CN110599555A - 基于hsi彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，具体涉及定量化学和生化成像领域，具体分析步骤如下：S1、建立HSI颜色模型，形成HSI分析基础，HSI颜色模型要求每种颜色都可以用色调H、饱和度S和强度I三种成分来表示；S2、获得单个等离子纳米颗粒的LSPR散射信号后，可以使用HSI系统中的色调值来分析DFM图像中的散射光；S3、完善HSI颜色模型。本发明通过对散射光的像素编码，采用HSI分析方法可以自动获得单个AuNP的LSPR散射信号，HSI分析更容易实现，比RGB分析更接近人类的视觉系统；此外，通过计算机编程，可以自动计算和获取DFM图像中每个光点对应的色调值，大大提高了精度，消除了人为误差。
Description
技术领域
本发明涉及定量化学和生化成像技术领域，更具体地说，本发明涉及基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法。
背景技术
等离子纳米颗粒(PNPs)由于与电磁辐射的强相互作用，具有很强的局域表面等离子体共振(LSPR)吸收和散射等光学特性。利用暗场显微(DFM)技术可以获得PNPs的等离子体共振散射光成像。由于暗场显微成像技术与光谱摄谱仪相结合，具有信噪比高、灵敏度高的优点，在研究纳米颗粒的尺寸、形状、组成和周围介质所需时间短。因此，iDFM技术已经广泛应用于细胞生物传感、化学反应检测、小分子检测等领域。
然而，由于细胞器的强烈散射干扰iDFM技术在动态复杂环境下的活细胞内分析存在困难。针对这些困难，iDFM技术通过去除图像中的背景干扰信息来研究单个PNPs的详细散射特性。DFM图像分析还可以将DFM图像转换为数字信息来实现对iDFM的定量分析，这避免了扫描纳米颗粒光谱的耗时过程。DFM图像分析与自动图像处理是一种提高iDFM的精度和量度的很好的方法。
近些年来，基于RGB的方法被广泛应用于分析暗场显微图像。但RGB颜色模型并不接近人类观察颜色的视觉系统，而且必须要知道生成颜色所需的红色或者绿色的百分比。此外，基于RGB的方法需要操作软件(如Image Pro Plus、IPP)并手动计算R、G和B百分比。如果DFM图像中包含许多粒子，这将会是非常耗时的工作，而且会引入一些误差。因此，找到一种能克服基于RGB的方法固有的缺点，分析单个PNP散射光颜色的新的颜色编码方法是十分必要的。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，通过对散射光的像素编码，采用HSI分析方法可以自动获得单个AuNP的LSPR散射信号，HSI分析更容易实现，比RGB分析更接近人类的视觉系统；此外，通过计算机编程，可以自动计算和获取DFM图像中每个光点对应的色调值，大大提高了精度，消除了人为误差。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，具体分析步骤如下：
S1、建立HSI颜色模型，形成HSI分析基础，HSI颜色模型要求每种颜色都可以用色调(H)、饱和度(S)和强度(I)三种成分来表示，模型建立步骤如下：
S1.1、利用DFM成像系统对等离子纳米颗粒(PNPs)的散射光IDFMS进行测量，得到散射光IDFMS中的色斑；
S1.2、通过计算机编程，将步骤S1.1中得到的散射光IDFMS中的色斑自动转换为HSI颜色模型中的数字色调值；
S1.3、通过用HSI颜色系统对等离子纳米颗粒(PNPs)的散射光颜色进行编码，得到HSI颜色模型，即HSI分析的基础；
S2、获得单个等离子纳米颗粒(PNPs)的LSPR散射信号后，可以使用HSI系统中的色调值来分析DFM图像中的散射光；
S3、将分析结果进行统计，与传统的RGB检测方法进行比较，确定利用色调值分析DFM图像中的散射光的准确率，根据不准确的检测方案进行分析调整色斑和色调值之间的转换误差，经过多次这种对比实验，调整转换误差直至将转换误差降到最低，完善HSI颜色模型。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.2中，计算机编程程序的算法包括图像分割、图像标签和像素中每个粒子的色调计算。
在一个优选地实施方式中，所述H分量以[0，360]度之间的角度描述颜色本身；0度表示红色，60度表示黄色，120度表示绿色，240度表示蓝色，300度表示洋红。
在一个优选地实施方式中，所述S分量代表白色污染水平，其范围为[0，1]。
在一个优选地实施方式中，所述I分量表示亮度信息，范围介于[0，1]和0之间表示黑色，1表示白色。
