CN110628665A - 一种嗜盐嗜碱微生物菌群及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜盐嗜碱微生物菌群及其应用，嗜盐嗜碱微生物菌群用于印染废水的降解，包括以下步骤：①嗜盐嗜碱微生物菌群的筛选和驯化；②嗜盐嗜碱微生物菌群的活化得到菌悬液；③染料废水的降解；吸取步骤②的菌悬液，加入到装有无机盐培养基和染料废水的三角瓶中，在恒温25℃～35℃、静置避光培养至废水脱色。本发明筛选和驯化得到的微生物菌群耐高盐和高碱环境，节省了普通微生物降解前稀释盐度、人工调节pH至中性的成本。

Description

一种嗜盐嗜碱微生物菌群及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物菌群，具体涉及在高碱高盐条件下能降解偶氮染料的嗜盐嗜碱微生物菌群及其降解废水的方法。
背景技术
印染废水作为工业废水排放量位居第三的污染废水，具有色度深、有机污染物含量高、难生物降解、盐度高、碱度高等特点。印染工厂生产消费品时，用到的偶氮染料不仅本身具有毒性，还会危害水中动植物的生长，直接或者间接的影响着人们的生活。除了污染水体外，偶氮染料还会对人直接造成伤害。偶氮染料中由于具有偶氮键和芳香环的原因，其在裂解反应后很有可能会产生大约24种致癌的芳香胺产物，其与人体代谢成分反应，与人体接触暴露时间较长后，这些化学组分与人体物质发生化学反应，形成了芳香胺，芳香胺具有毒性，能够致癌，对人体有着很大的危害。
偶氮染料废水现有的处理方法主要包括物理吸附法、化学氧化法及生物处理法。
物理吸附法和化学氧化法成本高，易造成二次污染，难以大规模用于偶氮染料废水处理中。生物法具有经济、环境友好等特点，是目前最广泛应用的降解方法。
但是，在染色的盐析工艺中大量使用NaNO3、Na2SO4和NaCl这些无机盐来提高印染效率，同时还会加入NaOH来调节酸碱度，这造成了偶氮染料废中盐的质量占10%~20%，pH达到12，这种染料废水就是典型高盐高碱工业废水。当水中NaCl浓度大于3%时，大多数细菌的生物代谢会被偶氮染料的毒性所毒害，水体中微生物丧失其生物活性，从而没有降解效果，造成细菌处理偶氮废水单元的脱色效果不理想。所以在印染废水进入生物处理工艺前需要稀释盐度、人工调节 pH 至中性左右，大大增加了企业的运营成本。
中国专利文献CN 108928917 A(申请号 201810916226.4）公开了一种偶氮染料金橙II的厌氧生物降解方法，包括以下步骤：通过序批模式，以甲烷作为电子供体，偶氮染料金橙II作为电子受体，采用反硝化厌氧甲烷氧化古菌对偶氮染料金橙II进行厌氧生物降解。所述厌氧生物降解的pH值为7.0～7.3。所述厌氧生物降解的温度为35～37℃。该方法及其使用的反硝化厌氧甲烷氧化古菌不适宜高盐高碱印染废水的处理。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种在高碱高盐条件下能降解偶氮染料的嗜盐嗜碱微生物菌群及其应用。
实现本发明第一目的的技术方案是一种嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法，包括以下步骤：
①在三角瓶中加入灭菌的无机盐培养基和标记染料，混合均匀；再向三角瓶中加入印染废水或污泥。
将三角瓶置于恒温培养箱中，在25℃～35℃下避光培养至标记染料脱色，得到第一代驯化后的菌群。
②从上述三角瓶中吸取第一代驯化后的悬浮液，接种至新鲜的灭菌的无机盐培养基和标记染料中，在25℃～35℃下避光培养至标记染料脱色，得到第二代驯化后的菌群。
③重复步骤②的操作7～10次后驯化结束，离心分离收集菌体，得到嗜盐嗜碱微生物菌群。
制备过程所用的无机盐培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.4～0.6g/L、NH4Cl0.2～0.4 g/L、CaCl2 0.08～0.12g/L、KH2PO4 0.15～0.3g/L、KCl 0.4～0.6g/L、NaCl 80～90g/L、MgCl2 10～15g/L；用Na0H溶液调节无机盐培养基的pH值为10～12；无机盐培养基的溶质为水。
步骤①中的标记染料为直接湖蓝、酸性大红GR、酸性金黄G或酸性黑。
进一步的，标记染料的浓度为0.1～6g/L。
进一步的，标记染料与无机盐培养基的体积比为1：40～67。
上述步骤②中接种量之比为1∶9～11。
