CN110627978A - 一种以纤维素纳米晶为基体的刷状聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种以纤维素纳米晶为基体的刷状聚合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药高分子材料领域，公开了一种以纤维素纳米晶为基体的刷状聚合物及其制备方法和应用。本发明先通过硫酸水解纤维素微晶得到纤维素纳米晶体，然后采用开环聚合(ROP)将PCL接枝在CNC表面，最后，进行与DMAEMA的ARGET ATRP反应制得CNC‑g‑PCL‑b‑PDMAEMA。所制备的CNC‑g‑PCL‑b‑PDMAEMA刷状聚合物生物相容性好，可以通过疏水作用和静电作用同时负载疏水性药物和光热剂，施加近红外光后，可以实现光热治疗，利用PCL的温敏性和PDMAEMA的pH敏感特性可以实现药物的可控释放，达到光热‑化学联合治疗，在药物载体领域具有应用前景。

Description

一种以纤维素纳米晶为基体的刷状聚合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药高分子材料领域，特别涉及一种以纤维素纳米晶为基体的刷状聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
根据最新的全球癌症数据，2018年全球范围内有1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例；化疗是目前治疗恶性肿瘤的重要手段之一，但是存在毒副作用大的缺点。因此，药物递送体系应运而生。药物载体进入人体后，要发挥作用，必须经历体内循环，聚集，渗透，进入肿瘤细胞和最终发挥治疗效果这五步，其中，第三步是较为重要的一步，提高药物载体的细胞膜穿透效率，将显著增强其抗癌效果。研究表明，棒状药物载体具有比球状更强的细胞膜穿透能力。因而，在药物载体的设计中，采用棒状构型，将得到更好的肿瘤抑制效果。
当药物载体进入肿瘤细胞后，最关键的一步就是释放药物实现化学治疗，这也是药物载体研究中，科研工作者最关注的一步。常见的药物载体主要有聚合物胶束、纳米粒子和脂质体，它们大都是通过物理或化学方式包载抗癌药物，再利用一些刺激响应释放抗癌药物，实现化学治疗。然而，这种传统单一药物载体面临着生物利用度差、产生耐药性及治疗效果不佳等局限。为了解决这个问题，最有效的方式就是联合治疗。早期的联合治疗是用脂质类/聚合物囊泡包载多种药物，加强化学治疗的效果，而这种方式会受到不同药物包载能力的限制。近年来，随着材料科学的发展，科学家提出基于材料优越的物理化学性能，将化学治疗，光热治疗(PDT)和光动力治疗(PTT)等多种治疗方式结合起来，去实现协同治疗。这种高效的联合治疗方式，成为了药物载体的研究热点。
在药物载体的设计与制备中，如果能够将载体的棒状优势和联合治疗相结合，就能从提高药物载体细胞内化能力和优化治疗效果两方面提高抗癌效果。纤维素纳米晶体(CNC)作为一种新兴天然的生物高分子材料，使这种设想成为了可能。首先，CNC具有良好的生物相容性、生物降解能力和价格低廉等优点；同时，它的统一的棒状外形使其在细胞内化方面具有优势；最后，CNC表面具有丰富的羟基，可以对其进行多功能改性，从而用于负载光敏剂、基因或者药物实现联合治疗。聚合物接枝改性是对CNC改性最常用的策略。Wang等[Polymer Chemistry,6(23),4206-4209]通过点击化学反应合成了CNC-g-PEEP的阴离子聚合物刷，利用静电作用负载阳离子药物DOX.HCl。Hou等[Journal of Materials ChemistryB,5(18),3348-3354]制备了P(IPOx-g-nPrOx)-g-CNC，用于负载光热剂，实现光热治疗。专利申请CNIO5175637A公布了一种改性纤维素纳米晶体的方法，采用原子转移自由基聚合(ATRP)将苯乙烯接枝到纤维素纳米晶体的表面，改善其热稳定性及其与有机材料的相容性。然而，目前对于CNC的改性都较简单，使其功能相对单一，只能实现单独的化学、光热或者基因治疗，因而，这类药物载体的治疗效果有限。
聚ε-己内酯(PCL)具有良好的生物相容性和较低的免疫原性，对药物的高渗透性等优点，但是其高结晶度、高熔点和低降解速率限制了其在生物材料中的应用。将PCL制备成嵌段共聚物是一种克服该缺点的有效方法，并且通过调整组成嵌段的种类和比例可以调控其温度响应范围。聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)是一种广泛应用于基因递送的亲水性阳离子聚合物，在正常pH(pH＝7.4)下，它带部分正电荷，可以利用静电作用负载阳离子小分子；同时，当其处于肿瘤的微酸环境(pH＝5.0)中，其侧链的叔氨基将发生质子化，亲水性增加，显示出pH响应性能。
综上所述，目前常见的药物载体存在着毒副作用大，细胞内化性能不佳和产生耐药性等缺点；棒状构型的纤维素纳米晶体和生物相容性好的PCL都是理想的药物载体材料，但是它们单独使用时，其材料功能单一且会受到结晶度和亲疏水特性的限制，不利于扩大其应用范围。因而，通过合理的分子设计，得到的CNC-g-PCL-b-PDMAEMA具有棒状构型，有利于细胞内化，同时，两亲性的侧链可以负载光热剂和药物，并兼具pH和温度响应性质，是解决上述问题的有效方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点和局限性，本发明的首要目的在于提供一种以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物材料。
该刷状聚合物材料的结构为：以纤维素纳米晶体为基体，分别接枝上疏水嵌段PCL和亲水的阳离子嵌段PDMAEMA形成pH和温度双响应的刷状聚合物。
本发明的另一目的在于提供上述一种以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物材料的制备方法。
该方法为先通过硫酸水解纤维素微晶得到纤维素纳米晶体，然后采用开环聚合(ROP)将PCL接枝在CNC表面，最后，进行与DMAEMA的ARGET ATRP反应制得CNC-g-PCL-b-PDMAEMA。
