CN110621789A - 用于搜索和鉴定发生实体瘤的前驱遗传状况的方法 - Google Patents

用于搜索和鉴定发生实体瘤的前驱遗传状况的方法 Download PDF

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Abstract

用于搜索和鉴定健康受试者中发生实体瘤的前驱遗传状况的方法包括遗传稳定性或不稳定性状况的评价循环和所述评价的至少一个重复循环。对所述受试者定期进行所述重复循环，频率取决于前一循环的结果。每个循环包括以下步骤：‑获取生物材料的样品，从所述生物材料分离DNA，扩增并测序所分离的DNA；‑验证在被考虑的样品的预定组的基因中选择的突变的存在，所述组的基因和所述突变与发生实体瘤相关；‑所述预定组的基因包括与一种或多种实体瘤有关的基因或热点组合的亚组，或与实体瘤有关的基因全组合；‑验证对每个基因和对每个评价循环所检测到的突变的频率，所述突变选自前述所选择的突变；‑记录对每个基因或每组基因所检测到的突变以及它们的频率；‑对于每个重复循环，基于所检测到的突变频率以及基于所述突变频率的增加，定义或更新所述受试者的遗传不稳定性指数，即总体遗传不稳定性指数(IT)或对于单个基因的遗传不稳定性指数(IG)；‑在每个重复循环中，基于超过对每个单个基因或每组基因定义的所述遗传不稳定性指数(IT、IG)的阈值(ITS、IGS)，评价所述受试者进入即将发生一种或多种实体瘤或多组实体瘤的前驱遗传状况。

Description

用于搜索和鉴定发生实体瘤的前驱遗传状况的方法
技术领域
本发明总体上涉及癌症预防的领域，并且更详细地涉及实体瘤预防的领域。
具体地，本发明包括用于在个体中搜索和鉴定作为发生实体瘤的前驱状态的遗传状况以及对在被考虑处于风险中的个体中存在形成此类肿瘤的显著可能性的统计学预测的方法。
背景技术
实体瘤由一个或多个组织块构成，所述组织块由肿瘤细胞和间质组成(依次由不同类型的细胞和细胞外基质构成)，其特征是异常和不受控制的生长，在一些情况下实体瘤可以导致全身病理状况。
肿瘤是由遗传改变引起的病理状况；它们以不同的步骤发展，在时间上延续，其中在一个或多个细胞的遗传产物中积累了一系列后续突变。
遗传不稳定性状况与受试者的遗传改变增加相关，它是肿瘤形成的特定风险的标志物。这些遗传改变增加了载体细胞形成肿瘤细胞系的风险。
关于结直肠癌，已经对此过程进行了充分的研究。在这些肿瘤的发生中，第一突变涉及称作看门基因/看管基因的基因，该基因负责控制遗传稳定性，该第一突变导致正常上皮细胞生长的选择性优势，使其在周围细胞中占优势并且成为显微镜下可见的克隆。
在结肠中最熟知的看门基因是APC基因。
几乎所有(约80％)的结直肠肿瘤以APC基因突变为特征。由此突变引起的小腺瘤生长非常缓慢，然而，如果在另一基因中发生第二突变，如例如在KRAS基因(或ATK1等)中发生，则此突变触发新的克隆生长期，导致所累及细胞的数目扩大。仅具有APC突变的细胞可以保持在腺瘤中，但相对于两种(或更多种)基因有突变的那些细胞它们的数目是有限的。
此序贯突变的过程，紧接着相应的克隆扩增，继续发生其他基因中的突变，诸如PIK3CA、SMAD4和TP53中的突变，具有生成恶性肿瘤的高可能性，所述恶性肿瘤可以延伸穿过下面的基底膜并转移，一般首先转移至区域淋巴结，然后转移至远隔器官，诸如肝脏或肺。
在最近的十年期间，一系列深入的测序公开了大多数常见形式的人类癌症的基因组全景图。对许多肿瘤的基因组的测序已经提供了与几千种突变和其他基因组改变有关的信息。目前，已经测序了超过一万个肿瘤基因组，并且随着测序成本的逐渐减小，许多其他肿瘤基因组将在不久的将来被表征。
对肿瘤基因组的测序允许对不同的“具有驱动突变的基因”进行分类并且将允许对许多其他基因进行分类。驱动突变是基因内提供显著生长优势的突变。
至今，已进行的研究已经允许鉴定大约140个基因，所述基因当突变时可以促进或“驱动”肿瘤形成。典型的肿瘤一般可以包含2-8个这样的“驱动基因”突变。其余的突变被认为是短暂的，并且它们不会提供任何细胞生长优势。
驱动基因经常参与对细胞的关键分子通路的调节，其以不同的形式和模式调节三种主要的细胞过程：细胞分化、存活(通过促进凋亡或抗凋亡信号)和维持。目前，在基础癌症研究中最迫切的需求之一是对这些不同通路的深入理解。然而，甚至对肿瘤基因组结构目前所达到的理解程度足以指导一些当前的治疗选择并且已确定开发在减少癌症发病率和死亡率方面更有效的方式。
筛查和早期诊断程序在改善癌症患者健康生存期和减少癌症患者死亡率方面具有重要作用。由于用于早期诊断的无创方式有助于促进患者的配合，因此明确建议在筛查和预防程序中包括它们。