上述步骤③得到的的微生物菌群包括Halomonas、Marinobacter、Clostridiisalibacter。
实现本发明第二目的的技术方案是一种按照上述的方法制备的嗜盐嗜碱微生物菌群在降解染料废水中的应用。
降解方法包括以下步骤：
①在三角瓶中加入灭菌的无机盐培养基和标记染料，混合均匀；再向三角瓶中加入印染废水或污泥；将三角瓶置于恒温培养箱中，在25℃～35℃下避光培养至标记染料脱色，得到第一代驯化后的菌群。
从上述三角瓶中吸取第一代驯化后的悬浮液，接种至新鲜的灭菌的无机盐培养基和标记染料中，在25℃～35℃下避光培养至标记染料脱色，得到第二代驯化后的菌群；重复第二代驯化操作7～10次后驯化结束，离心分离收集菌体，得到嗜盐嗜碱微生物菌群。②将步骤①驯化得到的嗜盐嗜碱微生物菌群活化得到菌悬液。
③染料废水的降解。吸取步骤②的菌悬液，加入到装有无机盐培养基和染料废水的三角瓶中，在25℃～35℃、静置避光培养至废水脱色。
步骤③中染料废水的浓度范围为100～400 mg/L。
降解过程所用的无机盐培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.4～0.6g/L、NH4Cl0.2～0.4 g/L、CaCl2 0.08～0.12g/L、KH2PO4 0.15～0.3g/L、KCl 0.4～0.6g/L、NaCl 80～90g/L、MgCl2 10～15g/L。
本发明具有积极的效果：
（1）本发明筛选和驯化得到的微生物菌群耐高盐和高碱环境，在高盐和高碱环境下对偶氮染料的降解效果明显。
（2）将筛选、驯化、富集的嗜盐嗜碱菌降解高盐度高碱性的染料废水，节省了普通微生物降解前稀释盐度、人工调节 pH 至中性的成本，是目前微生物处理高盐高碱染料废水处理单元中降解难问题的最佳途径。
（3）按照本发明方法筛选和驯化得到的的微生物菌群包括Halomonas、Marinobacter、Clostridiisalibacter，对直接湖蓝、酸性大红GR、酸性金黄G、酸性黑等染料具有优良的降解效果。
具体实施方式
（实施例1）嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法
①在250 mL三角瓶中加入灭菌的无机盐培养基100 mL和1.5～2.5mL（本实施例中为2mL）浓度为0.1～6g/L（本实施例中为5 g/L）的标记染料酸性金黄G ，混合均匀；再向三角瓶中加入印染厂废水处理后得到的活性污泥5g并混匀。
所用的无机盐培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.4～0.6g/L、NH4Cl 0.2～0.4g/L、CaCl2 0.08～0.12g/L、KH2PO4 0.15～0.3g/L、KCl 0.4～0.6g/L、NaCl 80～90g/L、MgCl2 10～15g/L；用Na0H溶液调节无机盐培养基的pH值为10～12；无机盐培养基的溶质为水。
本实施例中所用的无机盐培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.5g/L、NH4Cl 0.3g/L、CaCl2 0.1g/L、KH2PO4 0.2g/L、KCl 0.5g/L、NaCl 85.8g/L、MgCl2 12.6g/L；用Na0H溶液调节无机盐培养基的pH值为10；无机盐培养基的溶质为水。
将三角瓶置于恒温培养箱中，在25～35℃下（本实施例中为30℃）避光培养至酸性金黄G脱色，得到第一代驯化后的菌群。
酸性金黄G 用于标记驯化终点，当三角瓶中标记染料明显脱色时，此代驯化过程结束。除了酸性金黄G，标记染料还可以为直接湖蓝、酸性大红GR或酸性黑。
②从上述三角瓶中吸取10 mL第一代驯化后的悬浮液，接种至新鲜的100 mL灭菌的无机盐培养基中，新鲜的无机盐培养基中加入2 mL浓度为5 g/L的酸性金黄G。在30℃避光培养至酸性金黄G脱色后得到第二代驯化后的菌群。
此次所用的无机盐培养基的成分与培养第一代驯化菌群的无机盐培养基相同。
③重复步骤②的操作7～10次，本实施例中重复8次，驯化结束后，离心分离收集菌体，得到嗜盐嗜碱微生物菌群，将菌体放冰箱待用。