本发明的再一目的在于提供上述一种以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物材料的应用。
采用直接混合法和透析法制备PDMAEMA外层负载光热剂，PCL内层负载抗癌药物的纳米粒子药物载体。这种纳米粒子进入细胞后，在外界施加近红外光，光热剂会产生热量，一方面实现光热治疗，另一方面，肿瘤的微酸环境和产生的局部高温可以促使载体的结构发生变化，形成水的通道，释放药物。这种聚合物刷可以利用pH和温度的双响应有效地控制药物释放，并联合光热治疗。提高肿瘤的治疗效果。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种以纤维素纳米晶为基体的刷状聚合物，具有式Ⅰ所示结构：
其中，m＝300～1000，n＝17～41，x＝5～9。
所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备CNC-g-PCL：将ε-己内酯(ε-CL)、纤维素纳米晶体(CNC)、催化剂辛酸亚锡(Sn(Oct)2)和甲苯混合；抽真空然后通入保护气体；在60～95℃和搅拌条件下反应20～24h，最后加入盐酸溶液终止反应，经沉淀、过滤、干燥后得到CNC-g-PCL；
(2)制备CNC-g-PCL-Br大分子引发剂：将步骤(1)得到的CNC-g-PCL、溶剂四氢呋喃(THF)、三乙胺和小分子引发剂2-溴代异丁酰溴混合，抽真空然后通入保护气体，在冰浴中反应4～5h，再在室温下反应24～30h，经离心、沉淀、过滤、干燥后得到CNC-g-PCL-Br大分子引发剂；
(3)制备以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物材料：将步骤(2)制备的CNC-g-PCL-Br大分子引发剂、单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)、配体1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺(HMTEMA)和催化剂溴化铜溶于甲苯中，抽真空然后通入保护气体，搅拌后加入还原剂辛酸亚锡(Sn(Oct)2)，在60～90℃下，反应20～24h；去除催化剂，经过滤、滤液后处理，即得到CNC-g-PCL-b-PDMAEMA刷状聚合物，即所述的以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物。
优选的，步骤(1)所述ε-己内酯：纤维素纳米晶体：辛酸亚锡的质量比为2～8：0.5～1：0.02～0.04。
优选的，步骤(1)所述甲苯和ε-己内酯的体积质量比为3～5mL/g。
优选的，步骤(1)所述盐酸溶液和ε-己内酯的体积质量比为0.2～0.3mL/g。
优选的，步骤(1)所述盐酸溶液的浓度为1～3mol/L，更优选为1mol/L。
优选的，步骤(1)所述沉淀是指在反应后的溶液中加入溶液10倍体积的0℃的正庚烷进行沉淀。
优选的，步骤(1)所述干燥为真空干燥或者其他干燥方式均可，所述干燥的温度为40℃。
优选的，步骤(2)所述CNC-g-PCL：三乙胺：2-溴代异丁酰溴的质量比为2～4：0.95～2.18：2.08～4.65。
优选的，步骤(2)所述四氢呋喃和CNC-g-PCL的体积质量比为3～5mL/g。
优选的，步骤(2)所述室温为25℃。
优选的，步骤(2)所述离心是指反应后的溶液离心去除不溶性铵盐沉淀，取上清液。
优选的，步骤(2)所述沉淀是指将离心得到的上清液加入到上清液10倍体积的0℃的正己烷进行沉淀。
优选的，步骤(2)所述干燥取任何干燥方式均可，更优选为真空干燥，所述干燥的温度为35℃，所述干燥的时间为24h。
优选的，步骤(1)和步骤(2)所述保护气体为惰性气体或氮气，更有选的为氩气。
优选的，步骤(3)所述CNC-g-PCL-Br大分子引发剂：溴化铜：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯：1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺：辛酸亚锡的质量比为0.381～0.762：0.01～0.02：4.52～9.21：0.011～0.023：0.13～0.30。
优选的，步骤(3)所述甲苯和CNC-g-PCL-Br大分子引发剂的体积质量比为使用50～69mL/g。
优选的，步骤(3)所述去除催化剂指将反应产物溶解于四氢呋喃后，过中性氧化铝层析柱，四氢吠喃洗脱，除去催化剂。
优选的，步骤(3)所述滤液后处理的方式为将滤液旋蒸蒸发、加入滤液10倍体积的正己烷中沉淀、然后进行离心、过滤和干燥。
优选的，步骤(1)所述纤维素纳米晶体为棒状结构，所述纤维素纳米晶体的长度为100～200nm，所述纤维素纳米晶体的直径为10～20nm。
优选的，步骤(1)所述纤维素纳米晶体可购买或自制，更优选的为自制得到。
自制纤维素纳米晶体的步骤如下：
(1)在搅拌条件下，将微晶纤维素加入到硫酸溶液中混合搅拌，进行加热反应，反应结束后离心洗涤，得到纤维素纳米晶体粗产物；
(2)将纤维素纳米晶体粗产物置于水中透析；再进行超声处理，最后经过滤、冷冻干燥后，得到所述的纤维素纳米晶体。
优选的，步骤(1)所述微晶纤维素和硫酸溶液的质量体积比为1～3g：15～45mL。
优选的，步骤(1)所述硫酸溶液的浓度为64wt％。
优选的，步骤(1)所述加热反应的温度为35～65℃，更有选的为45℃；所述反应的时间为45～65min。
优选的，步骤(1)所述离心的转速为6000～7000rpm，所述离心的时间为10min。
优选的，步骤(2)所述透析的结束时间为直到透析液的pH为5～6。
优选的，步骤(2)所述超声处理的振幅为60～80％，所述超声处理的时间为10～20min。
优选的，步骤(2)所述冷冻干燥温度为-45～-55℃，干燥时间为24～36h。
上述制备的一种以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物材料在制备抗癌药物载体中的应用。
本发明制备的刷状聚合物材料生物相容性好，外层负载的光热剂，在近红外光(808nm)的照射下，可产生热量，实现光热治疗；同时，在光热剂产生的局部高温和肿瘤细胞的微酸环境下，药物载体会发生结构变化，快速释放抗癌药物，实现对肿瘤的靶向治疗。
