远端，基本上仅存在较小颗粒6。取决于应用，从初始时间t0到时间t2的示例性扩散时间间隔可以在五秒至十小时的范围内。
图7的步骤(d)描绘了采用电润湿力将离开液滴10从合并液滴9的远端分割或分离开的工艺步骤。由于不同的扩散迁移速率，离开液滴10仅主要包含从也包括颗粒6的原始混合物中分离出来的颗粒4，并且离开液滴10可以被转移到进一步的下游工艺中进行分析。在利用上述工艺的一个示例中，可以将离开液滴10用作供后续的分离工艺使用的另一样品液滴2，以增强颗粒分离。因此，可以适当地以迭代方式重复图7中概述的步骤，其中一个或多个离开液滴10成为样品液滴2，以进行颗粒4和6的进一步分离。
图8是描绘根据本发明的实施例的另一示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(c)的序列。图8的示例采用了与图7相当的电润湿操作，但是采用了离开液滴的备选形成。在该实施例中，图8的步骤(a)描绘了从图7的合并液滴9内的某位置处而非从图7的步骤(d)中所绘的远端分割出离开液滴12的工艺。AM-EWOD器件可以根据特定的反应协议或脚本进行操作，以将离开液滴从沿合并液滴的长度的任何位置分离。当离开液滴12从合并液滴中分离时，与如图7中所示的从合并液滴的远端分离离开液滴10相比，这种离开液滴12可以包含更多样化的颗粒种群。然而，与获取图7的离开液滴10所需的时间相比，获取图8的离开液滴12所需的时间可以大大减少。
然后，离开液滴12可以被用作供进一步分离处理使用的样品液滴。图8的步骤(b)描绘了第一嵌套分离工艺，其中将在步骤(a)处分离的离开液滴12用作二次分离工艺的样品液滴14，其可以与如先前所述的比较地进行。图8的步骤(c)描绘了进一步的嵌套操作，其中，在步骤(b)的二次分离工艺中样品液滴14和收集液滴8合并之后，获取了样品液滴16，并且允许从样品液滴16到收集液滴8中的进一步扩散。如所描绘的，样品液滴16与初始样品液滴2相比可以包含明显更少的颗粒，但是由于连续嵌套的分离步骤的数量增加，通常期望这些颗粒具有更均匀的大小，其中在有限的时间间隔之后(例如，在图7中的时间t1)，从合并液滴中去除离开液滴，而不是等待直到更完全的分离时间(例如，图7中的时间t2)。
以这种方式，可以执行诸如图8中所描绘的多个嵌套分离操作，以达到与等待如图7中所示的更完全的分离可比较的结果。与图7所描绘的单一过程相比，图8的这种嵌套过程最终可以在固定的时间段内导致更有效和/或更高效的分离，其中允许混合物沿合并液滴9的长度完全地扩散。
先前的实施例说明了“被动”微流体扩散分离工艺，其中分离仅通过扩散发生。在另一实施例中，AM-EWOD器件的顶板在位于顶板的外表面上的一对电极(-和+)下方的介电绝缘层内设置有孔，电压可以通过这些孔被传递至下方的液滴并且桥接各电极，以实现悬浮在这种液滴内的物种的电泳或介电电泳(DEP)分离。根据这样的原理，图9是描绘根据本发明的实施例的另一示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(d)的序列并且使用被修改为在液滴上施加电压以增强分离工艺的AM-EWOD器件。
如关于图7描述的，首先比较地进行图9的工艺。在图9的步骤(a)中，在AM-EWOD器件内的其各自的位置处输入或以其他方式产生样品液滴2和收集液滴8。图9的步骤(b)同样描绘了样品液滴2与收集液滴8的接触，这是在AM-EWOD反应协议或脚本的控制下实现的。图9的步骤(c)描绘了一系列时间进程事件，其表示颗粒混合物从样品液滴2内移动到收集液滴8中。在初始时间t0，与上述类似地，各液滴2和8通过AM-EWOD器件的操作被融合或合并以形成合并液滴9，使得不会在每个液滴内发生流体的块体移动，并且防止了对流混合。在合并的初始时间t0，颗粒4和6的混合物通常保留在样品液滴2的先前范围所占据的体积内。