对肿瘤病理学的分子发病机制的了解增多和分子分析的新技术的快速发展有助于开发和实现对体液中早期分子改变的鉴定和分析。细胞外DNA(“无细胞DNA”或“cfDNA”)可以见于血清、血浆、尿液和其他体液中。因此，对cfDNA的取样和分子分析代表了一种“液体活检”，其可以构成各种特定病理状况的一种“循环影像”。
在血液中，凋亡似乎是最常见的生成cfDNA的过程，尽管在癌症患者中，可能不能完全忽视由坏死过程提供的部分。一项分析来自32名患有4期结直肠癌的患者的血浆的cfDNA的令人关注的研究显示在34.4％的患者中，所获取的DNA具有两个等级尺寸(166bp和332bp)。
Stroun等人已经描述了可以在患者的cfDNA中鉴定出不同的癌症改变。之后发表的多篇论文已经证实了cfDNA含有与肿瘤的存在相关联的特异性改变，诸如与肿瘤细胞直接有关的特定基因的突变、甲基化和拷贝数目的变化(“拷贝数变化”或CNV)，由此证实循环肿瘤DNA(ctDNA)的存在。
已经进行了目的是使所选择的组织和血浆样品相互关联的各种研究，以便确认对循环cfDNA的分析可以用作诊断手段。
在来自17名转移性乳腺肿瘤患者的60个肿瘤组织和31个血浆样品中利用NGS技术(下一代测序)对50个肿瘤基因(覆盖2,800个COSMIC突变，Catalogue Of SomaticMutations In Cancer(癌症体细胞突变目录)-http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)进行的评价已经揭示了组织和血浆之间的76％一致性。从这些数据作者得出结论：血浆可以被认为是被采用用于筛查肿瘤的生物样品，作为转移性活检物的替代品。
上面提到的结果已经在一组34名患有18种不同类型肿瘤的患者中得到证实：该分析涉及组织和血浆样品中46个基因并且覆盖6,800个COSMIC突变。34名患者中有27名患者显示在组织样品中发现的突变与在ctDNA中发现的那些突变之间有97％的一致性。因此，基于ctDNA的NGS分析可以彻底改变对患有潜在可治愈的或转移性的癌症病理状况的患者的管理。
发明内容
技术问题
对风险状态的评价构成测试程序和遗传分析的重要组成部分。有很大的可能性，在不久的将来此种类型的方式将以系统化的方式在癌症病理状况的预先评估中实施。
另一方面，越来越频繁的是“健康”人要求进行遗传测试以测试对严重病理状况的倾向或检测病理前兆状态。也由于此种原因，医生应当在他们的常规监测程序中引入用于定义和管理风险的技术，以及用于鉴定肯定的或非常可能的病理前兆状况的技术。
遗传风险是指与确定的病理状况(关于本发明，特别是癌症病理状况)特异性相关联的突变的个体携带者实际上形成此病理状况的可能性。另一方面，鉴定病理前兆状况或发生病理状况的前驱状况涉及检测指示遗传不稳定性状况的生物分子信号，所述遗传不稳定性状况由于随后的演化可以随着时间推移肯定地或非常可能地导致所述病理状况的发生。
鉴于此，如在文中已经多次指出的那样，致癌作用受环境因素和遗传倾向两者影响，与特定病症相关的遗传背景极大地影响对与此特定病症相关联的风险的定义。
根据Wang E.等人，可以采用基于一系列特征性要素(的网络)的算法来生成肿瘤的关键成分的遗传模型并将突变的基因型与临床表型联系起来。此模式(和其他类似的模式)的使用说明了基于患者的基因组序列的个体谱预测可能的肿瘤治疗靶标、复发的可能性以及发生肿瘤的风险的策略。
综上所述，来源于基于特征性要素的网络的模型的预测方法可以用于癌症病理状况项目的诊断和优化管理以及预防。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种能够对临床上健康的个体获得他/她进入发生一种形式的实体瘤的前驱遗传状况的评价的监测方法，所述前驱遗传状况是或早或晚几乎肯定将使所述个体形成被监测的所述形式的肿瘤的状况。
发明概述
这个和其他目的通过本发明获得，本发明涉及一种在健康个体中搜索和鉴定遗传状况的方法(基于算法和相关联的数据库)，所述遗传状况是形成除脑肿瘤以外的实体瘤的前驱状态。此方法基于一系列关于突变频率的定期评价循环定义了上面提到的状况，所述定期评价循环涉及从与发生上述实体瘤相关的那些基因中选择的基因组合。
所述方法包括从个体获取生物样品(由体液诸如血液、尿液或脊髓液构成)，分离并扩增DNA以及对其测序。后续的分析步骤包括评价涉及上述基因组合的一个或多个突变的存在，所述突变选自所监测的基因的已知突变清单并且指示向形成肿瘤细胞的进化。
具体地，对在COSMIC数据库(Catalogue Of Somatic Mutations InCancer(癌症体细胞突变目录)-http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)中归类的50个基因以及总计2,800个突变利用NGS技术(下一代测序)进行评价。
