CN110623890A - 滇黄精提取物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种滇黄精提取物的应用，具体为在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。所述的抗皮肤衰老基因可为hbegf基因、igf1基因、CD44基因和csf2基因中的一种或多种。所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂可以增强和支持皮肤组织结构的稳固性，增加皮肤表皮的厚度，延缓皮肤衰老，可用于化妆品或者护肤品中。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物领域及日化领域，具体涉及一种滇黄精提取物的应用。
背景技术
皮肤被覆盖于整个人体表面，与外界环境直接接触，除了保护机体免受外界各种因素的伤害外，又是反应全身健康状态的一面镜子。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、淋巴管及肌肉。在真皮和表皮的连接区域又称为基底膜带，不仅是一层结构模型，而且具有多方面的功能，基底膜是上皮细胞的支撑垫，在上皮细胞组织与结缔组织之间起结构连接作用，同时，还具有其他方面的作用。比如，基底膜作为细胞的选择性通过屏障，通常可以阻止结缔组织细胞与基底膜上的上皮细胞接触，但允许淋巴细胞、巨噬细胞和神经元突触穿越通过；此外，细胞的形态、细胞的极性、细胞代谢、质膜上蛋白质的分布、细胞存活、细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与基底膜有着非常密切的关系。
胰岛素样生长因子igf1(insulin like growth factor 1)由该基因编码胰岛素样生长因子1，该蛋白质在功能和结构上与胰岛素相似，并且是参与调节生长和发育的蛋白质家族的成员。胰岛素样生长因子1可以促进角质细胞迁移，影响皮肤细胞的生长和发育，胰岛素样生长因子1水平的上调有助于延缓衰老。
肝素结合性表皮生长因子hbegf(heparin binding EGF like growth factor)基因编码肝素结合的EGF样生长因子，是结合并激活EGF受体生长因子的EGF家族的成员。hbegf在病理生理过程中起关键作用，包括癌症。在人体皮肤的部分厚度损伤后，会产生表皮生长因子，促进细胞增殖，对皮肤伤口愈合有益。此基因表达上调可有助于延缓皮肤衰老。
CD44是细胞表面跨膜糖蛋白，除了可以促进表皮层细胞细胞分化和增殖外，它还能够与透明质酸结合，因而也被称为透明质酸的受体。细胞通过CD44将透明质酸绑定在细胞外间隙，用来维持细胞间的高含水量。此外，CD44还在透明质酸的合成过程中起重要作用，皮肤细胞中CD44的表达量决定了皮肤中透明质酸的含量。但随着年纪增长，体内CD44会逐渐减少、活力也跟着下降，这也是肌肤干燥缺水的问题根源。通过激活CD44的表达，能够提升自体更新、制造透明质酸的工作效能，提升皮肤的保湿能力，从而延缓皮肤衰老。
集落刺激因子csf2(colony stimulating factor 2)基因编码的蛋白为集落刺激因子2，也称为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，是一种广谱的细胞因子，对早期的造血祖细胞具有促增殖的作用。主要作用于髓系祖细胞，通过与其高亲和力受体结合发挥生物学效应，使其迅速进入细胞周期向粒系和巨噬系分化，最后成为成熟细胞，并能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能。集落刺激因子2是一种重要的细胞长寿因子，与皮肤衰老息息相关。
因此，研究如何提高皮肤关键部位及功能相关的基因的表达，对于提高皮肤真表皮结构的稳定性，延缓皮肤衰老具有重要意义。
滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl)百合科黄精属草本植物，根状茎近圆柱形或近连珠状，结节有时作不规则菱状，肥厚。茎顶端作攀援状。叶轮生，每轮3-10枚，条形、条状披针形或披针形，先端拳卷。花序具花，总花梗下垂，花梗苞片膜质，微小，通常位于花梗下部；花被粉红色，裂片长3-5毫米；花丝长3-5毫米，丝状或两侧扁，花药长4-6毫米；子房长4-6毫米。浆果红色，直径1-1.5厘米，具7-12颗种子。花期3-5月，果期9-10月。产中国云南、四川、贵州。生于林下、灌丛或阴湿草坡，有时生于岩石上，海拔700-3600米，在越南、缅甸也有分布。根状茎也作黄精用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种滇黄精提取物的应用，具体为在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂可以增强和支持皮肤组织结构的稳固性，增加皮肤表皮的厚度，延缓皮肤衰老，可用于化妆品或者护肤品中。
本发明提供了一种滇黄精提取物在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。
所述的抗皮肤衰老基因可为hbegf基因、igf1基因、CD44基因和csf2基因中的一种或多种。
所述的滇黄精提取物可采用本领域常规的溶剂对滇黄精进行提取，还可采用乙醇和/或水提取，又可采用水(即滇黄精的水提物)提取。
所述的滇黄精提取物可为滇黄精全草的提取物，也可为滇黄精任意部位的提取物，例如为滇黄精根茎的提取物。
所述的滇黄精提取物的制备方法可为本领域的常规方法，还可包括下列步骤：
(1)在滇黄精的粉末中加入水进行提取，过滤，得滤液；
(2)滤液干燥后即可。
