CN110592179B

CN110592179B - 一种基于旋转液腔的生物气溶胶收集方法

Info

Publication number: CN110592179B
Application number: CN201910869997.7A
Authority: CN
Inventors: 付钰; 许添顺; 卢维来; 王璐; 李焓菲
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2039-09-16
Also published as: CN110592179A

Abstract

本发明提供了一种基于旋转液腔的生物气溶胶收集方法，其中，所述生物气溶胶收集方法包括以下步骤：(1)向收集瓶中加入收集液，将所述收集瓶放置在磁力搅拌器上并通过所述磁力搅拌器使所述收集液形成旋转液腔；其中，所述收集瓶包括瓶体和位于所述瓶体内的空心柱，所述空心柱设有伸出所述瓶体的收集瓶进口，所述瓶体的上部侧壁设有收集瓶出口，所述空心柱具有分散柱头，所述分散柱头位于所述瓶体的下部空间，所述分散柱头上设有气孔；以及其中，所述分散柱头位于所述旋转液腔的内部空间中；和(2)采用与所述收集瓶出口连通的真空泵将生物气溶胶吸入到所述收集瓶中进行收集。

Description

一种基于旋转液腔的生物气溶胶收集方法

技术领域

本发明涉及一种基于旋转液腔的生物气溶胶收集方法。

背景技术

生物气溶胶采样是准确研究气溶胶所携带微生物的关键步骤之一，生物气溶胶准确采样的基本原则是高效、完全地收集所有微生物。一般说来，生物气溶胶与非生物气溶胶的采样原理基本相同，都是采用重力沉降、惯性冲击、过滤、电或热沉淀等方法。

然而，与非生物气溶胶不同的是，生物气溶胶的研究对象是具有生物活性的微生物，因此在采样过程中需要考虑各种技术参数是否影响细胞的活性和可培养性。目前，已用于商业的安德森撞击器、SKC biosampler、

μ和旋风采样器等生物气溶胶收集装置的流速较大，对于生物气溶胶中的生物颗粒的活性有一定的影响，无论是液体撞击还是固体撞击都会有一部分生物气溶胶颗粒被反弹，进而损失一部分生物气溶胶。此外，这些装置还存在实际应用中成本高、结构复杂且比较沉重、操作不便等缺点。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术中存在的缺点，提供一种基于旋转液腔的生物气溶胶收集方法，本发明的生物气溶胶收集方法效率高，操作简便。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明提供了一种基于旋转液腔的生物气溶胶收集方法，其中，所述生物气溶胶收集方法包括以下步骤：

(1)向收集瓶中加入收集液，将所述收集瓶放置在磁力搅拌器上并通过所述磁力搅拌器使所述收集液形成旋转液腔；其中，所述收集瓶包括瓶体和位于所述瓶体内的空心柱，所述空心柱设有伸出所述瓶体的收集瓶进口，所述瓶体的上部侧壁设有收集瓶出口，所述空心柱具有分散柱头，所述分散柱头位于所述瓶体的下部空间，所述分散柱头上设有气孔；以及其中，所述分散柱头位于所述旋转液腔的内部空间中；和