每个评价循环对每个被监测基因检测涉及其的突变的存在，特别关注发生在已知热点(在癌症患者中频繁突变的位置)的突变。在突变的情况下，检查此被检测到的突变是否已经在先前的评价循环中被发现以及在哪个水平被发现(突变百分比或分数-等位基因频率)。在阴性的情况下，登记涉及此基因的新突变，并且算法计算指示突变频率随时间推移显示的趋势的值。该值构成系统的“关键风险指标”。所述趋势以数值表示，该数值通过计算突变频率的最后一个值与在先前评价循环中获得的值之间的关系获得，并且其趋势可以以图表表示以提供对遗传稳定性或不稳定性的水平的指示。
一旦根据本发明的鉴定方法已经检测到超过了对突变频率定义的阈值水平，则发出关于进入遗传不稳定性路径的报告，在此路径期间进一步的突变将使所述个体随着时间推移肯定地或非常可能地形成实体瘤。
被考虑用于每个评价循环的基因组合和它们的突变可以再次包括与发生实体瘤相关的50个基因的整个范围，或仅包括仅与一种或多种所选择的肿瘤相关的一些基因和热点。
具体地，有可能监测个体的遗传状况，其不稳定性与仅一种类型肿瘤或单一家族的肿瘤的发生相关。在这种情况下，被分析的基因数目限于与该肿瘤或该组肿瘤直接相关的那些。
根据本发明，被分析的基因组合和突变可以基于通过家族史调查获得的受试者既往病史选择。
当所检测到的突变频率显示超过预定值例如10％的生长趋势(该值可以根据随年数累积的数据更新)，该值是给定突变的等位基因频率(根据上文的定义)的增加数(例如，在后续的测试重复中APC基因的突变的等位基因频率从0.1％增加到5％)，监测系统将与被检查的组合相关的灵敏度(即，其将要求患者再次进行测试，此次使用相对于第一水平的测试具有更高的灵敏度和分析特异性的不同组合)关于突变增加所涉及的基因增加到直至100％。
所述方法包括评价参数的连续更新，诸如所选择的基因组合的分析循环的重复频率和与被分析的基因相关的灵敏度。具体地，重复频率基于稳定性指数定义；更准确地，较高的不稳定性指数值对应于测试的较高的重复频率，因为设想不稳定性状况自然地趋向增长，并且导致更快地具有新的显著突变的更高可能性。
根据本发明，在后续循环中记录并处理与每个评价循环所分析的DNA相关的所有原始数据和获得的结果，从而因为可用数据的量增加而提高评价的准确度。
为了尽可能创伤少的做出对风险状态的评价和预测，从个体获取用以分离被分析的DNA的生物样品由液体活检物(如本文中已经定义)构成。在本发明的优选实施方案中，液体活检物是外周血样品。
在本发明的实施方案中，液体活检物是尿液。
从生物样品分离并用于风险状态的评价和预测的DNA是cfDNA(无细胞DNA)。
在本发明的实施方案中，cfDNA分离自从外周血样品分离的血浆。
在本发明的另一实施方案中，cfDNA分离自从外周血样品分离的血浆。
根据本发明的方法还包括在收集的液体活检物中搜索ctDNA(循环肿瘤DNA)。
当检测到ctDNA时，评价和预测风险的方法基本上停止执行其任务，因为这意味着至少一个突变系已经导致形成肿瘤细胞。此时，用于风险评价和预测的系统发出目的是将对个体的控制转移到早期检测系统的信息，所述早期检测系统诸如，例如，由本申请人开发并使用的SCED系统——实体癌症早期检测(Solid Cancer Early Detection)。
附图说明
参照附图的附表，在下文的详细描述中指出本发明的特征，在权利要求书中本发明的特征是显而易见的，其中在附图中：
-图1图示了根据本发明的一般实施方案用于搜索和鉴定发生实体瘤时的前驱遗传状况的方法的流程图；
-图2图示了根据本发明的方法在评价突变中涉及的基因组合的列表，所述突变定义了遗传稳定性或不稳定性状况。
具体实施方式
本发明涉及一种用于搜索和鉴定健康个体中发生除脑肿瘤以外的实体瘤的前驱遗传状况的方法，所述方法用于基于个体的遗传稳定性的趋势的演化监测所述个体随时间推移与可能进入所述状况的相关性。
脑肿瘤一般被排除在根据本发明的用于搜索和鉴定发生实体瘤的前驱遗传状况的方法中所使用的方式之外。目前，科学证据不足以允许这种方式也用于脑肿瘤。与发生此类型肿瘤相关联的基因的组还没有被正确地鉴定出来，并且目前，它们似乎主要与DNA甲基化状态有关联，而非与其序列的特定突变有关联。事实上，提出的组合不适合于评价DNA甲基化状态。而且，需要指出的是，如已经由Bettegowda,C.等人(Bettegowda,C.等人，Detection of circulating tumor DNA in early-andlate-stage humanmalignancies.Science translational medicine 6,224ra224,doi:10.1126/ scitranslmed.3007094-2014)所述的那样，血脑屏障非常可能形成过滤器，其极大地减少了体循环中cfDNA的存在。因此，目前的提取和后续分析技术不允许提供足够强以用于分析肿瘤风险的数据。