在图9的示例中，AM-EWOD器件还被配置成在合并液滴9上施加电压，以通过电泳或DEP实现适当的元素分离。在形成合并液滴9之后，在时间t0，如图9的步骤(c)描绘的，在电极18和20之间施加电压。在该示例中，电极18是负电极，电极20是正电极，但是极性可以变化。通过电泳或DEP工艺，在时间t1，在所施加电压的影响下，颗粒基本上根据大小(或质量/电荷密度)从初始样品液滴中被分离。不同于关于图7和图8描述的其中依靠扩散来实现合并液滴内的颗粒分离的被动实施例，图9采用借助所施加电压的“主动”颗粒分离，其在合并液滴9内分别产生大致均一的颗粒4和6种群的离散带22和24。在图9的步骤(d)处，带22和24被从合并液滴9中分割或分离成离散的离开液滴26和28。离开液滴26和28可以经受进一步的分离工艺，以相对于颗粒子集改善基本的纯度或均匀性，或者可以将离开液滴26和/或28适当地引导至下游分析。
因此，在图9的主动分离工艺中，合并液滴9可以位于一对电极18和20的下方，对所述一对电极18和20施加电压以相对于仅采用扩散的被动分离工艺加速使物种从样品液滴2分离到收集液滴8中。尽管在该示例中使用电梯度来增强分离，但是可以采用可能适合于任何特定应用的诸如热梯度之类的其他梯度。如图9的步骤(d)描绘的，可以从合并液滴9中分割出离开液滴26和28。AM-EWOD器件可以由脚本配置成将离开液滴从沿合并液滴9的长度的任何位置分离。不同于传统的微流体器件，AM-EWOD的实现在液滴操控方面提供了更大的灵活性。可以开发脚本以在沿合并液滴的长度的任何位置处实现液滴的分离。通过这种灵活性，一旦去除了离开液滴26和28，样品液滴2和收集液滴8的剩余部分可以重新结合，使得可以与关于图7和图8所描述的类似地继续通过扩散进行分离，或者可以重复图9的主动分离工艺。
在本发明的另一方面，可以执行如参考图7或图8描述的通过扩散的初始分离。此后，可以将离开液滴与新的收集液滴8合并，然后将合并液滴暴露于施加的电势或其他梯度下，以进一步分离悬浮在合并液滴内的颗粒，如参考图9描述的。在又一实施例中，可以先进行通过电泳的初始分离，然后再进行通过扩散的分离。因此，一般而言，关于图7、图8和图9描述的工艺可以以可能适合于任何特定应用的任何顺序组合和执行。
图10是描绘根据本发明的实施例的另一示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(d)的序列并且与荧光染料样品的分离结合。在图10的步骤(a)中，在AM-EWOD器件阵列上的多个位置处将包括荧光染料的两个样品液滴100和102输入到器件阵列中。还在分别与样品液滴100和102相邻的位置处将包含缓冲剂的两个细长收集液滴104和106输入到器件阵列中。在为了示出AM-EWOD器件使用情况的该示例中，在初始时间t＝0时，通过选择性阵列元件致动将样品液滴之一与各收集液滴合并(在该示例中，样品液滴102与收集液滴106合并)，以允许这些液滴合并而不引起样品液滴内染料的块体搅动。进一步地，在该示例中，另一对样品液滴100和收集液滴104没有合并，以证明染料没有通过液滴在其中被围绕的填充流体扩散到收集液滴中。在该荧光染料的示例中，填充流体可以是油，例如十二烷。
图10的步骤(b)描绘了在第一时间间隔(在该示例中为2.5小时)之后染料从样品液滴102扩散到收集液滴106内的缓冲剂中的过程。再次地，因为样品液滴100和收集液滴104没有合并，所以没有染料从样品液滴100扩散到收集液滴104中。图10的步骤(c)描绘了在自样品液滴102和收集液滴106合并起的第二时间间隔(在该示例中为5.5小时)之后染料通过沿收集液滴106的长度扩散的进一步分布。从对应步骤(c)的图像中可以看出，随着染料继续与染料在其中扩散的缓冲剂混合，染料在扩散前缘(图中的右手端)处的强度更加扩散。
一旦足够量的染料已扩散到收集液滴106中，就可以通过AM-EWOD器件的操作将收集液滴104和106分成单独的或分割的液滴。因此，图10的步骤(d)描绘了在器件阵列元件的选择性致动的控制下将收集液滴104分割成一系列离散的圆形分割液滴105以及将收集液滴106分割成一系列离散的圆形分割液滴107之后的AM-EWOD器件阵列。如上所述，没有来自样品液滴100的染料扩散到收集液滴104中，因为这种液滴初始没有合并，这是通过任何分割液滴105中都没有荧光来描绘的。因此，从收集液滴104中划分出的分割液滴105不包含任何染料。由于穿过收集液滴106的扩散的进行，从最接近样品液滴102的收集液滴106中划分出的第一分割液滴和第二分割液滴107与样品液滴102相比具有近似均匀的荧光强度。相反，距离样品液滴102较远的第四分割液滴和第五分割液滴107显示出越来越低的荧光强度。在经过步骤(d)的时间的扩散分离的时间帧期间，没有可辨别的荧光染料在收集液滴106的全长度上行进，因此第六到最后的分割液滴107也不包含任何可辨别的染料。
