CN110582300A - 肿瘤免疫治疗性治疗方法 - Google Patents

肿瘤免疫治疗性治疗方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110582300A
CN110582300A CN201880029079.7A CN201880029079A CN110582300A CN 110582300 A CN110582300 A CN 110582300A CN 201880029079 A CN201880029079 A CN 201880029079A CN 110582300 A CN110582300 A CN 110582300A
Authority
CN
China
Prior art keywords
agonist
acting
long
cancer
peg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880029079.7A
Other languages
English (en)
Inventor
S·基维马
M·亨尼西
N·K·阿南德
H·蔡
邓波良
任忠旭
B·V·乔希
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nikta Therapeutic Co
Original Assignee
Nikta Therapeutic Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nikta Therapeutic Co filed Critical Nikta Therapeutic Co
Publication of CN110582300A publication Critical patent/CN110582300A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

提供了一种向患有癌症的患者施用以下各项的方法：(a)4‑1BB激动剂；(b)IL‑2Rβ活化量的长效IL‑2Rβ选择性激动剂；和/或(c)toll样受体激动剂，以及相关的组合物、试剂盒和组合物。

Description

肿瘤免疫治疗性治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请按照35U.S.C.§119(e)要求了于2017年5月5日提交的美国临时专利申请号62/502,051和于2017年5月2日提交的美国临时专利申请号62/500,486的优先权权益，将这些申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本文描述了(除其他事项外)包含4-1BB受体激动剂与IL-2Rβ选择性激动剂和/或toll样受体(TLR)激动剂组合的组合物、相关配制品、系统和试剂盒、治疗组合、治疗方法以及制备这些组合物的方法。本申请还涉及癌症免疫疗法领域，并且涉及例如通过将4-1BB受体激动剂与长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或toll样受体(TLR)激动剂组合施用于个体来治疗患有癌症的个体。
背景技术
4-1BB受体是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。该受体还被鉴定为CD137、CDw137、淋巴细胞活化诱导(ILA)型、和肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)。4-1BB是由T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、粒细胞和肥大细胞表达的39kDa跨膜蛋白。结合其配体4-1BBL后，4-1BB通过激活NF-κB、c-Jun和p38下游途径向CD4和CD8T细胞提供共刺激信号。认为4-1BB受体在调节免疫应答中很重要。(Arch和Thompson,Molecular andCellular Biology[分子与细胞生物学],1998年1月；18(1):558-565。还参见，Jang等人,Biochemical and Biophysical Research Communications[生物化学与生物物理学研究通讯]242,613–620(1998),文章编号RC978016。)已经研究了一些4-1BB受体激动剂的抗肿瘤特性，它们例如与以下各项抗体组合：结合CD20的抗体(Thall等人,New Drugs inHematology conference[血液学新药会议],博洛尼亚(Bologna),意大利,2016年5月9日至11日，2016年5月10日出席)、结合CCR4的抗体(辉瑞公司新闻稿，Pfizer And Kyowa HakkoKirin To Collaborate On Immuno-Oncology Combination Study[辉瑞公司和协和博科麒麟公司合作进行免疫肿瘤学组合研究],2014年9月29日)、结合PD-1的抗体(辉瑞公司新闻稿，Pfizer Presents Data from Phase 1b Trial Investigating Utomilumab(a 4-1BB agonist)in Combination with a Checkpoint Inhibitor[辉瑞提供研究乌托鲁单抗(4-1BB激动剂)与检查点抑制剂的组合的1b期试验的数据],2016年6月4日)、以及结合OX40的抗体(辉瑞公司新闻稿，Pfizer to Collaborate with National Cancer Institute toStudy Three Immunotherapy Agents Targeting Multiple Cancers[辉瑞与美国国家癌症研究所合作研究三种针对多种癌症的免疫疗法],2016年11月14日)。已经研究了其他几种4-1BB组合癌症疗法。(参见，例如，Bartkowiak和Curran,Frontiers in Oncology[肿瘤学前沿],2015,5,117,2015年6月08日。)
已经提出，IL-2Rβ-选择性激动剂的施用通过靶向适应性免疫系统而对患有某些癌症的患者有益。预期这种施用将减少调节性T细胞的免疫遏制性作用，同时增加CD8+记忆T细胞，从而募集患者自身的免疫系统以消除癌细胞。参见例如，Charych等人,AACR 2013,Abstract[摘要]#482。
在癌症治疗中经由施用IL-2Rβ选择性激动剂(其可直接免疫活化)来募集癌症患者的免疫系统可以在一些情况下例如通过施用另外的药剂来进一步增强。然而，当试图通过施用多于一种免疫调节物质来激活针对肿瘤的细胞毒性免疫应答时，出现了许多挑战。例如，在一些情况下，第二免疫调节剂的施用实际上可以减弱或遏制而不是增强第一免疫调节剂(当以单一药剂(即，作为单一疗法)施用时，该第一免疫调节剂促进强烈的抗肿瘤应答)的细胞毒性作用。在癌症免疫治疗中，尤其是在施用多种活性剂时，在免疫刺激和免疫抑制之间实现良好的平衡以提供有效的抗肿瘤应答是一项重大挑战。
除了靶向适应性免疫系统之外，还可以施用先天性免疫系统的刺激物来治疗癌症。例如，由于其强大的免疫刺激能力，已经研究了Toll样受体(TLR)。TLR主要由属于先天性免疫系统组的细胞(即树突细胞(DC)和单核细胞)表达。尽管TLR在几种类型的肿瘤中进行功能性表达，但它们可以对癌发生发挥正面作用和负面作用。TLR包含一个高度保守的种系编码模式识别受体家族，该家族可检测多种感染性生物体表达的病原体相关分子模式(PAMP)。TLR触发先天性免疫系统并增强对病原体和肿瘤表达的抗原的适应性免疫。在哺乳动物中已鉴定出至少13种不同的TLR(Zhao,G.等人,Journal for ImmunoTherapy ofCancer[癌症免疫治疗杂志]2014,2:12)。TLR1、TLR-2、TLR-4、TLR-5、TLR-6和TLR-10在细胞表面上表达，而TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9位于细胞中的内体膜上。(Kaczanowska,S.等人,J.Leukoc Biol.[白细胞生物学杂志]2013年6月；93(6):847-863)。TLR是检测病原体和恶性细胞衍生的分子(称为病原体相关分子模式(PAMP))的传感物，这些分子与TLR结合后会触发(NF)-κB和I型干扰素途径，从而在树突细胞(DC)和其他抗原呈递细胞(例如巨噬细胞)中产生促炎细胞因子。TLR对于刺激DC成熟、抗原摄取和呈递、以及CD4+细胞的分化和调节性T(Treg)细胞的控制是至关重要的。
TLR-7、TLR-8和TLR-9在识别核酸基序和内体区室中的表达方面是相似的(Zhao,G.,2014,同上)。几种配体(包括合成核苷和天然核苷)都已被表征为TLR7和/或TLR8配体。通过TLR7或TLR8受体识别这些核苷配体激活了细胞内途径，最终导致促炎细胞因子、趋化因子和I型干扰素(IFN)的诱导、以及共刺激分子的上调。TLR是I型膜蛋白，其特征在于由富含亮氨酸的重复序列组成的胞外结构域，对识别病原体相关分子模式和细胞质结构域(称为Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域，该结构域对于下游信号传导是必需的)负责。TLR7和TLR8密切相关，共享其细胞内内体位置及其配体。通过TLR7或TLR8识别配体之后，募集包含TLR结构域的衔接分子髓样分化初级应答基因88(MyD88)。TLR7/8和MyD88的缔合刺激白细胞介素-1受体相关激酶家族成员的募集，从而导致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和IκB激酶(IKK)复合物的下游激活。TLR 7和TLR 8的Toll样受体激动剂可以激活巨噬细胞，并且在某些情况下可以将肿瘤环境从肿瘤促进环境变为肿瘤遏制性(炎性)环境。
鉴于TLR配体具有以下潜在能力：激活如DC、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和人角质形成细胞等几种细胞类型，诱导细胞凋亡，产生增强的免疫原性以及对细胞毒性T细胞淋巴细胞和化学治疗剂介导的杀伤的敏感化，因此TLR配体被认为是一类可以产生有效抗肿瘤免疫应答的免疫应答调节剂。此外，已显示TLR8配体可逆转CD8+Treg细胞的遏制功能(Kiniwa Y.等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]2007；13:6947-58)。此外，TLR8配体的应用导致肿瘤浸润性Foxp3+Treg细胞减少，从而将肿瘤环境从肿瘤促进环境变为肿瘤遏制环境(Anz D.等人,Cancer Res.[癌症研究]2015；75:4483-93)。另一方面，在某些情况下，已显示TLR活化对于肿瘤细胞的增殖、侵袭性和/或存活是有利的(参见，例如，BohnhorstJ.等人,Leukemia[白血病]2006；20:1138-1144；以及Jego G.等人,Leukemia[白血病]2006；20:1130-1137)。还已经显示某些TLR 7/8激动剂可诱导免疫遏制和自身免疫性疾病(Chi H.等人Frontiers in Pharmacology.[药理学前沿]2017；8:304)。
已经研究了TLR激动剂的抗肿瘤特性，然而，总体而言，大多数TLR激动剂作为癌症治疗剂表现不佳。据推测，这种表现不佳可能是由免疫遏制因子的诱导抑制TLR激动剂诱导的炎症的机制所解释。(Lu,H.Frontiers in Immunology[免疫学前沿],2014年3月,5,83)。例如，TLR激动剂通过诱导共刺激分子(例如CD80、CD86和CD40)而对树突细胞和使免疫应答极化的炎性细胞因子(例如TNF-α和IL-12)产生免疫刺激作用。然而，TLR激动剂也具有免疫抑制作用，例如通过诱导几种免疫抑制因子(包括IL-10、调节性T细胞(Treg)和PD-1)，它们都可以阻遏抗肿瘤免疫力(Lu,H.,2014,同上)。因此，在试图获得免疫治疗组合方面存在显著的挑战，在该组合中两种组分可以良好地相互作用以提供增强的治疗效果。
如上所讨论的，尽管迄今为止在开发涵盖各种平台的有效癌症免疫疗法方面已经做出了巨大的努力，然而仍然需要鉴定和提供新的和更有效的免疫疗法治疗方案，例如用于治疗癌症。本公开试图解决该需求和其他需求。
本文描述了多个方面和实施例。照此，即使没有明确说明，本文描述的特征和实施例中的每一个意指可适用于(但不需要适用于)任何其他方面、实施例或特征或多个特征的组合，除非相反地指出。
发明内容
在第一方面，本文提供了一种方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用4-1BB激动剂与IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂的组合，本文将对其每一个进行更详细的说明。在某些实施例中，该组合可以促进免疫系统(例如通过促进CD8T细胞、CD11c+和CD8+树突细胞、以及嗜中性粒细胞)的活化，同时还克服免疫抑制(例如通过遏制调节性T细胞、巨噬细胞、和单核细胞)。
在另一方面，本文提供了一种方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用4-1BB激动剂和TLR激动剂。
在另一方面，本文提供了一种方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用4-1BB激动剂和IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂。
在另一方面，本文提供了一种方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用4-1BB激动剂、IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和TLR激动剂。
为了清楚起见，就施用顺序而言，可以同时地或顺序地且以任何顺序并通过相同的和/或不同的施用途径施用4-1BB激动剂、TLR激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂(每一种都以免疫调节量)。此外，治疗可以包括单个治疗周期，或者可以包括多个(即两个或更多个)治疗周期。其他治疗周期可包括施用4-1BB激动剂、TLR激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂，或施用其子集，并且本公开在此方面不受限制。
在与前述方面中任一方面相关的一个或多个实施例中，局部施用TLR激动剂。另外，在与前述方面中任一个或多个方面相关的一个或多个实施例中，肠胃外施用长效IL-2Rβ偏向性激动剂。又在与前述方面中任一个或多个方面相关的一个或多个其他实施例中，肠胃外施用4-1BB激动剂。在一个或多个相关的实施例中，将TLR激动剂直接施用至肿瘤部位。在一些适用的实施例中，同时地或甚至作为单一配制品的组分施用4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂。
在与前述方面中任一个或多个方面相关的一个或多个实施例中，彼此分开施用4-1BB激动剂、TLR激动剂(例如TLR 7/8激动剂的多臂聚合物缀合物)和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂。在又一个或多个其他实施例中，在施用长效IL-2Rβ偏向性激动剂和4-1BB激动剂之前，向受试者施用TLR激动剂。在一个或多个替代性实施例中，在治疗的第1天施用TLR激动剂，并且在治疗的第1至4天的任何一天施用长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或4-1BB激动剂。例如，在治疗的第1、2、3或4天的任何一天施用长效IL-2Rβ偏向性激动剂和4-1BB激动剂。在一些实施例中，一起施用4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂。
在与前述方面中任一个或多个方面相关的一个或多个实施例中，彼此同时施用4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂。例如，在一个或多个实施例中，在治疗的第1天施用4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂。在一些实施例中，以相同配制品施用4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂。
在与前述方面中任一个或多个方面相关的一个或多个实施例中，彼此同时施用4-1BB激动剂和TLR激动剂。例如，在一个或多个实施例中，在治疗的第1天施用4-1BB激动剂和TLR激动剂。在一个或多个实施例中，以相同配制品施用4-1BB激动剂和TLR激动剂。
在与前述方面中任一个或多个方面相关的一个或多个实施例中，彼此同时施用4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂。例如，在一个或多个实施例中，在治疗的第1天施用4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂。在一个或多个实施例中，以相同配制品施用4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂。
在一个优选实施例中，受试者是人类受试者。
在一个或多个另外的实施例中，癌症是实体癌。例如，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、胃癌、淋巴瘤、恶性黑素瘤、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、胆管癌、脑癌、宫颈癌、上颌窦癌、膀胱癌、食管癌、霍奇金病和肾上腺皮质癌。
在一些实施例中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂包括可释放地共价附接至聚乙二醇的阿地白介素。在又一些另外的实施例中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂包括可释放地共价附接至4、5和6个聚乙二醇聚合物的阿地白介素。在又一些其他实施例中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂包括可释放地共价附接至平均约6个聚乙二醇聚合物的阿地白介素。在一个或多个另外的实施例中，可释放地共价附接至阿地白介素的聚乙二醇聚合物是分支的。在又一个或多个特定实施例中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂是多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2，例如，(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2。在又一个或多个另外的实施例中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂是(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)平均6白细胞介素-2。
在与前述方面或实施例中任一项或多项相关的又一些其他实施例中，TLR激动剂是TLR-7或TLR-8激动剂。在一个或多个实施例中，TLR激动剂是TLR-7激动剂。在又一个或多个替代性实施例中，TLR激动剂是TLR-8激动剂。在一些实施例中，TLR激动剂是长效TLR激动剂，例如长效TLR-7或长效TLR-8激动剂(例如，多臂聚合物改性的TLR-7或TLR-8激动剂)。
在又一些另外的实施例中，长效TLR激动剂是TLR激动剂(例如TLR 7/8激动剂)的多臂水溶性聚合物缀合物。在又一个或多个其他实施例中，多臂水溶性聚合物稳定地共价连接至TLR激动剂，例如TLR 7/8激动剂。
在一个或多个替代性实施例中，多臂水溶性聚合物可释放地共价连接至TLR激动剂。在又一个或多个特定实施例中，长效TLR激动剂是一种基于4-臂-季戊四醇基的聚乙二醇缀合物，在其四个聚合物臂的每个的末端均具有稳定地或可释放地共价连接(任选地通过间插间隔子或接头部分)的TLR激动剂分子。在与TLR激动剂相关的一些实施例中，TLR激动剂是咪喹莫特(imiquimod)或瑞喹莫德(resiquimod)。在又一些其他实施例中，TLR激动剂是瑞喹莫德。在一个或多个特定实施例中，TLR激动剂是4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848。
在与前述方面或实施例中任一项或多项相关的又一些其他实施例中，4-1BB激动剂是抗体。在与前述方面或实施例中任一项或多项相关的又一些其他实施例中，4-1BB激动剂是人单克隆抗体。在一个或多个实施例中，4-1BB激动剂是PRS-342(皮里斯制药公司(Pieris Pharmaceuticals))、PRS-343(皮里斯制药公司)、EU-101(Eutilex公司)、乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513，BMS)或乌托鲁单抗(utomilumab)(PF-05082566，辉瑞公司(Pfizer))。在一个或多个实施例中，4-1BB激动剂是乌瑞鲁单抗(BMS-663513，BMS)或乌托鲁单抗(PF-05082566，辉瑞公司)。
在一些实施例中，组合疗法包括施用4-1BB激动剂和4臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848或(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2。在一些其他实施例中，组合疗法包括施用4-1BB激动剂与4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848和(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2的组合。在一些其他实施例中，4-1BB是乌瑞鲁单抗。在又一些另外的实施例中，4-1BB激动剂是乌托鲁单抗。
在该施用方法的任一个或多个方面的一些实施例中，该施用有效地在受试者中产生异位效应。
在又另一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含T细胞刺激量的4-1BB激动剂和IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或先天免疫活化量的TLR激动剂、连同用于治疗患有癌症的受试者的说明书。
在又另一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和T细胞刺激量的4-1BB激动剂、连同用于治疗患有癌症的受试者的说明书。
在又另一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含T细胞刺激量的4-1BB激动剂和先天免疫活化量的TLR激动剂、连同用于治疗患有癌症的受试者的说明书。
在该试剂盒的一个或多个实施例中，将4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂包含在用于向受试者施用的单一组合物中，其中该单一组合物任选地包含药学上可接受的赋形剂。在该试剂盒的一个或多个其他实施例中，将4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂包含在用于向受试者施用的单一组合物中，其中该试剂盒任选地进一步包含含有TLR激动剂的另外的单独组合物，即，用于向受试者施用，每种单独组合物任选地包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在该试剂盒的一些替代性实施例中，将4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂各自提供在单独的容器中，并且该试剂盒包含用于单独地向受试者施用TLR激动剂、4-1BB激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂的说明书。
在该试剂盒的一些实施例中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂、4-1BB激动剂和/或TLR激动剂均为固体形式。在一个或多个相关的实施例中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂、4-1BB激动剂和/或长效TLR激动剂均为适于在水性稀释剂中重构的固体形式。
在又一个或多个其他实施例中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂、4-1BB激动剂和/或TLR激动剂各自包含在各自含有药学上可接受的赋形剂的单独组合物中。
在以下说明书和权利要求书中阐述了另外的方面和实施例。
具体实施方式
定义
在描述和要求本公开的某些特征时，将根据以下所述的定义使用以下术语，除非另外指明。
如本说明书所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。
“水溶性非肽聚合物”表示在室温下至少35％(按重量计)可溶于水、优选大于70％(按重量计)可溶于水、且更优选大于95％(按重量计)可溶于水的聚合物。通常，“水溶性”聚合物的未经过滤的水性制剂透射过滤后相同溶液透射的光量的至少75％，更优选至少95％。然而，最优选的是水溶性聚合物至少95％(按重量计)可溶于水或完全可溶于水。关于“非肽”，当聚合物具有少于35％(按重量计)的氨基酸残基时，它是非肽的。
术语“单体”、“单体亚单元”和“单体单元”在本文中可互换使用，并且是指聚合物的基本结构单元之一。在均聚物的情况下，单个重复结构单元形成聚合物。在共聚物的情况下，重复两个或多个结构单元(以一种模式或随机地)以形成聚合物。优选的聚合物是均聚物。水溶性非肽聚合物包含一种或多种连续附接以形成单体链的单体。聚合物可以由单一单体类型(即，均聚物)或者两种或三种单体类型(即，共聚物)形成。
如本文使用的“聚合物”是具有约2至约4000或更多个，例如约2至约2000个单体的分子。特定的聚合物包括具有多种几何形状(例如线形、分支或叉形)的那些，将在下面更详细地描述。
如本文使用的，“PEG”或“聚乙二醇”意在涵盖任何水溶性聚(环氧乙烷)。除非另有说明，否则“PEG聚合物”或任何聚乙二醇是其中基本上全部(优选全部)单体亚基为环氧乙烷亚基的聚乙二醇，然而，该聚合物可包含不同的封端部分或官能团(例如用于偶联)。PEG聚合物可包含以下两种结构之一：-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-，这取决于末端的一个或多个氧是否已被取代，例如在合成转化过程中。如上所述，对于PEG聚合物，变量(n)(即重复单元的数目)在约2至2000或约2至4000的范围内，并且整个PEG的端基和结构可以变化。当PEG进一步包含用于连接至例如小分子或蛋白质的官能团时，该官能团当共价附接至PEG聚合物时不会导致形成氧-氧键(-O-O-，过氧化物键联)。