步骤(1)中，所述的滇黄精的粉末可为滇黄精根茎的粉末。
步骤(1)中，所述的滇黄精的粉末的目数可为20～60目，例如20目。
步骤(1)中，所述的水的加入量可为所述滇黄精的粉末的体积的8-12倍，例如10倍。
步骤(1)中，所述的提取的温度可为80-100℃，例如90℃。
步骤(1)中，所述的提取的次数可为1次以上，例如2次。
步骤(1)中，所述的提取的时间可为0.5-2h，例如1h。
步骤(1)中，所述的过滤的方法可为离心。所述的离心的速度可为6000-10000rpm，例如8000rpm。所述的离心的时间可为8-12分钟，例如10分钟。
步骤(2)中，所述的干燥可为冷冻干燥。
在本发明的一些方案中，所述的滇黄精提取物的制备方法可包括下列步骤：
(1)在滇黄精根茎的粉末中加入10倍于所述滇黄精根茎的粉末的体积的水，90℃水浴加热提取2次，每次1h，离心过滤后将滤液合并；所述的滇黄精的粉末的目数为20目；所述的离心的速度为8000rpm，所述的离心的时间为10分钟；
(2)滤液冷冻干燥后即可。
所述的滇黄精提取物在抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的浓度可为8-120μg/mL，还可为10-100μg/mL。
所述的滇黄精提取物在针对hbegf基因、igf1基因和CD44基因中的一种或多种基因的表达上调剂中的浓度可为8-12μg/mL，例如10μg/mL。
所述的滇黄精提取物在针对csf2基因的表达上调剂中的浓度可为80-120μg/mL，例如100μg/mL。
其中，所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂可用于化妆品或者护肤品中。
所述的滇黄精提取物可用于化妆品或者护肤品中。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种滇黄精提取物的应用，具体为在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂可以增强和支持皮肤组织结构的稳固性，增加皮肤表皮的厚度，延缓皮肤衰老，可用于化妆品或者护肤品中。
附图说明
图1为对照组的3D皮肤模型切片快蓝染色结果
图2为10ug/mL滇黄精提取物的3D皮肤模型切片快蓝染色结果
图3为100ug/mL滇黄精提取物的3D皮肤模型切片快蓝染色结果
图4为10ug/mL滇黄精提取物促进抗衰老功效相关基因hbegf的表达
图5为10ug/mL滇黄精提取物促进抗衰老功效相关基因igf1的表达
图6为10ug/mL滇黄精提取物促进抗衰老功效相关基因CD44的表达
图7为100ug/mL滇黄精提取物促进抗衰老功效相关基因csf2的表达
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1滇黄精提取物的制备
取滇黄精根茎20g，粉碎至20目左右，加入10倍体积去离子水浸没后，用90℃水浴加热提取1h，离心(8000rpm，10min)过滤得滤液，重复上述提取步骤一次，合并滤液，滤液冷冻干燥，得到滇黄精提取物约11.9g。
实施例2皮肤模型的制备
从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(NHDF)及人原代角质细胞(NHEK)(提取方法参考文献：伍津津，朱堂友.皮肤组织工程[M].北京：人民军医出版社，2009：72－103)。将人原代成纤维细胞复苏，复苏过程为：将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，离心机1000rpm/min离心10min。将复苏所得细胞使用DMEM培养基在37℃的二氧化碳培养箱中培养一周后，进行消化(将细胞从培养箱中取出，吸弃原培养基，加PBS 15mL润洗细胞一次，加8mL 0.05％胰蛋白酶后，于37℃的二氧化碳培养箱中孵育8min，取出，超净台中加10mL含FBS的DMEM培养基，移液枪取出细胞于50mL离心管中，离心机中1000rpm，离心10min后弃上清，细胞待用)后与胶原混合进行真皮阶段培养，于37℃的二氧化碳培养箱中培养3～4天，然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞，消化接种(5×104个细胞)到真皮阶段的皮肤模型表面，依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至18天得到可用于检测的3D皮肤模型(制备皮肤模型的具体步骤详见ANNIE F.BLACK,Ph.D.CHARBEL BOUEZ,al.Optimization and Characterization of an Engineered Human SkinEquivalent.TISSUE ENGINEERING Volume 11,Number 5/6,2005.Mary Ann Liebert,Inc.)。
实施例3滇黄精提取物的效果测试
1.1皮肤模型的培养
用实施例1制备的滇黄精提取物以培养基为溶剂配置终浓度为10mg/mL的滇黄精提取物溶液，在皮肤模型培养至第3天，按照测试浓度加入滇黄精提取物溶液，并以未加提取物溶液的模型为对照，18天后将3D皮肤模型切片，快蓝染色，观察滇黄精提取物对皮肤表皮的影响，同时提取测试组和对照组皮肤模型中RNA进行检测。
1.2 RNA的提取