④使用AxyPrep 细菌基因组DNA制备试剂盒（Axygen）对步骤③得到的菌群的总DNA进行提取，使用Illumina Miseq PE250高通量测试仪上机测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。测序长度为2×250 bp，引物分别为515F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’和 907R’5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’。对所有序列进行筛选和拼接。并根据序列的相似度，将序列归为多个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），通过Silva数据库对代表序列进行注释。比对显示菌群主要由Halomonas、Marinobacter、Clostridiisalibacter构成。
（实施例2）嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法
本实施例的嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法其余与实施例1相同，不同之处在于：步骤①在250 mL三角瓶中加入灭菌的无机盐培养基100 mL和2 mL浓度为5g/L的酸性金黄G ，混合均匀；再向三角瓶中加入印染厂废水10mL并混匀。
（实施例3）嗜盐嗜碱微生物菌群的应用
本实施例将嗜盐嗜碱微生物菌群用于染料废水的降解。
本实施例的染料废水的降解方法包括以下步骤：
①嗜盐嗜碱微生物菌群的筛选和驯化。
在250 mL三角瓶中加入灭菌的无机盐培养基100 mL和2mL浓度为5g/L的标记染料酸性金黄G ，混合均匀；再向三角瓶中加入印染厂废水处理后得到的活性污泥5g并混匀。
所用的无机盐培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.5g/L、NH4Cl 0.3 g/L、CaCl20.1g/L、KH2PO4 0.2g/L、KCl 0.5g/L、NaCl 85.8g/L、MgCl2 12.6g/L；用Na0H溶液调节无机盐培养基的pH值为10；无机盐培养基的溶质为水。
将三角瓶置于恒温培养箱中，在30℃下避光培养至酸性金黄G脱色，得到第一代驯化后的菌群。
从上述三角瓶中吸取10 mL第一代驯化后的悬浮液，接种至新鲜的100 mL灭菌的无机盐培养基中，新鲜的无机盐培养基中加入2 mL浓度为5 g/L的酸性金黄G。在30℃避光培养至酸性金黄G脱色后得到第二代驯化后的菌群。
此次所用的无机盐培养基的成分与培养第一代驯化菌群的无机盐培养基相同。
继续重复第二代驯化操作7～10次（本实施例中8次）后驯化结束，离心分离收集菌体，得到嗜盐嗜碱微生物菌群，将菌体放冰箱待用。
②嗜盐嗜碱微生物菌群的活化。
将步骤①驯化得到的嗜盐嗜碱微生物菌群活化，制备成含菌量1.8*107 CFU/ml的菌悬液。
活化所用培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.5g/L、NH4Cl 0.3 g/L、CaCl2 0.1g/L、KH2PO4 0.2g/L、KCl 0.5g/L、NaCl 85.8g/L、MgCl2 12.6g/L；用Na0H溶液调节无机盐培养基的pH值为10；无机盐培养基的溶质为水。
③染料废水的降解。
吸取10 mL步骤②的菌悬液，加入到装有100 mL无机盐培养基和250 mL浓度为100mg/L酸性金黄G的三角瓶中，在恒温培养箱中30 ℃、静置避光培养，16 小时后取样测定酸性金黄G的残留量。
所述无机盐培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.5g/L、NH4Cl 0.3 g/L、CaCl20.1g/L、KH2PO4 0.2g/L、KCl 0.5g/L、NaCl 85.8g/L、MgCl2 12.6g/L。
16 小时后染料明显脱色，16小时的降解率达到93.42%，结果表明嗜碱嗜盐菌群对酸性金黄G具有高效的降解性能。
（实施例4）嗜盐嗜碱微生物菌群的应用
本实施例的染料废水的降解方法其余与实施例3相同，不同之处在于：
步骤③中吸取10 mL步骤②的菌悬液，加入到装有100 mL无机盐培养基和200 mL染料废水的三角瓶中，染料废水中酸性金黄G的浓度为200 mg/L。16小时的降解率达到92.12%。
（实施例5）嗜盐嗜碱微生物菌群的应用
本实施例的染料废水的降解方法其余与实施例3相同，不同之处在于：
步骤③中在恒温培养箱中40 ℃、静置避光培养，16 小时后酸性金黄G降解率94.22%。活化所用培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.5g/L、NH4Cl 0.3 g/L、CaCl2 0.1g/L、KH2PO40.2g/L、KCl 0.5g/L、NaCl 85.8g/L、MgCl2 12.6g/L；用Na0H溶液调节无机盐培养基的pH值为8。