图11是如以上关于图10的步骤(d)描述的从收集液滴104和106中分离或划分出的各分割液滴105和107的荧光强度的图形表示。图12是指示图11的图表中的各分割液滴的编号的图。在该示例中，荧光强度被确定为每个相应液滴的集成荧光。带实心填充的附图标记“Bkg”表示对应样品液滴100和收集液滴104的背景控制，它们没有合并，因此没有发生扩散。没有填充的附图标记“Diff”表示对应样品液滴102和收集液滴106的微流体扩散分离工艺，它们被合并，因此发生了扩散。图11中的虚线表示系统的默认背景荧光的程度。
在图11中，液滴编号1表示对应图10的步骤(d)的时间处的样品液滴100(Bkg)和102(Diff)。此时，针对样品液滴100(Bkg)测量的荧光强度信号大于针对样品液滴102(Diff)测量的荧光强度信号。荧光强度信号的这种差异是由于没有染料材料从Bkg样品液滴100中扩散出来。样品液滴100(液滴1Bkg)的荧光强度信号因此是未稀释样品液滴的主要荧光。由于染料扩散到收集液滴106中(并因此稀释)，因此Diff样品液滴102的荧光强度信号从未稀释的荧光强度开始降低。
Bkg液滴系列105的液滴2-11的荧光强度在每个液滴中基本相同并且对应系统的默认背景荧光(虚线)，表明在样品液滴100与收集液滴104之间跨样品液滴-填充流体-收集液滴的界面没有可辨别的染料扩散。由于从样品液滴102到收集液滴106中的扩散，Diff液滴系列107的液滴2-5的荧光强度指示与Bkg液滴系列相比的荧光强度差。Diff液滴5的荧光强度差很小，但仍可区分，并且Diff分割液滴107距离样品液滴102越近，Diff荧光强度就越大。对于Bkg和Diff系列两者而言，液滴6-11的荧光强度均无明显差异并且对应在该示例中所使用的实验条件下的背景荧光，因为没有足够的时间来使染料发生远离样品液滴102的任何可辨别的扩散。图10-12中的数据证明了使用AM-EWOD器件控制，可以通过选择性地致动阵列元件来用AM-EWOD技术控制和监测染料从样品液滴到收集液滴中的扩散。
图13是描绘根据本发明的实施例的另一示例性微流体扩散分离方法的图，其被图示为步骤(a)至(d)的序列并且采用液滴界面双层。在图13的示例中，类似于先前的实施例，样品液滴2包括较大颗粒4和较小颗粒6的混合物，如步骤(a)所示。在图13的步骤(b)中，通过选择性地致动AM-EWOD器件的元件，使样品液滴与收集液滴8接触。在该示例中，使样品液滴和收集液滴彼此足够靠近，使得液滴界面接触，从而形成液滴界面双层(DIB)11。在采用形成DIB的该示例中，将两个液滴聚集在一起，使得他们仍然是接触的，但没有实际合并。通过在系统中适当选择可并入液滴或填充流体的表面活性剂，脂质双层可以在样品液滴和收集液滴的界面处形成DIB。DIB在EWOD应用中有多种用途，例如包括形成用于膜片钳感测的结构(例如，如在文献Martel and Cross，Biomicrofluidics，6，012813(2012)中描述的)或当将纳米孔插入到DIB中时用于DNA测序的结构(例如，如在文献GB1721649.0中描述的)。
因此，不同于以上关于图7所述的实施例，在图13的实施例中，样品液滴和收集液滴不合并，而是与在液滴界面处形成的DIB保持离散。因此，由于DIB被形成为包含控制某些物种或颗粒基于颗粒大小(流体动力学半径)和/或其他颗粒性质通过DIB的孔或离子通道，因而基于DIB的性质，通过透析或选择性分离的工艺将样品液滴2内的颗粒混合物分离到收集液滴8中。不同于图7的实施例，只要某些颗粒种群无法通过DIB，图13的样品液滴2内的所有颗粒种群将不会进入到收集液滴8中。