在一个优选地实施方式中，所述色调值对应于散射光的光谱和颜色。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明通过对散射光的像素编码，采用HSI分析方法可以自动获得单个AuNP的LSPR散射信号，HSI分析更容易实现，比RGB分析更接近人类的视觉系统；此外，通过计算机编程，可以自动计算和获取DFM图像中每个光点对应的色调值，大大提高了精度，该方法能克服基于RGB的方法固有的缺点，大大消除人为误差，实现数据的自动分析；
2、通过将HSI分析结果进行统计，与传统的RGB检测方法进行比较，确定利用色调值分析DFM图像中的散射光的准确率，根据不准确的检测方案进行分析调整色斑和色调值之间的转换误差，经过多次这种对比实验，调整转换误差直至将转换误差降到最低，完善HSI颜色模型，从而能够使成像分析更加准确。
附图说明
图1为本发明实施例2中基于单个PNPs的HSI颜色编码、通过计算机编程进行图像处理的过程和HSI颜色模型、对硫代DNA附着到AuNP的HSI颜色编码分析的示意图。
图2为本发明实施例2中AuNP的形态和光谱特征示意图。
图3为本发明中不同散射颜色的AuNP的特征DFM图像、相应AuNP的色调、饱和度和强度示意图。
图4为本发明实施例3中对不同溶剂中具有不同RI值的单个AuNP散射光颜色的彩色编码HSI分析的研究示意图。
图5为本发明实施例4中AuNPs的散射光颜色的色调值随着DNA的硫化而改变、DFM图像中单个粒子的色调值、不同浓度探针DNA结合AuNP前后AuNP散射光颜色的色调变化值的关系、与探针DNA相连并与不同浓度靶DNA杂交的AuNP示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供了基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，具体分析步骤如下：
S1、建立HSI颜色模型，形成HSI分析基础，HSI颜色模型要求每种颜色都可以用色调(H)、饱和度(S)和强度(I)三种成分来表示；
H分量以[0，360]度之间的角度描述颜色本身；0度表示红色，60度表示黄色，120度表示绿色，240度表示蓝色，300度表示洋红；
S分量代表白色污染水平，其范围为[0，1]；
I分量表示亮度信息，范围介于[0，1]和0之间表示黑色，1表示白色；
模型建立步骤如下：
S1.1、利用DFM成像系统对等离子纳米颗粒(PNPs)的散射光IDFMS进行测量，得到散射光IDFMS中的色斑；
S1.2、通过计算机编程，将步骤S1.1中得到的散射光IDFMS中的色斑自动转换为HSI颜色模型中的数字色调值，计算机编程程序的算法包括图像分割、图像标签和像素中每个粒子的色调计算；
S1.3、通过用HSI颜色系统对等离子纳米颗粒(PNPs)的散射光颜色进行编码，得到HSI颜色模型，即HSI分析的基础；
S2、色调值对应于散射光的光谱和颜色，获得单个等离子纳米颗粒(PNPs)的LSPR散射信号后，可以使用HSI系统中的色调值来分析DFM图像中的散射光；
S3、将分析结果进行统计，与传统的RGB检测方法进行比较，确定利用色调值分析DFM图像中的散射光的准确率，根据不准确的检测方案进行分析调整色斑和色调值之间的转换误差，经过多次这种对比实验，调整转换误差直至将转换误差降到最低，完善HSI颜色模型。
本发明是纳米级的定量化学和生化成像的一种全新的方法，具体是基于局域表面等离子体共振(LSPR)散射光，建立了一种简单的对单个PNP的暗场显微(DFM)图像进行编码的自动HSL彩色编码方法，HSL系统中的色调值可以实现暗场显微成像分析(iDFM)的精确定量分析。
实施例2：
以硫化DNA与金纳米粒子(AuNP)结合为例，形成HSI分析基础：
1)利用DFM成像系统对硫化DNA附着前后AuNP的散射光IDFMS进行了测量；
2)通过计算机编程，将得到的散射光IDFMS中的色斑自动转换为HSI颜色模型中的数字色调值；该程序的算法包括图像分割、图像标签和像素中每个粒子的色调计算；图1显示了硫化DNA附着在单个AuNP表面后散射光颜色色调值变化，在AuNP上附着硫化DNA后，单个AuNP的散射光颜色发生了变化，并且相应的色调值降低；
3)通过用HSI颜色系统对PNP的散射光颜色进行编码，形成了HSI分析的基础；
如图2A所示，这里使用的AuNP是球形的，平均尺寸约为50nm，在528nm处显示特征LSPR吸收带，在566nm处显示特征LSPR散射带(图2B)；由于其尺寸和形状，AuNP的散射光颜色主要为绿色，DFM图像中的每个光斑都包含许多像素，使用属于同一光斑的这些像素的平均色调值代表单个AUNP的色调值，计算机可以自动计算和获取DFM图像中每个点的HSI颜色值；
图2中，A代表50纳米AuNP的扫描电镜图像，大多数是球形的；B代表紫外LSPR吸收(黑色)和散射(红色)光谱。