本发明的机理为：
本发明公开的以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物材料是性能优异、具有pH和温度的双敏感的药物载体材料。纤维素纳米晶体作为聚合物刷的骨架，具有刚性结构，可以提供棒状载体的骨架；侧链的PCL是疏水性的半结晶聚合物，用于包载疏水性抗癌药物，并通过与亲水性聚合物结合，它会显示出温度响应性质。外层的PDMEMA作为载体的亲水外壳，主要作用有：增强载体的稳定性，pH响应控释药物和静电负载光热剂。该聚合物刷可以利用棒状优势进入肿瘤细胞，在外界施加近红外光(808nm)后，吲哚菁绿(ICG)分子吸收光能并跃迁至激活态的高振动能级，随后ICG分子去激活，产生热能并表现为高热和光热效果；局部的高温会使PCL发生相变，形成水的通道，有助于药物从载体内释放；同时，肿瘤的微酸环境会使PDMAMEA质子化，载体进一步溶胀，加速药物的释放，从而实现光热-化学联合治疗。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明采用硫酸水解纤维素微晶的方法，制备棒状的纤维素纳米晶体，制备方法简单，可实施性高。
(2)本发明通过开环聚合和原子转移自由基聚合相结合的方法，制备CNC-g-PCL-b-PDMAEMA刷状聚合物，制备方法操作简单，反应条件温和，易于调控材料的温度响应范围。
(3)本发明以纤维素纳米晶体作为基体，并接枝温敏嵌段聚合物PCL-b-PDMAEMA，可以用于负载疏水性药物和光热剂，实现光热-化学联合治疗，可以提高药物载体的肿瘤抑制效果。
附图说明
图1为实施例1中CNC-g-PCL的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3。
图2为实施例1中CNC-g-PCL-Br的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3。
图3为实施例1中CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3。
图4为实施例1中CNC、CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的红外光谱对比图。
图5为实施例1制得的纤维素纳米晶体的粒径分布图。
图6为实施例1制得的CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的粒径分布图。
图7为实施例1中CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的DSC谱图。
图8为实施例2中CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的DSC谱图。
图9为实施例3中CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的DSC谱图。
图10为实施例5的光热转换曲线性能图。
图11为实施例6的pH响应药物释放实验结果性能图。
图12为实施例6的近红外光触发药物释放实验结果性能图。
图13是实施例7的空白药物载体组的细胞毒性结果示意图。
图14是实施例7的游离DOX组、P@DOX/ICG组和P@DOX/ICG+激光组的毒性结果示意图。
图15为实施例8的CLSM测试结果图，其中A对应A板培养4h的时刻吸走培养基的样品，B对应B板培养15min时刻吸收培养基的样品，C对应B板培养0.5h时刻吸走培养基的样品，D对应B板培养2h时刻吸收培养基的样品，E对应B板培养4h时刻吸收培养基的样品。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中涉及的物料均可从商业渠道获得。实施例所述室温为25℃。各组分用量以质量体积份计，g/mL。在实施例中部分化学品使用的缩写对照如下：
实施例1
(1)纤维素纳米晶体的制备：于100mL的烧瓶中，称取1g的纤维素微晶和15mL的硫酸溶液(64wt％)，混合，在35℃下搅拌反应65min；反应完成后，6000rpm离心分离后洗涤，然后透析5天直到馏出液的pH稳定为5；之后，用布兰森450声波降解器在60％的振幅下对产物超声处理20min，最后过滤、冷冻干燥，得到的白色粉末即为纤维素纳米晶体(CNC)。
(2)CNC-g-PCL的制备：将0.5g步骤(1)中制备的纤维素纳米晶体、2gε-己内酯，0.02g Sn(Oct)2和8mL甲苯加入到50mL的干燥茄形瓶中，放入磁子，密封后，抽真空通氩气三次；将烧瓶放入油浴中加热到60℃并在该温度下反应20h；加入0.5mL盐酸水溶液(1mol/L)终止反应。反应后的溶液置于10倍溶液体积的0℃庚烷中沉淀，过滤，在40℃下真空干燥，得到的白色粉末即为CNC-g-PCL，合成反应式见式(1)。
(3)CNC-g-PCL-Br的制备：将2g步骤(2)中制备的CNC-g-PCL、7mL THF、0.95g三乙胺和2.08g2-溴代异丁酰溴加入到50mL的干燥茄形瓶，放入磁子，密封反应瓶后，抽真空通氩气三次；先在冰浴中反应4h，再在室温下反应24h，反应完成后，离心除去不溶性铵盐，取上清液用上清液10倍体积的0℃的正己烷沉淀两次、过滤，在35℃下真空干燥24h，得到的黄色沉淀即为CNC-g-PCL-Br，合成反应式见式(2)。
(4)CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的制备：向50mL的干燥茄形瓶中依次加入0.381g步骤(3)制备的CNC-g-PCL-Br、0.011gHMTEMA、4.52g的DMAEMA、10mgCuBr2和26mL甲苯，加入磁子，用反口橡皮塞密封，抽真空通氩气三次；搅拌10min使配合物形成；最后加入0.13g的Sn(Oct)2，并搅拌5min，再置于60℃油浴中反应24h。反应完成后，冷却到室温，用THF稀释混合物，室温下放置1h，之后将反应物通过中性氧化铝柱除去CuBr2，经过滤后得到的滤液旋蒸浓缩后，将其缓慢滴加到滤液10倍体积的正己烷中沉淀，离心，得到无色粘稠状产物，在30℃下真空干燥48h，得到的粘稠状固体即为CNC-g-PCL-b-PDMAEMA，合成反应式见式(3)。