剪取3D皮肤模型组织约2*3mm，放入2mL EP管中；加入1mL Trizol，加入2颗钢珠，用组织破碎仪匀浆，50Hz超声5min后；9000rpm、4℃条件下离心1min，将上清液转移到新的1.5mL EP管中；加入200μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5min；9000rpm、4℃条件下离心15min；移转上层水相(约400μL)于新1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm、4℃条件下离心10min；弃上清液后，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，8000rpm、4℃条件下离心5min；弃上清液后，沉淀空气干燥5～10分钟后，溶于30μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水中；分光光度计测定RNA浓度。
1.3基因表达分析
根据QuantiGene R 2.0Plex Assay试剂盒进行RNA的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析。
1.4结果判定
在基因表达分析的试验中，如果添加了滇黄精提取物的阳性组相对于空白对照组，抗皮肤衰老基因的表达量明显升高，可推断舌岩白菜具有延缓衰老的功效。
滇黄精提取物的效果总结如下所述。
1、滇黄精提取物对皮肤表皮的影响
将图2、图3与图1(图1、图2和图3均为显微镜下拍摄得到，显微镜放大倍数均为10倍)对比可知，在添加滇黄精提取物后，对比未处理组的重建皮肤模型，10ug/mL和100ug/mL滇黄精提取物可以有效地增加重建皮肤模型表皮的厚度，基底层上细胞排列更加紧密，角质层分化更加完善。这说明滇黄精提取物具有潜在延缓皮肤衰老，提升皮肤整体活力和健康状况的作用。
2、滇黄精提取物对抗皮肤衰老基因表达的影响
如图4所示，添加10μg/mL滇黄精提取物后，与对照组(NT)相比，在皮肤模型中抗衰老功效相关基因hbegf表达上调1.9倍。
如图5所示，添加10μg/mL滇黄精提取物后，与对照组(NT)相比，在皮肤模型中抗衰老功效相关基因igf1表达上调1.47倍。
如图6所示，添加10μg/mL滇黄精提取物后，与对照组(NT)相比，在皮肤模型中抗衰老功效相关基因CD44表达上调1.37倍。
由此可推断10μg/mL浓度下的滇黄精提取物能够提高抗衰老功效相关基因的表达，有提高皮肤结构稳定和延缓衰老的功效。此外，CD44基因表达的上调可以促进透明质酸的合成，增加皮肤中透明质酸的含量，提高皮肤保湿能力。
如图7所示，添加100μg/mL滇黄精提取物后，与对照组(NT)相比，抗衰老功效相关基因csf2表达上调1.6倍。由此可推断100μg/mL浓度下的滇黄精提取物具有提高抗衰老功效相关基因的表达，有提高皮肤结构稳定和延缓衰老的功效。
Claims (10)
1.一种滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl)提取物在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗皮肤衰老基因为hbegf基因、igf1基因、CD44基因和csf2基因中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的滇黄精提取物为滇黄精的水提物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的滇黄精提取物为滇黄精根茎的提取物。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的滇黄精提取物的制备包括下列步骤：
(1)在滇黄精的粉末中加入水进行提取，过滤，得滤液；
(2)滤液干燥后即可。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的滇黄精的粉末为滇黄精根茎的粉末；
和/或，所述的滇黄精的粉末的目数为20～60目；
和/或，所述的水的加入量为所述滇黄精的粉末的体积的8-12倍，例如10倍；
和/或，所述的提取的温度为80-100℃，例如90℃；
和/或，所述的提取的次数为1次以上，例如2次；
和/或，所述的提取的时间为0.5-2h，例如1h；
和/或，所述的过滤的方法为离心；
和/或，所述的干燥为冷冻干燥。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的滇黄精提取物的制备包括下列步骤：
(1)在滇黄精根茎的粉末中加入10倍于所述滇黄精根茎的粉末的体积的水，90℃水浴加热提取2次，每次1h，离心过滤后将滤液合并；所述的滇黄精的粉末的目数为20目；所述的离心的速度为8000rpm，所述的离心的时间为10分钟；
(2)滤液冷冻干燥后即可。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的滇黄精提取物在抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的浓度为8-120μg/mL，例如10-100μg/mL。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的滇黄精提取物在针对hbegf基因、igf1基因和CD44基因中的一种或多种基因的表达上调剂中的浓度为8-12μg/mL，例如10μg/mL；
和/或，所述的滇黄精提取物在针对csf2基因的表达上调剂中的浓度为80-120μg/mL，例如100μg/mL。
10.如权利要求1-9任一项所述的应用，其特征在于：所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂用于化妆品或者护肤品中。
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