如图13的步骤(c)描绘的，在初始时间t0，如上所述，在样品液滴2和收集液滴8的界面处形成DIB 11。在随后的时间t1，选定颗粒种群(在此示例中为较小颗粒6)已跨DIB 11迁移到收集液滴8中，并且未选定颗粒种群(在此示例中为较大颗粒4)通常不通过DIB 11。选定颗粒种群6可以通过随时间扩散而进一步分散到整个收集液滴8中，并且在另外的时间t2之后，可以将离开液滴10从收集液滴8中分割或分离，以用于可与先前实施例比较的下游处理。
如以上关于图8和图9的实施例描述的工艺特征也可以与采用DIB的图13的实施例组合地应用。例如，可以修改跨DIB的颗粒混合物的分离，使得在初始分离之后，可以在不破坏DIB的情况下在沿收集液滴的任何位置处将离开液滴从收集液滴内隔离。此外，通过穿过收集液滴或在DIB上施加电压或其他梯度，可以增强或以其他方式修改选定颗粒种群跨DIB的转移。另外，可以利用改变各液滴内溶液的组成来引起透析或渗透，以选择性地在收集液滴内分隔样品颗粒的混合物。
在图7至图13中描绘的每个前述微流体扩散分离方法中，利用了诸如图1至图6中所描绘的AM-EWOD器件的有益性质，以达成AM-EWOD器件的元件阵列内的选择性液滴分配和空间液滴操控。在使用中，二维阵列元件阵列(x，y)限定了可以在其中执行液滴操控操作的区域。本发明的系统和工艺可以在任何(x，y)维大小的AM-EWOD元件阵列内实现。二维大小确定了可以在器件内控制的流体的相应体积。元件阵列内的每个阵列元件可以与唯一的参考数据项相关联，以用于跟踪给定阵列元件处的液滴操作。根据其中正在利用液滴的工艺或反应方案，电子器件控制器或处理器可以使用这种数据来允许一个或多个液滴在AM-EWOD器件的元件阵列上从第一位置选择性地移动到第二位置。
通常地，处理器被配置成遵循体现为存储在非暂时性计算机可读介质上的程序代码的反应协议或脚本，例如关于图1描述的。根据反应协议，处理器生成控制信号，用于将选择性致动电压施加到AM-EWOD器件的阵列元件，以产生电润湿力来执行所需的液滴操控操作。反应协议可以包含一系列的一个或多个液滴操控操作，这些操作可以依次或同时执行，以根据反应协议达成期望的结果。液滴操控操作可以例如包括从初始储液器分配液滴以及根据需要移动选定液滴以执行以上关于各种实施例描述的各种液滴合并、DIB形成和离开液滴分割操作。
本发明方法的优点的示例包括以下：与常规构造相比，样品液滴和收集液滴的对流混合被最小化以提供增强的颗粒分离。结果，需要的试剂更少，并且可以使用非常小的液体体积执行微流体扩散分离，这降低了成本和反应协议的复杂性。AM-EWOD器件易于形成和保持细长的收集液滴，这允许包含所需颗粒的液滴的有效扩散和隔离。使用AM-EWOD实现还允许在同一器件上进行样品预处理和下游产品处理，因为可以通过选择性地致动阵列元件执行必要的液滴操控操作而在AM-EWOD器件的单独区域中进行预处理、颗粒分离和下游处理。
以下表示本发明实施例的用途的非限制性示例。
蛋白质流体动力学半径的确定
在AM-EWOD器件内执行通过扩散到缓冲剂中而确定蛋白质混合物的流体动力学半径。如关于图7描述的，在AM-EWOD器件内制备包含不同浓度的感兴趣的蛋白质的样品液滴。首先，将单体蛋白质的储备溶液分配到AM-EWOD器件中。从该储备液滴中，再分配若干液滴，每个液滴被混合到限定体积的缓冲剂中，以产生浓度系列。还从已输入到AM-EWOD器件的缓冲剂储备液滴中分配包含缓冲剂的细长收集液滴。使每个相应样品液滴与收集液滴接触。在初始时间t0，在每对液滴之间的界面处执行对AM-EWOD器件的阵列元件的致动以引起合并，而没有各液滴的搅动或对流混合。在时间t1，在沿收集液滴的长度的不同位置距离处分割和分离液滴，例如如图12描绘的。然后，将每个分割液滴与荧光染料组合以标记每个相应液滴中存在的任何蛋白质分子，并且确定每个液滴的荧光强度，如以上结合图10至图12描述的。然后，使用每个相应液滴的相对荧光强度来确定在定义的时间间隔内沿各收集液滴所行进的距离。
可以用不同分子质量的不同蛋白质重复该实验，并且通过在将各分割液滴与染料混合之后测量荧光强度而确定的每种蛋白质每单位时间的行进距离与相对分子质量相关。每单位时间的扩散距离用于确定每种相应蛋白质的流体动力学半径。