(2)采用与所述收集瓶出口连通的真空泵将生物气溶胶吸入到所述收集瓶中进行收集。

优选地，所述收集液为PBS缓冲液。

优选地，所述分散柱头具有三个均匀分布喷嘴。

优选地，所述瓶体的内径为20～100mm，优选为35mm。

优选地，所述瓶体的侧壁上设有刻度。

优选地，所述步骤(1)中加入的收集液为所述瓶体容积的0.1～0.2倍，优选为0.15倍。

优选地，步骤(1)中所述分散柱头的气孔与所述旋转液腔的内液面相切。

优选地，所述步骤(1)中所述磁力搅拌器的转速为100～1000转/分钟，优选为760转/分钟。

优选地，所述收集瓶出口和所述真空泵之间设有气体流量计。

优选地，所述收集瓶出口与所述气体流量计之间和所述气体流量计与所述真空泵之间通过胶管连接。

优选地，所述真空泵上设有控制旋钮，所述生物气溶胶收集方法还包括以下步骤：通过控制旋钮和气体流量计控制气体流速。

更优选地，所述气体流速为10L/min。

本发明具有以下优势：

(1)本发明的生物气溶胶收集方法可以在大部分环境中轻便、高效地收集生物气溶胶。

(2)本发明中，通过磁力搅拌器在收集瓶中形成旋转液腔，生物气溶胶颗粒经由空心柱被抽入收集瓶中，经由分散柱头以软着陆的方式被旋转的水力均匀分散地打在液腔上，对微生物的伤害较低，又因为液腔是旋转的，极大程度上避免了生物气溶胶颗粒撞击在液面上时反弹的发生，进而有利于保持微生物的活性，并提高了生物气溶胶的收集效率。

(3)本发明的生物气溶胶收集方法中采用的轻便简洁、成本低，有利于推广应用。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明的生物气溶胶收集方法的一种实施方案的示意图；

图2是旋转液腔的形成示意图；

图3是收集瓶的一种实施方案的示意图；

图4是试验I～IV的真菌收集效率对比图，其中，试验I采用具有五孔圆台形的分散柱头的收集瓶，未形成旋转液腔；试验II采用具有三孔圆台形的分散柱头的收集瓶，未形成旋转液腔；试验III采用具有三孔圆台形的分散柱头的收集瓶，形成旋转液腔；试验IV采用设有3个均匀分布的喷嘴的分散柱头的收集瓶，形成旋转液腔；

图5是大肠杆菌细菌雾化气溶胶收集效率对比图；

图6是收集的大肠杆菌细菌雾化气溶胶的死亡率对比图；和

图7是采用不同体积的收集液的大肠杆菌细菌雾化气溶胶收集效率对比图。

其中，上述附图包括以下附图标记：

1-收集瓶进口，2-收集瓶出口，3-分散柱头，4-刻度，5-磁力搅拌器，6-胶管，7-气体流量计，8-真空泵，9-控制旋钮，10-瓶体，11-空心柱，12-气孔，13-旋转液腔，14-转子，15-收集瓶，16-旋转液腔的内部空间，17-喷嘴。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

图1示出了本发明的生物气溶胶收集方法的一种实施方案，图2示出了旋转液腔的形成。如图1和图2所示，收集瓶15包括瓶体10和位于瓶体10内的空心柱11。空心柱11设有伸出瓶体10的收集瓶进口1，瓶体10的侧壁上部设有收集瓶出口2，空心柱11的分散柱头3上设有气孔12，分散柱头3位于瓶体10的下部空间。

参照图1和图2，本发明的生物气溶胶收集方法包括以下步骤：

(1)向收集瓶15中加入收集液，将收集瓶15放置在磁力搅拌器5上并通过磁力搅拌器5使收集液旋转，由此在收集瓶15的下部形成旋转液腔13，分散柱头3位于旋转液腔的内部空间16中；和

(2)采用与收集瓶出口2连通的真空泵8将生物气溶胶吸入到收集瓶15中进行收集。

本发明中，通过磁力搅拌器在收集瓶中形成旋转液腔，生物气溶胶颗粒经由空心柱被抽入收集瓶中，经由分散柱头以软着陆的方式被旋转的水力均匀分散地打在液腔上，对微生物的伤害较低，又因为液腔是旋转的，极大程度上避免了生物气溶胶颗粒撞击在液面上时反弹的发生，进而有利于微生物的活性的保持，并提高了生物气溶胶的收集效率。

根据本发明的一种实施方案，其中，所述收集液是能够收集、负载微生物的液体。

本发明中，可以根据生物气溶胶中微生物的类型选择合适的收集液。在一些优选的实施方案中，所述收集液为水、PBS缓冲液或液体营养液。

根据本发明的一种实施方案，参照图3，分散柱头3具有3个均匀分布的喷嘴17。

根据本发明的一种实施方案，其中，瓶体10的内径为20～100mm，优选为35mm。

根据本发明的优选实施方案，其中，瓶体10的内径为35mm，空心柱11的内径为8mm，分散柱头3具有3个在直径为13mm的圆周上均匀分布的喷嘴17，喷嘴17的内径(即气孔12的直径)为3mm，喷嘴17与瓶体10底部的距离为20mm。