所述方法包括以预定的间隔执行一系列突变频率的定期评价循环，所述定期评价循环涉及从与发生上述实体瘤相关联的那些基因中选择的基因组合。图1借助于实施例说明了后面将要描述的方法的步骤的可能工作流。在不偏离本发明的范围的前提下，所述工作流的非根本改变是可能的。
除非另外指明，则认为在本处理中使用的技术术语具有本领域普通技术人员普遍和明确已知的含义(例如，“液体活检物”、“DNA分离”、“DNA扩增”、“DNA测序”、“ctDNA”、“cfDNA”、“循环肿瘤细胞”等)。还设定被提及和被意在用于执行根据本发明所述的方法的分子生物学和遗传工程的技术(例如，“NGS-下一代测序”)是实践中普遍使用的标准技术并且也是本领域普通技术人员所熟知的。
对于搜索和鉴定发生实体瘤的前驱遗传状况的每个循环，本发明所提出的方法包括从个体获取生物样品，从所述生物样品分离DNA，然后在适当地扩增DNA的相关级分后对其测序，优选地利用NGS技术测序。
为了尽可能创伤少的做出对风险状态的评价和预测，从个体获取用以分离DNA进行分析的生物样品由液体活检物组成。液体活检物基本上由在个体中循环并由他/她通过体液的大量分泌或排泄产生的液体或半液体生物物质形成。
在本发明的优选实施方案中，液体活检物是外周血样品，如果需要，获取并处理外周血样品以便依据后续的用途而分离血浆或血清。
在本发明的不同实施方案中，液体活检物是尿液。
根据本发明，从生物样品分离并用于评价和预测风险状态的DNA是cfDNA(无细胞DNA)。
大约70年前首次由Mendel和Metis证明了循环的游离DNA即cfDNA(无细胞DNA)的存在。上述DNA来源于坏死细胞(过早死亡)和/或凋亡细胞(程序性死亡)并且通常由所有类型的细胞释放。在发现cf-DNA后约40年，Stroun等人已经证明在cf-DNA中也可以鉴定到特异性的致癌性改变。之后，发表了数篇论文，通过研究与肿瘤相关的特异性改变证实了循环肿瘤DNA(ctDNA)的存在。因此ctDNA是总cfDNA的一部分并且估计在极早期占0.01％-1％，在进展期达40％，如已由Bettegowda,C.等人(Bettegowda,C.等人，Detection ofcirculating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies.Sciencetranslational medicine 6,224ra224,doi:10.1126/scitranslmed.3007094-2014)描述的那样。
如已提到的那样，在血液中，凋亡似乎是生成cfDNA的最常见的过程，尽管在癌症患者中通过坏死过程提供的部分也不能完全忽略。
在血清和血浆中cfDNA的量和变异性似乎在患病患者中要比健康对照中大得多，特别是在晚期肿瘤的情况下(而非早期肿瘤)大得多。
要考虑的是cfDNA的量还受生理病理条件诸如炎性过程影响，并且因为cfDNA的稳定性非常低(从15分钟至几小时)，因此不总是能确保结果的可靠性和一致性。在此情况下，基于测试的定期重复的方式提供了获得较低的假阴性发生率的优势。
利用NGS组合(该组合可以评价癌症涉及的50个基因(参见图2)覆盖60种实体瘤和31种血液肿瘤中的2,800个突变(COSMIC))的研究已经分析了17名乳腺转移性肿瘤患者并且评估了在组织和血浆之间76％的一致性。从这些数据作者得出结论：血浆可以被认为是被采用用于筛查肿瘤的生物样品，作为转移性活检物的替代品。
在本发明的实施方案中，cfDNA分离自从取自个体的外周血样品分离的血浆。
在本发明的不同实施方案中，cfDNA分离自从取自个体的外周血样品分离的血清。
根据已知技术，存在于血浆中的cfDNA可以使用覆盖以二氧化硅或硅树脂的磁珠分离。在这两种情况下，利用在高浓度的pH接近7.5的离液盐的存在下DNA(带负电荷)与二氧化硅(带正电荷)结合的能力(Chen和Thomas,1980；Marko等人，1982；Boom等人，1990)。DNA与二氧化硅的结合由离液盐所引起的脱水作用以及氢键的形成引起，所述氢键与弱的静电排斥作用相竞争(Melzak等人，1996)。之后，通过用醇溶液反复洗涤移除过量的盐、蛋白、碳水化合物、代谢物和其他污染物质。最后，通过低离子强度溶液(如TE-缓冲液或水)洗脱纯化的DNA。
根据本发明的用于评价和预测风险的方法的下一步骤由分析所选择的基因组合(图1)组成，特别关注所选择的组的热点，所述分析包括评价涉及上述基因组合的一个或多个突变的存在，所述突变选自被监测的基因的已知突变清单并且指示向形成肿瘤细胞演化。