术语“封端的(end-capped)”或“末端加帽的(terminally capped)”在本文中可互换使用，是指具有封端部分的聚合物的末端或端点。通常，尽管不必要的，封端部分包含羟基或C1-20烷氧基或烷芳氧基基团。因此，封端部分的实例包括烷氧基(例如，甲氧基和乙氧基)、苄氧基以及芳基、杂芳基、环、杂环等。另外，设想了前述各种的饱和、不饱和、取代和未取代的形式。此外，封端基团还可以是硅烷。封端基团还可以有利地包含可检测标签。当聚合物具有包含可检测标签的封端基团时，可以通过使用合适的检测器来确定聚合物和/或与聚合物偶联的目标部分(例如，活性剂)的量或位置。此类标记包括但不限于荧光剂、化学发光剂、用于酶标记的部分、比色部分(例如染料)、金属离子、放射性部分等。合适的检测器包括光度计、薄膜、光谱仪等。另外，封端基团可包含靶向部分。
术语“靶向部分”是指帮助缀合物定位于例如靶向区域(例如帮助进入细胞或结合受体)的分子结构。优选地，靶向部分包含维生素、抗体、抗原、受体、DNA、RNA、唾液酸化的路易斯X抗原、透明质酸、糖、细胞特异性凝集素、类固醇或类固醇衍生物、RGD肽、细胞表面受体的配体、血清组分、或针对各种细胞内或细胞外受体的组合分子。靶向部分还可以包含脂质或磷脂。示例性磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺。这些脂质可以呈胶束或脂质体等形式。靶向部分可以进一步包含可检测标签，或者可替代地可检测标签可以用作靶向部分。当聚合物缀合物具有包含可检测标签的靶向基团时，可以通过使用合适的检测器来确定聚合物和/或与聚合物偶联的部分(例如活性剂)的量和/或分布/位置。此类标签包括但不限于荧光剂、化学发光剂、用于酶标记的部分、比色剂(例如染料)、金属离子、放射性部分、金颗粒、量子点等。
在水溶性聚合物如PEG的情况下，分子量可以表示为数均分子量或重均分子量。除非另有说明，否则本文中对分子量的所有提及均指重均分子量。分子量测定、数均和重均都可以使用凝胶渗透色谱法或其他液相色谱技术(例如，凝胶过滤色谱法)进行测量。也可以使用其他测量分子量值的方法，例如使用端基分析或依数性(例如，凝固点降低、沸点升高或渗透压)的测量来确定数均分子量，或使用光散射技术、超速离心、MALDI TOF或粘度测定法来确定重均分子量。PEG聚合物通常是多分散的(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，低多分散性值为优选小于约1.2，更优选小于约1.15，仍更优选小于约1.10，又仍更优选小于约1.05，且最优选小于约1.03。
关于聚合物的几何形状或整体结构，“分支的”是指具有两个或更多个从分支点延伸的聚合物“臂”或链的聚合物。
关于聚合物的几何形状或整体结构，“叉状”是指具有两个或更多个从分支点(通常通过一个或多个原子)延伸的官能团的聚合物。
“分支点”是指包含一个或多个原子的分叉点，聚合物在该分叉点处从线性结构分支或分叉成一个或多个另外的臂。
术语“反应的”或“活化的”是指在有机合成的常规条件下容易地反应或以实际速率反应的官能团。这与不反应或需要强催化剂或不切实际的反应条件才能反应的那些基团(即“非反应性”或“惰性”基团)相反。
关于反应混合物中分子上存在的官能团，“不易反应的”表示该基团在有效在反应混合物中产生所需反应的条件下仍很大程度上保持完整。
“保护基团”是阻止或阻断分子中特定化学反应性官能团在某些反应条件下反应的部分。保护基团可以根据被保护的化学反应性基团的类型以及所采用的反应条件以及分子中另外的反应性基团或保护基团的存在而变化。可以被保护的官能团例如包括羧酸基团、氨基基团、羟基基团、硫醇基团、羰基基团等。对于以下各项的代表性保护基团包括：对于羧酸，包括酯(例如对甲氧基苄基酯)、酰胺和酰肼；对于氨基基团，包括氨基甲酸酯(例如叔丁氧基羰基)和酰胺；用于羟基基团，包括醚和酯；用于硫醇基团，包括硫醚和硫酯；用于羰基基团，包括缩醛和缩酮；等等。这类保护基团是本领域技术人员熟知的，并且例如在T.W.Greene和G.M.Wuts,Protecting Groups in OrganiCSynthesis[有机合成中的保护基团],第三版,威利出版社(Wiley),纽约,1999,以及其中引用的参考文献中描述。
“保护形式”的官能团是指带有保护基团的官能团。如本文使用的，术语“官能团”或其任何同义词涵盖其保护形式。
“可释放的键联”是在生理条件下裂解的相对不稳定的键，其中该裂解可以通过许多不同机制中的任何一种发生。一种类型的示例性可释放键联是可水解键，即例如在生理条件下与水反应时裂解(即被水解)的键，例如像酰胺键(如芳族酰胺键)的水解。键在水中水解的趋势可能不仅取决于连接两个原子的键联的一般类型，而且取决于附接至这些原子的取代基。示例性水解不稳定或较弱的键联可以包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽、寡核苷酸、硫酯和碳酸酯。可释放的键联还包括酶促可释放的键联，其中“酶促可释放的键联”意指易于被一种或多种酶裂解的键联。释放机制的另外的类型包括但不限于1,6-苄基消除、β-消除等。尽管某些键可能被认为是稳定或可释放的，但应在分子实体或结构实体的整体结构内考虑这种表征。在某些情况下，包含可释放的键的聚合物缀合物可以被称为前药，其中在体内(即，在生理条件下)裂解该可释放的键时，母体药物被释放(或可以最终被释放，这取决于可释放地附接至活性剂上的聚合物部分的数量)。共价“可释放的”键联，例如在与活性部分(例如白细胞介素-2、或TLR激动剂(例如瑞喹莫德(也称为R848)))共价附接的水溶性聚合物(例如聚乙二醇)的背景下，是在生理条件下裂解从而从活性部分释放或分离水溶性聚合物或从水溶性聚合物分离活性部分的键联。
“稳定的”键联或键是指在水中(例如，在生理条件下)基本稳定的化学键，也就是说，在生理条件下在延长的时间段内不会发生任何明显程度的水解。水解稳定的键联的实例通常包括但不限于以下：碳-碳键(例如，在脂肪族链中)、醚、酰胺、尿烷、胺等。通常，稳定的键联是在生理条件下每天表现出小于约1％-2％的水解速率的键联。代表性化学键的水解速率可在大多数标准化学教科书中找到。
“TLR 7/8激动剂”(或“TLR激动剂”)是作为Toll样受体7和/或Toll样受体8的激动剂的任何化合物。
“4-1BB激动剂”是作为4-1BB受体的激动剂的任何化合物(例如小分子、配体或抗体)。
“基本上(substantially)”或“基本上(essentially)”是指几乎全部或完全，例如95％或更高，更优选97％或更高，仍更优选98％或更高，甚至更优选99％或更高，又仍更优选99.9％或更高，在某些给定数量中最优选99.99％或更高。
“烷基”是指烃链，其长度范围为约1至20个原子。此类烃链优选但不必是饱和的，并且可以是支链或直链的。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、2-甲基丁基、异丙基、3-甲基戊基等。如本文使用的，当提及三个或更多个碳原子时，“烷基”包括环烷基。“烯基”基团是具有至少一个碳-碳双键的2至20个碳原子的烷基基团。
术语“经取代的烷基”或“经取代的Cq-r烷基”(其中q和r是标识烷基基团中包含的碳原子范围的整数)表示被一个、两个或三个卤素原子(例如F、Cl、Br、I)、三氟甲基、羟基、C1-7烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、叔丁基等)、C1-7烷氧基、C1-7酰氧基、C3-7杂环基、氨基、苯氧基、硝基、羧基、酰基、氰基等取代的上述烷基基团。经取代的烷基基团可以被相同或不同的取代基取代一次、两次或三次。
“低级烷基”是指含有1至7个碳原子的烷基基团，并且可以是直链或支链的，以甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基为例。
“低级烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的2至6个碳原子的低级烷基基团。
“非干扰性取代基”是当存在于分子中时通常与分子中包含的其他官能团不反应的那些基团。
“烷氧基”是指-O-R基团，其中R是烷基或经取代的烷基，优选C1-C20烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等)，优选C1-C7。
术语“芳基”意指具有多达14个碳环原子的芳族基团。芳基基团包括苯基、萘基(naphthyl)、联苯、菲基、萘基(naphthalenyl)等。“经取代的苯基”和“经取代的芳基”分别表示被一个、两个、三个、四个或五个(例如1-2、1-3或1-4个)选自卤素(F、Cl、Br、I)、羟基、氰基、硝基、烷基(例如C1-6烷基)、烷氧基(例如C1-6烷氧基)、苄氧基、羧基、芳基等取代基取代的苯基基团和芳基基团。
本文所述的碱性反应物或酸性反应物包括中性反应物、带电反应物及其任何相应的盐形式。
如本文所述的示例性缀合物、活性部分或其他适当适用的化学部分意在在适用的情况下涵盖其类似物、异构体、多晶型物、溶剂化物和药学上可接受的盐形式。
“药理学有效量”、“生理学有效量”和“治疗有效量”在本文中可互换使用，意指在血流或在靶组织中提供所需水平的活性剂和/或缀合物所需的活性剂(例如像聚合物缀合物)的量。准确的量可以取决于多种因素，例如，具体的活性剂、组合物的组分和物理特征、意向患者群体、患者注意事项，并且可由本领域技术人员基于本文中提供的和相关文献中可用的信息容易地决定。例如，当(顺序地或同时地)施用时，治疗有效量的化合物或一种或多种化合物的组合是引起所需生物学或医学应答(例如破坏癌细胞或减缓或停滞受试者癌症的进展)的量。该术语还适用于将在靶细胞中诱导特定期望的应答的化合物的剂量，例如，当组合施用时，以提供有益的作用。在某些实施例中，该组合作用是累加的。在某些实施例中，该组合作用是协同的。此外，本领域技术人员将认识到，在本发明的组合疗法的情况下，4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂(例如，多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2)、和/或TLR激动剂能以“亚治疗量”(即小于单独施用时该化合物的治疗有效量)使用。
组合疗法或“与……组合”是指使用多于一种治疗剂来治疗特定的障碍或病症。“与……组合”并不旨在暗示必需同时施用这些治疗剂和/或配制这些治疗剂用于一起递送，尽管这些递送方法也在本公开的范围内。治疗剂可以与一种或多种其他另外的药剂同时、在其之前或之后施用。组合疗法中的治疗剂还可以在有或没有停药期(restingperiod)(例如，在方案的某些天不施用治疗剂)的情况下以交替的给药方案进行施用。与另一种治疗剂“组合”的治疗剂的施用包括但不限于两种或更多种药剂的顺序施用和同时施用。通常，每种治疗剂将以针对该特定药剂所确定的剂量和/或时间表施用。
“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可以包含在本文所述的组合物中并且对患者没有明显不利的毒理学作用的组分。
如本文使用的术语“患者”或“受试者”是指患有或易于患有通过施用如本文提供的化合物或组合物或组合来预防或治疗的病症(例如癌症)的活生物体，并且包括人类和动物。受试者包括但不限于哺乳动物(例如，鼠类、猿猴、马、牛、猪、犬、猫等)，并且优选地是人类。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的情况可以发生但不必发生，于是该描述包括其中发生该情况的实例以及其中不发生该情况的实例。
如本文使用的“小分子”是指通常具有小于约1000Da的分子量的有机化合物。
概述
本文所述的组合物、系统、试剂盒、组合物和方法结合了药物设计和治疗原理上的许多创新进展，这些进展整合到能够使先天性免疫系统活化的新颖、潜在更安全和高效的抗癌疗法中。
为了解决与当前涉及单一免疫治疗剂的抗肿瘤策略相关的缺陷中的至少一些，例如高全身性暴露和相关毒性和/或次佳溶瘤作用，本文提供了组合物、系统、组合和方法，其包括向患有癌症的受试者施用先天免疫活化量(例如T细胞刺激量)的4-1BB激动剂、以及TLR激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种。本公开至少部分地基于令人惊奇的有利的治疗组合的发现，该组合包括(i)4-1BB激动剂和至少一种TLR激动剂或长效IL-2R激动剂(并且更具体地是IL-2Rβ偏向性激动剂)，或(ii)4-1BB激动剂、TLR激动剂和长效IL-2R激动剂(并且更具体地是IL-2Rβ偏向性激动剂)。
Il-2通过含有α受体(IL2Rα，CD25)、β受体(IL2Rβ，CD122)、和共同γ链受体(γc，CD132)的受体信号传导复合物来刺激免疫细胞增殖和活化。高剂量时，IL2与异二聚体IL2Rβγ受体结合，这导致肿瘤杀伤性CD8+记忆效应T(CD8T)细胞的所希望的扩增。然而，IL2还以更高的亲和力与其异源三聚体受体IL2Rαβγ结合，从而扩增免疫遏制性CD4+、CD25+调节性T细胞(Treg)，这可能产生针对癌症免疫疗法的不良作用。因此，本文提供了一种治疗模式，该治疗模式将4-1BB激动剂与(i)IL-2Rαβ偏向性激动剂，特别是长效IL-2Rαβ偏向性激动剂，或(ii)TLR激动剂，例如TLR 7/8激动剂，或(i)两者，即与IL-2Rαβ偏向性激动剂(特别是长效IL-2Rαβ偏向性激动剂)和TLR激动剂(例如TLR 7/8激动剂)组合施用。不受理论的束缚，据信，通过利用能刺激T细胞活性的4-1BB激动剂，当与长效IL-2化合物(在该化合物中，与负责激活免疫遏制性Treg的IL2Rα亚基相互作用的区域被掩盖(即，其活性被遏制或抑制))，即长效IL-2Rαβ偏向性激动剂选择性组合时，和/或与具有抗原呈递细胞成熟和T细胞初免的作用机制的TLR激动剂选择性组合时，可以实现优异的治疗功效，如从本公开和支持实例中将变得显而易见。实际上，在一个代表性实例中，前述组合产生了惊人的异位效应，使得在所有肿瘤中均观察到功效，这两种肿瘤是其中直接施用4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rαβ激动剂中的至少一种(原发性肿瘤)以及未直接施用4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rαβ偏向性激动剂中的至少一种(继发性肿瘤)的肿瘤。
本文提供的组合疗法至少部分引起对如本文所述的TLR7/8激动剂和长效IL-2Rαβ偏向性激动剂(例如像，多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2)的组合在小鼠肿瘤模型中的免疫系统应答的初步研究，其中观察到体内生长的、对多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2有应答的大部分T细胞获得了表面蛋白CD11c表达，该表达通常与髓样细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)相关。这些细胞与T细胞在功能和发育上都非常不同，并且不是示例性长效IL-2Rαβ偏向性激动剂多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2的直接靶标。对CD11c表面蛋白表达的这种识别通过使用流式细胞术分析得到了进一步支持，该流式细胞术对与特定免疫细胞类型相关的各种细胞类型特异性细胞表面蛋白的丰度进行了评分。这一发现，即表达表面蛋白CD11c的T细胞是偶然发现的，因为在T细胞分析中，几乎从未使用过CD11c蛋白检测，因为CD11c蛋白通常不与这些细胞相关。
与示例性长效IL-2Rαβ偏向性激动剂(多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2)不同，TLR激动剂(如本文所述的那些，例如示例性TLR 7/8激动剂4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848)直接靶向表达CD11c蛋白的细胞类型，使得组合治疗的分析和评估包括针对由长效IL-2Rαβ偏向性激动剂导致的T细胞、以及TLR 7/8激动剂靶向的巨噬细胞和树突细胞这两者的身份标记物。这种组合的分析使在相同环境下的长效IL-2Rαβ偏向性激动剂靶细胞群和TLR 7/8激动剂靶细胞群这两者的细胞表面蛋白标记物可视化，并且出乎意料地揭示了CD8T细胞上的CD11c蛋白表达。
长效IL-2Rαβ偏向性激动剂、以及长效IL-2Rαβ偏向性激动剂与TLR 7/8激动剂的组合对CD8T细胞上的CD11c蛋白表达的诱导的这一认知导致了以下调查：经由4-1BB刺激T细胞而开发的非天然激动剂是否会使长效IL-2Rαβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂诱导的T细胞攻击癌细胞增强。如本文所提供的，已经发现当与长效IL-2Rαβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂组合时，4-1BB激动剂的施用还使长效IL-2Rαβ偏向性激动剂和TLR激动剂诱导的T细胞攻击癌细胞增强，从而提高治疗功效。
4-1BB激动剂
4-1BB在造血谱系的多个细胞上表达，包括活化后的CD8T细胞、活化的CD4辅助T细胞、B细胞、调节性T细胞、自然杀伤(NK)细胞等(Bartkowiak等人,Front.Oncol.[肿瘤学前沿]第5卷,文章117,2015)。4-1BB激动剂疗法对先天性和适应性免疫组均引起不同的免疫效应子应答。最有效的应答通过增加干扰素γ产生和多种颗粒酶的表达来刺激CD8+细胞毒性T细胞增殖并增加其效应子潜力。还可以刺激CD4+效应T细胞扩增并产生促炎细胞因子(Bartkowiak，同上)。
本文提供的组合物、系统或组合包含至少一种4-1BB激动剂。本文提供的治疗方法包括施用4-1BB激动剂，即，用于刺激先天性免疫应答。施用4-1BB激动剂可有效地增强例如T细胞增殖、IL-2分泌、存活和/或细胞溶解活性。
可以根据本文所述的组合物、系统、组合和方法来使用和/或施用各种4-1BB激动剂，并且本文中的组合物、系统、组合和方法不限于此。不受理论的限制，据信，由于4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rαβ偏向性激动剂的互补性质和作用机制，可以经由刺激所希望的T细胞应答的IL-2途径(即，经由4-1BB激动剂与TLR激动剂和/或长效IL-2Rαβ偏向性激动剂的共同施用)获得成功的结果。
示例性4-1BB激动剂包括但不限于例如，PRS-342(具有HER2靶向性抗体的CD137特异性抗运载蛋白(anticalin)，皮里斯制药公司)、PRS-343(遗传连接到HER2靶向性抗体的、激动性CD137靶向性抗运载蛋白，皮里斯制药公司)、EU-101(Eutilex公司)、乌瑞鲁单抗(BMS-663513，BMS)或乌托鲁单抗(PF-05082566，辉瑞公司)。在一个或多个实施例中，4-1BB激动剂是乌瑞鲁单抗(BMS-663513，BMS)或乌托鲁单抗(PF-05082566，辉瑞公司)，并且任一者或两者都可以在本文提供的双治疗性治疗方法和三治疗性治疗方法中作为4-1BB激动剂组合施用。
在一些实施例中，药理学有效量可以为约0.5mg/kg体重至500mg/kg体重、1至100mg/kg、3至50mg/kg、3至30mg/kg或3至15mg/kg之间。在一些实施例中，当与长效IL-2Rαβ偏向性激动剂、长效TLR 7/8激动剂任一者组合施用时，或当与前述两者组合施用时，小于0.5mg/kg体重的剂量可能是有效的。
如实例19所示，与使用单一药剂4-1BB激动剂和多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2与示例性长效TLR 7/8激动剂的组合的免疫疗法相比，施用4-1BB激动剂、示例性长效IL-2Rαβ偏向性激动剂(即，多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2)和长效TLR 7/8激动剂的组合可有效提高鼠CT-26结肠肿瘤模型的存活率。在示例性动物模型中，包含10μg剂量的4-1BB激动剂的组合疗法可导致100％的存活率。值得注意的是，在此实例中，较高剂量的4-1BB激动剂(100μg)可导致75％的存活率。因此，包括低剂量的4-1BB激动剂的组合疗法显示出比较高剂量的4-1BB激动剂更好的功效。这些结果与使用4-1BB激动剂的单一药剂研究相反，在该单一药剂研究中，10μg剂量导致25％的存活率，而100μg剂量导致100％的存活率。在一些实施例中，组合疗法允许使用较低剂量的4-1BB激动剂，这是很重要的，因为已显示4-1BB抗体激动剂可导致剂量限制性肝炎(Bartkowiak，同上)。
如实例20所示，施用示例性4-1BB激动剂和长效IL-2Rαβ偏向性激动剂多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2的组合提供了相似的结果，使得提供低剂量(即10μg剂量)的4-1BB激动剂的治疗可导致100％的存活率。
Toll样受体(TLR)激动剂
在一个或多个实施例中，本文提供的组合物、系统、组合和治疗方法可包含TLR激动剂，即，用于刺激先天性免疫应答。TLR激动剂的施用例如对激活先天免疫、髓样细胞应答和增加肿瘤抗原呈递是有效的。通常，TLR激动剂可通过模仿局部感染在肿瘤中产生创建肿瘤遏制性微环境。
多种TLR激动剂可用于组合物、系统或组合中；或根据本文所述的方法施用，并且本公开就此而言不受限制。不受理论的限制，据信，由于4-1BB激动剂、TLR激动剂(和长效IL-2Rαβ偏向性激动剂)的互补性质和作用机制，可以经由刺激所希望的T细胞应答的IL-2途径(即，经由4-1BB激动剂和TLR激动剂、与或不与长效IL-2Rαβ偏向性激动剂的共同施用)获得成功的结果。
在一些优选的实施例中，TLR激动剂是长效的，例如呈TLR7/8激动剂的水溶性聚合物缀合物(优选多臂水溶性聚合物缀合物，例如多臂聚乙二醇聚合物(PEG)缀合物)的形式。TLR激动剂的示例性多臂聚合物缀合物描述于PCT申请号PCT/US2018/0131999中，将该申请的内容通过引用以其全文明确地并入本文。
在一些实施例中，TLR激动剂是Toll样受体(“TLR”)激动剂化合物(即，TLR 7/8激动剂(TLR 7、TLR 8受体或两者的激动剂))的多臂聚合物缀合物。在一些特定的实施例中，多臂聚合物缀合物具有根据式I的结构：
其中R(与每个Q一起)是分别带有3至约50个羟基、硫醇或氨基基团的多元醇、多硫醇或多胺的残基；每个Q独立地是选自氧、硫和-NH的接头(例如，分别对应于来自多元醇、多硫醇或多胺的氧、硫或氮原子)；每个POLY独立地是水溶性非肽聚合物，例如像聚乙二醇；每个Xr独立地是含键联的间隔子部分；Q是从3至约50的正整数；并且每个TLR 7/8AG是Toll样受体7/8激动剂，其中式I还包括其药学上可接受的盐。下面讨论的是式I的多臂聚合物缀合物的各个组分。
就式I而言，在一个或多个实施例中，与多臂聚合物连接的多元醇、多硫醇或多胺的残基“R”是具有约3至约150个碳原子的含有机基团的部分(例如，约3至约50个碳原子)。在一些优选的实施例中，为多元醇、多胺或多硫醇核心分子的R(当其与Q一起时，即(R-Q)q)包含3至约25个碳原子，或3至约10个碳原子，例如，如3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。除了由Q定义的那些之外，该残基还可以包含一个或多个杂原子(例如，O、S或N)。关于多元醇(或多胺或多硫醇)，残基意指去除一个或多个末端氢原子之后的母体分子，以提供适合附接至POLY的有机基团。
如先前所述，形成本文提供的多臂缀合物的支化基础的多元醇、多硫醇或多胺的残基“R-Q”q源自相应的多元醇、多硫醇或多胺。在一个或多个实施例中，相应的多元醇、多硫醇或多胺分别带有至少三个可用于聚合物附接的羟基、硫醇或氨基基团。“多元醇”是包含三个或更多个羟基基团的分子。“多硫醇”是包含三个或更多个硫醇基团的分子。“多胺”是包含三个或更多个氨基基团的分子。
在一个或多个实施例中，多元醇、多胺或多硫醇通常分别包含3至约25个羟基、或氨基基团或硫醇基团，例如分别包含3至约10个(即3、4、5、6、7、8、9或10个)羟基、氨基基团或硫醇基团，优选分别包含3至约8个(即3、4、5、6、7或8个)羟基、氨基基团或硫醇基团。在一个或多个实施例中，各羟基、硫醇或氨基基团之间的原子数将变化，尽管各羟基、硫醇或氨基基团之间的长度为约1至约20个(例如1至约5个)间插原子(例如碳原子)是示例性的。在提及间插核心原子和长度时，-CH2-被认为具有一个间插的长度，-CH2CH2-被认为具有两个原子的长度，等等。
示例性多元醇和多胺分别具有(自由基)-(OH)q和(自由基)-(NH2)q结构，其中(自由基)对应于有机基团，且q是从3至约50的正整数。注意，如上所述，在式I中，变量“Q”当与R一起时通常代表如本文所述的核心有机基团的残基。也就是说，当描述多元醇、多硫醇和聚合物胺时，特别是通过名称描述时，这些分子在掺入含多臂聚合物的结构中之前即以其形式(即，称为母体分子)提及。也就是说，当描述优选的有机核心分子时，特别是通过名称描述时，核心分子以其前体形式而不是在去除例如一个或多个质子后的自由基形式来描述。因此，例如，如果有机核心基团衍生自季戊四醇，则前体多元醇具有结构C(CH2OH)4，并且有机核心基团(与Q一起)对应于C(CH2O-)4，其中Q是O。因此，例如，对于具有式I的缀合物(其中R(与Q一起)为多元醇季戊四醇C(CH2OH)4的残基)，残基R(与Q一起)对应为“C(CH2O-)4”，使得多臂聚合物缀合物中的每个“q”聚合物臂将从季戊四醇核心或残基的每个氧原子中发出。
示例性多元醇包括具有1至10个碳原子和3至10个羟基基团的脂肪族多元醇，包括例如三羟基烷烃、四羟基烷烃、多羟基烷基醚、多羟基烷基聚醚等。脂环族多元醇包括直链或闭环糖和糖醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、白坚木醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、侧金盏花醇、卫矛醇、岩藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、塔格糖、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。脂肪族多元醇的另外的实例包括葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖的衍生物和相关的立体异构体。还可以使用芳族多元醇，例如1,1,1-三(4'-羟基苯基)烷烃，例如1,1,1-三(4-羟基苯基)乙烷、2,6-双(羟基烷基)甲酚等。可以使用的其他核心多元醇包括聚羟基冠醚、环糊精、糊精和其他碳水化合物(例如单糖、寡糖和多糖、淀粉和淀粉酶)。
示例性多元醇包括甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、二季戊四醇、三季戊四醇、甘油的乙氧基化形式、三羟甲基丙烷的乙氧基化形式、季戊四醇的乙氧基化形式、二季戊四醇的乙氧基化形式、三季戊四醇的乙氧基化形式。而且，优选的是还原糖(例如山梨糖醇)和甘油低聚物(例如二甘油、三聚甘油、六聚甘油等)。可以使用具有21个可用羟基基团的羟丙基-β-环糊精来合成21臂聚合物。另外，还包括平均具有24个羟基基团的聚甘油作为示例性多元醇。
示例性多胺包括脂肪族多胺，例如二亚乙基三胺、N,N',N"-三甲基二亚乙基三胺、五甲基二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、二亚丙基三胺、三亚丙基四胺、双-(3-氨基丙基)-胺、双-(3-氨基丙基)-甲胺和N,N-二甲基-二亚丙基-三胺。可以使用的天然存在的多胺包括腐胺、亚精胺和精胺。许多适于使用的合适的五胺、四胺、低聚胺(oligoamine)和戊烷脒类似物在Bacchi等人(2002)Antimicrobial Agents andChemotherapy[抗微生物剂与化学疗法],46(1):55-61中描述，将该文献通过引用并入本文。