跨液滴界面双层的传输
进行对水相元素在悬浮于非水载体介质中的液滴之间的传输的考察。将油滴中的磷脂稳定水分配到AM-EWOD器件内。通过在AM-EWOD器件内将单独的液滴聚集在一起而将这种液滴用于产生液滴界面双层(DIB)。DIB用于研究溶质跨双层膜的扩散，以及研究通过形成于DIB中的孔或离子通道的主动传输。
在第一实验中，考察了荧光素或钙黄绿素通过双层的扩散。在中性pH的条件下，钙黄绿素(一种荧光素的衍生物)通常比荧光素极性更大。先前的考察证明了与极性较高的分子相比，脂质双层对极性较低的分子的选择性渗透性(Scientific Reports第5卷，文章编号：9951(2015))。因此，荧光素可以更容易地扩散穿过双层，而钙黄绿素则不能。在AM-EWOD器件内分配了三个液滴种群。第一种群包含缓冲剂，第二种群包含100μM浓度的荧光素，第三种群包含100μM浓度的钙黄绿素。在AM-EWOD器件的控制下，使包含缓冲剂的液滴分别与包含荧光素或钙黄绿素的液滴接触。
在时间t0、t1(30分钟)和t2(60分钟)，确定荧光强度，激发波长为494nm，发射波长为515nm。确定的是：在30分钟后，当在包含荧光素的液滴与包含缓冲剂的液滴之间形成DIB时，可以从包含缓冲剂的液滴中检测出荧光；在60分钟后，荧光强度增加，因为更多荧光素跨双层扩散到缓冲剂中。但是，即使在60分钟后，也没有能够从与包含钙黄绿素的液滴一起形成DIB的包含缓冲剂的液滴中检测到荧光。
在第二实验中，将两个液滴种群分配到AM-EWOD器件中。液滴种群之一包括α溶血素、单链核酸(ssDNA)和双链核酸(dsDNA)的混合物。另一液滴种群仅包括缓冲剂。使液滴在AM-EWOD器件内紧密接触，从而在它们之间形成液滴界面双层。当包括α溶血素、ssDNA和dsDNA的液滴与包括缓冲剂的液滴接触时，α溶血素选择性地跨脂质双层插入，在液滴之间提供孔。ssDNA穿过孔进入包含缓冲剂的液滴中，而dsDNA则阻塞孔。通过以下来执行分析：分离液滴，然后作为穿过插入到双层中的α溶血素孔进行传输的结果，确定液滴是包括ssDNA和dsDNA的混合物还是仅包括ssDNA。例如，使用诸如Promega UK的
Figure BDA0002382870740000221
dsDNA和ssDNA之类的测定程序来评估液滴。备选地，可以测量当将电压施加到作为DIB保持在一起的液滴上时流过的电流。在这种情况下，当ssDNA通过α溶血素孔时，流过膜的电流会发生变化。
结果表明，在AM-EWOD器件内成功地形成了双层脂质膜——首先，如通过荧光素而不是钙黄绿素跨双层的选择性扩散所证明；其次，通过成功地将α溶血素插入到双层中，随后ssDNA从一个液滴传输到另一个液滴证明。
扩散免疫测定
在AM-EWOD器件内，通过将分别包含缓慢扩散抗体和快速扩散抗原的液滴聚集在一起而执行扩散免疫测定。抗原被制备为与荧光标记的结合物，以允许监测跨液滴宽度的相对荧光强度。每个物种的储备溶液的液滴被首先分配到AM-EWOD器件中。然后从储备液滴中分配每种元素的更多液滴，其中每个液滴与各自的缓冲剂液滴混合，以分别产生相对于抗体或标记抗原的浓度不同的一系列液滴。
使抗体和抗原的每个相应稀释液的液滴在AM-EWOD器件内接触，在初始时间t0，每对相应液滴的连接处的阵列元件被解致动以及重新致动，以使液滴在无块体搅动情况下融合。在时间t1，将每个组合液滴分割，并且确定距组合液滴中心线的离散距离处的荧光程度。与预期抗体扩散到包含标记抗原的液滴中相比，预期扩散更快的标记抗原会更进一步地迁移到包含抗体的液滴中。各液滴的分析表明了作为距液滴中心线距离的函数的相对荧光强度分布。
在进一步的实验中，将标记抗原与包含未标记抗原的样品混合，以产生具有固定量的标记抗原以及带有未标记抗原的一系列稀释液的一系列液滴，并且重复上述步骤。在这种上下文中，发生了抗体绑定到标记抗原或未标记抗原的竞争。由于标记抗原与未标记抗原之间的这种绑定竞争，标记抗原和未标记抗原各自迁移到抗体中的速率揭示了每单位距离的不同荧光强度分布。基于记录的荧光强度分布，可以为目标抗原开发校准模型。