例如，从遗传的角度看，在美国和欧洲约10％的肺肿瘤患者(非小细胞型)的特征是EGFR基因的突变(Lynch等人，2004；.Paez等人，2004；.Pao等人，2004)。这些突变主要在EGFR外显子18-21内发生，所述外显子编码EGFR的酪氨酸激酶结构域的一部分。涉及外显子19的这些突变中大约90％是缺失，或在外显子21内是SNV(如突变L858R)(Ladanyi和Pao2008)。这些突变增加了EGFR蛋白的酪氨酸激酶活性，决定了刺激肿瘤细胞存活的细胞通路的超活化(Sordella等人，2004)。无论种族来源，EGFR基因的突变更常见于不吸烟(在患者的一生期间吸烟少于100根)的腺癌组织类型的女性患者(Lynch等人，2004)。然而，涉及EGFR基因的这些突变也可以见于其他亚组的肺癌患者，因此也见于吸烟者。在看似“健康的”患者的cfDNA中上述突变的存在表示显然的警报，其必须紧接着进行监测和一系列彻底的检查以评价肿瘤块的存在。
具体地，利用NGS技术(下一代测序)对50个基因评价cfDNA，所述基因的清单在图2中提供，其覆盖目前2,800个COSMIC突变(癌症体细胞突变目录)。
要理解的是，对于本发明的目的，被评价的基因清单和突变清单不应被认为是静态的，因为本领域中广泛的研究活动以及可用的现代测序和分析技术可以导致对参与一种或多种实体瘤类型的致癌作用的新基因、新热点或新突变的鉴定。
对于每个被监测的基因，每个评价循环搜索涉及该基因的突变(参见上面EGFR的实例)，特别关注在已知热点内发生的突变。当存在显著的突变时，在计算机化系统的存储器区域内记录该突变，该计算机化系统在物理上被设置成执行所述方法的计算步骤(图1)。
在测试的每个重复循环中，即在第一个循环后的每个循环中，检查检测到的突变是否已经在先前的评价循环中已被检测到。在阴性的情况下，登记涉及该基因的新突变，并且算法计算指示突变频率随时间推移显示的趋势的值。该值构成系统的“关键风险指标”。
所述趋势以数值表示，该数值通过计算突变的最后一个频率值与在先前评价循环中获得的值之间的关系获得，并且其趋势可以以图表表示以提供对遗传稳定性或不稳定性的水平的指示。
在根据本发明的方法的非限制性实施方案中，两次检查之间的比较可以通过根据下式的总遗传不稳定性指数IT合计在一起：
IT＝
其中：
要执行控制的基因的数目。
要注意的是在此情况下，总不稳定性指数IT表示总体状况，无需区分特定基因的变化。
以类似的方式，能够根据下式定义特定基因的不稳定性指数IG：
其中要执行控制的基因的被评价热点的数目为#。
考虑用于每个评价循环的基因的组合和它们的突变可以再次包括与发生实体瘤相关的50个基因的整个范围(图2)，或仅包括仅与一种或多种所选择的肿瘤相关的一些基因和热点。
具体地，能够监测发生仅一种类型肿瘤或单一家族肿瘤的风险。在此情况下，被分析的基因数目限于与该肿瘤或该组肿瘤直接相关的那些。
在任何情况下，根据预设的搜索靶标，根据上述过程不稳定性指数的定义可以涉及单一基因、由与发生特定肿瘤或特定家族肿瘤相关联的一组基因组成的组合，或由通常与发生实体瘤相关联的50个基因(目前是50个基因，或者如果未来鉴定到其他基因，则更多基因)组成的整个组合。
根据本发明，被分析的基因组合和突变可以基于通过家族史调查获得的受试者既往病史选择。
当评价循环检测到表示生长趋势的突变的频率高于10％时，(可以根据将随年数累积的数据更新的值)，该值是确定的突变的等位基因频率的增加数(例如，在后续的测试重复中APC基因的突变的位基因频率从0.1％增加到5％)，监测系统将与被检查的组合相关的灵敏度(即，其将要求患者再次进行测试，此次使用相对于第一水平的测试具有更高的灵敏度和分析特异性的不同组合)关于突变增加所涉及的基因增加到直至100％。
例如，使用所述组合和市售技术“ cfDNA”，达到极低的检出限，即等于0.05％。这意味着该系统基于特定化学(“ TagSequencing”),不同于第一水平的筛查，能够鉴定在仅0.05％的被分析的DNA样品中存在的突变。
该方法包括评价参数的连续更新，诸如所选择的基因组合的分析循环的重复频率和与被分析的基因相关的灵敏度。具体地，重复频率基于不稳定性指数(IT或IG，取决于分析几种基因的组合还是单一基因)定义；更准确地，不稳定性指数的低值对应于测试的基础重复频率，其可以例如是每年一次测试。甚至此指数值的中等增加可以提示增加的重复频率，因为考虑到不稳定性状况自然地趋向增长，并且意味着在更短时间内新的显著突变的更大可能性。超过不稳定性指数IT、IG的特定阈值ITS、IGS鉴定在发生被监测的肿瘤或一组肿瘤时前驱遗传状态(即将导致个体肯定地或非常可能形成上面提到的肿瘤或在任何情况下形成至少一种所监测的肿瘤的路径)中的突变的序列的演变。不稳定性指数的阈值可以例如设定为0.1。