氢核磁共振波谱(1H NMR)：用Bruker公司的AVANCEⅢ400测试聚合物的结构和组成。以四甲基硅烷(TMS))为内标，氘代氯仿(CDCl3)为溶剂，频率为400MHz，温度为25℃。
红外光谱分析(FT-IR)：用Nicolet 6700傅丽叶红外光谱仪测定聚合物的结构。样品通过溴化钾压片，测定产物在500-4000cm-1波长范围内的红外光谱。
动态光散射粒径分析(DLS)：用Malvern ZetasizerNanoS动态光散射仪测试CNC和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的粒径(Dh)、粒径分布(PDI)和Zeta电位。所有样品在测试前经0.45μm过滤头过滤，使用800nm二极管激光器，散射角为90°，温度为25℃。
差示扫描量热仪(DSC)：采用Q200型差示扫描量热仪分析CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的相变温度。称取3-5mg的样品，放入钼制的坩埚中，而后密封，进行升温测试，升温速率10℃/min，测试温度范围为20-80℃，温度用铟校正。测试样品为嵌段共聚物本体。测试过程中有氮气保护，氮气流速50mL/min。
图1为实施例1中CNC-g-PCL的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3，由图1可得：4.06ppm是CNC上的-CH2O-(a)和PCL上-CH2O-(f)的化学位移；1.40、1.64和2.30ppm是PCL链上相连的-CH2-(b,c,d,e)的化学位移；3.65ppm是端羟基相连的-CH2-(g)的化学位移；1.25ppm是CNC糖环上-CH-(h)的化学位移；说明CNC-PCL的成功合成。并且通过计算重复单元(d)和端基(g)的峰面积得到聚合物的聚合度和分子量，得出聚合度n为17，分子量为2057，同时，m＝300。
图2为实施例1中CNC-g-PCL-Br的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3，由图2可得：1.95ppm是溴代异丁酰溴上的-(CH3)2-的化学位移；同时，与端羟基相连的-CH2-(g)的化学位移由3.65ppm转移到4.17ppm；且和1.93ppm处积分面积比为1:3；说明CNC-g-PCL-Br的成功合成。
图3为实施例1中CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3，由图3可得：4.05(l峰)和2.56ppm(m峰)分别是PDMAEMA主链上-CH2-的特征质子峰，且2.28ppm(n峰)出现其-(CH3)2-的质子峰，证明合成成功。同时，通过峰面积比值Im/Ie得出聚合物的分子量为13024，其中，嵌段PCL聚合度为n＝17，嵌段PDMAEMA的聚合度为x＝5，m＝300。
图4为实施例1中CNC、CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的红外光谱对比图，由图4可得：对于CNC-g-PCL，在1725cm-1出现了PCL中酯羰基的特征吸收峰，同时CNC上的羟基吸收峰明显减弱，证明PCL成功接枝到CNC表面；对于CNC-g-PCL-b-PDMAEMA，在2821cm-1和2770cm-1处出现了DMAEMA上亚甲基的伸缩振动吸收峰，证明产物的成功合成。
图5为实施例1制得的纤维素纳米晶体(CNC)的粒径分布图，由图5可得CNC的平均粒径为97.89nm，粒度分布指数为0.256。
图6为实施例1制得的CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的粒径分布图，由图6可得：产物的平均粒径为234nm，粒度分布指数为0.293。
图7为实施例1中CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的DSC谱图，由图7可得：CNC-g-PCL的熔点为54.4℃，CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的熔点为50.6℃，而纯PCL的熔点为65℃(参考现有文献数据得知)，说明CNC和PDMAEMA的引入均会破坏PCL的结晶结构，进而使其熔点降低。
实施例2
(1)纤维素纳米晶体的制备：于100mL的烧瓶中，称取2g的纤维素微晶和30mL的硫酸溶液(64wt％)，混合，在45℃下搅拌反应55min；反应完成后，6000rpm离心分离后洗涤，然后透析5天直到馏出液的pH稳定为5.5；之后，用布兰森450声波降解器在70％的振幅下对产物超声处理15min，最后过滤、冷冻干燥，得到的白色粉末即为纤维素纳米晶体。
(2)CNC-g-PCL的制备：将0.5g步骤(1)中制备的纤维素纳米晶体、4gε-己内酯，0.03g Sn(Oct)2和16mL甲苯加入到50mL的干燥茄形瓶中，放入磁子，密封后，抽真空通氩气三次；将烧瓶放入油浴中加热到85℃并在该温度下反应24h；加入1mL盐酸水溶液(1mol/L)终止反应。反应后的溶液置于10倍溶液体积的0℃庚烷中沉淀，过滤，在40℃下真空干燥，得到的白色粉末即为CNC-g-PCL。
(3)CNC-g-PCL-Br的制备：将3g步骤(2)中制备的CNC-g-PCL、10.5mLTHF、1.46g三乙胺和3.72g的2-溴代异丁酰溴加入到50mL的干燥茄形瓶，放入磁子，密封反应瓶后，抽真空通氩气三次；先在冰浴下反应5h，再在室温下反应24h，反应完成后，离心除去不溶性铵盐，取上清液用上清液10倍体积的0℃的正己烷沉淀两次、过滤，在35℃下真空干燥24h，得到的黄色沉淀即为CNC-g-PCL-Br。
(4)CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的制备：向100mL的干燥茄形瓶中依次加入0.572g步骤(3)制备的CNC-g-PCL-Br、0.0165g HMTEMA、6.79g的DMAEMA、15mg CuBr2和30.03mL甲苯，加入磁子，用反口橡皮塞密封，抽真空通氩气三次；搅拌10min使配合物形成；最后加入0.192g的Sn(Oct)2，并搅拌5min，再置于70℃油浴中反应22h。反应完成后，冷却到室温，用THF稀释混合物，室温下放置1h，之后将反应物通过中性氧化铝柱除去CuBr2，经过滤后得到的滤液旋蒸浓缩后，将其缓慢滴加到滤液10倍体积的正己烷中沉淀，离心，得到无色粘稠状产物，在30℃下真空干燥48h，得到的粘稠状固体即为CNC-g-PCL-b-PDMAEMA。