根据本发明的一种实施方案，其中，瓶体10的侧壁上设有刻度4。

根据本发明的一种实施方案，其中，步骤(1)中加入的收集液为瓶体容积的0.1～0.2倍，优选为0.15倍。

根据本发明的一种实施方案，其中，磁力搅拌器(其转子)的转速越高，所形成的旋转液腔的内部空间越大，这将导致分散柱头上的气孔远离旋转液腔的内液面，进而导致收集效率降低，当分散柱头上的气孔与旋转液腔的内液面相切时，收集效率最高，且对微生物活性影响最小。

在一些优选实施方案中，步骤(1)中分散柱头3的气孔12与旋转液腔13的内液面相切。

根据本发明的一种实施方案，其中，步骤(1)中磁力搅拌器5的转速为100～1000转/分钟，优选为760转/分钟。

在一些具体实施方案中，转子14置于瓶体10内，通过磁力搅拌器5带动转子14转动，进行形成旋转液腔13。

根据本发明的一种实施方案，其中，收集瓶出口2和真空泵8之间设有气体流量计7。

本发明中，通过气体流量计7可以随时检测、查看吸入收集瓶15中的气体流速。

根据本发明的一种实施方案，其中，收集瓶出口2与气体流量计7之间和气体流量计7与真空泵8之间通过胶管6连接。

根据本发明的一种实施方案，其中，真空泵8上设有控制旋钮9，生物气溶胶收集方法还包括以下步骤：通过控制旋钮9和气体流量计8控制气体流速。

目前，商业化的生物气溶胶收集工艺中气流流速通常都大于10L/min，特别是安德森撞击器、

μ和旋风采样器的采样流速都远远大于10L/min。只有SKC biosampler和AGI-30的采样流速在12.5L/min，但是它们成本太高。空气中的生物样品被收集时在收集瓶内会有一个被切割的过程，气体流速低时对于生物气溶胶中的微生物活性较好。

根据本发明的一种实施方案，其中，本发明不要求高的气体流速，能够保持微生物活性。在一些实施方案中，气体流速为10L/min。

实施例

1.试验I和试验II

(1)向收集瓶中加入15ml pH值为7.4的PBS缓冲液作为收集液，将收集瓶放置在磁力搅拌器上进行搅拌，磁力搅拌器5的转速为50转/分钟，所采用的转子为圆柱形转子，长度为30mm，直径为6mm，在收集瓶的下部未形成旋转液腔。

(2)启动真空泵，调整控制旋钮，控制气体流速为10L/min，对室内生物气溶胶进行收集。

其中，收集瓶的瓶体的内径为35mm，空心柱的内径为8mm，分散柱头底部圆台直径为13mm，气孔的直径为3mm，分散柱头与瓶体底部的距离为20mm，不同之处在于：试验I中收集瓶的分散柱头呈五孔圆台形，而试验II中收集瓶的分散柱头呈三孔圆台形。

2.试验III和试验IV

(1)向收集瓶中加入15ml pH值为7.4的PBS缓冲液作为收集液，将收集瓶放置在磁力搅拌器上进行搅拌，在收集瓶的下部形成旋转液腔；其中，磁力搅拌器5的转速为760转/分钟，所采用的转子为圆柱形转子，长度为30mm，直径为6mm。试验IV中，喷嘴端部恰好与旋转液腔的内液面相切。

其中，试验III中采用与试验II相同的收集瓶，而试验IV中收集瓶的参数如下：瓶体的内径为35mm，空心柱的内径为8mm，分散柱头具有3个在直径为13mm的圆周上均匀分布的喷嘴，喷嘴的内径(相当于气孔的直径)为3mm，喷嘴与瓶体底部的距离为20mm。