图3A显示了AuNP的特征DFM图像；利用HSI颜色模型，可以用数字色调值来表示DFM图像中散射光斑的颜色；对于不同的散射光颜色，五个纳米颗粒的色调值是不同的(图3B显示)；散射绿光的粒子1具有较高的色调值，而散射红光的粒子5具有较低的色调值，而其他粒子则具有介于粒子1和5之间的色调值；
图3中，A代表AuNP的特征DFM图像；B代表AuNP的色调(B)；C代表AuNP的饱和度；D代表AuNP的强度。
这些结果表明，HSI模型的色调值可以代表iDFMS中散射光斑的颜色，同时，计算了所选五个AuNP的饱和度和强度(图3C和3D)。结果表明，饱和度和强度与颜色变化不一致。
实施例3：
研究单个AuNP散射光颜色的变化，直接验证用HSI模型分析单个AuNP散射光颜色的可能性，同时建立了标准光谱颜色的色调值与散射光谱偏移之间的关系：
1)由于单个AuNP散射光颜色的变化对周围介质非常敏感，分别在折射率(ri)为1.333、1.362、1.393、1.4318和1.479的水、乙醇、1-丁醇、乙二醇(eg)和二甲基亚砜(dmso)中浸泡AuNP；
2)通过上述的计算机编程，可以自动计算出DFM图像中每一个AuNP的散射光颜色的色调值。
浸泡的AuNP具有不同的散射光颜色，从绿色逐渐变为黄绿色或黄色，其中散射光的红移随溶剂的Ri增加而发生，图4B为获得的在不同溶剂中浸泡的单个AuNP的色调值与所用溶剂的折射率之间的线性关系。
如图4B所示，随着RI从1.333变为1.479，DFM图像中每个粒子的色调值从138.2变为92.2，并且色调偏移的RI灵敏度(σ)为每315.1a.u/RIU，这时用表达式σ＝ΔR/ΔH计算，其中ΔH是色调值的移动，ΔR是RI的变化。
此外，作为HSI分析的另一个验证，建立了标准光谱颜色的色调值与散射光谱偏移之间的关系，图4C显示色调值与光波长呈线性关系。
图4中，A：浸泡在水、乙醇、1-丁醇、EG和DMSO中的AuNP的DFM图像；B：AuNP散射光颜色的色调值与溶剂的RI值之间的线性关系，从11个粒子(n＝11)计算误差线；C：所选AuNP散射光颜色的色调值与标准光谱颜色波长之间的线性关系。
综上所述，我们可以得出色调值与RI呈线性关系，这些结果表明，用HSI系统中的色调值来描述散射光的颜色是合理的，表明HSI分析是一种可靠的散射光颜色编码方法。
实施例4：
以室温下Au-S键形成过程中硫化DNA与AuNP的结合为例，应用HSI颜色编码方法进行分析硫化DNA与AuNP结合过程中散射光的颜色变化，并进一步探讨Au-S键的结合机理：
1)检测AuNP与硫化DNA结合后散射光颜色的变化：将AuNP固定在干净的玻璃载玻片上后，在室温下的pH3.0缓冲液中向AuNP中添加探针DNA序列(5′-sh-ttt-ttg-cta-ttt-gat-ggc-3′)5分钟；将AuNP固定在干净的玻璃载玻片上后，在室温下的pH3.0缓冲液中向AuNP中添加探针DNA序列(5′-sh-ttt-ttg-cta-ttt-gat-ggc-3′)5分钟；每个AUNP表面都能结合大量的DNA分子，导致AUNP附近的RI增加；
2)为了获得定量的理解，我们进一步监测了不同浓度的DNA溶液中硫化DNA与AuNP结合，将浓度在0.1纳米到1000纳米之间的探针DNA溶液导入AuNP中；
3)为了进一步证明HSI分析的实用性和可用性，我们进一步测试了在不同浓度的互补靶DNA(5′-ATT AAAGCT CGC CAT CAAATAGCAA-3′)存在下，与硫化DNA结合的AuNP的杂交特性。
图5A和图5B显示了硫化DNA附着到AuNP前后的单个AuNP的DFM图像，图5C显示了DFM图像中单个粒子的色调值。与预期的一样，AuNPs的散射光颜色的色调值会随着DNA的硫化而改变。
结果表明，散射光颜色有明显的变化，可以通过色相值的变化来观察；纳米颗粒在附着硫化DNA后，其周围的RI增加。同时，我们通过RGB分析和色调偏移值计算了红色百分比偏移。这些结果表明，HSI分析的灵敏度高于RGB分析。
图5D显示了不同浓度探针DNA结合AuNP前后AuNP散射光颜色的色调变化值的关系，这些结果表示高浓度的硫化DNA由于附着更多的硫化DNA而导致更大的RI变化，表明在100纳米浓度的硫化DNA溶液中可以获得稳定的结合物。根据计算结果，考虑到AuNP的曲率半径和尺寸，每个AuNP表面都可以连接640个分子。
在不同浓度的互补靶DNA(5′-ATT AAAGCT CGC CAT CAAATAGCAA-3′)存在下，由于纳米颗粒附近局部环境的RI增加，DNA杂交可能导致纳米颗粒的LSPR散射光谱峰红移。图5E显示了不同靶DNA浓度的探针DNA与靶DNA杂交前后散射光颜色的色调变化值的关系。很明显，AuNP散射光颜色的色调偏移值比图5D中的色调偏移值更明显，并且色调偏移值随目标DNA浓度的变化而增加。