根据本发明，逐渐增加测试的重复频率允许最佳地监测个体的状况并且了解指示正在形成肿瘤的特定的突变何时会发生。
根据本发明，记录与每个评价循环所分析的DNA相关的所有原始数据和获得的结果，并在后续的循环期间进行修订，从而因为可用数据的量增加而提高评价的准确度。
根据本发明的方法的另一特征，为研究体细胞突变对cfDNA的测序与对生殖细胞突变的分析组合。为此目的，根据已经描述的内容，分离并测序具有热点癌症组合(HSCP)的cfDNA，其允许以1％的灵敏度研究参与肿瘤形成过程的50个基因中的2800个突变。
此外，分离并测序个体的生殖DNA，例如淋巴细胞DNA，并且检查上文提到的DNA中存在相同的突变。为了本发明的目的，个体的淋巴细胞DNA可以一般来自已经获取和分离了cfDNA的相同的液体活检物，或来自另一份最近或甚至早得多的活检物，因为淋巴细胞DNA中存在的生殖突变形成个体的遗传产物的一部分。
优选地利用与cfDNA测序相同的读取度对淋巴细胞DNA进行测序以获得直接可比较的结果。
如果突变存在于cfDNA分析中且不存在于利用相同读取度测序的淋巴细胞DNA中，则此突变被定义为是体细胞突变。因此，定义下面几组突变：
A组：由在cfDNA中发现的突变组成；
B组：由通过用于cfDNA的相同组合分析的淋巴细胞DNA中发现的突变组成；
C组：由定义为存在于cfDNA中但不存在于淋巴细胞中的突变的体细胞突变组成。
当鉴定到体细胞突变(即，在该分析中，C组不为空)时，利用已知的操作技术通过COSMIC数据库评价其中已经主要发现这样的体细胞突变的组织。
下一步是使用在此情况下也已知的操作技术从对生殖系的分析研究是否存在形成这些组织的肿瘤的较高可能性。上面提到的方式将通过定制的组合来进行，所述定制组合的定义是已发现的一个或多个体细胞突变的函数，并且能够基于cfDNA中的突变基因(或多个突变基因)评价个体对特定肿瘤的易感性。
此外，如果所关注的体细胞突变涉及肺、结肠或乳腺，则以较高的灵敏度(多至0.1％)分析循环DNA，例如借助于市售的组合并且使用市售技术Tag_
当完成这些首次分析时，完成评价，提出肿瘤学会诊意见以解释和评价结果并计划新测试以便监测被检查的个体。
根据本发明的方法还包括在获取的液体活检物中搜索ctDNA(循环肿瘤DNA)，作为完成对遗传稳定性的评价和对肿瘤形成的前驱期的鉴定的附加活性。可以仅当已计算的不稳定性指数超过预设的阈值ITS、IGS时进行这样的操作，如图1中所示的那样，或还当不稳定性指数的值低于此阈值时进行这样的操作，作为预防。
当检测到ctDNA时，用于评价遗传稳定性和鉴定肿瘤形成的前驱期的方法基本上结束其功能，因为这意味着至少一个突变系已经导致了肿瘤细胞的形成。此时，用于评价遗传状况的系统给出将对个体的控制转移到早期检测系统(“早期检测(Early Detection)”)的信息，所述早期检测系统诸如，例如，由本申请人开发并使用的“SCED系统——实体癌症早期检测(Solid Cancer Early Detection)”。
下面借助于实施例描述一些应用，所述实施例集中于评价遗传稳定性以及鉴定与单一实体瘤或实体瘤家族有关的肿瘤形成的前驱期，并且特别是与肺肿瘤、乳腺肿瘤和卵巢肿瘤以及结直肠肿瘤有关的肿瘤形成的前驱期。
实施例1:肺肿瘤
在本发明的实施方案中，用于评价遗传稳定性和鉴定肿瘤形成的前驱期的方法应用于监测与肺肿瘤的发生关联的遗传状况。
发生肺肿瘤的最严重的风险因素是吸烟。在由吸烟者所吸入的烟量和形成这种肿瘤的可能性增加之间的明确对应关系已经得到广泛的证明并且已被认为是事实。
几个研究报道吸烟者形成肺肿瘤的风险比不吸烟者高14倍(对于每天多于20支烟的烟瘾大的吸烟者，达到20倍)。尽管大气污染、此类型癌症的家族倾向性以及存在其他肺部疾病可能增加形成肿瘤的可能性，但是每10个肺肿瘤中有8/9个归因于香烟烟雾。
基于对他/她的与肺肿瘤相关联的特定基因的特异性突变以及这种突变的数目和频率可以在未来生成肿瘤细胞的个人风险的量化，以充分的可靠性为被监测的人提供知晓是否检测到进展以及已经达到了哪个演变期的可能性。
根据本发明的方法，在此例中对肿瘤发生的前驱状态的定义与肺肿瘤直接涉及的11个基因的突变、尤其是169个不同热点有关。表1提供了构成将被评价的组合的基因和热点的清单。
对健康个体关于与肺肿瘤有关的组合评价遗传不稳定性的方法的应用借助于实施例进行描述。