下面提供的是对应于多元醇残基的说明性结构(尽管每个结构都用衍生自相应羟基基团的氧原子(“O”)表示，但每个“O”可以被硫(“S”)或NH取代以分别表示多硫醇或多胺的相应残基)。注意，下面所示的残基将被理解为与R(与Q一起)对应的具有式I的缀合物，以提供具有与氧(或其他合适的杂原子)原子数相对应的多个臂的如下所示的多臂聚合物缀合物。
以及
其中m是0-40[例如0-10，例如0-5(即，0、1、2、3、4、5等)]的正整数。
多臂聚合物TLR 7/8激动剂缀合物包含水溶性非肽聚合物。可以使用各种各样的聚合物，并且本文提供的结构在水溶性聚合物的类型(例如，聚环氧乙烷或聚噁唑啉)或大小(例如，大小为2至4,000个单体)方面不受限制。
关于类型，水溶性非肽聚合物应理解为一系列重复单体，其中一种或多种单体的类型决定了水溶性非肽聚合物的类型。示例性单体包括但不限于环氧烷烃，例如环氧乙烷或环氧丙烷；烯烃醇，例如乙烯醇、1-丙烯醇或2-丙烯醇；乙烯基吡咯烷酮；羟烷基甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟烷基酯，其中在每种情况下，烷基优选为甲基；α-羟酸，例如乳酸或乙醇酸；磷腈，噁唑啉，碳水化合物(如单糖)，糖醇(如甘露醇)；以及N-丙烯酰基吗啉。在一个或多个实施例中，水溶性非肽聚合物是选自该组的两种单体类型的共聚物，或更优选地是选自该组的一种单体类型的均聚物。对于包括嵌段共聚物的共聚物，共聚物中的两种单体类型可以是相同的单体类型，例如，两种环氧烷烃，例如环氧乙烷和环氧丙烷。
关于大小，水溶性非肽聚合物可以相对较小，或者水溶性非肽聚合物可以相对较大。
关于式I中的POLY，即每个聚合物臂，在其中存在相对较小的水溶性非肽聚合物的那些实施例中，分子量的示例性值包括：低于约2000；低于约1500；低于约1450；低于约1400；低于约1350；低于约1300；低于约1250；低于约1200；低于约1150；低于约1100；低于约1050；低于约1000；低于约950；低于约900；低于约850；低于约800；低于约750；低于约700；低于约650；低于约600；低于约550；低于约500；低于约450；低于约400；低于约350；低于约300；低于约250；低于约200；以及低于约100道尔顿。相对较小的水溶性非肽聚合物的示例性范围包括约100至约1400道尔顿；约100至约1200道尔顿；约100至约800道尔顿；约100至约500道尔顿；约100至约400道尔顿；约200至约500道尔顿；约200至约400道尔顿；约75至1000道尔顿；以及约75至约750道尔顿。
对于相对较小的水溶性非肽聚合物(“POLY”)，单体的数量通常将落入以下范围的一个或多个范围中：1和30(包含端值)之间；约2和约25之间；约2和约20之间；约2和约15之间；约2和约12之间；约2和约10之间。在某些情况下，聚合物(和相应的缀合物)中串联单体的数量是1、2、3、4、5、6、7或8中的一种。在另外的实施例中，聚合物(和相应的缀合物)包含9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体。在又其他实施例中，每个聚合物“臂”(和相应的缀合物)中的聚合物部分具有串联的21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个单体。因此，例如，当水溶性非肽聚合物臂包含-(OCH2CH2)n-时，在一些实施例中，“n”是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的整数，并且可以落在以下范围的一个或多个范围内：约1和约25之间；约1和约20之间；约1和约15之间；约1和约12之间；约1和约10之间。
当缀合物中的全部水溶性非肽聚合物的分子量相对较大(例如，大于2,000道尔顿)时，总分子量可以落在2,000道尔顿至约150,000道尔顿的范围内。然而，示例性范围包括以下分子量：在约3,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内；在约5,000道尔顿至约110,000道尔顿的范围内；在大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内，在约6,000道尔顿至约90,000道尔顿的范围内，在约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内，在大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内，在约20,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内，在约53,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内，在约25,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内，在约29,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内，在约35,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内，以及在约40,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内。
关于式I中的每个聚合物臂“POLY”，相对较大的水溶性非肽聚合物的示例性分子量包括约500道尔顿、约750道尔顿、约1,000道尔顿、约1500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、以及约20,000道尔顿。
关于多臂缀合物的全部聚合物部分，相对较大的水溶性非肽聚合物的示例性分子量包括例如约20,000道尔顿、22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、以及约75,000道尔顿。具有总分子量为前述任一项的水溶性非肽聚合物的支化形式也可以用于各聚合物臂中，以提供多支化的缀合物。
因此，无论使用相对较小还是较大的水溶性非肽聚合物，当水溶性非肽聚合物是聚(环氧乙烷)时，该聚合物将包含许多(OCH2CH2)单体[或(CH2CH2O)单体，这取决于PEG的定义方式]。如整个说明书中所使用的，重复单元的数目由“(OCH2CH2)n”中的下标“n”标识。因此，(n)的值通常落在以下范围的一个或多个范围内：2至约3400、约100至约2300、约100至约2270、约136至约2050、约225至约1930、约450至约1930、约1200至约1930、约568至约2727、约660至约2730、约795至约2730、约795至约2730、约909至约2730、以及约1,200至约1,900。对于分子量已知的任何给定聚合物，可以通过将聚合物的总重均分子量除以重复单体的分子量来确定重复单元的数量(即“n”)。
关于多臂水溶性非肽聚合物，这些聚合物通常包含三个或更多个可分辨的水溶性非肽聚合物臂或区段。除其他好处外，与例如具有与其附接的单个TLR 7/8激动剂的线性聚合物相比，多臂水溶性非肽聚合物(考虑到每条臂与TLR 7/8激动剂共价附接的能力)可以提供更大的药物特征。在一个或多个优选的实施例中，多臂水溶性聚合物具有4个聚合物臂，例如PEG臂，每个经由Xr附接至TLR 7/8激动剂。
关于式I，通常将POLY共价附接至TLR 7/8激动剂的含键联间隔子部分可以在生物学相关的pH下水解和/或酶促稳定或可释放。也就是说，在一些实施例中，Xr是水解稳定的键联。在又一些其他实施例中，Xr包括可释放的键联。
如先前所述，稳定的键联是在施用于患者之后不会在体内明显裂解的键联。在这方面，稳定的键联是本领域普通技术人员已知的。另外，可以通过实验(例如，通过将具有所建议的稳定键联的缀合物施用于患者并测试(例如，通过色谱技术或其他合适的技术)定期获取的用于指示裂解的血液样品)来测试与本文提供的缀合物结合的给定的键联是否可以用作稳定的键联。
在多臂缀合物的一些实施例中，含键联的间隔子部分包含插入在TLR 7/8激动剂与水溶性非肽聚合物之间的可释放键联。因此，可释放的键联是在施用于患者之后在体内裂解的键联，从而从其聚合物臂释放TLR 7/8激动剂化合物(或其稍微修饰的形式，例如具有小分子标签)。在这方面，可释放的键联是本领域普通技术人员已知的。另外，可以通过实验(例如，通过将具有所建议的可释放键联的缀合物施用于患者并测试(例如，通过色谱技术或其他合适的技术)定期获取的用于指示裂解的血液样品)来测试与本文提供的多臂缀合物结合的给定的键联是否是天然可释放的。在一些优选的实施例中，TLR 7/8激动剂的多臂聚合物缀合物包含可释放的键联，也就是说，Xr包含可释放的键联。
例如，在将缀合物样品与来自人的肝素化且合并的血浆(pH 7.2-7.4)一起在37℃孵育并在各个时间点取出样品(其中样品立即冷冻直到样品分析和定量，例如，使用任何合适的检测和定量技术，例如LC-MS)之后，可以在体外确定对TLR 7/8激动剂的多臂聚合物缀合物中所包含的键联的可释放性质的评估。然后基于以下假设计算表观转化半衰期(t1/2,app)：从其初始标称孵育浓度开始的缀合物转化仅归因于TLR 7/8激动剂释放，其中约300小时或更短的t1/2可以被认为是可释放的键联或可释放的缀合物的指示。
用于与本文提供的缀合物结合使用的示例性可释放键联可包括但不限于酰胺、硫醚、氨基甲酸酯、酯、碳酸酯、脲以及酶可裂解的肽键联，这取决于TLR 7/8激动剂化合物的结构和整体接头结构。在某些情况下，键或键联单独考虑时，可能通常不被视为本质上是“可释放的”或可裂解的，然而，当与键联共价附接的分子实体(例如具有咪唑并喹啉结构的TLR 7/8激动剂化合物)的结构一起使用时，由于特定的释放机理(例如β-消除、酰胺水解等)，这种键联可以是可释放的。例如，硫醚、酰胺、氨基甲酸酯、酯、碳酸酯、脲等可以经由β-消除反应或经由水解作用裂解(在有或没有酶促配位的情况下，例如，酯可以用作可释放的键联，无论该酯是否经由酯酶裂解)。
在释放导致未修饰的母体分子释放的情况下，包含可释放键联的、TLR 7/8激动剂的多臂聚合物缀合物通常被归类为前药，因为它们在施用后(即在生理条件下)会释放共价附接的TLR 7/8激动剂化合物。通常，本文所述的多臂聚合物瑞喹莫德(R-848)缀合物包含对于瑞喹莫德的可释放的键联。
关于酶可裂解的肽键联，间隔子部分可包括一系列氨基酸中的一个或多个，已知这些氨基酸是意向患者群体中存在的酶的底物。以这种方式，在向患者施用后，缀合物中所包含的酶可裂解的肽键联的酶诱导性裂解将释放TLR 7/8激动剂(或从裂解中得到具有相对较小分子片段或“标签”的TLR 7/8激动剂)。给定的患者群体中经受酶促裂解的肽键联的实例例如描述于美国专利申请公开号US 2005/0079155中，并且还可以通过实验确定。
关于Xr，含键联的间隔子部分可包含许多示例性氨基酸中的任何一种，例如β-丙氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、亮氨酸、二甲基甘氨酸等。在一些实施例中，Xr包含羧甲基(“CM”)基团-CH2C(O)-，其经由氨基酸的氨基基团共价附接至前述氨基酸中的任何一个或多个，其中氨基酸的末端羧基基团共价附接至TLR7/8激动剂的氨基基团以提供酰胺键联，该酰胺键联在一些实施例中是可释放的。
在一些实施例中，含键联的间隔子部分“Xr”符合式II：
～[X1]a-[Lr]b-X2～
(式II)
其中“a”为零或一(使得零表示“X1”不存在，一表示其存在)；“b”为零或一(使得零表示“Lr”不存在，一表示其存在)；X1当存在时是间隔子；Lr当存在时是键联；并且X2是直接共价附接至TLR 7/8激动剂的官能团。
在其中a和b都为零的式II的那些情况下，应理解的是，含键联的间隔子由X2组成，X2是将TLR 7/8激动剂共价附接至多臂聚合物的剩余部分(例如，附接至聚合物臂POLY上)的官能团。在这种情况下，含键联的间隔子仅包含官能团X2，并且在TLR 7/8激动剂与水溶性非肽聚合物之间不存在其他原子。通常，X2包含未修饰的TLR 7/8激动剂的、与多臂聚合物的剩余部分共价附接的一个或多个原子。例如，如果附接在TLR 7/8激动剂的氨基基团上发生，则通常该氨基基团形成X2的一部分。
在其中a和b之一或两者均为1的式II的那些实例中，将理解的是，含键联的间隔子含有一个或多个除构成X2的原子以外的其他原子。非限制性示例性X1和Lr，当从左到右或从右到左考虑时，包括-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、二价环烷基基团、-N(R6)-(其中R6是H或选自由以下组成的组的有机基团：烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基和经取代的芳基、以及前述一项或多项的组合)。另外的间隔子和键联包括酰氨基、酰基、芳氧基、含有1和5个(包含端值)碳原子的亚烷基桥、烷基氨基、具有约2至4个(包含端值)碳原子的二烷基氨基、哌啶并、吡咯烷并、N-(低级烷基)-2-哌啶基、吗啉代、1-哌嗪基、4-(低级烷基)-1-哌嗪基、4-(羟基-低级烷基)-1-哌嗪基、4-(甲氧基-低级烷基)-1-哌嗪基、芴基和胍。然而，出于本说明书的目的，当原子团紧邻聚合物区段时，该原子团不被视为间隔子，并且该原子团与该聚合物的单体相同，使得该基团仅代表该聚合物链的延伸。
当存在时，间隔子和/或键联通常但不必是本质上线性的。另外，间隔子和/或键联通常但不必是水解稳定的和/或酶稳定的。在一个或多个实施例中，当存在间隔子或键联时，其链长小于约12个原子(例如，小于约10个原子、小于约8个原子和小于约5个原子)。关于确定特定间隔子或键联的长度，本文的长度被定义为单链中的原子数，不计算取代基。例如，脲键联例如此，R-POLY-NH-(C＝O)-NH-TLR 7/8激动剂，被认为链长为三个原子(-NH-C(O)-NH-)。
关于式II，X1(当存在时)的特定实例包括-CH2C(O)-(在本文中称为羧甲基)。
X2的实例包括-C(O)-NH-(其中NH是与TLR 7/8激动剂附接的点，并在共价附接之前形成未修饰的TLR激动剂的一部分)；-NH-C(O)-NH-(其中NH是与TLR 7/8激动剂附接的点，并在共价附接之前形成未修饰的TLR激动剂的一部分)；-NH-C(O)(其中羰基碳表示与TLR 7/8激动剂附接的点，并在共价附接之前形成未修饰的TLR激动剂的一部分)；以及-NH(其中氮原子表示与TLR7/8激动剂附接的点，并在共价附接之前形成未修饰的TLR激动剂的一部分)。
Lr的实例包括-(CRxRy)z-和–NH(CRxRy)z-，其中每个Rx和Ry独立地选自氢、低级烷基、卤素(X)、和卤素取代的低级烷基，并且z是从1至6的整数，例如选自1、2、3、4、5和6。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基和己基；示例性卤素基团可以是氟、氯、溴、碘。说明性Lr基团包括例如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2--CH2CHF-、-CHCH3-、-CHCH(CH3)2-、-CHCH2CH(CH3)2-、-C(CH3)2-、-NHCH2-、-NHCH2CH2-、-NHCH2CH2CH2-、-NHCH2CH2CH2CH2-、-NHCH2CH2CH2CH2CH2-、-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2--NHCH2CHF-、-NHCHCH3-、-NHCHCH(CH3)2-、-NHCHCH2CH(CH3)2-、以及-NHC(CH3)2-。本文提供了另外的结构。
在一个或多个实施例中，TLR 7/8激动剂(例如为多臂水溶性聚合物-TLR激动剂缀合物的长效TLR 7/8激动剂)可具有约3至约50个聚合物臂，并且更通常地具有约3至约10个从中心分子(例如，通常为多元醇、多硫醇或多胺)延伸的聚合物臂(例如，具有3、4、5、6、7、8、9或10个水溶性聚合物臂)，水溶性聚合物部分稳定或可释放地共价附接至该中心分子。通常，从中心延伸的水溶性聚合物臂稳定地与其共价附接。示例性多元醇核心分子包括例如甘油、三羟甲基丙烷、还原糖(例如山梨糖醇或季戊四醇)、以及甘油低聚物(例如六聚甘油)。通常但不必地，多臂水溶性聚合物缀合物将具有共价附接在每个聚合物臂末端的TLR激动剂。
现在转到式I的TLR 7/8激动剂，TLR 7/8激动剂是作为Toll样受体7和/或Toll样受体8的激动剂的任何化合物。优选地，TLR 7/8激动剂是小分子激动剂。说明性结构类别包括含鸟苷的化合物和咪唑并喹啉。说明性TLR激动剂包括但不限于例如TLR-7或TLR-8激动剂。
代表性TLR激动剂包括例如泰拉托莫徳(telratolimod)(3M-052，3M公司；MEDI-9797，医学免疫公司(MedImmune))、瑞喹莫德(R848；S-28463，可得自3M公司)、咪喹莫特(R837；S-26308)、S-28690(咪唑并喹啉，3M公司)、N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基-]甲磺酰胺(3M-001，3M公司)、(852A，3M公司；PF-4878691，辉瑞公司)、维斯缪恩(vesimune)(TMX-101，Telormedix SA公司)、维托莫德(vesatolimod)(GS-9620，吉利德科学公司(Gilead Sciences))、ANA-773(Anadys公司)、甲基2-(3-(((3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9H-嘌呤-9-基)丙基)(3-吗啉代丙基)氨基)甲基)苯基)乙酸酯(AZD8848，阿斯利康公司(Astra Zeneca))、CL097、R848的水溶性衍生物(InvivoGen公司)、噻唑并喹诺酮衍生物(CL057；3M-002，3M公司)、3M-003(咪唑并喹啉，3M公司)、TMX-202(Telormedix SA公司)、TMX-302(Telormedix SA公司)、TMX-306(Telormedix SA公司)、9-苄基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)腺嘌呤(IV136，辉瑞公司)、IV209、3M-011(3M公司)、-丁基氨基-8-羟基-9-(6-甲基吡啶-3-基甲基)腺嘌呤(SM-276001)、甲基3-[(6-氨基-2-丁氧基-7,8-二氢-8-氧代-9H-嘌呤-9-基)甲基]苯乙酸酯(SM-324405)、(SM-360320)、4-氨基-1-苄基-6-三氟甲基-1,3-二氢咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮(PF-4171455，辉瑞公司)、CpG、CpR、ssRNA、BHMA、甲基2-(3-(((3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9H-嘌呤-9-基)丙基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)甲基)苯基)乙酸酯(AZ12441970，阿斯利康公司)、以及2-(3-(((3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7H-嘌呤-9(8H)-基)丙基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)苯基)乙酸(AZ12443988，阿斯利康公司)。
例如，在一个或多个实施例中，TLR 7/8激动剂选自以下：4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-甲基)-N-(20-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)苯甲酰胺；3-(1-(1-(4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20-六氧杂-2-氮杂二十二烷-22-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酸；4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-甲基)-N-(20-氨基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)苯甲酰胺；4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)-N-(32-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂-基)甲基)-N-(32-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十二烷基)苯甲酰胺；3-(1-(1-(4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-3-(1-(1-(4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H嘌呤-9-基)甲基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧杂-2-氮杂三十四烷-34-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-丙酸；4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)-N-(32-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十二烷基)-苯甲酰胺；4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)-N-(59-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十九氧杂五十九烷基)苯甲酰胺；N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5c]喹啉-1-基)丁基]甲磺酰胺；[8-(3-(吡咯烷-1-基甲基)苄基)-4-氨基-2-丁氧基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮]；[2-(4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧代-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酰胺基)乙基2,3-双(十二烷酰基氧基)丙基磷酸酯]；[1-(4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧代-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20-六氧杂-2-氮杂二十三烷-23-烯酸]；[9-苄基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)腺嘌呤；甲基2-(3-{[6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7H-嘌呤-9(8H)-基]甲基}苯基)乙酸酯，SM-324406：2-(3-{[6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7H-嘌呤-9(8H)-基]甲基}苯基)乙酸；甲基2-(3-(((3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7H-嘌呤-9(8H)-基)丙基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)苯基)乙酸酯；2-(3-(((3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7H-嘌呤-9(8H)-基)丙基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)苯基)。
在式I的一些特定实施例中，TLR 7/8激动剂是泰拉托莫徳(3M-052，3M公司；MEDI-9197，医学免疫公司)、瑞喹莫德(R848；S-28463，可得自3M公司)、咪喹莫特(R837；S-26308)、S-28690(咪唑并喹啉，3M公司)、N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基-]甲磺酰胺(3M-001，852A，3M公司；PF-4878691，辉瑞公司)、维斯缪恩(TMX-101，Telormedix SA公司)、维托莫德(GS-9620，吉利德科学公司)、ANA-773(Anadys公司)、甲基2-(3-(((3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9H-嘌呤-9-基)丙基)(3-吗啉代丙基)氨基)甲基)苯基)乙酸酯(AZD8848，阿斯利康公司)、CL097、R848的水溶性衍生物(InvivoGen公司)、甲基3-[(6-氨基-2-丁氧基-7,8-二氢-8-氧代-9H-嘌呤-9-基)甲基]苯乙酸酯(SM-324405)、甲基2-(3-((((3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9H-嘌呤-9-基)丙基)(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)甲基)苯基)乙酸酯(AZ12441970，阿斯利康公司)、GSK2245053(葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))、SZ-101、4-[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲醛(UC-1V150，加州大学圣地亚哥分校(U.C.San Diego))、9-苄基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)腺嘌呤(SM360320，1V136，辉瑞公司)、VTX-1463和VTX-2337(VentiRx公司)。在又一些其他实施例中，TLR 7/8激动剂是(N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5c]喹啉-1-基)丁基]甲磺酰胺或[8-(3-(吡咯烷-1-基甲基)苄基)-4-氨基-2-丁氧基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮]。
在某些优选的实施例中，TLR 7/8激动剂是咪唑并喹啉化合物。说明性咪唑并喹啉包括例如美国专利号5,389,640中所述的1-取代的、2-取代的1H-咪唑并[4,5-c]-喹啉-4-胺化合物。这类化合物包括4-氨基-7-氯-α,α-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇；4-氨基-α,α-二甲基-2-羟甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇；4-氨基-α,α-二甲基-2-甲氧基甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇；2-乙氧基甲基-1-(3-甲氧基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；以及1-(2-甲氧基乙基)-2-甲氧基甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺。