图5中，A：AuNPs接近硫化DNA前DFM图像；B：AuNPs接近硫化DNA后DFM图像；C：A和B中单个粒子散射光颜色的色调值；D：不同探针DNA浓度(0.1、1、10、50、100、200、500和1000nm)下AuNP散射光颜色的色调变化关系；E：与探针DNA(100nm)相连并与不同浓度(1、10、50、100、200、500和1000nm)靶DNA杂交的AuNP；误差线由18个粒子(n＝18)计算得出。
结果表明，AuNP表面的DNA杂交使探针DNA与AuNP结合后的RI进一步增加，靶DNA浓度影响平衡前的RI变化，其中AuNP表面的所有探针DNA都与靶DNA结合。
综上所述，我们提出了一种利用HSI颜色系统对单个PNP散射光进行颜色编码分析的新方法。通过对散射光的像素编码，我们证明了用HSI分析可以自动获得单个AuNP的LSPR散射信号，并将此方法应用于研究硫代DNA与AuNP的结合。通过引入HSI颜色系统，对PNPs的散射光颜色给出了一个新的观点。其次，与以往基于RGB分析的分子结合研究相比，HSI分析更容易实现，比RGB分析更接近人类的视觉系统。此外，通过计算机编程，可以自动计算和获取DFM图像中每个光点对应的色调值，大大提高了精度，消除了人为误差。因此，HSI分析可以作为分析PNP散射光的一种很好的方法。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，其特征在于，具体分析步骤如下：
S1、建立HSI颜色模型，形成HSI分析基础，HSI颜色模型要求每种颜色都可以用色调H、饱和度S和强度I三种成分来表示，模型建立步骤如下：
S1.1、利用DFM成像系统对等离子纳米颗粒的散射光IDFMS进行测量，得到散射光IDFMS中的色斑；
S1.2、通过计算机编程，将步骤S1.1中得到的散射光IDFMS中的色斑自动转换为HSI颜色模型中的数字色调值；
S1.3、通过用HSI颜色系统对等离子纳米颗粒的散射光颜色进行编码，得到HSI颜色模型，即HSI分析的基础；
S2、获得单个等离子纳米颗粒的LSPR散射信号后，可以使用HSI系统中的色调值来分析DFM图像中的散射光；
S3、将分析结果进行统计，与传统的RGB检测方法进行比较，确定利用色调值分析DFM图像中的散射光的准确率，根据不准确的检测方案进行分析调整色斑和色调值之间的转换误差，经过多次这种对比实验，调整转换误差直至将转换误差降到最低，完善HSI颜色模型。
2.根据权利要求1所述的基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，其特征在于：所述步骤S1.2中，计算机编程程序的算法包括图像分割、图像标签和像素中每个粒子的色调计算。
3.根据权利要求1所述的基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，其特征在于：所述H分量以[0，360]度之间的角度描述颜色本身；0度表示红色，60度表示黄色，120度表示绿色，240度表示蓝色，300度表示洋红。
4.根据权利要求1所述的基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，其特征在于：所述S分量代表白色污染水平，其范围为[0，1]。
5.根据权利要求1所述的基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，其特征在于：所述I分量表示亮度信息，范围介于[0，1]和0之间表示黑色，1表示白色。
6.根据权利要求1所述的基于HSI彩色编码的等离子纳米颗粒暗场显微成像分析方法，其特征在于：所述色调值对应于散射光的光谱和颜色。
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| CN104978740A (zh) * | 2015-05-10 | 2015-10-14 | 刘畅 | 基于图像颜色特征的成份自动测量方法 |
| CN106504212A (zh) * | 2016-11-07 | 2017-03-15 | 湖南源信光电科技有限公司 | 一种改进的hsi空间信息低照度彩色图像增强算法 |
| CN107016699A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-08-04 | 上海大学 | 一种自动识别杂色粒子的彩色编码方法 |
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Patent Citations (3)
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