从一名45岁男性患者获取10毫升外周血；将血液离心以将血浆(含有循环的游离DNA)与血细胞成分(淋巴细胞和红细胞)分离。在此患者中，从4ml血浆开始，提取14uL浓度为2.36ng/uL的cfDNA。使用20ng cfDNA来制备所谓的“NGS文库”，NGS文库是与条形码(合成的DNA序列)相关联的一组DNA片段，所述条形码以明确的方式限定标本。基于读取的浓度(3390pM)，将此文库与从其他标本获得的文库(每个文库将具有不同的条形码)混合(汇集)。将cfDNA测序并且分析在表1(肺)的基因和热点组合中的突变；发现KRAS基因的突变p.G12D为0.49％。
6个月后，重复相同的分析，发现KRAS基因的相同突变p.G12D为1.05％；利用下式计算不稳定性指数：
得到值0.047。由于该指数值低于阈值0.1，建议6个月后重复测试。
表1
实施例2:乳腺肿瘤和卵巢肿瘤
执行根据本发明的方法的用于评价遗传稳定性和鉴定肿瘤形成的前驱期的测试以特定的方式应用于经历或过去已经经历激素替代疗法、避孕或卵巢刺激的女性。
此外，其可以有利地用于监测和预防的其他具体实例，例如，对携带遗传的BRCA 1|2突变的女性的预防程序，所述女性具有形成子宫肿瘤或卵巢肿瘤的高风险。
在此例中使用的基因组合和突变包括在表中列举的10个基因和159个热点(参见表2)。
对健康个体关于与乳腺-卵巢肿瘤有关的组合评价遗传不稳定性的方法的应用借助于实施例进行描述。
从一名57岁女性患者获取10毫升外周血；将血液离心以将血浆(含有循环的游离DNA)与血细胞成分(淋巴细胞和红细胞)分离。在此患者中，从4ml血浆开始，提取14uL浓度为1.71ng/uL的cfDNA。使用20ng cfDNA来制备所谓的“NGS文库”，NGS文库是与条形码(合成的DNA序列)相关联的一组DNA片段，所述条形码以明确的方式限定标本。基于读取的浓度(3240pM)，将此文库与从其他标本获得的文库(每个文库将具有不同的条形码)混合(汇集)。将cfDNA测序并且分析在表2(乳腺和卵巢)的基因和热点组合中的突变；发现PIK3CA基因的突变p.H1047R为0.57％。
6个月后，重复相同的分析，发现PIK3CA基因的突变p.H1047R为1.75％并发现TP53基因的新突变p.R175H为0.34％；利用下式计算不稳定性指数：
得到值0.152。由于该指数值超过阈值0.1，建议3个月后重复测试。
表2
实施例3：结肠肿瘤和直肠肿瘤
对遗传稳定性的评价和对与结肠和直肠肿瘤类别有关的肿瘤形成的前驱期的鉴定包括对14个基因和246个热点的定期分析，所述14个基因和246个热点如表3中所指定的那些，表3列举了目前涉及各个热点的所有基因。
涉及结直肠系统的肿瘤经常随良性病变演变形成，所述良性病变诸如肠粘膜中的腺瘤性息肉。
肿瘤的形成可以被一些风险因素促进，如肥胖或高卡路里和脂肪、低纤维的饮食，或遗传因素，例如，病理状况的家族史。此外，年龄、慢性肠炎性病理状况以及息肉病史同样可以促进并增加发生肿瘤的可能性。
良性肿瘤变成恶性所需的时间通常是非常长的(7-15年)，并且这种演变可以有利地利用通过根据本发明的方法所提供的定期测试和随后对风险状态的评价进行追踪。
对健康个体关于与结直肠肿瘤有关的组合评价遗传不稳定性的方法的应用借助于实施例进行描述。
从一名65岁男性患者获取10毫升外周血；将血液离心以将血浆(含有循环的游离DNA)与血细胞成分(淋巴细胞和红细胞)分离。在此患者中，从4ml血浆开始，提取14uL浓度为1.49ng/uL的cfDNA。使用20ng cfDNA来制备所谓的“NGS文库”，NGS文库是与条形码(合成的DNA序列)相关联的一组DNA片段，所述条形码以明确的方式限定标本。基于读取的浓度(8130pM)，将此文库与从其他标本获得的文库(每个文库将具有不同的条形码)混合(汇集)。将cfDNA测序并且分析在表1(肺)的基因和热点组合中的突变；发现APC基因的突变p.R1450Ter为0.15％。
6个月后，重复相同的分析，发现APC基因的相同突变p.R1450*为1.05％；利用下式计算不稳定性指数：
得到值0.026。由于该指数值低于阈值0.1，建议6个月后重复测试。
表3
要理解上面已经描述的内容仅作为非限制性实施例。因此，本发明的可能的改变和变体被认为在本发明的方法被授权的保护范围内，如上面所述和下面权利要求书所要求保护的。
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Claims (19)

1.一种用于搜索和鉴定健康受试者中发生实体瘤的前驱遗传状况的方法，其特征在于包括用于评价遗传稳定性或不稳定性状况的评价循环和所述评价的至少一个重复循环，对所述受试者定期进行所述重复循环，每个循环包括以下步骤：
-获取所述受试者的生物材料的样品，从所述生物材料分离DNA，扩增并测序所分离的DNA；