3.收集效率

3.1采用涂板的方法，对试验I～IV收集的微生物气溶胶进行计数，结果见图4。

如图4所示，与试验I和试验II相比，本发明方法(试验III和试验IV)可以提高收集效率。具体地，与试验I和试验II相比，本发明方法在室内真菌气溶胶收集试验中可以将收集效率提高2-3倍。

3.2由于细菌在室内气溶胶收集时环境影响因素较大，本发明还采用试验I～IV对大肠杆菌进行雾化气溶胶收集。

采用大肠杆菌标准株ATCC 25922，培养基为LB培养基，在恒温振荡摇床37℃、200r/min下培养10小时，取菌液并离心，用灭菌水清洗，重悬备用。

取20ml清洗后的菌液导入微生物气溶胶雾化发生器中，并且在扩散室中形成微生物气溶胶，体积流量为0.2ml/min，微生物气溶胶的初始浓度为3×10⁷菌落数/m³。

采用试验I～IV来收集所形成的大肠杆菌雾化气溶胶，结果见图5。由图5可知，与试验I和试验II相比，本发明方法可以提高细菌收集效率1-2倍。

4.存活率

采用PI染色流式细胞分析的方法来表征3.2部分中试验III所收集的大肠杆菌的死亡率，并且测量在相同条件但不施加搅拌的情况下所收集的大肠杆菌的死亡率作为参照，结果见图6。

由图6可以看出，本发明的收集方法(试验III)对微生物的活性影响比单纯的液体撞击(不施加搅拌)要小，说明本发明的收集方法可以在一定程度上保护微生物的活性。另外，不希望受理论限制，认为，死亡率较高的原因可能是由于雾化的过程中会使部分大肠杆菌丧失细胞活性，从而导致了死亡率较高。

5.收集液体积的选择

分别将10ml、15ml和20ml的收集液加入到收集瓶中，采用试验III中的仪器，按照试验III中的步骤来收集大肠杆菌雾化气溶胶，其中，大肠杆菌雾化气溶胶的形成参见3.2部分。收集效率见图7。

如图7所示，随着收集液体积的增加，收集瓶的收集效率不断增加，从图中可以看出15ml和20ml收集效率相差并不是很大，考虑到收集瓶的体积和其他综合的原因，采用15ml的收集液体积比较合适。

在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制；方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于旋转液腔的生物气溶胶收集方法，其中，所述生物气溶胶收集方法包括以下步骤：

(1)向收集瓶中加入收集液，将所述收集瓶放置在磁力搅拌器上并通过所述磁力搅拌器使所述收集液形成旋转液腔；其中，所述收集瓶包括瓶体和位于所述瓶体内的空心柱，所述空心柱设有伸出所述瓶体的收集瓶进口，所述瓶体的上部侧壁设有收集瓶出口，所述空心柱具有分散柱头，所述分散柱头位于所述瓶体的下部空间，所述分散柱头上设有气孔；以及其中，所述分散柱头位于所述旋转液腔的内部空间中，加入的收集液为所述瓶体容积的0.1～0.2倍；和

(2)采用与所述收集瓶出口连通的真空泵在10L/min的气体流速下将生物气溶胶吸入到所述收集瓶中进行收集。

2.根据权利要求1所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述收集液为PBS缓冲液。

3.根据权利要求1所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述分散柱头具有三个均匀分布的喷嘴。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述瓶体的内径为20～100mm。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述瓶体的内径为35mm。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述步骤(1)中加入的收集液为所述瓶体容积的0.15倍。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的生物气溶胶收集方法，其中，步骤(1)中所述分散柱头的气孔与所述旋转液腔的内液面相切。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述步骤(1)中所述磁力搅拌器的转速为760～1000转/分钟。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述步骤(1)中所述磁力搅拌器的转速为760转/分钟。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述收集瓶出口和所述真空泵之间设有气体流量计。

11.根据权利要求10所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述收集瓶出口与所述气体流量计之间和所述气体流量计与所述真空泵之间通过胶管连接。

12.根据权利要求10所述的生物气溶胶收集方法，其中，所述真空泵上设有控制旋钮，所述生物气溶胶收集方法还包括以下步骤：通过控制旋钮和气体流量计控制气体流速。