差示扫描量热仪(DSC)：采用Q200型差示扫描量热仪分析CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的相变温度。称取3-5mg的样品，放入钼制的坩埚中，而后密封，进行升温测试，升温速率10℃/min，测试温度范围为20-80℃，温度用铟校正。测试样品为嵌段共聚物本体。测试过程中有氮气保护，氮气流速50mL/min。
实施例2中的产物CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的1H NMR谱与实施例1基本相同。通过峰面积比值得出聚合物的分子量为15010，其中，嵌段PCL聚合度为n＝21，嵌段PDMAEMA的聚合度为x＝7，同时，m＝700。
实施例2中的CNC、CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的红外光谱对比图与实施例1相同，证明产物的成功合成。
实施例2中CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的粒径分布图与实施例1中基本类似，产物均一性较好，粒径略微增大。平均粒径为250nm，粒度分布指数为0.23。
图8为实施例2中CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的DSC谱图。由图8可得：CNC-g-PCL的熔点为59.5℃，CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的熔点为49.5℃，对比纯的PCL和实施例(1)中的产物可以知道，通过调节原料的加入量(CNC:ε-CL:DMAEMA)，可以调节产物的相变温度。
实施例3
(1)纤维素纳米晶体的制备：于100mL的烧瓶中，称取3g的纤维素微晶和45mL的硫酸溶液(64wt％)，混合，在65℃下搅拌反应45min；反应完成后，7000rpm离心分离后洗涤，然后透析5天直到馏出液的pH稳定为6；之后，用布兰森450声波降解器在80％的振幅下对产物超声处理10min，最后过滤、冷冻干燥，得到的白色粉末即为纤维素纳米晶体。
(2)CNC-g-PCL的制备：将1g步骤(1)中制备的纤维素纳米晶体、8gε-己内酯，0.04gSn(Oct)2和32mL甲苯加入到100mL的干燥茄形瓶中，放入磁子，密封后，抽真空通氩气三次；将烧瓶放入油浴中加热到95℃并在该温度下反应24h；加入2mL盐酸水溶液(1mol/L)终止反应。反应后的溶液置于10倍溶液体积的0℃庚烷中沉淀，过滤，在40℃下真空干燥，得到的白色粉末即为CNC-g-PCL。
(3)CNC-g-PCL-Br的制备：将4.0g步骤(2)中制备的CNC-g-PCL、14mLTHF、2.18g三乙胺和4.65g的2-溴代异丁酰溴加入到50mL的干燥茄形瓶，放入磁子，密封反应瓶后，抽真空通氩气三次；先在冰浴下反应5h，再在室温下反应30h，反应完成后，离心除去不溶性铵盐，取上清液用上清液10倍体积的0℃的正己烷沉淀两次、过滤，在35℃下真空干燥24h，得到的黄色沉淀即为CNC-g-PCL-Br。
(4)CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的制备：向100mL的干燥茄形瓶中依次加入0.762g步骤(3)制备的CNC-g-PCL-Br、0.023g HMTEMA、9.21g的DMAEMA、20mg CuBr2和52mL甲苯，加入磁子，用反口橡皮塞密封，抽真空通氩气三次；搅拌10min使配合物形成；最后加入0.3g的Sn(Oct)2，并搅拌5min，再置于90℃油浴中反应20h。反应完成后，冷却到室温，用THF稀释混合物，室温下放置1h，之后将反应物通过中性氧化铝柱除去CuBr2，经过滤后得到的滤液旋蒸浓缩后，将其缓慢滴加到滤液10倍体积的正己烷中沉淀，离心，得到无色粘稠状产物，在30℃下真空干燥48h，得到的粘稠状固体即为CNC-g-PCL-b-PDMAEMA。
差示扫描量热仪(DSC)：采用Q200型差示扫描量热仪分析CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的相变温度。称取3-5mg的样品，放入钼制的坩埚中，而后密封，进行升温测试，升温速率10℃/min，测试温度范围为20-80℃，温度用铟校正。测试样品为嵌段共聚物本体。测试过程中有氮气保护，氮气流速50mL/min。
实施例3中的产物CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的1H NMR谱与实施例1基本相同。通过峰面积比值得出聚合物的分子量为19623，其中，嵌段PCL聚合度为n＝41，嵌段PDMAEMA的聚合度为x＝9，m＝1000。
实施例3中的CNC、CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的红外光谱对比图与实施例1相同，证明产物的成功合成。
实施例3中CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的粒径分布图与实施例1中基本类似，产物均一性较好，粒径略微增大。平均粒径为270nm，粒度分布指数为0.222。
图9为实施例3中CNC-g-PCL和CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的DSC谱图。由图9可得：CNC-g-PCL的熔点为62.0℃，CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的熔点为56.4℃，综合对比实施例1、2和3，可以看出通过改变反应中的投料比，可以调控CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的相变温度。
实施例4
装载抗癌药物的纳米粒子药物载体的制备