（实施例6）嗜盐嗜碱微生物菌群的应用
本实施例的染料废水的降解方法其余与实施例3相同，不同之处在于：
步骤③中吸取10 mL步骤②的菌悬液，加入到装有100 mL无机盐培养基和250 mL染料废水的三角瓶中，染料废水中酸性大红GR的浓度为200 mg/L。
在恒温培养箱中30 ℃、静置避光培养，18小时后酸性大红GR降解率91.12%。

Claims (10)

1.一种嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
①在三角瓶中加入灭菌的无机盐培养基和标记染料，混合均匀；再向三角瓶中加入印染废水或污泥；
将三角瓶置于恒温培养箱中，在25℃～35℃下避光培养至标记染料脱色，得到第一代驯化后的菌群；
②从上述三角瓶中吸取第一代驯化后的悬浮液，接种至新鲜的灭菌的无机盐培养基和标记染料中，在25℃～35℃下避光培养至标记染料脱色，得到第二代驯化后的菌群；
③重复步骤②的操作7～10次后驯化结束，离心分离收集菌体，得到嗜盐嗜碱微生物菌群；
制备过程所用的无机盐培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.4～0.6g/L、NH4Cl 0.2～0.4 g/L、CaCl2 0.08～0.12g/L、KH2PO4 0.15～0.3g/L、KCl 0.4～0.6g/L、NaCl 80～90g/L、MgCl2 10～15g/L；用Na0H溶液调节无机盐培养基的pH值为10～12；无机盐培养基的溶质为水。
2.根据权利要求1所述的嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法，其特征在于：步骤①中的标记染料为直接湖蓝、酸性大红GR、酸性金黄G或酸性黑。
3.根据权利要求2所述的嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法，其特征在于：标记染料的浓度为0.1～6g/L。
4.根据权利要求3所述的嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法，其特征在于：标记染料与无机盐培养基的体积比为1：40～67。
5.根据权利要求1所述的嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法，其特征在于：步骤②中接种量之比为1∶9～11。
6.根据权利要求1至5之一所述的嗜盐嗜碱微生物菌群的制备方法，其特征在于：步骤③得到的的微生物菌群包括Halomonas、Marinobacter、Clostridiisalibacter。
7.一种按照权利要求1所述的方法制备的嗜盐嗜碱微生物菌群在降解染料废水中的应用。
8.根据权利要求7所述的嗜盐嗜碱微生物菌群在降解染料废水中的应用，其特征在于降解方法包括以下步骤：
①在三角瓶中加入灭菌的无机盐培养基和标记染料，混合均匀；再向三角瓶中加入印染废水或污泥；将三角瓶置于恒温培养箱中，在25℃～35℃下避光培养至标记染料脱色，得到第一代驯化后的菌群；
从上述三角瓶中吸取第一代驯化后的悬浮液，接种至新鲜的灭菌的无机盐培养基和标记染料中，在25℃～35℃下避光培养至标记染料脱色，得到第二代驯化后的菌群；重复第二代驯化操作7～10次后驯化结束，离心分离收集菌体，得到嗜盐嗜碱微生物菌群；
②将步骤①驯化得到的嗜盐嗜碱微生物菌群活化得到菌悬液；
③染料废水的降解；
吸取步骤②的菌悬液，加入到装有无机盐培养基和染料废水的三角瓶中，在25℃～35℃、静置避光培养至废水脱色。
9.根据权利要求7所述的嗜盐嗜碱微生物菌群在降解染料废水中的应用，其特征在于：步骤③中染料废水的浓度范围为100～400 mg/L。
10.根据权利要求7所述的嗜盐嗜碱微生物菌群在降解染料废水中的应用，其特征在于降解过程所用的无机盐培养基中各组分的含量为：Na2SO4 0.4～0.6g/L、NH4Cl 0.2～0.4g/L、CaCl2 0.08～0.12g/L、KH2PO4 0.15～0.3g/L、KCl 0.4～0.6g/L、NaCl 80～90g/L、MgCl2 10～15g/L。
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