在一个或多个优选的实施例中，TLR 7/8激动剂为瑞喹莫德(R-848)或咪喹莫特(1-异丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)、或其衍生物。在一个或多个特定的实施例中，TLR 7/8激动剂是咪喹莫特，
在又某些其他特定实施例中，TLR 7/8激动剂是瑞喹莫德，
TLR 7/8激动剂与多臂聚合物的共价附接可以经由与TLR 7/8激动剂化合物上的任何合适的官能团或原子附接来实现。适用于附接至多臂聚合物的说明性官能团包括氨基、羟基、羧基和硫醇等。在某些优选的实施例中，与咪喹莫特的共价附接发生在芳族-NH2基团上。在其他优选的实施例中，与瑞喹莫德的共价附接发生在芳族-NH2基团上。下面提供了示例性结构。
本文所述的缀合物能以多种方法制备，并且在以下实例中提供了示例性合成。
在一个实例中，通过以下方法制备多臂聚合物TLR7/8激动剂缀合物，该方法包括将多臂水溶性非肽反应性聚合物共价附接至TLR 7/8激动剂。许多TLR 7/8激动剂可以商购获得，或者可以通过本领域技术人员已知的方法合成。
TLR 7/8激动剂的多臂聚合物缀合物的某些特征是优选的，并且如下所述的这些特征中的每一个将被单独地和明确地组合地考虑。在一些优选的实施例中，从中心发出的每个聚合物臂是相同的。也就是说，例如，关于式I，从R发出的每个Q、POLY、Xr和TLR 7/8激动剂是相同的。在某些优选的实施例中，q是4。在其他优选的实施例中，多臂聚合物缀合物包含季戊四醇核心。在又一些其他实施例中，TLR 7/8激动剂是瑞喹莫德。在又一些另外的实施例中，POLY是聚乙二醇，并且POLY-Xr包括–CH2-C(O)-氨基酸-，其中氨基酸选自β-丙氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、亮氨酸、H2NCH2CHFCOOH和二甲基甘氨酸，并且氨基酸的氨基基团直接附接至羰基基团。在前述的又一些其他实施例中，氨基酸是甘氨酸。在又一些其他实施例中，多臂聚合物缀合物是化合物6。
除其他优点外，本文提供的多臂聚合物TLR 7/8缀合物允许该缀合物的局部施用，例如施用至肿瘤部位，其中该缀合物在停留于肿瘤部位期间可有效地优先局部启动抗肿瘤免疫。多臂缀合物伴随特定的TLR 7/8激动剂的结构、附接化学和施用方式可有效导致缀合物在肿瘤中保留较长时间段，并有效增加肿瘤抗原呈递和T细胞刺激(即导致增强的CD8T细胞初免)，即引发先天性免疫应答，同时由于局部活性而伴有最小的毒副作用。
以下提供了具有上述特征的代表性缀合物。例如，缀合物可以具有由式III：
或其药学上可接受的盐或立体异构体定义的结构，其中L为–(CH2)m–、–(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)m–、–CHF-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)m–、–CH(CH3)-NH-C(O)-(CH2)m–、–(CH2)m-CH(CH(CH3)2)-NH-C(O)-(CH2)m–、–(CH2)m-CH(CH2CH(CH3)2)-NH-C(O)-(CH2)m–、–C(CH3)2-NH-C(O)-(CH2)m–、单键、或–NH-(CH2)m–，
每个m独立地是从1至5的整数(包含端值)；
每个n独立地是从40至350的整数(包含端值)；
R1是氢或–CH2-O-CH2-CH3；并且
R2是氢或羟基。
在式III的特定缀合物中，L选自例如–CH2–、–CH2-CH2-NH-C(O)-CH2–、–CH2-CH2-CH2–、–CHF-CH2-NH-C(O)-CH2–、–CH2-NH-C(O)-CH2–、–CH(CH3)-NH-C(O)-CH2–、–CH2-CH(CH(CH3)2)-NH-C(O)-CH2–、–CH2-CH(CH2CH(CH3)2)-NH-C(O)-CH2–、–C(CH3)2-NH-C(O)-CH2–、单键、以及–NH-CH2-CH2–。
式III的一些具体实施例如下。
例如，在一些实施例中，每个n独立地是从100至250(包含端值)的整数。
在式III的一些缀合物中，R1是氢并且R2是氢。
在式III的又一些其他缀合物中，R1是–CH2-O-CH2-CH3，并且R2是羟基。
在一个或多个实施例中，TLR 7/8激动剂是20,000道尔顿的基于4-臂-季戊四醇基的聚乙二醇缀合物，其在四个聚合物臂的每个的末端具有稳定地或可释放地共价连接的TLR激动剂分子，例如瑞喹莫德或咪喹莫特。在又一个或多个实施例中，TLR 7/8激动剂分子是瑞喹莫德。
在某些实施例中，长效TLR激动剂是基于4-臂-季戊四醇基的聚乙二醇缀合物，其在四个聚合物臂的每个的末端具有可释放地共价连接的瑞喹莫德(R848)，并且具有以下结构。
前述的TLR激动剂多臂聚合物缀合物在本文中被称为“4-臂-PEG-CM-N-R848”，其中N表示与TLR激动剂分子R848的氨基连接；在实例3中描述了其制备。
特定的多臂缀合物具有如下结构。也就是说，在一些实施例中，多臂聚合物缀合物(例如长效TLR激动剂)具有化合物1-10或12-16：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物中任一项的结构。
在某些实施例中，TLR激动剂是具有以下所示结构的化合物11，其中n是如本文所述的重复单元的任何合适数量。
在又一些其他优选的实施例中，TLR激动剂化合物是具有以下所示结构的化合物6，其中n是如本文所述的重复单元的任何合适数量：
在化合物1-10或12-16的一些实施例中，化合物的整个多臂PEG部分具有约10,000道尔顿的重均分子量。在化合物1-10或12-16的又一些其他实施例中，化合物的整个多臂PEG部分具有约20,000道尔顿的重均分子量。在化合物1-10或12-16的又一些其他实施例中，化合物的整个多臂PEG部分具有约30,000道尔顿的重均分子量。在化合物1-10或12-16的又一些另外的实施例中，化合物的整个多臂PEG部分具有约40,000道尔顿的重均分子量。在化合物1-10或12-16的一些优选实施例中，化合物的整个多臂PEG部分具有约20,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施例中，由于不完全化学转化(即，与TLR 7/8激动剂共价偶联)，在化学合成期间常规遇到的产率小于100％和/或其他不可避免的并发情况，包含多臂聚合物缀合物的示例性组合物将包含少于理想数目的附接至“q”个聚合物臂中每一个的TLR 7/8激动剂化合物。该数目通常被称为聚合物负载度，其中100％负载表示完全负载，使得TLR 7/8激动剂化合物共价附接至“q”个聚合物臂的每个的末端。例如，示例性“4-臂-PEG”缀合物可以表征为包含四臂缀合物的混合物，其中该组合物中至少50面积％(a/a，如通过HPLC所测量的)的四臂缀合物具有与TLR 7/8激动剂偶联的四个臂中的每一个。包含示例性“4-臂-PEG”缀合物的其他示例性组合物可以表征为包含四臂缀合物的组合物，其中该组合物中至少65％-90％、70％-85％、或70％-75％面积％(a/a，如通过HPLC所测量的)的四臂缀合物具有与TLR 7/8激动剂偶联的四个臂中的每一个。
缀合物可以本身或以药学上可接受的盐的形式施用，并且本文中对任何一种或多种多臂聚合物缀合物的任何提及旨在包括其药学上可接受的盐。如果使用，如本文所述的缀合物的盐应是药理学和药学上均可接受的。可以使用文献中详述的标准方法，通过使缀合物与有机酸或无机酸反应来制备这种药理学和药学上可接受的盐。有用的盐的实例包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸、三氟乙酸等。而且，药学上可接受的盐可以制备成碱金属或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠、钾或钙盐。
缀合物，特别是缀合物的TLR 7/8激动剂部分，可包含一个或多个手性中心。对于其中包含的每个手性中心，本发明化合物和结构旨在涵盖每种旋光异构体以及光学活性形式的任何组合或比例，例如单个光学活性对映体，或对映体的任何组合或比例(例如，非消旋(scalemic)混合物和外消旋混合物)。
本文还提供了包含如本文所述的TLR 7/8激动剂的多臂聚合物缀合物的药物制剂和组合物。在一个或多个实施例中，多臂TLR 7/8激动剂缀合物本身将为固体形式(例如沉淀物)。
可以通过任何合适的施用途径来施用TLR激动剂，例如，真皮内、静脉内、皮下、节内、淋巴内、瘤内施用等。在该方法的一个或多个特定实施例中，将TLR激动剂以有效激活受试者的先天免疫力的量例如通过注射直接施用于肿瘤。
长效IL-2Rβ偏向性激动剂
本文所述的方法、配制品、系统、试剂盒、组合物、组合等可另外涉及长效IL-2Rβ偏向性激动剂的施用。在这方面，本公开不限于任何特定的长效IL-2Rβ偏向性激动剂，只要该激动剂表现出的对IL-2Rβ的体外结合亲和力比在同一体外模型中对IL-2Rαβ的结合亲和力至少大5倍(更优选至少大10倍)，并且具有至少比IL-2大10倍的有效体内半衰期(半衰期基于IL-2的体内消失)。举例来说，可以针对作为标准的IL-2来测量结合亲和力。在这方面，示例性长效IL-2Rβ偏向性激动剂，即实例1中提及的多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2(在本文中也称为“RSLAIL-2”)表现出对IL-2Rαβ的亲和力相对于IL-2降低约60倍，但对IL-2Rβ的亲和力相对于IL-2降低仅约5倍。
长效IL-2Rβ偏向性激动剂的非限制性实例在国际专利公开号WO 2012/065086和WO 2015/125159中描述。示例性长效IL-2Rβ偏向性激动剂是本申请实例1中提及的多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2(“RSLAIL-2”)，其中可释放的PEG基于如下所示的2,7,9-取代的芴，其中聚(乙二醇)链从芴环上的2位和7位经由酰胺键联(芴-C(O)-NH～)延伸，并经由与氨基甲酸酯氮原子(经由亚甲基基团(-CH2-)附接至芴环的9位)附接而可释放地共价附接至IL-2(白细胞介素-2)。在这方面，RSLAIL-2是包含下式所涵盖的化合物的组合物：
其中IL-2是白细胞介素-2(例如像，阿地白介素)，包括其药学上可接受的盐，其中“n”独立地是从约3至约4000的整数。RSLAIL-2也称为2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2。
在一个或多个实施例中，上述2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2组合物包含不超过10％(基于摩尔量)、优选不超过5％(基于摩尔量)的下式所涵盖的化合物，
其中IL-2是白细胞介素-2，(n)(指与IL-2附接的聚乙二醇部分的数量)是选自由1、2、3、7和>7组成的组的整数；以及其药学上可接受的盐。
在又一些其他实施例中，RSLAIL-2平均具有约六个附接至IL-2的聚乙二醇部分(也称为(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)6avg白细胞介素-2)。在一些其他实施例中，RSLAIL-2通常被认为是无活性的前药，即在施用后无活性，并且凭借聚乙二醇部分在体内的缓慢释放，提供了有效地在肿瘤部位实现持续浓度的、有效的偶联形式的白细胞介素-2。
关于本部分的结构，每个“n”的代表性范围包括例如从约40至约550的整数，或从约60至约500的整数，或从约113至约400、或200-300的整数。在某些实施例中，每个聚乙二醇链中的“n”为约227(即，从中心芴基核心延伸的每个聚乙二醇链的重均分子量为约10,000道尔顿，使得整个支链PEG部分的重均分子量为约20,000道尔顿)，即，本文中称为的多(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2或称为的(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2，其具有以下所示的结构：
RSLAIL-2的另外的示例性组合物包含根据上式的化合物，其中该分子的整个聚合物部分的重均分子量在约250道尔顿至约90,000道尔顿的范围内。其他合适的范围包括选自以下的范围的重均分子量：约1,000道尔顿至约60,000道尔顿，在约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内，在约10,000道尔顿至约55,000道尔顿的范围内，在约15,000道尔顿至约50,000道尔顿的范围内，以及在约20,000道尔顿至约50,000道尔顿的范围内。
聚乙二醇聚合物部分的其他说明性重均分子量包括约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、以及约75,000道尔顿。在一些实施例中，聚乙二醇聚合物的重均分子量为约20,000道尔顿。
如上所述，长效IL-2Rβ偏向性激动剂可以呈药学上可接受的盐的形式(TLR激动剂也是如这种情况)。通常，此类盐通过与药学上可接受的酸或酸等效物反应而形成。在这方面，术语“药学上可接受的盐”通常是指相对无毒的、无机酸加成盐和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过使本文所述的长效白细胞介素-2与合适的有机酸或无机酸分别反应并分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、草酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见例如，Berge等人,(1977)“Pharmaceutical Salts[药学盐]”,J.Pharm.Sci.[药学科学杂志]66:1-19)。因此，如所描述的盐可以衍生自无机酸，这些无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；或由有机酸制备，这些有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、草酸、衣康酸等。
关于前述IL-2Rβ偏向性激动剂，如本文使用的术语“IL-2”是指具有人IL-2活性的部分。在IL-2残基的背景下，术语‘残基’意指IL-2分子在一个或多个共价附接位点处共价附接至聚合物(如聚乙二醇)之后保留的部分，如以上式中所示。应理解的是，当未修饰的IL-2附接至聚合物(如聚乙二醇)时，由于存在与这种或这些聚合物的键联相关的一个或多个共价键而使IL-2轻微改变。在一些情况下，将这种附接至另一个分子的IL-2的轻微改变形式称为IL-2的“残基”。
例如，具有对应于国际专利公开号WO 2012/065086中描述的SEQ ID NO:1至4中任一者的氨基酸序列的蛋白质是示例性IL-2蛋白质，如与其基本上同源的任何蛋白质或多肽一样。术语基本上同源意指特定主题序列(例如突变序列)因一个或多个取代、缺失或添加而不同于参考序列，其净效应不导致在该参考序列与主题序列之间不利的官能差异。出于本文的目的，具有大于95％的同源性、等效的生物活性(不过不必需是等效强度的生物活性)、以及等效的表达特征的序列被认为是基本上同源的。出于确定同源性的目的，应当忽略成熟序列的截短。如本文使用的，术语“IL-2”包括例如通过定点诱变而有意修饰或通过突变而偶然修饰的蛋白质。这些术语还包括具有1至6个额外糖基化位点的类似物、在蛋白质的羧基端具有至少一个额外氨基酸的类似物(其中该一个或多个额外氨基酸包括至少一个糖基化位点)以及具有包括至少一个糖基化位点的氨基酸序列的类似物。该术语包括天然部分和重组产生的部分。另外，IL-2可以来源于人类来源、动物来源以及植物来源。一种示例性IL-2是被称为阿地白介素的重组IL-2。
可以使用常规方法(如涉及放射性标记化合物、体内施用该化合物和确定其清除率的那些)来判定提出为长效IL-2Rβ偏向性激动剂的化合物是否是“长效”。出于本文的目的，IL-2Rβ偏向性激动剂的长效性质典型地使用流式细胞术来测定以测量在施用有待在小鼠中评估的激动剂之后的不同时间点在淋巴细胞中的STAT5磷酸化。作为参考，在IL-2的情况下信号丢失约24小时，但是持续时间段大于长效IL-2Rβ偏向性激动剂的时间段。作为说明，对于RSLAIL-2组合物，信号持续数天。
现在考虑如本文所述的长效激动剂的IL-2Rβ偏向性，实例2提供与RSLAIL-2的示例性组合物的受体偏向性有关的体外数据和体内数据两者。如实例2中所描述，在鼠类黑素瘤肿瘤模型中，当与IL-2比较时，RSLAIL-2的CD8/调节性T细胞的比率支持IL-2受体β相对于IL2受体α的优先活化。示例性长效IL-2Rβ偏向性激动剂(如RSLAIL-2)例如可有效于相对于Treg优先活化，并扩增效应CD8+T细胞和NK细胞。
此外，代表性长效IL-2Rβ偏向性激动剂(如RSLAIL-2)相对于IL-2提供增加的肿瘤暴露并且优选地显著提高的肿瘤暴露，例如当针对IL-2的等效物归一化时暴露增加至少50倍、或暴露增加至少100倍、或暴露增加至少200倍、或暴露增加至少300倍、或暴露增加至少400倍、或暴露增加至少500倍。
方法、组合物和试剂盒
根据本文所述的方法、组合、组合物、配制品、系统和试剂盒，该长效IL-2Rβ偏向性激动剂以IL-2Rβ活化量提供。本领域的普通技术人员可以确定多少给定的长效IL-2Rβ偏向性激动剂足以提供针对IL-2Rβ的临床相关激动活性。例如，本领域的普通技术人员可以参考文献，和/或施用一系列增加量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂并且确定哪个或哪些量提供IL-2Rβ的临床上有效的激动活性。可替代地，长效IL-2Rβ偏向性激动剂的活化量可以使用以上描述的和本领域已知的体内STAT5磷酸化测定来确定(在施用之后体内测定)，其中足以在大于10％NK细胞的峰值下诱导STAT5磷酸化的量被视为活化量。
然而，在一个或多个实例中，该IL-2Rβ活化量是以蛋白质的量表达的由以下范围中的一个或多个所涵盖的量：约0.01至100mg/kg；约0.01mg/kg至约75mg/kg；约0.02mg/kg至约60mg/kg；约0.03mg/kg至约50mg/kg；约0.05mg/kg至约40mg/kg；约0.05mg/kg至约30mg/kg；约0.05mg/kg至约25mg/kg；约0.05mg/kg至约15mg/kg；约0.05mg/kg至约10mg/kg；约0.05mg/kg至约5mg/kg；约0.05mg/kg至约1mg/kg。在一些实施例中，以小于或等于0.7mg/kg的剂量施用长效IL-2Rβ偏向性激动剂。特定的说明性给药范围包括例如约0.1mg/kg至约10mg/kg、或约0.2mg/kg至约7mg/kg、或约0.2mg/kg至小于约0.7mg/kg。
在某些实施例中，将本文提供的组合物和方法中使用的一定剂量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2每3周施用一次。
在某些另外的实施例中，本文提供的组合物、组合和方法中使用的长效IL-2Rβ偏向性激动剂多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2的量为约0.0005至0.3mg/kg；约0.001mg/kg至约0.3mg/kg；约0.001mg/kg至约0.25mg/kg；约0.001mg/kg至约0.15mg/kg；约0.001mg/kg至约0.05mg/kg；约0.001mg/kg至约0.01mg/kg；约0.001mg/kg至约0.008mg/kg；约0.001mg/kg至约0.005mg/kg；约0.002mg/kg至约0.005mg/kg；约0.002mg/kg至约0.004mg/kg。
在一些实施例中，以小于或等于0.003mg/kg的剂量施用长效IL-2Rβ偏向性激动剂多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2。在某些实施例中，给药范围包括例如约0.001mg/kg至约0.01mg/kg、或约0.002mg/kg至约0.008mg/kg、或约0.002mg/kg至小于约0.006mg/kg。在某些实施例中，将本文提供的组合物和方法中使用的一定剂量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2每3周施用一次。
为了确认，关于长效IL-2Rβ偏向性激动剂，活化的量和程度可以广泛变化，并且当与单独施用4-1BB激动剂结合或与TLR激动剂组合时仍然有效。也就是说，仅表现出在IL-2Rβ处的最小激动活性持续足够延长的时间段的一定量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂仍然可以是长效IL-2Rβ偏向性激动剂，只要当与4-1BB激动剂以及任选地TLR激动剂一起施用时，本文所述的方法、组合物和试剂盒产生临床上有意义的应答。在一些情况下，由于(例如)协同相互作用和应答，当伴随施用4-1BB激动剂以及任选地TLR激动剂(例如，长效TLR激动剂)时，可能仅需要IL-2Rβ的最小激动活性。类似地，当在本文所述的组合中使用时，4-1BB激动剂和/或TLR激动剂的剂量(当该药剂单独施用时)可被认为是“亚治疗”剂量，然而当用作本文提供的双模式或三模式治疗策略的一部分时，此类剂量可导致临床上有意义的应答。
本文描述的治疗方法可以持续长达监督患者护理的临床医生认为该治疗方法有效的时间。指示该治疗方法有效的非限制性参数包括以下中的任何一个或多个：肿瘤缩小(就重量和/或体积而言)；个体肿瘤集落的数量减少；肿瘤消除；以及无进展存活。肿瘤大小的变化可以通过任何合适的方法如成像来确定。可以采用各种诊断成像方式，如计算机断层摄影术(CT扫描)、双能CDT、正电子发射断层摄影术和MRI。
有待施用的TLR激动剂、4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂的实际剂量以及与本文所述的方法、组合物、配制品、系统和试剂盒相关的给药方案将根据受试者的年龄、体重和一般状况以及所治疗的病症的类型和严重程度(例如，所治疗的癌症的进展)、医疗保健专业人员的判断、以及有待施用的特定TLR激动剂、4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂而变化。治疗有效量是本领域技术人员已知的和/或在相关参考文本和文献中描述的，或可以确定的。通常，治疗上有效量的4-1BB激动剂或TLR 7/8激动剂(基于活性分子)的范围是约0.001mg至1000mg，优选其剂量是0.01mg/天至750mg/天，并且更优选其剂量是0.10mg/天至500mg/天。
可以根据临床医师的判断、患者的需要等等，按多种给药方案施用单位剂量的4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂(再次，优选地以药物制剂的一部分提供)中的任何一种。具体给药方案将是本领域普通技术人员已知的或可以使用常规方法通过实验确定。示例性给药方案包括但不限于：施用每日五次、每日四次、每日三次、每日两次、每日一次、每周三次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次以及其任何组合。一旦已实现临床终点，就暂停组合物的给药。
关于施用TLR激动剂、4-1BB激动剂、和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂的频率和时间表，本领域普通技术人员将能够确定适当的频率。例如，在治疗周期中，临床医生可以决定以单剂量或一系列剂量(例如，在数天或数周的过程内)施用TLR激动剂。4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂也是如此。TLR激动剂、4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂可以在施用另一种TLR激动剂、4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂之前、与其一起或之后施用。
应理解的是，可以将4-1BB激动剂与TLR激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的任一种或两种一起施用或与之分开施用。在实施例中，可以将4-1BB激动剂与TLR激动剂或长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的任一种一起施用，但与另一种TLR激动剂或长效IL-2Rβ偏向性激动剂分开施用。在一些实施例中，将4-1BB激动剂与TLR激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的每一种分开施用(这取决于施用的是哪一种或这两种)。应当理解，当包括TLR激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂这两者时，它们可以一起施用。在一个特定的实施例中，同时地或一起(以同一配制品或以单独的配制品)施用4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂。应当理解，能以任何顺序施用4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂。此外，根据需要，可以将4-1BB激动剂、TLR激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的任何一种或全部的施用隔开数分钟、数小时或数天。
在一些治疗方案中，TLR激动剂在治疗开始时以单剂量施用。将长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或4-1BB激动剂与TLR激动剂同时、或在施用TLR激动剂之前、或在施用TLR激动剂之后施用。例如，在一些治疗方式中，长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或4-1BB激动剂在TLR激动剂施用的7天(之前或之后)(例如，在第1、2、3、4、5、6或7天中的任何一天)内施用，其中第1天表示治疗开始。在一些治疗方案中，将长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或4-1BB激动剂在施用TLR激动剂的4天(例如，在第1、2、3、或4天中的任何一天)内施用。基于IL-2Rβ偏向性激动剂的长效性质，这种化合物通常相对不频繁地施用(例如，每三周一次、每两周一次、每8-10天一次、每周一次等)。
与治疗过程相关的示例性时间长度包括约一周；约两周；约三周；约四周；约五周；约六周；约七周；约八周；约九周；约十周；约十一周；约十二周；约十三周；约十四周；约十五周；约十六周；约十七周；约十八周；约十九周；约二十周；约二十一周；约二十二周；约二十三周；约二十四周；约七个月；约八个月；约九个月；约十个月；约十一个月；约十二个月；约十三个月；约十四个月；约十五个月；约十六个月；约十七个月；约十八个月；约十九个月；约二十个月；约二十一个月；约二十二个月；约二十三个月；约二十四个月；约三十个月；约三年；约四年以及约五年。
本文描述的治疗方法典型地持续长达监督患者护理的临床医生认为该治疗方法有效(即该患者对治疗有应答)的时间。指示该治疗方法有效的非限制性参数可以包括以下中的一个或多个：肿瘤缩小(就重量和/或体积和/或视觉外观而言)；个体肿瘤集落的数量减少；肿瘤消除；无进展存活；通过合适的肿瘤标志物(如果适用)的适当应答、NK(自然杀伤)细胞的数量增加、T细胞的数量增加、记忆T细胞的数量增加、中心记忆T细胞的数量增加、调节性T细胞(如CD4+Treg、CD25+Treg和FoxP3+Treg)的数量减少等。