装载抗癌药物的纳米粒子药物载体的制备方法：首先，把10mg DOX·HCl(99％，购买于北京华联化学材料有限公司)和40mg实施例1制得的CNC-b-PCL-g-PDMAEMA分别溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中得到DOX·HCl溶液和聚合物溶液，之后，在DOX·HCl溶液中加入48μL的三乙胺(TEA)，搅拌24h得到DOX溶液，接着将DOX溶液和聚合物溶液混合后，继续搅拌4h得到混合物，将得到的混合物置于截留分子量为3.5kDa的透析袋中，在1L的去离子水中透析，透析过程中，前8h，每4h换一次水，随后，每隔6h更换一次，总共透析24h。之后，用0.45μm的滤头过滤后，滤液冷冻干燥，得到CNC-b-PCL-g-PDMAEMA@DOX，即所述的装载抗癌药物的纳米粒子药物载体。
紫外可见分光光度计(岛津公司，UV-2450)测试药物载体的载药量：将1mg的CNC-g-PCL-b-PDMAEMA@DOX溶在10mL DMF中，测其在480nm的紫外吸收光谱，然后得到阿霉素的浓度，并计算得到载体的载药量，计算得到其载药量为8.22％。
实施例5
单独包载光热剂和共包载药物和光热剂的纳米粒子的制备
单独包载光热剂的纳米粒子的制备：将25mg的实施例1制备的CNC-g-PCL-b-PDMAEMA加入到20mL的ICG(250μg/mL，购买于安耐吉化学有限公司)甲醇溶液中，然后在黑暗中连续搅拌12h得到混合物，之后，将混合物置于截留分子量为3.5kDa的透析袋内，在1L去离子水中透析24h以除去未包载的ICG，冷冻干燥得到CNC-g-PCL-b-PDMAEMA@ICG，简写为P@ICG，即所述的单独包载光热剂的纳米粒子。
共包载药物和光热剂的纳米粒子的制备：将25mg的实施例4制备的CNC-g-PCL-b-PDMAEMA@DOX加入到20mL的ICG(250μg/mL)甲醇溶液中，然后在黑暗中连续搅拌12h得到混合物，之后，将混合物置于截留分子量为3.5kDa的透析袋内，在1L去离子水中透析24h以除去多余的ICG，冷冻干燥得到CNC-g-PCL-b-PDMAEMA@DOX/ICG，简写为P@DOX/ICG，即所述的共包载药物和光热剂的纳米粒子。
光热转换性能探究：取ICG浓度为10μg/mL的游离ICG、P@ICG和P@DOX/ICG的PBS溶液(pH＝7.4)以及空白PBS溶液(pH＝7.4)各5mL，用808nm的2.0W/cm2的近红外激光器(长春镭仕光电科技有限公司，MW-GX-808/5000mW)分别照射上述溶液，每个样品照射10min，温度用带热电偶探针的温度计每30s测一次温度。
图10为实施例5的光热转换曲线性能图。由图10可得：空白PBS溶液未显示出明显的温度变化，证明808nm的近红外光对正常组织无损伤；而在10min的近红外光照射下，游离ICG，P@ICG和P@DOX/ICG均升温到40℃以上；说明无论是单独负载ICG还是同时负载ICG和DOX均可以达到较好光热治疗的效果。
实施例6
体外释放实验
pH响应药物释放实验：称取两份5mg实施例5制备的P@DOX/ICG分别分散于5mL的pH＝5.0的醋酸盐缓冲液和5mL的pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，得到分散液。将上述分散液分别置于透析袋(截留分子量为3.5kDa)中，转入40mL相同pH值的同种缓冲液中，再置于药物溶出仪，在37℃，110rpm转速下进行体外释放。定时取样3mL进行紫外分析(测定波长为485nm)，并同时补加3mL新鲜缓冲液。用紫外分光光度法(岛津公司，UV-2450)测定不同时间释放液中DOX浓度，绘制体外释放曲线，结果见图11。
图11为实施例6的pH响应药物释放实验结果性能图，由图11可见，在pH＝7.4，37℃时，80h后，仅有不到40％的DOX从P@DOX/ICG中释放出来，而在pH＝5.0的条件下，DOX的释放量增加到80％。由此证明，药物载体具有pH响应药物释放性能。这主要归功于两方面的原因：一是酸性条件下，药物DOX的溶解性增加，导致药物释放加快；二是外层的PDMAEMA嵌段具有pH响应性能，在酸性条件下，PDMAEMA上的叔氨基发生部分质子化使外层变得疏松，有利于药物从载体中释放出来。
近红外光触发药物释放实验：将两份1mg实施例5制备的P@DOX/ICG分别分散于将1mL醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中，分别标记为P1和P2，将二者置于透析袋(截留分子量为3.5kDa)中；之后，将透析袋分别置于10mL PBS缓冲液(V0＝40mL，pH 5.0)中，再将其放入药物溶出仪，在37℃，110rpm转速下进行体外释放。对于P1，每隔2h，使用近红外激光(808nm，1W/cm2，长春镭仕光电科技有限公司，MW-GX-808/5000mW)照射5min；对于P2，则不进行照射处理。对于P1和P2，每隔1h取样200μL，并补加200μL新鲜缓冲液。用紫外分光光度法(测定波长为485nm，岛津公司，UV-2450)测定不同时间释放液中DOX的浓度，绘制体外释放曲线，结果见图12。
图12为实施例6的近红外光触发药物释放实验结果性能图，由图12可见，对于P1，第一次激光照射后(1h)，DOX从P@DOX/ICG中的累计释放量从2.8％迅速增长至41.5％，而在随后的第3h和第5h，P@DOX/ICG溶液接受激光照射后，DOX的释放量分别从42.7％和50.9％分别增长至49.6％和54.3％，最终P@DOX/ICG在13h内实现了超过84％的药物释放，约为同时刻同样条件下无光照的P2的药物释放量的5倍，由此证明近红外激光对DOX药物释放具有显著的促进作用。
实施例7
药物载体P@DOX/ICG的细胞毒性实验
将HepG2细胞接种到96孔培养板上，细胞密度为每孔5×104个细胞，37℃过夜培养细胞，并在每孔中加入200μL的DMEM培养基(低糖型，购买于北京杰辉生物有限公司)，并将细胞置于5％CO2培养箱中于37℃培养24h，使细胞充分贴壁生长，然后进行如下的操作：