随后使用扩散免疫测定来分析临床样品。制备与测定的目标相对应的标记抗原，并且制备一系列稀释液，其包括带有感兴趣的临床样品的一系列稀释液的固定浓度的标记抗原。在AM-EWOD器件内，分配抗体液滴和临床样品/标记抗原并使其接触。在初始时间t0，合并液滴而不会引起内含物的搅动，并且启动抗原到抗体中的扩散。在时间t1，确定跨液滴宽度的相对荧光强度。将荧光强度分布与特定抗原的校准模型进行比较，从中确定目标抗原的浓度或量。
因此，本发明的一个方面是一种操作电介质上电润湿(EWOD)器件执行微流体扩散分离方法的方法。在示例性实施例中，该方法包括以下步骤：将样品液滴输入到EWOD器件中，其中样品液滴包括颗粒的混合物，所述颗粒包括彼此不同的第一颗粒和第二颗粒；将收集液滴输入到EWOD器件中；执行电润湿操作以使样品液滴与收集液滴接触；在初始时间，启动颗粒分离工艺，通过该颗粒分离工艺将一部分样品液滴引入到收集液滴中，其中第一颗粒以不同于第二颗粒的速率移动穿过收集液滴；以及在从初始时间起的一段时间间隔之后，执行电润湿操作以从收集液滴中分割出离开液滴，其中离开液滴具有比在初始时间样品液滴中第一颗粒相对于第二颗粒的浓度高的第一颗粒相对于第二颗粒的浓度。该方法可以单独地或组合地包括一个或多个以下特征。
在该方法的示例性实施例中，执行电润湿操作以使样品液滴与收集液滴接触包括将样品液滴与收集液滴合并，并且分离工艺包括样品液滴的第一颗粒和第二颗粒扩散到收集液滴中。
在该方法的示例性实施例中，将样品液滴与收集液滴合并的电润湿操作最小化样品液滴和收集液滴的体扰动和对流混合。
在该方法的示例性实施例中，执行电润湿操作以使样品液滴与收集液滴接触包括在样品液滴和收集液滴的界面处形成液滴界面双层(DIB)，并且分离工艺包括第一颗粒或第二颗粒跨DIB的选择性移动。
在该方法的示例性实施例中，分离工艺包括在收集液滴内或在样品液滴与收集液滴之间施加梯度。
在该方法的示例性实施例中，梯度是由位于EWOD器件内的电极形成的电压梯度。
在该方法的示例性实施例中，分离工艺包括电泳和/或介电电泳。
在该方法的示例性实施例中，该方法进一步包括执行电润湿操作，以将离开液滴转移到EWOD器件上的另一位置以进行下游处理。
在该方法的示例性实施例中，时间间隔在五秒至十小时的范围内。
在该方法的示例性实施例中，输入样品液滴包括执行电润湿操作以从EWOD器件内的源液滴中制备样品液滴。
在该方法的示例性实施例中，制备样品液滴包括在EWOD器件内将源样品与试剂混合，并且试剂将源样品消化成第一颗粒和第二颗粒。
在该方法的示例性实施例中，制备样品液滴包括蛋白质的蛋白酶消化、肽的肽酶消化或核酸的核酸酶消化。
在该方法的示例性实施例中，第一颗粒和/或第二颗粒包括蛋白质或核酸。
在该方法的示例性实施例中，样品液滴包括荧光染料，并且该方法还包括测量离开液滴的荧光强度。
在该方法的示例性实施例中，在根据任何实施例执行的后续分离工艺中，将离开液滴用作样品液滴。
在该方法的示例性实施例中，顺序地重复分离工艺，并且每个随后分离的离开液滴变成用于下一后续分离工艺的样品液滴。
本发明的另一方面是一种微流体系统，其包括电介质上电润湿(EWOD)器件，该器件包括：配置成接收液滴的元件阵列，该元件阵列包括多个单独的阵列元件；以及控制系统，其被配置成通过控制施加到元件阵列的致动电压来执行电润湿操作，以对存在于元件阵列上的液滴执行操控操作，由此所述控制系统被配置成执行根据任一实施例的方法。本发明的另一方面是一种非暂时性计算机可读介质，其存储由用于控制施加到电介质上电润湿(EWOD)器件的元件阵列的阵列元件的致动电压的处理设备执行的程序代码，该程序代码可由处理设备执行以执行根据任一实施例的方法。
尽管已经关于一个或多个特定实施例示出和描述了本发明，但是本领域的其他技术人员在阅读和理解本说明书和附图的基础上可以想到等效的变更和修改。特别地，关于由上述元件(部件、组件、器件、组合物等)执行的各种功能，除非另有说明，否则用于描述此类元件的术语(包括对“装置”的引用)旨在对应执行所描述元件的指定功能(即，功能上等效)的任何元件，即使不是在结构上等同于执行本文所述的本发明的一个或多个示例性实施例中的功能的公开结构。另外，尽管以上可能已仅针对若干实施例中的一个或多个描述了本发明的特定特征，但是对于任何给定或特定应用可能是期望的和有利的是，这种特征可以与其他实施例的一个或多个其他特征组合。