-验证在被考虑的样品的预定组的基因中选择的突变的存在，所述组的基因和所述突变与发生实体瘤相关；
-所述预定组的基因包括与一种或多种实体瘤有关的基因或热点组合的亚组，或与实体瘤有关的基因全组合；
-验证对每个基因和对每个评价循环所检测到的突变的频率，所述突变选自前述所选择的突变；
-记录对每个基因或每组基因所检测到的突变以及它们的频率；
-对于每个重复循环，基于所检测到的突变频率以及基于所述突变频率的增加，定义或更新所述受试者的遗传不稳定性指数，即总体遗传不稳定性指数(IT)或对于单个基因的遗传不稳定性指数(IG)；
-在每个重复循环中，基于超过对每个单个基因或每组基因定义的所述遗传不稳定性指数(IT、IG)的阈值(ITS、IGS)，评价所述受试者进入发生一种或多种实体瘤或多组实体瘤的前驱遗传状况。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述遗传不稳定性指数(IT、IG)还基于相对于一个或多个先前评价循环的突变频率的增加来定义。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述总体遗传不稳定性指数(IT)被定义为：考虑被监测的基因的整个组，响应每个基因所观察到的突变的增加的值(ΔFk)与所评价的基因数目之间的关系的总和。
4.根据权利要求1所述的方法，其中对单个基因的所述基因不稳定性指数(IG)被定义为：考虑被监测的热点的整个组，响应每个热点所观察到的突变的增加的值(ΔFj)与所评价的热点数目之间的关系的总和。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品由液体活检物组成，并且验证预定组的基因中存在突变的阶段对从所述液体活检物分离并且随后进行扩增和测序的DNA样品进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述液体活检物是外周血。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述液体活检物是尿液或脊髓液。
8.根据权利要求5-7中之一所述的方法，其中在被分析的DNA样品中寻找cfDNA的级分，并且其中在所述cfDNA级分中验证突变的存在。
9.根据权利要求5-7中之一所述的方法，其中还在被分析的DNA样品中寻找从所述液体活检物分离的ctDNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在鉴定循环ctDNA后，寻址信息被发送到早期检测系统(“早期检测”)。
11.根据权利要求9所述的方法，其中在被分析的所述DNA样品中鉴定ctDNA后，在所述液体活检物中寻找CTC(“循环肿瘤细胞”)的存在。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定组的基因和所选择的突变考虑所述受试者的既往病史来定义。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定组的基因和所选择的突变考虑它们与特定类型的肿瘤的关联来定义。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述重复周期在每个重复循环后根据在当前循环中计算的所述不稳定性指数(IT、IG)的值和在一个或多个先前循环中计算的同一指数的值被重新计算。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在所述不稳定性指数(IT、IG)的计算值相对于在一个或多个先前循环中计算的同一指数(IT、IG)的值增加后，在每个重复循环中设定与被监测的基因或基因组合有关的更大的分析灵敏度。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，在每个所述评价和重复循环中，还分离并测序生殖DNA，并对随后的不稳定性指数计算考虑仅存在于cfDNA中且在所述生殖DNA中不存在的突变。
17.根据权利要求16所述的方法，其中以与测序所述cfDNA相同的读取度对所述生殖DNA测序。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述生殖DNA来源于已经从中获取所述cfDNA的同一液体活检物。
19.一种用于搜索和鉴定健康受试者中发生实体瘤的前驱遗传状况的系统，所述系统包括一组计算机程序的指令，所述指令目的在于执行根据权利要求1所限定的遗传稳定性或不稳定性状况的评价循环和所述评价的至少一个重复循环。
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