空白药物载体组：首先，将空白药物载体CNC-g-PCL-b-PDMAMEMA(实施例1制备得到)和DMEM培养基混合，分别配成浓度1，5，10，100，200，400μg/mL的空白载体溶液；之后，移走96孔板中从第2列到第8列所有孔中的细胞培养介质后，在第2列中加入200μL新鲜的DMEM培养介质，作为对照。从第3列到第8列，依次加入200μL的浓度为1，5，10，100，200，400μg/mL的空白载体溶液，每个浓度的溶液加入到孔板的一列中，最后，将所有细胞置于5％CO2培养箱中于37℃培养24h。
游离DOX组：首先，将DOX(99％，购买于北京华联化学材料有限公司)和DMEM培养基混合，分别配成浓度0.1，1，2，5，10，20μg/mL的DOX溶液，之后，移走96孔板中从第2列到第8列所有孔中的细胞培养介质后，在第2列中加入200μL新鲜的DMEM培养介质，作为对照。从第3列到第8列，依次加入200μL的浓度为0.1，1，2，5，10，20μg/mL的DOX溶液，每个浓度的溶液加入到孔板的一列中，最后，将所有细胞置于5％CO2培养箱中于37℃培养24h。
P@DOX/ICG组：首先，将P@ICG/DOX(实施例5制备得到)和DMEM培养基混合，分别配成浓度0.1，1，2，5，10，20μg/mL的P@ICG/DOX溶液，之后，移走96孔板中从第2列到第8列所有孔中的细胞培养介质后，在第2列中加入200μL新鲜的DMEM培养介质，作为对照。从第3列到第8列，依次加入200μL的浓度为0.1，1，2，5，10，20μg/mL的P@ICG/DOX溶液，每个浓度的溶液加入到孔板的一列中，最后，将所有细胞置于5％CO2培养箱中于37℃培养24h。
P@DOX/ICG+激光组：首先，将P@ICG/DOX(实施例5制备得到)和DMEM培养基混合，分别配成浓度0.1，1，2，5，10，20μg/mL的P@ICG/DOX溶液，之后，移走96孔板中从第2列到第8列所有孔中的细胞培养介质后，在第2列中加入200μL新鲜的DMEM培养介质，作为对照。从第3列到第8列，依次加入200μL的浓度为0.1，1，2，5，10，20μg/mL的P@ICG/DOX溶液，每个浓度的溶液加入到孔板的一列中，孵育4h后，立刻除去培养基，加入200μL新鲜培养基，然后，使用激光(808nm，2W/cm2，照射时长2min，长春镭仕光电科技有限公司，MW-GX-808/5000mW)处理细胞。最后，将所有细胞置于5％CO2培养箱中于37℃培养24h。
培养24h后，空白药物载体组、游离DOX组、P@DOX/ICG组和P@DOX/ICG+激光组细胞均进行以下处理：吸走培养基，加入200μL的PBS缓冲液(pH＝7.4)润洗细胞后除去，然后每孔加入20μL的3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液和180μL的DMEM培养基，再培养4h；最后，除去未还原的MTT溶液和培养介质，每孔加入200μL的二甲基亚砜，避光在37℃的摇床中振荡15min，使甲瓒完全溶解。在酶标仪(深圳汇松MB-530)上检测每个孔在490nm处的吸光度，计算细胞存活率。所述3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液的浓度为5mg.mL-1，配制方法为：称取MTT250 mg粉末溶解在50mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中。
图13是实施例7的空白药物载体组的细胞毒性结果示意图，从图中可知，空白聚合物刷CNC-g-PCL-b-PDMAEMA对HepG2细胞基本无毒，在400mg/L的高浓度下细胞存活率仍然可达80％以上。
图14是实施例7的游离DOX组、P@DOX/ICG组和P@DOX/ICG+激光组的毒性结果示意图。从图中可知，经过24h的培养，在药物较低(浓度为0.1-1μg/mL)时，在不施加近红外光的情况下，相同剂量DOX的P@DOX/ICG的细胞毒性略低于游离DOX，这是由于DOX是小分子，主要通过被动扩散的方式进入细胞，而P@DOX/ICG是通过胞吞的方式进入，前者的细胞内化效率更高。同时，DOX从药物载体中释放是一个缓慢的过程。对于P@DOX/ICG+激光组的情况下，当浓度较低时，其细胞毒性也是略低于游离DOX的，推测其原因可能是，低浓度时，ICG的浓度也较低，无法累积足够的高温使载体发生相变和实现光热治疗。当浓度增加至5μg/mL时，P@DOX/ICG+激光组的细胞毒性基本与游离DOX持平，甚至略高于游离DOX。此时，光热剂ICG产生的局部高温能够导致细胞溶酶体的破坏和载体相变使药物的突释，实现化学和光热协同治疗。综上证明，在近红外光的照射下，P@DOX/ICG具有良好的肿瘤抑制效果。
实施例8
药物载体P@DOX/ICG的细胞内化性能评价
CLSM测试：取2个24孔板，以4×105细胞/孔的细胞浓度将HepG2细胞加入到24孔板中进行培养，培养基为2mL的DMEM(低糖型，购买于北京杰辉生物有限公司，下同)，底部放置载玻片，将细胞接种在载玻片上，并置于温度为37℃、饱和湿度和5％CO2的培养箱中培养过夜，吸走培养基，向其中一个板的所有孔中分别加入2mL的DOX浓度为50mg/L的游离DOX溶液(所述游离DOX溶液由DOX加入到DMEM中配置而成)，记为A板；另外一个板的所有孔中分别加入溶度为50mg/L的P@DOX/ICG溶液(P@DOX/ICG溶液由实施例5制备的P@DOX/ICG和DMEM配置而成)，记为B板，A板和B板均在37℃、5％CO2的培养箱中培养，对于A板，在培养4h的时刻吸走培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞两次，用浓度为4％的多聚甲醛溶液固定30min，然后去掉多聚甲醛溶液，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗细胞两次，最后用染料Hochest33342(99％，购买于上海研生实业有限公司)染色15min，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗细胞三次，置于载玻片后进行封片处理。将载玻片放置于激光共聚焦显微镜(CLSM,Zeiss,LSM 510,Germany)下进行观察，以488nm为激发波长，检测575nm的发射强度；对于B板，在培养15min，0.5h，2h和4h的时刻，每次取一列，吸走培养基，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗细胞两次，用浓度为4％的多聚甲醛溶液固定30min，然后去掉多聚甲醛溶液，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗细胞两次，最后用染料Hochest 33342(99％，购买于上海研生实业有限公司)染色15min，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗细胞三次，置于载玻片后进行封片处理，将载玻片放置于激光共聚焦显微镜(CLSM,Zeiss,LSM 510,Germany)下进行观察，以488nm为激发波长，检测575nm的发射强度。