工业实用性
所描述的实施例可以用于提供增强的AM-EWOD器件。AM-EWOD器件可以形成芯片实验室系统的一部分。这样的器件可以用于生化或生理材料的光学检测，例如用于细胞检测和细胞计数。应用包括医疗保健诊断测试、材料测试、化学或生化材料合成、蛋白质组学、生命科学和法医学研究的工具。
附图标记清单：
2-样品液滴，
4-较大颗粒，
6-较小颗粒，
8-收集液滴，
9-合并液滴，
10-离开液滴，
12-备用离开液滴，
14-二次处理样品液滴，
16-另一样品液滴，
18-第一电极，
20-第二电极，
22-第一颗粒的离散带，
24-第二颗粒的离散带，
26-第一离开液滴，
28-第二离开液滴，
32-读取器，
34-盒，
35-外部传感器模块，
36-AM-EWOD器件，
38-控制电子器件，
40-存储设备，
44-下部基板组件，
46-薄膜电子器件，
48-阵列元件电极，
48A-阵列元件电极，
48B-阵列元件电极，
50-二维元件阵列，
51-阵列元件，
52-液滴，
54-顶部基板，
56-间隔物，
58-参考电极，
60-非极性流体，
62-绝缘体层，
64-第一疏水涂层，
66-接触角，
68-第二疏水涂层，
70A-有液滴存在的电负载，
70B-无液滴存在的电负载，
72-阵列元件电路，
74-集成行驱动器，
76-列驱动器，
78-集成传感器行寻址，
80-列检测电路，
82-串行接口，
84-电压供应接口，
86-连接线，
88-致动电路，
90-液滴感测电路，
100-样品液滴，
102-样品液滴，
104-细长收集液滴，
105-圆形分割液滴，
106-细长收集液滴，
107-离散的圆形分割液滴。

Claims (20)

1.一种操作电介质上电润湿EWOD器件的方法，包括以下步骤：
将样品液滴输入到所述EWOD器件中，其中所述样品液滴包括颗粒的混合物，所述颗粒包括彼此不同的第一颗粒和第二颗粒；
将收集液滴输入到所述EWOD器件中；
执行电润湿操作以使所述样品液滴与所述收集液滴接触；
在初始时间，启动颗粒分离工艺，通过该工艺将一部分所述样品液滴引入到所述收集液滴中，其中所述第一颗粒以不同于所述第二颗粒的速率移动穿过所述收集液滴；以及
在从所述初始时间起的一段时间间隔之后，执行电润湿操作以从所述收集液滴中分割出离开液滴，其中所述离开液滴具有比在所述初始时间所述样品液滴中所述第一颗粒相对于所述第二颗粒的浓度高的所述第一颗粒相对于所述第二颗粒的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中执行电润湿操作以使所述样品液滴与所述收集液滴接触包括将所述样品液滴与所述收集液滴合并，并且所述分离工艺包括所述样品液滴的所述第一颗粒和所述第二颗粒扩散到所述收集液滴中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中将所述样品液滴与所述收集液滴合并的所述电润湿操作最小化所述样品液滴和所述收集液滴的体扰动和对流混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中执行电润湿操作以使所述样品液滴与所述收集液滴接触包括在所述样品液滴和所述收集液滴的界面处形成液滴界面双层(DIB)，并且所述分离工艺包括所述第一颗粒或所述第二颗粒跨DIB的选择性移动。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述分离工艺包括在所述收集液滴内或在所述样品液滴与所述收集液滴之间施加梯度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述梯度是由位于所述EWOD器件内的电极形成的电压梯度。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述分离工艺包括电泳和/或介电电泳。