本文提供的方法可用于(除其他事项外)治疗患有癌症的患者。例如，患者可能对以下治疗应答：单独用TLR激动剂的治疗、单独用长效IL-2Rβ偏向性激动剂的治疗、单独用4-1BB激动剂的治疗，以及TLR激动剂、4-1BB激动剂和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂的组合的治疗，但对组合更应答。作为进一步的实例，患者可以对4-1BB激动剂或长效IL-2Rβ偏向性激动剂/TLR激动剂无应答，但对组合应答。仍作为进一步的实例，当单独施用时，患者可以对TLR激动剂、4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的任一种都无应答，但对组合应答。在实施例中，治疗癌症的方法包括向患者施用一种或多种药物组合物，这些药物组合物包含4-1BB激动剂、以及TLR激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种。在一个实施例中，本文提供了如本文所述的一种或多种药物组合物在制备可用于治疗癌症(例如实体癌)的药物中的用途。
例如，通常经由注射进行TLR激动剂、4-1BB激动剂、和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂的施用。还考虑了其他施用方式，例如口服、肺的、鼻的、口腔的、直肠的、舌下的、经皮的、瘤内的、以及肠胃外的方式。如本文使用的，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、动脉内、瘤内、淋巴内、腹膜内、心脏内、鞘内和肌肉内注射，以及输注注射。如先前所述，TLR激动剂、4-1BB激动剂、和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂可以分开施用。可替代地，如果希望TLR激动剂、4-1BB激动剂、和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂的施用是同时的，作为初始剂量或在整个治疗过程中或在给药方案的各个阶段--并且TLR激动剂、4-1BB激动剂、和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂是一起相容且在给定制剂中相容--，则同时施用可以经由施用单一剂型/配制品(例如，静脉内施用含有全部免疫组分的静脉内配制品)来实现。本领域普通技术人员可以通过常规测试确定此类组分是否一起相容且在给定配制品中相容。
本文所述的治疗组合，即4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂，能以一种或多种组合物或配制品的形式提供。应当理解，4-1BB激动剂、以及长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂中的至少一种能以同一组合物提供。在其他实施例中，4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂可以各自以单独的组合物提供。通常，组合物包括与药物赋形剂组合的4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂中的一种或多种。本文所述的组合物可以呈固体或液体形式。
示例性赋形剂包括但不限于选自由以下组成的组的那些：碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合。
碳水化合物，例如糖、衍生化糖(例如糖醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物)，可以作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇、肌醇等。
赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，例如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合。
制剂还可以包含抗微生物剂以用于预防或阻止微生物生长。合适的抗微生物剂的非限制性实例包括氯化苄烷铵、苄索氯铵、苯甲醇、西吡氯铵、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)、及其组合。
在制剂中还可以存在抗氧化剂。抗氧化剂用于防止氧化，由此防止缀合物或制剂的其他组分的变质。合适的抗氧化剂包括例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸钠、焦亚硫酸钠、及其组合。
表面活性剂可以作为赋形剂存在。示例性表面活性剂包括：聚山梨醇酯，例如“吐温20”和“吐温80”，以及普郎尼克(pluronic)，例如F68和F88(两者均可从新泽西州芒特奥利夫的BASF公司(BASF,Mount Olive,NJ)获得)；脱水山梨糖醇酯；脂质，例如磷脂，例如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸和脂肪酯；类固醇，例如胆固醇；以及螯合剂，例如EDTA、锌和其他此类合适的阳离子。
药学上可接受的酸或碱可以作为赋形剂存在于制剂中。可以使用的酸的非限制性实例包括选自由以下组成的组的那些酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸、及其组合。合适的碱的实例包括但不限于选自由以下组成的组的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾、及其组合。
根据本公开和相关用于配制的方法，适用于在组合物中使用的其他药物赋形剂和/或添加剂可以在例如，“Remington:The Science&Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]”,第22版,Remington:The Essentials of Pharmaceutics[雷明顿：药学要点](2009)；以及在“Physician’s Desk Reference[医师手册]”,2017和在“Handbook ofPharmaceutical Excipients[药物赋形剂手册]”,第7版中找到。
组合物中的4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂的量将根据许多因素而变化，但当组合物储存于单位剂量容器中时最佳将是治疗有效剂量。治疗有效剂量可以通过重复施用增加量的4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂来以实验方式确定，以便确定产生临床所希望的终点的量。
组合物中任何单独赋形剂的量将根据赋形剂的活性和组合物的特定需要而变化。任何单独赋形剂的最佳量通过常规实验确定，即通过制备含有不同量的赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其他参数，并且然后确定在没有显著不良作用的情况下获得最佳性能的范围。
然而，通常，赋形剂将在组合物中以按重量计约1％至约99％、优选按重量计约5％-98％，更优选按重量计约15％-95％的赋形剂的量存在，其中最优选的浓度小于按重量计30％。
这些药物组合物可以采取任何数目的形式并且就此而言组合物不受限制。示例性制剂可以呈适合于口服施用的形式，例如片剂、囊片、胶囊、软胶囊、糖锭、分散剂、悬浮剂、溶液、酏剂、糖浆、锭剂、透皮贴剂、喷雾剂、栓剂以及散剂。在优选的实施例中，组合物为适合用于瘤内施用的形式。
口服剂型包括片剂、囊片、胶囊、软胶囊、悬浮剂、溶液、酏剂、以及糖浆，并且还可以包括任选包封的多种颗粒、珠粒、粉末或丸粒。这样的剂型是使用药物配制领域中已知的常规方法来制备的并且描述于相关的文件中。
片剂和囊片例如可以使用标准的片剂加工方法和设备来生产。当制备含有本文所述的缀合物的片剂或囊片时，直接压片以及造粒技术通常是优选的。除了4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂之外，片剂和囊片通常还应含有无活性的药学上可接受的载体材料，例如粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、稳定剂、表面活性剂、着色剂、流动剂等。粘合剂被用来对片剂赋予粘合性质并且以此确保该片剂保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉(包括玉米淀粉以及预胶凝淀粉)、明胶、糖类(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、以及乳糖)、聚乙二醇、蜡类、以及天然的和合成的胶质，例如阿拉伯胶海藻酸钠、聚乙烯吡咯酮、纤维素聚合物(包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素等)以及Veegum。润滑剂被用来促进片剂的制造，从而促进粉末流动并且防止在释放压力时颗粒顶裂(即，颗粒破损)。有用的润滑剂是硬脂酸镁、硬脂酸钙以及硬脂酸。崩解剂被用来促进片剂的崩解，并且通常是淀粉、粘土、纤维素、藻胶、胶质或交联聚合物。填充剂包括例如诸如二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、滑石、高岭土、粉状纤维素、以及微晶纤维素等材料，连同水溶性材料，例如甘露醇、尿素、蔗糖、乳糖、右旋糖、氯化钠以及山梨糖醇。如本领域所熟知的，稳定剂被用来抑制或延缓药物的分解反应(包括例如氧化反应)。
胶囊也是优选的口服剂型，在这种情况下，包含4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂的组合物可以被包封成液体或凝胶形式(例如在软胶囊的情况下)或固体(包括粒子，例如颗粒、珠粒、粉末或丸粒)形式。合适的胶囊包括硬和软胶囊，并且通常由明胶、淀粉或纤维材料制成。两件式硬质明胶胶囊优选是例如使用明胶条或类似物而密封的。
包括呈基本干燥的形式的肠胃外配制品(作为冻干物或沉淀物，它可以呈粉末或饼的形式)连同准备注射用的配制品，它们是液体并且需要将干燥形式的肠胃外配制品进行重构的步骤。适合用于在注射之前重构固体组合物的稀释剂的实例包括注射用抑菌水、水中的5％右旋糖、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、盐水、无菌水、去离子水及其组合。
在一些情况下，旨在用于肠胃外施用的组合物可以采取非水性溶液、悬浮液、或乳液的形式，通常是无菌的。非水性溶剂或媒介物的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油和玉米油)、明胶、以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。
本文所述的肠胃外配制品还可以包括辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。通过掺入杀菌剂、通过细菌截留滤器过滤、辐照或加热，将这些配制品灭菌。
组合物或配制品还可以使用常规的透皮贴剂或其他透皮递送系统通过皮肤施用，其中将4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂包含在层叠结构中，该结构作为药物递送装置而贴附在皮肤上。在这种结构中，4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂包含在上背衬层下面的层或“储层”中。该层叠结构可以包含单个的储层，或者它可以包含多个储层。
也可以将4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂配制成用于直肠施用的栓剂。关于栓剂，将4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂与栓剂基质材料混合，该材料是(例如在室温下保持固态但是在体温下软化、熔融或溶解的赋形剂)例如可可黄油(可可油)、聚乙二醇、甘油明胶、脂肪酸、及其组合。栓剂可以例如通过进行以下步骤(不必按示出的顺序)来制备：将栓剂基质材料熔融以形成熔体；掺入4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂(在栓剂基质材料熔融之前或之后)；将熔体倒入模具中；冷却熔体(例如将含熔体的模具放置在室温环境中)，由此形成栓剂；并且从模具中移出这些栓剂。
在一些优选的实施例中，将包含4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂中的至少一种的至少一种组合和/或组合物在瘤内施用，例如直接施用至肿瘤，例如通过注射。这种施用提供了在肿瘤中实现例如高浓度的TLR 7/8激动剂，其中TLR 7/8激动剂延迟释放到体循环中，并且在包含可释放的键联的缀合物情况下，延迟释放到肿瘤本身中。用于瘤内施用TLR 7/8激动剂的多臂聚合物缀合物的示例性配制品包含在pH 7.4下的Na/K磷酸盐缓冲液。
在一些实施例中，可以将包含4-1BB激动剂、长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或TLR激动剂的组合物进一步掺入合适的递送媒介物中。此类递送媒介物可提供缀合物的受控和/或连续释放，并且其还可用作靶向部分。递送媒介物的非限制性实例包括辅助剂、合成辅助剂、微胶囊、微粒、脂质体和酵母细胞壁颗粒。酵母细胞壁可以被各种处理以选择性地去除蛋白质组分层、葡聚糖层或甘露聚糖层，并且其被称为全葡聚糖颗粒(WGP)、酵母β-葡聚糖甘露聚糖颗粒(YGMP)、酵母葡聚糖颗粒(YGP)、红酵母属(Rhodotorula)酵母细胞颗粒(YCP)。酵母细胞，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和红酵母属物种是优选的；然而，可以使用任何酵母细胞。这些酵母细胞在流体动力学体积方面表现出不同的特性，并且在它们可以释放其内容物的靶器官中也不同。将这些颗粒的生产方法和表征描述于美国专利号5,741,495、4,810,646、4,992,540、5,028,703、5,607,677和美国专利申请公开号2005/0281781和2008/0044438中。
本文所述的治疗组合，即4-1BB激动剂和长效IL-2Rβ偏向性激动剂和/或TLR激动剂，能以试剂盒的形式提供。如上所述，这些组分可以包含在单一组合物中，任选地伴有一种或多种药学上可接受的赋形剂，或者可以提供在单独的容器中，其中试剂盒通常包括使用说明书。合适的药学上可接受的赋形剂包括例如在Handbook of PharmaceuticalExcipients[药物赋形剂手册],第7版,Rowe,R.C.编辑,Pharmaceutical Press[医药出版社],2012中描述的那些。这些试剂盒组分(例如包含TLR激动剂、4-1BB激动剂、和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂的组合物)可以呈液体或固体形式。在某些实施例中，TLR激动剂、4-1BB激动剂、和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂均呈固体形式。代表性固体形式是为固体干燥形式的那些，例如含有按重量计少于约5％的水，或优选地按重量计少于2％的水。这些固体形式通常适于在水性稀释剂中重构。
还提供了向患有病症的患者施用4-1BB激动剂以及TLR激动剂(例如TLR 7/8激动剂)的至少一种多臂聚合物缀合物和本文提供的长效IL-2Rβ偏向性激动剂的方法，该患者对4-1BB激动剂和TLR激动剂(例如TLR 7/8激动剂)的多臂聚合物缀合物和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种有应答，例如像患有癌症的患者。该方法包括施用治疗有效量的一种或多种组合物(优选地作为药物制剂的一部分提供)。
本文描述的方法、试剂盒和相关组合物可以用于治疗患有可以通过本文提供的方法治疗或预防的任何病症(如癌症)的患者。在实施例中，癌症是实体癌。示例性病症是癌症，例如像肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、脑癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤(包括晚期黑素瘤和/或转移性黑素瘤)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、以及白血病。在一些特定实施例中，有待治疗的癌症是实体癌，例如像乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、尿路上皮癌、胃癌、淋巴瘤、恶性黑素瘤、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、胆管癌、脑癌、宫颈癌、上颌窦癌、膀胱癌、食管癌、梅克尔细胞癌、霍奇金病以及肾上腺皮质癌。在一些实施例中，癌症是局部晚期或转移性实体瘤恶性肿瘤。
本发明的方法、试剂盒和组合物可用于增强施用作为单一药剂的TLR激动剂、4-1BB激动剂、和/或长效IL-2Rβ偏向性激动剂的治疗效果。可以在治疗期间、单轮治疗之后、2-3个治疗周期之后等的任何合适的时间点并且通过多种合适方法中的任一种来评估增强的应答，包括肿瘤的缩小(部分应答)(即肿瘤大小或体积的评估)、肿瘤的消失、疾病进展的减少(癌症未进展)以及在适当时一种或多种肿瘤测试标志物的分析。特别有效的治疗将使存活延长(当以50％最大肿瘤生长评估时)至少5天、或至少10天、或至少12天、或至少15天、或至少20天、或至少30天或更长时间。
本文提供的方法、试剂盒、组合物等也可用于减少经历治疗的受试者的肿瘤生长或大小(或体积)。例如，在一些实施例中，当与治疗前肿瘤的大小相比时，一个或多个治疗周期可有效使肿瘤大小减小约25％、或约30％、或约40％、或约50％、或甚至约60％、或约70％或更多，例如约90％或更多。
实例
应理解，前述描述以及随后的实例旨在说明而不是限制本文提供的本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修改对本发明所属领域的技术人员而言将是显而易见的。
材料与方法
克隆并表达具有与阿地白介素的氨基酸序列相同的氨基酸序列的重组人IL-2，并且将其用于制备本文称为RSLAIL-2的示例性长效IL-2Rαβ偏向性激动剂。
RSLAIL-2是指可按照PCT国际专利申请公开号WO 2015/125159中的实例1的程序获得的组合物，并且一般是指包含多聚乙二醇化形式的IL-2的组合物，其中用于形成缀合物的PEG试剂的附接在施用于受试者后是可释放的。
4-臂-20kD-PEG-SCM对应于以下结构：
R848(瑞喹莫德)具有以下结构(显示为自由基)：
可以根据PCT国际专利申请公开号WO 2010/019233A1的实例3来合成4-臂-PEG20kD-SCM和4-臂-PEG40kD-SCM。
可以根据PCT国际专利申请公开号WO 2010/019233A1的实例1来合成4-臂-PEG20kD-BA。
mPEG5kD-SC可从美国加利福尼亚州尔湾市的NOF美国公司(NOF AmericaCorporation,Irvine,California,USA)获得。
4-臂-PEG20kD-SC可从美国马萨诸塞州沃特敦市的Biochempeg科学公司(Biochempeg Scientific Inc.,Watertown,Massachusetts,USA)获得。
4-臂-PEG20kD-NCO可从美国德克萨斯州普莱诺市的JenKem技术公司(JenKemTechnology,Plano,Texas,USA)获得。
4-臂-PEG20k-胺可从美国阿拉巴马州阿拉巴市的莱桑生物公司(Laysan Bio,Arab,Alabama,USA)获得。
LOB12.3是抗CD137抗体，其可与小鼠4-1BB反应。LOB12.3抗体是一种激动性抗体，已显示其与免疫检查点抑制剂组合施用时，会刺激4-1BB信号传导并延迟体内肿瘤生长。LOB12.3可从美国新罕布什尔州西黎巴嫩市的Bio X Cell公司(Bio X Cell,WestLebanon,New Hampshire,USA)获得。
除非另有说明，否则实例中提及的所有非PEG化学试剂均可商购。除非另有说明，否则水溶性聚合物试剂的制剂可以使用文献中描述的本领域已知的技术来制备，或者可以从可商购的来源获得。
实例1
rIL-2与mPEG2-C2-Fmoc-20kD-NHS的反应
将1.44mg/ml的经纯化rIL-2(106.4mL)装入第一容器中，随后添加53.6mL配制缓冲液(10mM乙酸钠，pH 4.5，5％海藻糖)。测量pH为4.62，测量温度为21.2℃。将PEG试剂C2-PEG2-FMOC-NHS-20K(如在WO 2006/138572中所描述可供使用的)(13.1g)装入第二容器中，随后添加73.3mL的2mM HCl。将所得溶液手动涡旋25分钟。将硼酸钠(0.5M，pH 9.8)添加到第一容器中以使pH升高至约9.1，接着将含有PEG试剂的第二容器的内容物在1分钟至2分钟的时间段内添加到第一容器中。接着通过将8.1mL 2mM HCl装入第二容器中并将内容物添加到第一容器中来执行冲洗步骤。对于缀合反应，最终rIL-2浓度是0.6mg/mL，硼酸钠浓度是120mM，pH是9.1+/-0.2，温度是20℃-22℃，并且PEG试剂与rIL-2的摩尔比在针对该试剂的活性调整之后(取代水平)是35:1。使缀合反应进行30分钟，并通过添加75mL 2N乙酸酸化(以使pH降至约4)来淬灭。如先前所描述通过离子交换色谱法纯化产物，得到主要为4聚体、5聚体和6聚体(指可释放地共价附接至r-IL-2的PEG试剂的数量)的组合物(其中8聚体和更高的PEG化程度在与色谱法相关的洗涤步骤期间去除)。该组合物在本文中称为“RSLAIL-2”，并且更具体地称为(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2。
实例2
RSLAIL-2的受体偏向性和相关的免疫治疗特性
与IL-2受体的结合亲和力和与免疫刺激概况相关的受体偏向性：通过表面等离子体共振(Biacore T-100)直接测量RSLAIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合亲和力并且将其与临床上可用的IL-2(阿地白介素)的结合亲和力比较。使用EDC/NHS化学法使抗人抗体(英杰公司(Invitrogen))与CM-5传感器芯片的表面偶合。然后，使用人IL-2Rα-Fc或IL-2Rβ-Fc融合蛋白作为此表面上捕获的配体。以5mM开始，在pH 4.5的乙酸盐缓冲液中制备RSLAIL-2和其活性IL-2缀合物代谢物(1-PEG-和2-PEG-IL-2)的连续稀释液。允许这些稀释液结合至配体持续5分钟，并且针对浓度对结合的应答单位(RU)作图以确定EC50值。将每种同种型对每种IL-2受体亚型的亲和力计算为相对于IL-2的亲和力的倍数变化。
RSLAIL-2的体外结合和活化概况表明聚乙二醇化干扰IL2与IL2Rα之间相对于阿地白介素的相互作用；进行了调查以确定这些效应是否使体内免疫细胞亚型的概况偏向。在施用RSLAIL-2或IL2后肿瘤中CD8T细胞和Treg细胞的数量是IL2的多效性作用是否由于IL2与聚(乙二醇)在IL2/IL2Rα界面处缀合(如在RSLAIL-2中)而转变的重要量度。为了解决该问题，用单剂量的RSLAIL-2或5个剂量的阿地白介素治疗具有皮下B16F10小鼠黑素瘤肿瘤的小鼠，并通过流式细胞术定量肿瘤微环境中的免疫细胞。
在阿地白介素处理的小鼠的肿瘤中，总CD8细胞和记忆CD8细胞作为肿瘤浸润性淋巴细胞的百分比增加；然而，这些效应是短暂的，在第5天达到相对于媒介物的显著性。相比之下，在单次RSLAIL-2施用后达到显著(P<0.05)和持续的总CD8T细胞和记忆CD8T细胞刺激，其中相对于阿地白介素具有超高的记忆CD8(第7天)和总CD8(第7天和第10天)百分比。RSLAIL-2和阿地白介素治疗均在治疗开始后5天和7天产生增加的经活化自然杀伤(NK)细胞，但这种作用在第10天减少。肿瘤浸润性淋巴细胞的CD4细胞百分比在RSLAIL-2治疗后在第5天相对于媒介物减少。在第10天，与媒介物和阿地白介素比较，RSLAIL-2产生更少的CD4细胞百分比。进一步分析CD4细胞群的FoxP3+子集，该子集定义了Treg群体。RSLAIL-2施用在每个时间点都减少了Treg的百分比，这与由PEG链引起的对IL2Rα亚单元的接近减少相一致。相比之下，使用阿地白介素的Treg减少是适度的，在第5天达到显著。到第7天，CD8T细胞的增加和Treg的减少使得肿瘤中CD8/Treg比率显著升高。RSLAIL-2、阿地白介素和媒介物的CD8/Treg的比率分别为449、18和4，从而支持对于RSLAIL-2而言，相对于IL2受体α，优先活化IL2受体β。
进行免疫组织化学染色，并且证实CD8T细胞不仅数量增加，而且散布在肿瘤细胞中。这些结果指示，与未修饰的IL-2(阿地白介素)情况下观察到的相比，RSLAIL-2有效于诱导更稳健的体内记忆效应CD8T细胞应答，而没有相当地刺激肿瘤中的Treg，这与体外IL2Rβ偏向性结合概况一致。也就是说，相对于Treg，RSLAIL-2有效于优先活化并扩增效应CD8+T细胞和NK细胞。
实例3
示例性长效TLR激动剂4-臂-PEG20k-CM-N-R848(瑞喹莫德)的合成
在20℃下，将4-臂-20k-PEG-SCM(5.0g，1.0mmol的SCM)和R848(377mg，1.2mmol)溶解于无水DMF(25ml)中。将该反应溶液在50℃下搅拌18小时。将该反应溶液倒入1升乙醚中，同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(IPA)(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在IPA中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(4.24g，具有5.1％wt.R848负载量)。1H NMR(500Mhz,氯仿-d)δ9.4(宽,0.9H),8.22–8.14(t,1.8H),7.61(ddd,J＝8.3,7.0,1.3Hz,0.9H),7.49(ddd,J＝8.2,7.0,1.4Hz,0.9H),4.94(s,1.8H),4.80(s,1.8H),3.7-3.9(m,460H),1.32(s,5.1H),1.25(t,J＝7.0Hz,2.7H)。
实例4
4-臂-PEG20k-CM-β-丙氨酸-N-R848(化合物2)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-CM-β-丙氨酸：
将β-丙氨酸(7.100g，10当量)和碳酸氢钠(6.720g，10当量)添加到去离子水(800ml)中，并将该混合物搅拌以形成澄清的溶液。将4-臂-PEG20k-SCM(40.020g，1当量)添加到溶液中。将该反应溶液在室温下搅拌3小时。将5N HCl添加到溶液中以将pH调节到4.0。将溶液用二氯甲烷(150ml)萃取两次，并将有机相合并，并用无水硫酸钠干燥。通过玻璃料去除固体。将滤液凝缩至50ml，并然后添加到500ml乙醚中以得到沉淀。通过过滤获得呈白色粉末的产物(35.050g，产率87％)，并在高真空下干燥过夜。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.98(s,7.11H),3.64(t,7.11H),3.58-3.33(m,1818H),3.27(s,7.90H),2.40(t,7.11H)。