图15为实施例8的CLSM测试结果图，其中A对应A板培养4h的时刻吸走培养基的样品，B对应B板培养15min时刻吸收培养基的样品，C对应B板培养0.5h时刻吸走培养基的样品，D对应B板培养2h时刻吸收培养基的样品，E对应B板培养4h时刻吸收培养基的样品。由图15可得：从左到右(DOX和细胞核已经在图中标出)，当为B板培养15min时刻吸收培养基的样品时，P@DOX/ICG首先出现在细胞质中，有一小部分药物出现在细胞核。随着培养时间的增长，越来越多的药物出现细胞核内，当为B板培养4h时刻吸收培养基的样品时，大部分药物定位在细胞核内，证明P@DOX/ICG具有较好的细胞内化性能。但是，其荧光强度明显没有游离DOX的强，这是因为DOX是小分子，是通过被动扩散进入细胞的，而P@DOX/ICG是利用胞吞进入细胞的，因而，在相同的时间内游离DOX进入细胞核的速度快于P@DOX/ICG，这与细胞毒性实验的结果一致。
实施例2和3的制备的CNC-g-PCL-b-PDMAEMA均可用于负载光热粒子和抗癌药物，它们的光热性能、药物释放性能、肿瘤抑制效果(细胞毒性)和细胞内化性能和实施例1制备的CNC-g-PCL-b-PDMAEMA的效果持平。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种以纤维素纳米晶为基体的刷状聚合物，其特征在于，具有式Ⅰ所示结构：
其中，m＝300～1000，n＝17～41，x＝5～9。
2.权利要求1所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将ε-己内酯、纤维素纳米晶体、辛酸亚锡和甲苯混合；抽真空然后通入保护气体；在60～95℃和搅拌条件下反应20～24h，最后加入盐酸溶液终止反应，经沉淀、过滤、干燥后得到CNC-g-PCL；
(2)将步骤(1)得到的CNC-g-PCL、四氢呋喃、三乙胺和2-溴代异丁酰溴混合，抽真空然后通入保护气体，在冰浴中反应4～5h，再在室温下反应24～30h，经离心、沉淀、过滤、干燥后得到CNC-g-PCL-Br大分子引发剂；
(3)将步骤(2)制备的CNC-g-PCL-Br大分子引发剂、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺和溴化铜溶于甲苯中，抽真空然后通入保护气体，搅拌后加入辛酸亚锡，在60～90℃下，反应20～24h；去除溴化铜，经过滤、滤液后处理，即得到CNC-g-PCL-b-PDMAEMA刷状聚合物，即所述的以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物。
3.根据权利要求2所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述ε-己内酯：纤维素纳米晶体：辛酸亚锡的质量比为2～8：0.5～1：0.02～0.04。
4.根据权利要求2所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述甲苯和ε-己内酯的体积质量比为3～5mL/g；步骤(1)所述盐酸溶液和ε-己内酯的体积质量比为0.2～0.3mL/g。
5.根据权利要求2所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述盐酸溶液的浓度为1～3mol/L；
步骤(1)所述纤维素纳米晶体为棒状结构，所述纤维素纳米晶体的长度为100～200nm，所述纤维素纳米晶体的直径为10～20nm。
6.根据权利要求2所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述沉淀是指在反应后的溶液中加入溶液10倍体积的0℃的正庚烷进行沉淀；步骤(2)所述沉淀是指将离心得到的上清液加入到上清液10倍体积的0℃的正己烷进行沉淀。
7.根据权利要求2所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述CNC-g-PCL：三乙胺：2-溴代异丁酰溴的质量比为2～4：0.95～2.18：2.08～4.65；
步骤(2)所述四氢呋喃和CNC-g-PCL的体积质量比为3～5mL/g。
8.根据权利要求2所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述保护气体为惰性气体或氮气；
步骤(3)所述滤液后处理的方式为将滤液旋蒸蒸发、加入滤液10倍体积的正己烷中沉淀、然后进行离心、过滤和干燥。
9.根据权利要求2所述以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述CNC-g-PCL-Br大分子引发剂：溴化铜：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯：1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺：辛酸亚锡的质量比为0.381～0.762：0.01～0.02：4.52～9.21：0.011～0.023：0.13～0.30；
步骤(3)所述甲苯和CNC-g-PCL-Br大分子引发剂的体积质量比为使用50～69mL/g。
10.权利要求1所述一种以纤维素纳米晶体为基体的刷状聚合物在制备抗癌药物载体中的应用。
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