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，进一步包括执行电润湿操作以将所述离开液滴转移到所述EWOD器件上的另一位置，以进行下游处理。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述时间间隔在五秒至十小时的范围内。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中输入所述样品液滴包括执行电润湿操作以从所述EWOD器件内的源液滴制备所述样品液滴。
11.根据权利要求10所述的方法，其中制备所述样品液滴包括在所述EWOD器件内将源样品与试剂混合，并且所述试剂将所述源样品消化成所述第一颗粒和所述第二颗粒。
12.根据权利要求11所述的方法，其中制备所述样品液滴包括蛋白质的蛋白酶消化、肽的肽酶消化或核酸的核酸酶消化。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一颗粒和/或所述第二颗粒包括蛋白质或核酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述样品液滴包括荧光染料，并且所述方法还包括测量所述离开液滴的荧光强度。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在根据权利要求1-14中任一项执行的后续分离工艺中，将所述离开液滴用作所述样品液滴。
16.根据权利要求15所述的方法，其中顺序地重复所述分离工艺，并且每个随后分离的离开液滴变成用于下一后续分离工艺的样品液滴。
17.一种微流体系统，包括：
电介质上电润湿EWOD器件，其包括配置成接收液滴的元件阵列，所述元件阵列包括多个单独的阵列元件；
其中液滴包括样品液滴和收集液滴，所述样品液滴包括颗粒的混合物，所述颗粒包括彼此不同的第一颗粒和第二颗粒；以及
控制系统，被配置成通过控制施加到所述元件阵列的致动电压来执行电润湿操作，以对存在于所述元件阵列上的液滴执行操控操作；
其中，所述控制系统被配置成执行以下步骤：
执行电润湿操作以使所述样品液滴与所述收集液滴接触；
在初始时间，启动颗粒分离工艺，通过该工艺将一部分所述样品液滴引入到所述收集液滴中，其中所述第一颗粒以不同于所述第二颗粒的速率移动穿过所述收集液滴；以及
在从所述初始时间起的一段时间间隔之后，执行电润湿操作以从所述收集液滴中分割出离开液滴，其中所述离开液滴具有比在所述初始时间所述样品液滴中所述第一颗粒相对于所述第二颗粒的浓度高的所述第一颗粒相对于所述第二颗粒的浓度。
18.根据权利要求17所述的微流体系统，其中所述EWOD器件还包括电极布置，并且所述分离工艺包括在所述收集液滴内或在所述样品液滴与所述收集液滴之间与所述电极布置形成电压梯度。
19.根据权利要求17-18中任一项所述的微流体系统，其中所述控制系统被配置成以使所述样品液滴和所述收集液滴的体扰动和对流混合最小化的方式合并所述样品液滴和所述收集液滴。
20.一种存储程序代码的非暂时性计算机可读介质，所述程序代码由处理设备执行以控制施加到电介质上电润湿EWOD器件的元件阵列的阵列元件的致动电压，所述EWOD器件包括配置成接收液滴的元件阵列，所述元件阵列包括多个单独的阵列元件，并且其中所述液滴包括样品液滴和收集液滴，所述样品液滴包括颗粒的混合物，所述颗粒包括彼此不同的第一颗粒和第二颗粒；
所述程序代码可由所述处理设备执行以执行以下步骤：
执行电润湿操作以使所述样品液滴与所述收集液滴接触；
在初始时间，启动颗粒分离工艺，通过该工艺将一部分所述样品液滴引入到所述收集液滴中，其中所述第一颗粒以不同于所述第二颗粒的速率移动穿过所述收集液滴；以及
在从所述初始时间起的一段时间间隔之后，执行电润湿操作以从所述收集液滴中分割出离开液滴，其中所述离开液滴具有比在所述初始时间所述样品液滴中所述第一颗粒相对于所述第二颗粒的浓度高的所述第一颗粒相对于所述第二颗粒的浓度。
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