4-臂-PEG20k-CM-β-丙氨酸-N-R848：
在20℃下，将4-臂-PEG20k-CM-β-丙氨酸(4.012g，0.8mmol的-COOH)、羟基苯并三唑(216mg，1.6mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(307mg，1.6mmol)和N,N-二异丙基乙胺(207mg，1.6mmol)溶解于二氯甲烷(25ml)中。将该混合物在室温下搅拌30分钟。添加R848(302mg，0.96mmol)，并将该反应溶液在20℃下搅拌24小时。将该反应溶液添加到1升的乙醚中，同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(3.860g，具有5.6％w/w R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.82(s,3.56H),8.17(d,J＝8.0Hz,4.49H),8.07(d,J＝8.0Hz,4.02H),7.49(t,J＝7.8Hz,4.17H),7.49(t,J＝7.8Hz,7.55H),4.93(s,8.39H),4.79(s,9.0H),3.99(s,7.60H),3.80-3.44(m,1818H),1.33(s)和1.26(t,J＝7.1Hz)(总共34.18H)。
实例5
4-臂-PEG20k-BA-N-R848(化合物3)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-BA-N-R848：
在20℃下，将4-臂-PEG20k-BA(4.020g，0.8mmol的COOH)、羟基苯并三唑(216mg，1.6mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(307mg，1.6mmol)、和N,N-二异丙基乙胺(207mg，1.6mmol)溶解于二氯甲烷(15ml)中。将该混合物在室温下搅拌30分钟。添加R848(302mg，0.96mmol)，并将该反应溶液在20℃下搅拌24小时。将该反应溶液添加到1升的乙醚中，同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(3.805g，具有5.2％w/w R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.16(d,J＝8.5Hz,3.45H),8.07(d,J＝8.5Hz,3.43H),7.59(t,J＝7.8Hz,3.63H),7.47(t,J＝7.8Hz,3.71H),4.91and 4.78(s,15.86H),3.77-3.40(m,1818H),2.10(t,7.30H),1.33(s)和1.26(t,J＝7.1Hz)(总共31.34H)。
实例6
4-臂-PEG20k-CM-α-(R)-氟-丙酰胺-N-R848(化合物4)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-CM-α-(R)-氟-丙酸：
将4-臂-PEG20k-SCM(5.140g，1.03mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中。将(R)-3-氨基-2-氟-丙酸(440mg，4.11mmol)和三乙胺(416mg，4.11mmol)添加到N,N-二甲基甲酰胺(5ml)中以形成悬浮液。将该悬浮液添加到在DCM溶液中的4-臂-PEG20k-SCM里。将该反应在20℃下搅拌10天，并然后用水(200ml)稀释。将水溶液用二氯甲烷(3x100ml)萃取。将有机相合并，用无水硫酸镁干燥并过滤。将滤液浓缩至50ml，将其添加至乙醚(1升)中以形成沉淀物。通过过滤收集沉淀物，将该沉淀物在高真空下干燥以给出4.638g呈白色固体的4-臂-PEG20k-CM-α-(R)-氟-丙酸(具有70％取代)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.49(s,2.77H),5.02(d,J＝48.5Hz,2.77H),4.15(s,3.95H),3.65(br,1818H),3.11(q,J＝7.3Hz,2.92H),1.35(t,J＝7.3Hz,3.95H)。
4-臂-PEG20k-CM-α-(R)-氟-丙酰胺-N-R848：
将4-臂-PEG20k-CM-α-(R)-F-丙酸(2.004g，0.4mmol的COOH)、N,N-二异丙基乙胺(207mg，1.6mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(153mg，0.8mmol)、和羟基苯并三唑(108mg，0.9mmol)溶解于无水二氯甲烷(15ml)中。在30分钟内添加R848(113mg，0.36mmol)。将该反应溶液在20℃下搅拌18小时。将该反应溶液添加至1升的乙醚中同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(1.602g，具有4.1(w/w)％R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.17(s,5.53H),7.54(d,J＝57.7Hz,6.72H),4.92(s,4.74H),4.79(s,4.74H),3.62(br,1818H),1.5-1.0(br.,30.0H)。
实例7
4-臂-PEG40k-CM-N-R848(化合物5)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG40k-CM-N-R848：
将4-臂-PEG40k-SCM(4.410g，0.44mmol的SCM)溶解于无水二氯甲烷(33ml)中。在室温下添加R848(116mg，0.53mmol)。将所得混合物溶液在室温下搅拌4天。将反应混合物浓缩以去除溶剂。将残余物用如上所提及的异丙醇(300ml)再结晶两次以提供4.262g呈白色固体的产物。基于NMR分析，该产物包含2.0％(w/w)R848。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.16(m,5.4H),7.58(t,2.8H),7.47(t,2.8H),4.92-4.70(m,10.6H),4.07(s,1.5H),3.88-3.45(m,3636H),1.23(s)和1.21(t)(总共23.6H)。
实例8
4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848(化合物6)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸：
将甘氨酸(6.003g，10当量)和碳酸氢钠(6.720g，10当量)添加到去离子水(800ml)中，并将溶液进行搅拌直到变得澄清。将4-臂-PEG20k-SCM(40.020g，1当量)添加到溶液中。将该反应溶液在室温下搅拌3小时。将5N HCl溶液添加到溶液中以将pH调节至4.0。将溶液用二氯甲烷(2x150ml)萃取。将有机相合并，并用无水硫酸钠干燥。通过玻璃料去除固体。将滤液凝缩至50ml，并然后添加到500ml乙醚中以获得沉淀物。通过过滤获得呈白色固体粉末的产物(35.050g)，并在高真空下干燥过夜。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.01(d,7.1H),3.99(s,7.1H),3.74-3.48(m,1818H),3.35(s,7.1H)。
4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848：
在20℃下，将4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸(2.520g，0.5mmol COOH)、羟基苯并三唑(135mg，1mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(192mg，1mmol)、和N,N-二异丙基乙胺(258mg，2mmol)溶解于二氯甲烷(15ml)中。将该混合物在20℃下搅拌30分钟。添加R848(189mg，0.6mmol)。将该反应溶液在20℃下搅拌18小时。将该反应溶液倒入1升乙醚中，同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(1.823g，具有5.1％w/w R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.97(s,3.56H),8.18(d,J＝8.5Hz,3.52H),8.16–8.11(m,2.77H),7.81(s,2.92H),7.63(t,J＝7.8Hz,3.06H),7.51(t,J＝7.8Hz,3.48H),4.98(d,J＝39.6Hz,13.32H),4.81(s,6.64H),4.13(s,6.20H),3.65(s,1818H),1.34(s,23.63H),1.27(t,J＝7.1Hz,10.59H)。
实例9
4-臂-PEG20k-CM-(L)-丙氨酸-N-R848(化合物7)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-CM-L-丙氨酸：
将L-丙氨酸(7.100g，10当量)和碳酸氢钠(6.720g，10当量)添加到去离子水(800ml)中，并将该溶液搅拌直到变得澄清。然后将4-臂-PEG20k-SCM(40.030g，1当量)添加到溶液中。将该反应溶液在20℃下搅拌3小时。将5N HCl溶液添加到溶液中以将pH调节至4.0。将溶液用二氯甲烷(2x150ml)萃取。将有机相合并，并用无水硫酸钠干燥。通过玻璃料去除固体。将滤液凝缩至50ml，并然后添加到500mL乙醚中以获得沉淀物。通过过滤获得呈白色固体粉末的产物(35.012g，产率87％)，并在真空中干燥过夜。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.42(m,3.56H),3.85(s,7.11H),3.58-3.33(m,1818H),3.27(s,7.90H),1.30(d,10.28H)。
4-臂-PEG20k-CM-L-丙氨酸-N-R848：
在20℃下，将4-臂-PEG20k-CM-L-丙氨酸(2.500g，0.5mmol的COOH)、N,N-二异丙基乙胺(258mg，2.0mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(192mg，1.0mmol)和羟基苯并三唑(135mg，1mmol)溶解于无水二氯甲烷(15ml)中。在30分钟内添加R848(189mg，0.6mmol)。将该反应溶液在20℃下搅拌18小时。将该反应溶液倒入1升的乙醚中，同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(1.702g，具有4.2％(w/w)R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝8.4Hz,5.14H),7.69–7.54(m,3.95H),7.48(d,J＝8.0Hz,2.37H),4.90(s,4.74H),4.78(s,4.74H),3.62(br,1818H),1.60(d,J＝6.9Hz,5.93H),1.39(d,J＝7.3Hz,5.93H),1.36–1.27(m,21.73H),1.24(d,J＝6.7Hz,15.80H)。
实例10
4-臂-PEG20k-CM-(L)-缬氨酸-N-R848(化合物8)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
Boc-缬氨酸-R848：
将1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(R848)(237.5mg，0.755mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(5ml)中。添加Boc-L-缬氨酸(263.4mg，1.2mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(187.4mg，1.534mmol)。添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(236.1mg，1.232mmol)。将所得混合物在室温下搅拌3h。添加水以猝灭该反应。添加盐水。将该混合物用乙酸乙酯(2x50ml)萃取。将合并的有机溶液经无水硫酸钠干燥，浓缩至干燥。使用1％-10％甲醇/二氯甲烷，将残余物经硅胶快速柱色谱纯化以提供呈白色固体的产物(394.7mg)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.99(br.,1H),8.15-8.11(m,2H),7.58(t,J＝7.5Hz,1H),7.47(t,J＝7.5Hz,1H),5.42(m,1H),4.89(br,2H),4.77(s,2H),3.63(q,J＝7.0Hz,2H),3.27(m,1H),2.45(br,1H),1.44(s,9H),1.31(br,6H),1.22(t,J＝7.0Hz,3H),1.14(br,3H),0.93(d,J＝6.0Hz,3H)。LC-MS:514(MH+/z)。
缬氨酸-R848.nTFA盐：
将(S)-叔丁基(1-((2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(Boc-缬氨酸-R848)(377.0mg，0.73mmol)溶解于二氯甲烷(30ml)中，并添加三氟乙酸(3ml，38.8mmol)。将所得混合物在室温下搅拌3.5h。将该混合物浓缩以去除溶剂。将残余物在高真空下干燥以提供呈TFA盐的产物(678.5mg)。
LC-MS:414(MH+/z)。
4-臂-PEG20k-缬氨酸-N-R848
在室温下，将4-臂-PEG20k-SCM(4.170g，0.74mmol的SCM)在无水二氯甲烷(20ml)中的溶液添加到缬氨酸-R848.nTFA(约0.734mmol)和三乙胺(0.3mL，2.15mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(1.0ml)中的混合物里。将二氯甲烷(约10mL)用于在小瓶中溶解4-臂-PEG20k-SCM残余物，并添加到反应混合物中。添加三乙胺(0.15mL，1.076mmol)。将所得混合物在室温下搅拌23h。将反应混合物浓缩以去除溶剂。将残余物用异丙醇(275ml)再结晶。将固体用乙醚洗涤，并在高真空下干燥过夜以提供4.053g呈白色固体的产物。药物负载量为4.3％(w/w)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.99(br),8.10-8.09(m,6H),7.54(t,J＝7.5Hz,3H),7.47(d,3H).7.42(t,J＝7.5Hz,3H),4.840(br,6H),4.712(s,6H),4.07-3.95(m,6H),3.72-3.42(m,1818H),3.39(m,3H),2.41(br,6H),1.36(br,18H),1.16(t,J＝6.5Hz,9H),1.12(m,9H),0.92(d,J＝6.0Hz,9H)。
实例11
4-臂-PEG20k-CM-(L)-亮氨酸-N-R848(化合物9)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
Boc-Leu-R848：
将1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(R848)(421.8mg,1.34mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中。添加Boc-Leu-OH(501.4mg，2.207mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(344.6mg，2.82mmol)。添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(438.2mg，2.286mmol)。将所得混合物在室温下搅拌18h。添加水以猝灭该反应。添加盐水。将该混合物用乙酸乙酯(2x50ml)萃取。将合并的有机溶液经无水硫酸钠干燥，并浓缩至干燥。使用1％-10％甲醇/二氯甲烷，将残余物经硅胶快速柱色谱纯化，以提供呈白色固体的产物(494mg，70％产率)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ9.03(br,1H),8.16(d,J＝8.0Hz,1H),8.17(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(t,J＝7.5Hz,1H),7.46(t,J＝7.5Hz,1H),5.26(m,1H),4.85(br,2H),4.77(s,2H),3.63(q,J＝7.0Hz,2H),3.26(m,1H),1.89(m,2H),1.69(s,3H),1.56(m,1H),1.43(s,9H),1.31(br,3H),1.22(t,J＝7.0Hz,3H),1.08(br,3H),0.94(d,J＝6.0Hz,3H)。LC-MS:528(MH+/z)。
Leu-R848.nTFA盐：
将(S)-叔丁基(1-((2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸酯(Boc-Leu-R848)(494mg，0.936mmol)溶解于二氯甲烷(20ml)中，并且添加三氟乙酸(3ml，38.8mmol)。将所得混合物在室温下搅拌4h。将该混合物浓缩以去除溶剂。将残余物在高真空下干燥以提供呈TFA盐的产物(895.7mg)。
LC-MS:428(MH+/z)。
4-臂-PEG20k-CM-L-亮氨酸-R848：
在室温下，将4-臂-PEG20k-SCM(5.200g，0.96mmol的SCM)在无水二氯甲烷(30ml)中的溶液添加至R848-Leu-NH2.nTFA(约0.936mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(1.0ml)中的溶液里。将二氯甲烷(约10mL)用于在小瓶中溶解4-臂-PEG20k-SCM的残余物，其被添加到反应混合物中。添加三乙胺(0.35ml，2.51mmol)。将所得混合物在室温下搅拌35min。添加三乙胺(0.25ml，1.79mmol)。将该混合物在室温下搅拌19h。将反应混合物浓缩以去除溶剂。将残余物用异丙醇(275ml)再结晶。将固体用乙醚洗涤并在高真空下干燥过夜以提供5.12g呈白色固体的产物。药物负载量为4％(w/w)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09-8.08(m,5.5H),7.51(t,J＝7.5Hz,2.75H),7.40(m,5.5H).4.85(br,5.5H),4.70(s,5.5H),4.02-3.91(m,5.5H),3.70-3.32(m,1818H),1.81(m,2.75H),1.72(br,2.75H),1.63(m,2.75H),1.22(m,16.5H),1.12(t,J＝6.0Hz,8.25H),0.95(br,8.25H),0.86(d,J＝6.0Hz,8.25H)。
实例12
4-臂-PEG20k-CM-α,α-二甲基-甘氨酸-N-R848(化合物10)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-CM-α,α-二甲基-甘氨酸：
将2-氨基-2-甲基丙酸(2.890g，28mmol)和碳酸氢钠(2.352g，28mmol)溶解于水(40ml)中。将4-臂-PEG20k-SCM(7.0g，1.4mmol的SCM)分批添加。将该反应混合物在20℃下搅拌18小时。将该反应用1M HCl(42ml)中和至pH 4.7。将该反应混合物用氯化钠饱和并用二氯甲烷(3x100ml)萃取。将有机相经无水硫酸镁干燥并浓缩。将残余物用异丙醇(500ml)再结晶以给出4.710g呈白色固体的4-臂-PEG20k-CM-α,α-二甲基-甘氨酸(具有80％取代)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.45(s,3.56H),4.15(s,2.77H),3.97(s,2.77H),3.64(br,1818H),3.41(s,7.90H),1.62(s,19.36H)。
4-臂-PEG20k-CM-α,α-二甲基-甘氨酸-N-R848：
在20℃下，将4-臂-PEG20k-CM-α,α-二甲基-甘氨酸(2.000g，0.43mmol的COOH)、N,N-二异丙基乙胺(258mg，2.0mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(153mg，0.9mmol)、和羟基苯并三唑(108mg，0.9mmol)溶解于无水二氯甲烷(15ml)中。在30分钟内添加R848(138mg，0.44mmol)。将该反应溶液在20℃下搅拌18小时。将该反应溶液倒入1升的乙醚中，同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(1.819g，具有4.7％(w/w)R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.71(s,3.95H),8.29–8.03(m,3.95H),7.57(s,3.95H),7.45(s,3.95H),4.83(d,J＝66.8Hz,11.85H),3.61(br,1818H),2.50(s,7.90H),1.76(s,11.85H),1.42(s,3.95H),1.26(d,J＝34.3Hz,27.65H)。
实例13
mPEG5k-氨基甲酸酯-N-R848(化合物11)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
mPEG5k-氨基甲酸酯-N-R848：
在50℃下，将mPEG5k-SC(2.500g，0.5mmol)、R848(236mg，0.75mmol)和N,N-二异丙基乙胺(129mg，1.0mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(20ml)中。将该反应溶液在50℃下搅拌18小时。将该反应溶液添加至1升的乙醚中同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(2.338g，具有4.5％(w/w)R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.18(s,0.77H),8.13(dd,J＝8.4,1.3Hz,0.78H),7.59(ddd,J＝8.4,7.0,1.3Hz,0.82H),7.49–7.44(m,0.82H),4.91(s,1.7H),4.78(s,1.7H),4.43(d,J＝4.8Hz,1H),3.63(br,574H),3.37(s,3H),1.32(s,5H),1.25(t,J＝7.0Hz,2H)。
实例14
4-臂-PEG20k-氨基甲酸酯-N-R848(化合物12)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-氨基甲酸酯-N-R848：
在50℃下，将4-臂-PEG20k-SC(5.0g，1.0mmol的SCM)和R848(377mg，1.2mmol)溶解于无水1,2-二氯乙烷(25ml)中。将N,N-二异丙基乙胺(129mg，2mmol)添加到溶液中。将该反应溶液在50℃下搅拌18小时。将该反应溶液添加至1升的乙醚中同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(300ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。形成沉淀物，并通过过滤收集，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(4.240g，具有4.5％(w/w)R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.16(t,J＝8.7Hz,5.93H),7.61(t,J＝7.7Hz,3.16H),7.48(t,J＝7.7Hz,3.16H),4.93(s,2.96H),4.80(s,5.93H),4.45(t,J＝4.8Hz,2.96H),3.82(t,J＝4.8Hz,2.96H),3.79(t,J＝5.0Hz,5.93H),3.65(br,1818H),3.42(s,3.16H),1.33(s,19.75H),1.26(t,J＝7.0Hz,7.90H)。
实例15
4-臂-PEG20k-脲-N-R848(化合物13)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-脲-N-R848：
在50℃下，将4-臂-PEG20k-异氰酸酯(1.0g，0.2mmolNCO)和R848(69.2mg，0.22mmol)溶解于无水1,2-二氯乙烷(10ml)中。将该反应溶液在50℃下搅拌18小时。将该反应溶液倒入0.5升的乙醚中，同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体添加到异丙醇(250ml)中，并将悬浮液加热至60℃以形成澄清的溶液。将该溶液冷却至室温同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。再次重复在异丙醇中通过沉淀进行纯化，并随后在高真空下干燥过夜以给出呈白色固体的纯的缀合物(938g，具有4.7％(w/w)R848负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.30(d,J＝5.5Hz,3.56H),8.17–8.09(m,7.11H),7.94(d,J＝8.3Hz,3.56H),7.57(t,J＝7.8Hz,3.56H),7.43(t,J＝7.8Hz,3.56H),4.92(s,7.51H),4.77(s,7.51H),3.63(br,1818H),1.32(s,23.70H),1.24(t,J＝7.1Hz,10.67H)。
实例16
4-臂-PEG20k-CM-咪喹莫特(化合物14)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG20k-CM-咪喹莫特：
在室温下，将4-臂-PEG20k-SCM(6.789g，1.2mmol的SCM)溶解于无水二氯甲烷(33ml)中，并然后添加到咪喹莫特(359.7mg，1.452mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(5.0ml)中的悬浮液里。将二氯甲烷(约10mL)用于溶解4-臂-PEG20k-SCM残余物，并添加到反应混合物中。将所得混合物在室温下搅拌3天。添加二氯甲烷(10ml)。将该混合物在室温下再搅拌一天。将反应混合物浓缩以去除溶剂。将残余物用异丙醇再结晶两次以提供4.8612g呈白色固体的产物。药物负载量为3.9％(w/w)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.55(br,2.5H),8.026(m,3.2H),7.853(d,J＝8.0Hz,3.3H),7.720(s,3.3H),7.450(t,J＝8.0Hz,3.3H),7.371(t,J＝8.0Hz,3.3H),4.30-4.18(m,13.26H),3.471(m,1818H),2.190(m,3.1H),0.877和0.986(2s,20.4H)。
实例17
4-臂-PEG40k-CM-N-咪喹莫特(化合物15)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
4-臂-PEG40k-CM-N-咪喹莫特：
将4-臂-PEG40k-SCM(5.110g，0.51mmol的SCM)溶解于无水二氯甲烷(33ml)中，并且在室温下添加咪喹莫特(148mg，0.61mmol)。将所得悬浮液在室温下搅拌4天以形成澄清的溶液。将反应混合物浓缩以去除溶剂。将残余物用如上所提及的异丙醇(250ml)再结晶两次以提供4.609g呈白色固体的产物。基于NMR分析，该产物包含1.8％(w/w)咪喹莫特。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.21(d,3.06H),8.02(d,3.06H),7.85(s,3.15H),7.63(t,3.34H),7.53(t,3.17H),4.34(d,6.21H),3.89-3.43(m,3636H),1.03(s,18.09H)。
实例18
4-臂-PEG20k 4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)-苯甲酰胺(化合物16)的合成
根据以下反应方案合成标题化合物。
在20℃下，将4-臂-PEG20k-胺(1.500g，0.3mmol的胺)溶解于二氯甲烷(3ml)中。将该溶液添加到含有N,N-二异丙基乙胺(116mg，0.9mmol)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化物六氟磷酸盐(137mg，0.36mmol)、和4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯甲酸(108mg，0.3mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中。将该反应混合物在20℃下搅拌18小时。将该反应溶液添加至0.3升的乙醚中同时搅拌。通过过滤收集形成的沉淀物，并用乙醚(50ml)洗涤。将所获得的固体通过快速色谱法(使用二氯甲烷中的10％-30％甲醇)进行纯化。将产物溶解于20ml二氯甲烷中并过滤。将滤液浓缩并再次在乙醚中沉淀物，以给出呈白色固体的纯的缀合物(300mg，具有6.0％(w/w)药物负载量)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.26(s,3.95H),7.78(d,J＝7.9Hz,7.90H),7.52(d,J＝7.9Hz,7.90H),5.67(s,7.90H),5.04(s,7.90H),4.42(t,J＝5.0Hz,7.90H),3.66(br,1818H)。
实例19
体内研究：在鼠CT-26结肠肿瘤模型中施用RSLAIL-2和TLR激动剂和4-1BB激动剂
进行研究以评估和比较当与用单一药剂4-1BB激动剂和RSLAIL-2结合TLR激动剂进行免疫治疗相比时，说明性长效IL-2Rβ偏向性激动剂RSLAIL-2和示例性长效TLR激动剂(4-臂-PEG20k-CM-N-R848)和示例性4-1BB激动剂(抗CD137抗体LOB12.3)的组合在鼠CT-26结肠肿瘤模型中的抗肿瘤应答。
体内模型：使用的小鼠是约10周龄雌性Balb/c品种，其中在每个侧腹上植入2百万个CT26肿瘤细胞。允许细胞成熟成为肿瘤持续10天，达到100-150mm3的体积。
给药：将4-臂-PEG20k-CM-N-R848以40μl体积以瘤内或瘤周围(即，直接地)对两种肿瘤之一(原发性肿瘤)进行给药。其次，对侧肿瘤不直接用TLR激动剂(4-臂-PEG20k-CM-N-R848)处理。将RSLAIL-2通过静脉内注射按0.8mg/kg全身给药。将CD137激动剂通过腹膜内注射全身给药。
经标记的组：“RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848”：在肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)用20μg的4-臂-20kPEG-CM-N-R848对小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还在第4天和第13天按0.8mg/kg的剂量对相同的小鼠静脉内给药RSLAIL-2(即，总共给予2个剂量，相隔9天，从给药第0天之后开始4天)。
标记为“100μg CD137激动剂”的组：从肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)开始，用100μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药总共三次，并且另外在第5天和第10天给药。
标记为“10μg CD137激动剂”的组：从肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)开始，用10μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药总共三次，并且另外在第5天和第10天给药。
标记为“100μg CD137激动剂+RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848”的组：从肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)开始，用100μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药总共三次，并且另外在第5天和第10天给药。在肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)用20μg的4-臂-20kPEG-CM-N-R848对相同的小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还在第4天和第13天按0.8mg/kg的剂量对相同的小鼠静脉内给药RSLAIL-2(即，总共给予2个剂量，相隔9天，从给药第0天之后开始4天)。
标记为“10μg CD137激动剂+RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848”的组：从肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)开始，用10μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药总共三次，并且另外在第5天和第10天给药。在肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)用20μg的4-臂-20kPEG-CM-N-R848对相同的小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还在第4天按0.8mg/kg的剂量对相同的小鼠静脉内给药RSLAIL-2(即，总共给予2个剂量，相隔9天，从给药第0天之后开始4天)。
标记为“媒介物”的组：在肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)用40μl汉克氏缓冲盐水(4-臂-PEG20k-CM-N-R848的媒介物)对小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还在第4天和第13天用RSLAIL-2媒介物对相同的小鼠进行静脉内给药，总共2个剂量，相隔9天，从给药第4天开始。
测量：每周2-3次通过卡尺测量所收集的肿瘤体积并使用以下公式计算：L x W2/2，其中L是肿瘤长度，并且W是肿瘤宽度。
结果：数据提供于表1中。当与相同剂量水平的CD137激动剂单一疗法相比以及与功效较差的RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848双重疗法相比，在较低剂量水平的10μgCD137激动剂下的三重组合的结果令人震惊-即，RSLAIL-2和4-臂-PEG20k-CM-N-R848和CD137-激动剂的三重组合施用不仅对根除原发性肿瘤(通过注射直接向其施用4-臂-PEG20k-CM-N-R848)是有效的，还对根除继发性肿瘤是有效的。在完全的肿瘤消退后在21天的过程中，未观察到肿瘤再生长。此外，较低剂量水平的10μg CD137激动剂的三重组合疗法组的存活率仍为100％，而“10μg CD137激动剂”单一疗法组和“RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848”组在第42天的存活率减少到25％。作为单一疗法的“100μg CD137激动剂”组显示存活率为89％，而在第15天时在“100μg CD137激动剂+RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848”组中的100μg CD137激动剂剂量水平与RSLAIL-2和4-臂-PEG20k-CM-N-R848的三重组合导致毒性相关的存活率降低到75％。
表1.小鼠存活比例
百分比存活率提供如下：
0％≤+<25％
25％≤++<50％
50％≤+++<75％
75％≤++++<100％
给药开始后的第42天在实验结束时，用10μg CD137激动剂的单一药剂治疗导致仅25％的动物存活。25％的存活动物全部具有完全应答，治疗侧的肿瘤和未经治疗侧的肿瘤均消除。
在给药开始后的第42天在研究结束时，用100μg CD137激动剂的单一药剂治疗导致87.5％的动物存活。存活组中的所有动物均具有完全应答，其中两种肿瘤均被消除。
给药开始后的第42天在研究结束时，用RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848的双药剂治疗导致12.5％的动物存活。存活组中的所有动物均具有完全应答，其中两种肿瘤均被消除。
给药开始后的第42天在研究结束时，用100μg CD137激动剂+RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848的三药剂治疗导致87.5％的动物存活。存活组中的所有动物均具有完全应答，其中两种肿瘤均被消除。
最值得注意的是，给药开始后的第42天在研究结束时，用10μg CD137激动剂+RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848的三重组合治疗导致100％的动物存活。存活组中的所有动物均具有完全应答，其中两种肿瘤均被消除。引人注目地，在治疗的过程中，原发性和继发性肿瘤均被消除。也就是说，出乎意料地，低剂量10μg CD137激动剂和RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848的组合治疗不仅是优于等同剂量CD137激动剂单一药剂和亚有效的RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-N-R848双重组合免疫疗法治疗方式的显著改善，后两者第42天的存活率分别为10％和20％，而三重联合免疫疗法至少在第42天存活率为100％，而且还导致完全根除原发性肿瘤(注射TLR激动剂)和继发性肿瘤(未直接注射TLR激动剂，远离原发性肿瘤部位)。
媒介物组中无存活的动物。由于在治疗开始后第11天和第22天之间达到限制肿瘤体积，将所有动物均从研究中移除。
实例20
体内研究：在鼠CT-26结肠肿瘤模型中施用RSLAIL-2和4-1BB激动剂
进行研究以评估和比较当与用单一药剂4-1BB激动剂进行免疫治疗相比时，说明性长效IL-2Rβ偏向性激动剂RSLAIL-2和示例性4-1BB激动剂(抗CD137抗体LOB12.3)的组合在鼠CT-26结肠肿瘤模型中的抗肿瘤应答。
体内模型：使用的小鼠是约10周龄雌性Balb/c品种，其中在每个侧腹上植入2百万个CT26肿瘤细胞。允许细胞成熟成为肿瘤持续10天，达到100-150mm3的体积。
将RSLAIL-2通过静脉内注射按0.8mg/kg全身给药。将CD137激动剂通过腹膜内注射全身给药。
标记为“100μg CD137激动剂”的组：从肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)开始，用100μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药总共三次，并且另外在第5天和第10天给药。
标记为“10μg CD137激动剂”的组：从肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)开始，用10μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药总共三次，并且另外在第5天和第10天给药。
标记为“100μg CD137激动剂+RSLAIL-2”的组：从肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)开始，用100μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药总共三次，并且另外在第5天和第10天给药。还在第4天和第13天按0.8mg/kg的剂量对相同的小鼠静脉内给药RSLAIL-2(即，总共给予2个剂量，相隔9天，从给药第0天之后开始4天)。
标记为“媒介物”的组：在肿瘤大小为100-150mm3的第一个给药日(给药第0天)用40μl汉克氏缓冲盐水(4-臂-PEG20k-CM-N-R848的媒介物)对小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还在第4天和第13天用RSLAIL-2媒介物对相同的小鼠进行静脉内给药，总共2个剂量，相隔9天，从给药第4天开始。
测量：每周2-3次通过卡尺测量所收集的肿瘤体积并使用以下公式计算：L x W2/2，其中L是肿瘤长度，并且W是肿瘤宽度。
结果：数据提供于表2中。
表2.小鼠存活比例
百分比存活率提供如下：
0％≤+<25％
25％≤++<50％
50％≤+++<75％
75％≤++++<100％
给药开始后的第42天在实验结束时，用10μg CD137激动剂的单一药剂治疗导致仅25％的动物存活。25％的存活动物全部具有完全应答，治疗侧的肿瘤和未经治疗侧的肿瘤均消除。
在给药开始后的第42天在研究结束时，用100μg CD137激动剂的单一药剂治疗导致87.5％的动物存活。存活组中的所有动物均具有完全应答，其中两种肿瘤均被消除。
最值得注意的是，给药开始后的第42天在研究结束时，用10μg CD137激动剂+RSLAIL-2的双重组合治疗导致100％的动物存活。存活组中的所有动物均具有完全应答，其中两种肿瘤均被消除。引人注目地，在治疗的过程中，原发性和继发性肿瘤均被消除。也就是说，出乎意料地，低剂量10μg CD137激动剂和RSLAIL-2的组合治疗不仅是优于等同剂量CD137激动剂单一药剂的显著改善，在第42天存活率为25％。
实例21
在鼠CT-26结肠肿瘤模型中施用RSLAIL-2和TLR激动剂和4-1BB激动剂
进行研究以评估和比较当与用单一药剂4-1BB激动剂和RSLAIL-2结合TLR激动剂进行免疫治疗相比时，说明性长效IL-2Rβ偏向性激动剂RSLAIL-2和示例性长效TLR激动剂(4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848)和示例性4-1BB激动剂(抗CD137抗体LOB12.3)的组合在鼠CT-26结肠肿瘤模型中的抗肿瘤应答。
体内模型：使用每个侧腹上植入CT-26肿瘤细胞的约10周龄雌性Balb/c品系小鼠。允许细胞成熟成为肿瘤(例如持续10天)，达到合适的体积(例如100-150mm3的体积)。
给药：将4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848以适当剂量(例如，以40μl的体积)以瘤内/瘤周围(即，直接地)给药于两种肿瘤之一(原发性肿瘤)。其次，对侧肿瘤可以不直接用TLR激动剂(4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848)处理。将RSLAIL-2通过静脉内注射(例如，按0.8mg/kg)全身给药。将CD137激动剂通过腹膜内注射全身给药。
经标记的组：“RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848”：在适当肿瘤大小(例如100-150mm3)的第一个给药日(给药第0天)用4-臂-20kPEG-CM-甘氨酸-N-R848(例如20μg)对小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还用适当剂量的RSLAIL-2(例如，第4天和第13天0.8mg/kg，总共2个剂量)对相同的小鼠进行静脉内给药。
标记为“100μg CD137激动剂”的组：从适当肿瘤大小(例如范围为100-150mm3)的第一个给药日(给药第0天)开始，用100μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药适当的总次数(例如三次)，并且任选地在其他天(例如在第5天和第10天)给药。
标记为“10μg CD137激动剂”的组：从适当肿瘤大小(例如范围为100-150mm3)的第一个给药日(给药第0天)开始，用10μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药适当的总次数(例如三次)，并且任选地在其他天(例如在第5天和第10天)给药。
标记为“100μg CD137激动剂+RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848”的组：从适当肿瘤大小(例如范围为100-150mm3)的第一个给药日(给药第0天)开始，用100μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药适当的总次数(例如总共三次)，并且任选地在其他天(例如第5天和第10天)给药。在适当肿瘤大小(例如100-150mm3)的第一个给药日(给药第0天)用适当剂量的4-臂-20kPEG-CM-甘氨酸-N-R848(例如20μg)对相同的小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还用适当剂量的RSLAIL-2(例如，在隔开的天，0.8mg/kg)对相同的小鼠进行静脉内给药。
标记为“10μg CD137激动剂+RSLAIL-2+4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848”的组：从适当肿瘤大小(例如范围为100-150mm3)的第一个给药日(给药第0天)开始，用10μg的CD137激动剂对小鼠进行腹膜内给药适当次数(例如总共三次)，并且任选地在其他天(例如在第5天和第10天)给药。在适当肿瘤大小(例如100-150mm3)的第一个给药日(给药第0天)用适当量的4-臂-20kPEG-CM-甘氨酸-N-R848(例如20μg)对相同的小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还用适当剂量(例如0.8mg/kg)的RSLAIL-2对相同的小鼠进行静脉内给药适当的给药次数(例如，在隔开的第4天和第9天)。
标记为“媒介物”的组：在适当肿瘤大小(例如，范围为100-150mm3)的第一个给药日(给药第0天)用40μl汉克氏缓冲盐水(4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848的媒介物)对小鼠进行瘤内/瘤周围给药。还在适当的天(例如，第4天和第13天，总共2个剂量，相隔9天，从给药第4天开始)用RSLAIL-2媒介物对相同的小鼠进行静脉内给药。
测量：每周2-3次通过卡尺测量所收集的肿瘤体积并使用以下公式计算：L x W2/2，其中L是肿瘤长度，并且W是肿瘤宽度。
通过引用并入
本文引用的所有文章、书籍、专利、专利公开和其他的出版物均通过引用以其全文并入。倘若本说明书的传授内容和通过引用并入的技术之间不一致，则以本说明书中的传授内容和定义的含义为准(特别是关于在本文所附的权利要求中使用的术语)。例如，在本申请和通过引用并入的出版物以不同方式定义了同一术语的情况下，应该将该术语的定义保留在该定义所处文件的传授内容内。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种施用方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用4-1BB激动剂和至少一种IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、该IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和该toll样受体激动剂中的每一种。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂和该IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂和该toll样受体激动剂。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基本上同时施用该4-1BB激动剂、该toll样受体激动剂和/或该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的每一种。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该4-1BB激动剂与该toll样受体激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种分开施用。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基本上同时施用该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的每一种。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基本上同时施用该4-1BB激动剂和该toll样受体激动剂中的每一种。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该toll样受体激动剂与该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种分开施用。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该4-1BB激动剂全身性地施用于受试者。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该4-1BB激动剂静脉内施用于受试者。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂以同一配制品施用。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该toll样受体激动剂直接施用于受试者的癌症组织。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该toll样受体激动剂直接施用于受试者的实体癌。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该toll样受体激动剂通过选自瘤内注射和瘤周围注射的方法施用。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该长效IL-2Rβ偏向性激动剂全身性地施用于受试者。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该长效IL-2Rβ偏向性激动剂静脉内施用于受试者。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该4-1BB激动剂是与4-1BB受体选择性结合的抗体。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该4-1BB激动剂是抗CD137抗体。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该4-1BB激动剂选自乌瑞鲁单抗和乌托鲁单抗。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该长效IL-2Rβ偏向性激动剂选自多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2、(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2、和(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)平均6白细胞介素-2。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该TLR激动剂是TLR-7激动剂、TLR-8激动剂或TLR-7/8激动剂。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该TLR激动剂选自R848、咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-N-R848、4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848、以及化合物1-16中的任何一种。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该癌症是实体癌。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、胃癌、淋巴瘤、恶性黑素瘤、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、胆管癌、脑癌、宫颈癌、上颌窦癌、膀胱癌、食管癌、霍奇金病以及肾上腺皮质癌。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、以及IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂中的至少一种有效促进免疫系统的活化。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、以及IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂中的至少一种有效促进CD8 T细胞、CD11c+和CD8+树突细胞以及嗜中性粒细胞中的至少一种的活化。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、以及IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂中的至少一种有效遏制调节性T细胞、巨噬细胞和单核细胞。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、以及IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂中的至少一种有效产生对癌症的异位效应。
30.一种试剂盒，该试剂盒包含：
4-1BB激动剂；
(i)toll样受体激动剂和(ii)IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种；以及
用于将它们施用于患有癌症的受试者的说明书。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中配制该4-1BB激动剂用于全身施用。
32.如权利要求30或31所述的试剂盒，其中配制该长效IL-2Rβ偏向性激动剂用于全身施用。
33.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，其中配制该4-1BB激动剂或该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种用于静脉内施用。
34.如权利要求30-33中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒至少包含以单一配制品配制的该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂。
35.如权利要求30-34中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒包含(i)以单一配制品配制的该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂，和(ii)以分开的配制品配制的toll样受体激动剂。
36.如权利要求30-35中任一项所述的试剂盒，其中该4-1BB激动剂、该长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或该TLR激动剂中的每一种均呈适合在水性稀释剂中重构的固体形式。
37.如权利要求30-36中任一项所述的试剂盒，其中配制该toll样受体激动剂用于直接施用于受试者的癌组织。
38.如权利要求30-37中任一项所述的试剂盒，其中配制该toll样受体激动剂用于瘤内注射或瘤周围注射。
39.如权利要求30-38中任一项所述的试剂盒，其中该4-1BB激动剂选自抗CD137抗体乌瑞鲁单抗和乌托鲁单抗。
40.如权利要求30-39中任一项所述的试剂盒，其中该长效IL-2Rβ偏向性激动剂选自多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2、(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2、和(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)平均6白细胞介素-2。
41.如权利要求30-40中任一项所述的试剂盒，其中该TLR激动剂选自R848、咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-N-R848、4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848、以及化合物1-16中的任何一种。
42.4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，用于在疗法中使用。
43.如权利要求42所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，用于在癌症的治疗中使用。
44.如权利要求42-43中任一项所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，用于在实体癌的治疗中使用。
45.如权利要求42-44中任一项所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，其中该TLR激动剂是R848或化合物1-16中的任何一种。
46.如权利要求42-45中任一项所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，其中该TLR激动剂是R848、咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-N-R848或4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848。
47.如权利要求42-46中任一项所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，其中该长效IL-2Rβ偏向性激动剂选自多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2、(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2、和(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)平均6白细胞介素-2。

Claims (47)

1.一种施用方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用4-1BB激动剂和至少IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、该IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和该toll样受体激动剂中的每一种。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂和该IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂和该toll样受体激动剂。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基本上同时施用该4-1BB激动剂、该toll样受体激动剂和/或该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的每一种。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该4-1BB激动剂与该toll样受体激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种分开施用。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基本上同时施用该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的每一种。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基本上同时施用该4-1BB激动剂和该toll样受体激动剂中的每一种。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该toll样受体激动剂与该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种分开施用。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该4-1BB激动剂全身性地施用于受试者。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该4-1BB激动剂静脉内施用于受试者。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂以同一配制品施用。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该toll样受体激动剂直接施用于受试者的癌症组织。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该toll样受体激动剂直接施用于受试者的实体癌。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该toll样受体激动剂通过选自瘤内注射和瘤周围注射的方法施用。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该长效IL-2Rβ偏向性激动剂全身性地施用于受试者。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该长效IL-2Rβ偏向性激动剂静脉内施用于受试者。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该4-1BB激动剂是与4-1BB受体选择性结合的抗体。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该4-1BB激动剂是抗CD137抗体。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该4-1BB激动剂选自乌瑞鲁单抗和乌托鲁单抗。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该长效IL-2Rβ偏向性激动剂选自多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2、(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2、和(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)平均6白细胞介素-2。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该TLR激动剂是TLR-7激动剂、TLR-8激动剂或TLR-7/8激动剂。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该TLR激动剂选自R848、咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-N-R848、4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848、以及化合物1-16中的任何一种。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该癌症是实体癌。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、胃癌、淋巴瘤、恶性黑素瘤、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、胆管癌、脑癌、宫颈癌、上颌窦癌、膀胱癌、食管癌、霍奇金病以及肾上腺皮质癌。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、以及IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂中的至少一种有效促进免疫系统的活化。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、以及IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂中的至少一种有效促进CD8 T细胞、CD11c+和CD8+树突细胞以及嗜中性粒细胞中的至少一种的活化。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、以及IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂中的至少一种有效遏制调节性T细胞、巨噬细胞和单核细胞。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用该4-1BB激动剂、以及IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂和toll样受体激动剂中的至少一种有效产生对癌症的异位效应。
30.一种试剂盒，该试剂盒包含：
4-1BB激动剂；
(i)toll样受体激动剂和(ii)IL-2Rβ活化量的长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种；以及
用于将它们施用于患有癌症的受试者的说明书。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中配制该4-1BB激动剂用于全身施用。
32.如权利要求30或31所述的试剂盒，其中配制该长效IL-2Rβ偏向性激动剂用于全身施用。
33.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，其中配制该4-1BB激动剂或该长效IL-2Rβ偏向性激动剂中的至少一种用于静脉内施用。
34.如权利要求30-33中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒至少包含以单一配制品配制的该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂。
35.如权利要求30-34中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒包含(i)以单一配制品配制的该4-1BB激动剂和该长效IL-2Rβ偏向性激动剂，和(ii)以分开的配制品配制的toll样受体激动剂。
36.如权利要求30-35中任一项所述的试剂盒，其中该4-1BB激动剂、该长效IL-2Rβ偏向性激动剂、和/或该TLR激动剂中的每一种均呈适合在水性稀释剂中重构的固体形式。
37.如权利要求30-36中任一项所述的试剂盒，其中配制该toll样受体激动剂用于直接施用于受试者的癌组织。
38.如权利要求30-37中任一项所述的试剂盒，其中配制该toll样受体激动剂用于瘤内注射或瘤周围注射。
39.如权利要求30-38中任一项所述的试剂盒，其中该41BB激动剂选自抗CD137抗体乌瑞鲁单抗和乌托鲁单抗。
40.如权利要求30-39中任一项所述的试剂盒，其中该长效IL-2Rβ偏向性激动剂选自多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2、(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2、和(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)平均6白细胞介素-2。
41.如权利要求30-40中任一项所述的试剂盒，其中该TLR激动剂选自R848、咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-N-R848、4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848、以及化合物1-16中的任何一种。
42.4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，用于在疗法中使用。
43.如权利要求42所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，用于在癌症的治疗中使用。
44.如权利要求42-43中任一项所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，用于在实体癌的治疗中使用。
45.如权利要求42-44中任一项所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，其中该TLR激动剂是R848或化合物1-16中的任何一种。
46.如权利要求42-45中任一项所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，其中该TLR激动剂是R848、咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-咪喹莫特、4-臂-PEG20k-CM-N-R848或4-臂-PEG20k-CM-甘氨酸-N-R848。
47.如权利要求42-46中任一项所述的4-1BB激动剂、以及(i)长效IL-2Rβ偏向性激动剂和(ii)toll样受体激动剂中的至少一种，其中该长效IL-2Rβ偏向性激动剂选自多(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)白细胞介素-2、(2,7-(双-甲氧基PEG10kD-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)4-6白细胞介素-2、和(2,7-(双-甲氧基PEG-甲酰胺)(9H-芴-9-基)甲基N-氨基甲酸酯)平均6白细胞介素-2。
CN201880029079.7A 2017-05-02 2018-05-02 肿瘤免疫治疗性治疗方法 Pending CN110582300A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762500486P 2017-05-02 2017-05-02
US62/500,486 2017-05-02
US201762502051P 2017-05-05 2017-05-05
US62/502,051 2017-05-05
PCT/US2018/030714 WO2018204528A1 (en) 2017-05-02 2018-05-02 Immunotherapeutic tumor treatment method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110582300A true CN110582300A (zh) 2019-12-17

Family

ID=64016803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880029079.7A Pending CN110582300A (zh) 2017-05-02 2018-05-02 肿瘤免疫治疗性治疗方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210292425A1 (zh)
EP (1) EP3628010A4 (zh)
JP (1) JP7165680B2 (zh)
KR (1) KR20190141760A (zh)
CN (1) CN110582300A (zh)
AU (1) AU2018261102A1 (zh)
CA (1) CA3062291A1 (zh)
MA (1) MA48862A (zh)
MX (1) MX2019013071A (zh)
WO (1) WO2018204528A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020012252A (es) 2018-05-14 2021-04-28 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de interleucina 12 activables y metodos de uso de los mismos.
AU2019271148B2 (en) 2018-05-14 2023-07-06 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
AU2020255935A1 (en) * 2019-04-05 2021-12-02 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Water soluble adjuvant and composition containing same
CA3137512A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods and use thereof
EP4048302A1 (en) * 2019-10-25 2022-08-31 Neoleukin Therapeutics, Inc. Methods of administration of il-2 receptor agonists

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241139A1 (en) * 2006-10-31 2008-10-02 Regents Of The University Of Colorado Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity
CN106132438A (zh) * 2014-02-21 2016-11-16 尼克塔治疗印度私人有限公司 与抗CTLA‑4抗体或抗PD‑1抗体组合的IL‑2Rβ选择性激动剂

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10248141B4 (de) * 2002-10-11 2007-04-19 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Nukleinsäuren und deren Verwendung für die Gentherapie
US7387271B2 (en) * 2002-12-30 2008-06-17 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory combinations
KR20130036246A (ko) * 2010-05-07 2013-04-11 베일러 리서치 인스티튜트 사람 ｃｄ8+ ｔ 세포의 수지상 세포 면역수용체(ｄｃｉｒ)-매개 교차프라이밍
US20130331443A1 (en) * 2010-12-22 2013-12-12 Nektar Therapeutics Multi-arm polymeric prodrug conjugates of taxane-based compounds
CN103458924A (zh) 2011-02-10 2013-12-18 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 含有4-1bbl的佐剂组合物
US10149887B2 (en) 2015-10-23 2018-12-11 Canbas Co., Ltd. Peptides and peptidomimetics in combination with t cell activating and/or checkpoint inhibiting agents for cancer treatment
CA3049254A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 Nektar Therapeutics Multi-arm polymer conjugates of tlr agonist compounds and related immunotherapeutic treatment methods
CA3072320A1 (en) * 2017-08-17 2019-02-21 Nektar Therapeutics Immunotherapeutic tumor treatment method

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241139A1 (en) * 2006-10-31 2008-10-02 Regents Of The University Of Colorado Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity
CN106132438A (zh) * 2014-02-21 2016-11-16 尼克塔治疗印度私人有限公司 与抗CTLA‑4抗体或抗PD‑1抗体组合的IL‑2Rβ选择性激动剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TODD BARTKOWIAK ET AL.: "4-1BB agonists: multi-potent potentiators of tumor immunity" *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2019013071A (es) 2019-12-11
JP7165680B2 (ja) 2022-11-04
CA3062291A1 (en) 2018-11-08
KR20190141760A (ko) 2019-12-24
EP3628010A1 (en) 2020-04-01
AU2018261102A1 (en) 2019-11-07
US20210292425A1 (en) 2021-09-23
EP3628010A4 (en) 2021-02-17
JP2020518610A (ja) 2020-06-25
MA48862A (fr) 2020-04-01
WO2018204528A1 (en) 2018-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7250679B2 (ja) Ｔｌｒ作動薬化合物のマルチアームポリマーコンジュゲート及び関連の免疫療法治療の方法
JP7165680B2 (ja) 免疫療法的腫瘍治療方法
US20210130467A1 (en) Immunotherapeutic tumor treatment method
Lynn et al. Impact of polymer-TLR-7/8 agonist (adjuvant) morphology on the potency and mechanism of CD8 T cell induction
US20200317784A1 (en) Methods and compositions for treating cancer by modifying multiple arms of the immune system
EP3215189A1 (en) Polymer adjuvant
KR20210113262A (ko) 패턴 인식 수용체 작용제의 컨쥬게이트
JP7471600B2 (ja) 抗原ペプチド－アジュバントヌクレオチドコンジュゲート体を含む免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物
KR20230128509A (ko) 암 치료에서 조작된 세포 요법의 향상을 위한 방법
WO2023288226A2 (en) Polymer engineered forms of interferon-gamma and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination