CN110579460A - 一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统及方法，所述系统包括：照明光源、激光器、图像生成单元、数据采集卡、荧光信号产生单元、荧光寿命采集单元以及控制终端。本申请通过目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号，通过对声光偏转器加载数字信号对应的声波频率，可以使声光偏转器将光束快速偏转到样品指定位置，实现快速灵活的寻址扫描成像；通过三路同步信号控制时间相关单光子计数采集卡同步对荧光寿命数据进行保存，并利用目标区域及其外接矩形的像素坐标对荧光寿命图像进行校正，从而实现任意形状目标区域的寻址扫描快速荧光寿命成像。

Description

一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统及方法

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，尤其涉及一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统及方法。

背景技术

自显微镜发明以来，光学显微成像技术在生物医学研究领域的应用日益广泛。在诸多光学显微成像技术中，荧光寿命显微成像(FLIM)技术近年来备受科研人员青睐。这种技术通常采用外源性荧光探针特异性标记样品，通过探测探针分子的荧光寿命来获取样品的结构与功能信息。由于荧光寿命在测量时不受探针浓度、激发光强度以及光漂白等因素的影响，且能非常灵敏反映探针所处微环境的变化，因而常用于定量测量样品微环境中的许多物理、生化参量，例如黏度、温度、离子浓度、pH值等。

目前用于对荧光寿命进行监测的荧光显微成像系统采用振镜扫描技术，其控制方式简单，通常为栅扫描(顺序扫描)方式，但在扫描时存在机械惯性，不能从样品上一点迅速移动到另一点，因而限制了荧光寿命的成像速度。

因此，现有技术有待于进一步的改进。

发明内容

鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明的目的在于提供一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统及方法，克服现有技术荧光显微成像系统采用振镜扫描技术，在扫描时存在机械惯性，不能从样品上一点迅速移动到另一点，存在荧光寿命成像慢的缺陷。

本发明所公开的第一实施例为一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其中，所述系统包括：

照明光源和激光器；

用于将所述照明光源产生的照明光束照射到样品面上生成样品明场图或荧光图的图像生成单元；

用于根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号的数据采集卡；

用于根据所述数字信号将所述激光器产生的激光光束投射到样品面上，激发所述目标区域产生荧光信号的荧光信号产生单元；

用于采集并处理所述荧光信号得到所述目标区域的荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中的荧光寿命采集单元；

用于根据所述荧光寿命数据生成所述目标区域的畸变荧光寿命图像，并根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像的控制终端。

所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其中，所述荧光信号产生单元包括：

用于接收所述激光器产生的激光光束，并对所述激光光束的空间色散和时间色散进行预校正的色散补偿棱镜；

用于接收预校正后的所述激光光束，并根据所述数字信号将预校正后的所述激光光束投射到样品面上，激发所述目标区域产生荧光信号的声光偏转器。

所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其中，所述荧光寿命采集单元包括：

用于采集所述荧光信号，并将所述荧光信号转换为相应的电信号的光电倍增管；

用于对所述光电倍增管转换的电信号进行处理得到荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中的时间相关单光子计数采集卡。

所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其中，所述数据采集卡通过电缆线同时与所述时间相关单光子计数采集卡和所述声光偏转器连接，用于同时分别向所述时间相关单光子计数采集卡输出三路同步信号和所述声光偏转器输出数字信号。

所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其中，所述控制终端同时连接所述数据采集卡、声光偏转器和时间相关单光子计数采集卡。

本发明所公开的第二实施例为一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其中，所述方法包括：

将照明光源产生的照明光束照射到样品面上生成样品明场图或荧光图；

根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号；

根据所述数字信号将激光器产生的激光光束投射到样品面上，激发所述目标区域产生荧光信号；

采集并处理所述荧光信号得到所述目标区域的荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中；

根据所述荧光寿命数据生成所述目标区域的畸变荧光寿命图像，并根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像。

所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其中，所述将照明光源产生的照明光束照射到样品面上生成样品明场图或荧光图的步骤之后，还包括：

拍摄所述样品明场图或荧光图；

在所述样品明场图或荧光图上选取至少一个用于进行荧光寿命成像的所述目标区域。

所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其中，所述根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号的步骤包括：

根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标与声波频率的线性对应关系计算所述目标区域的像素坐标对应的声波频率；

根据所述目标区域的像素坐标对应的声波频率输出所述数字信号。

所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其中，所述三路同步信号包括像素信号、行信号和帧信号；

所述根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出三路同步信号的步骤包括：

根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标确定扫描像素是否为所述目标区域的第一个像素，若是，则同时输出像素信号、行信号和帧信号；

若否，则根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标确定所述扫描像素是否为各行像素中的第一个像素，若是，则同时输出像素信号和行信号；若否，则输出像素信号。

所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其中，所述根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像的步骤包括：

根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标，依次计算将所述目标区域内各行的各个像素移到正确存储位置的移位数值，形成移位矩阵；

根据所述移位矩阵对所述畸变荧光寿命图像中的各个像素进行X方向移位和Y方向移位，得到所述目标区域的荧光寿命图像。

有益效果，本发明提供了一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统及方法，通过目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号，通过对声光偏转器加载数字信号对应的声波频率，可以使声光偏转器将光束快速偏转到样品指定位置，实现快速灵活的寻址扫描成像；通过三路同步信号控制时间相关单光子计数采集卡同步对荧光寿命数据进行保存，并利用目标区域及其外接矩形的像素坐标对荧光寿命图像进行矫正，从而实现任意形状目标区域的寻址扫描快速荧光寿命成像。

附图说明

图1是本发明所提供的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统的结构示意图；

图2是本发明所提供的规则形状目标区域寻址扫描荧光寿命成像的数字信号和三路同步信号产生原理图；

图3是本发明所提供的不规则形状目标区域寻址扫描荧光寿命成像的选区形状分析和三路同步信号产生原理图；

图4是本发明所提供控制终端对单个不规则目标区域或在Y方向连续变化的多个不规则目标区域的畸变荧光寿命图像进行校正的原理图；

图5是本发明所提供控制终端对在Y方向不连续变化的多个不规则目标区域的畸变荧光寿命图像进行校正的原理图；

图6是本发明所提供的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统测量铃兰根茎标准样品得到的荧光寿命图像；

图7是本发明所提供的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法具体实施例流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

由于现有技术中荧光显微成像系统采用振镜扫描技术，其在扫描时存在机械惯性，不能从样品上一点迅速移动到另一点，因而限制了荧光寿命的成像速度。为了解决上述问题，本发明提供了一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，如图1所示。本发明的系统包括：照明光源1和激光器2；用于将所述照明光源1产生的照明光束照射到样品面9上生成样品明场图或荧光图的图像生成单元3；用于根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号的数据采集卡6；用于根据所述数字信号将所述激光器2产生的激光光束投射到样品面9上，激发所述目标区域产生荧光信号的荧光信号产生单元4；用于采集并处理所述荧光信号得到所述目标区域的荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中的荧光寿命采集单元5；以及用于根据所述荧光寿命数据生成所述目标区域的畸变荧光寿命图像，并根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像的控制终端7。

具体实施过程中，需要获取待测样品的荧光寿命图像时，将待测样品放置在样品台上，照明光源1产生的照明光束被图像生成单元2接收并照射到样品面9上生成样品明场图或荧光图。然后对样品明场图或荧光图进行拍摄，并将拍摄的图片存储到控制终端7中以选取需要进行荧光成像的目标区域，控制终端7会根据用户选择的目标区域自动获取目标区域的像素坐标，并根据所述目标区域的像素坐标控制数据采集卡6输出对应的数字信号和三路同步信号。随后数据采集卡6将数字信号传输到荧光信号产生单元4，荧光信号产生单元4根据接收的数字信息将激光器2产生的激光光束投射到样品面9上的目标区域，激发所述目标区域产生荧光信号。与此同时，数据采集卡6将三路同步信号传输到荧光寿命采集单元5，荧光寿命采集单元5采集并处理荧光信号得到所述目标区域的荧光寿命数据后，按照三路同步信息将目标区域的荧光寿命数据按行保存在预先设置的寿命图像文件中。最后控制终端7读取寿命图像文件中的荧光寿命数据，通过负指数拟合得到所述目标区域每个像素的荧光寿命值，生成所述目标区域畸变的荧光寿命图像，对畸变荧光寿命图像进行校正得到正确的目标区域荧光寿命图像。本发明中根据目标区域的像素坐标对目标区域进行扫描，定位准确，扫描速度快；根据目标区域形状分析产生对应的三路同步信号对寿命数据进行保存并对生成的荧光寿命图像进行校正，可以实现任意形状、任意形状选区的荧光寿命成像，成像速度快。

在一具体实施方式中，当照明光源1为卤素灯、LED灯时，图像生成单元3生成样品明场图；当照明光源1为汞灯、氙灯时，图像生成单元3生成宽场荧光图。所述图像生成单元3包括用于接收照明光源1产生的照明光束，并对所述照明光束进行聚光的第一聚光镜31；用于接收所述第一聚光镜31聚集的照明光束，并对所述照明光束进行反射的第一反射境32；用于接收第一反射境32反射的照明光束，并对所述照明光束进行聚光的第二聚光镜33；用于接收所述第二聚光镜33聚集的照明光束，并对所述照明光束进行过滤的第一滤光片34。具体实施时，照明光源1产生的照明光束经过第一聚光镜31聚光后照射到第一反射镜32表面，被所述第一反射镜32反射到第二聚光镜33上进行聚光后照射到第一滤光片34上，经过第一滤光片34进行滤光后照射到样品面9上产生样品明场图或宽场荧光图。

在一具体实施方式中，获取到样品明场图或宽场荧光图后，可以通过CCD探测器，CMOS相机或其它灵敏度较高的面阵探测器拍摄产生的样品明场图或宽场荧光图。在一具体实施方式中，拍摄样品明场图或荧光图时使用CCD探测器，如果获取到的是样品明场图，则CCD曝光时间不宜太高，一般控制在10ms左右，避免过曝。

在一具体实施方式中，拍摄结束后将获得的图片保存在控制终端7中，然后可以由用户自行手动选出需要进行荧光寿命成像的目标区域，所述目标区域的形状可以是规则形状(如矩形)，也可以是预设的特定不规则形状(如环形、扇形等)或其他用户自定义的任意不规则形状；当然目标区域可以为一个连续区域，也可以为多个不连续区域。选取目标区域后，控制终端7会自动定位并保存目标区域的像素坐标信息，同时自动进行目标区域形状分析，生成其外接矩形并保存所述外接矩形的像素坐标信息，在一具体实施例中所述像素坐标信息按先X坐标依次增大、再Y坐标依次增大的顺序排列，保存的像素坐标信息用于后续数据采集卡6输出数字信号和三路同步信号，保存的外接矩形像素坐标信息用于后续校正畸变的荧光寿命图像。

在一具体实施方式中，所述激光器2为飞秒脉冲激光器，在一具体实施例中为可调谐的蓝宝石飞秒脉冲激光器。所述荧光信号产生单元4包括用于接收激光器2产生的激光光束，并对所述激光光束的功率进行调节的半波片41和偏振分束棱镜42；用于对接收到的激光光束进行反射的第二反射镜43；用于接收第二反射镜43反射的激光光束，并对所述激光光束进行扩束整形的第一扩束整形透镜对44；用于接收所述第一扩束整形透镜对44扩束整形后的激光光束，并对所述激光光束的空间色散和时间色散进行校正的色散补偿棱镜45；用于接收所述色散补偿棱镜45校正后的所述激光光束，并根据数据采集卡6输出的数字信号对所述激光光束进行偏转的声光偏转器(AOD)46；用于接收所述声光偏转器(AOD)46发出的激光光束，并对所述激光光束进行扩束整形的第二扩束整形透镜对47；用于接收第二扩束整形透镜对47扩束整形后的激光光束，并将所述激光光束反射到样品面9上的双色镜48；以及用于接收双色镜48反射的激光光束，将所述激光光束聚焦照射在样品面9上激发焦点处的样品产生荧光，并收集样品面9焦点处产生的荧光信号的物镜49。具体实施时，激光器2发出的激光光束经过半波片41和偏振分束棱镜42进行功率调节后，经过反射镜43反射到第一扩束整形透镜44中进行扩束整形，然后经过色散补偿棱镜45对扩束整形后的激光光束进行空间色散和时间色散的校正，以改善后续荧光成像质量。校正后的激光光束经过两个反射镜43抬高后照射到正交放置的一对声光偏转器(AOD)46中，激光光束再经过第二扩束整形透镜47进行扩束整形后，由双色镜48照射到样品面9产生荧光信号。

在一具体实施例中，控制终端7与数据采集卡6通过电缆线连接，控制终端7中预先存储有像素坐标与声波频率的线性对应关系。控制终端7获取到目标区域的像素坐标后，通过像素坐标与声波频率的线性对应关系逐一计算目标区域中每个像素坐标的声波频率，并将每个像素坐标对应的声波频率传输到数据采集卡6中。数据采集卡6根据每个像素坐标输出对应的数字信号，并将数字信号转换为对应的声波信号加载到声光偏转器(AOD)46上使其按目标区域的像素坐标进行扫描。在一具体实施例中，所述数据采集卡6输出的数字信号为32位数字信号，其中低16位数字信号控制声光偏转器(AOD)46在X方向上的扫描，高16位数字信号控制声光偏转器(AOD)46在Y方向上的扫描。每个像素位置都对应特定的声波频率，即对应特定的数字信号，因此只要输出对应的32位数字信号就可以令AOD将光束快速偏转到样品指定位置。

在一具体实施方式中，所述荧光寿命采集单元5包括用于接收荧光信号，并对所述荧光信号进行过滤的第二滤光片51；用于接收所述第二滤光片51过滤后的荧光信号，并将接收到的所述荧光信号转换为电信号的光电倍增光(PMT)53；用于对所述光电倍增光(PMT)53转换的电信号进行处理得到所述目标区域的荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中的时间相关单光子计数采集卡(TCSPC card)54。具体实施时，所述光电倍增光(PMT)53与时间相关单光子计数采集卡(TCSPC card)54通过电缆连接，目标区域产生的荧光信号经过物镜49和双色镜48后照射到第二滤光片51进行过滤后，经过所述光电倍增光(PMT)53采集转换为电信号，并由所述时间相关单光子计数采集卡(TCSPC card)54对电信号进行处理得到目标区域中每个像素的荧光光子随时间分布情况，即光子数-时间分布，简称为“荧光寿命信息”。当然，本实施例中所述光电倍增光(PMT)53还可以替换为雪崩式发光二极管(APD)等点探测器等。

在一具体实施例中，所述寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统还包括用于对第二滤光片51输出的荧光信号进行分束的分束镜10；从分束镜10分束后的荧光信号，一部分用于荧光寿命采集单元5获取荧光寿命信息，另一部分由图像记录模块8记录。其中所述图像记录模块8包括用于接收分束镜10分束后的荧光信号，并对所述荧光信号进行反射的第三反射镜81；用于接收第三反射镜81反射的荧光信号并对所述荧光信号进行会聚的透镜83；用于接收透镜83会聚的荧光信号，并对所述荧光信号的荧光强度图像进行记录的面阵探测器82。具体实施时，第二滤光片51过滤后的荧光信号被分束镜10分为两束，一束照射到光电倍增光(PMT)53上，另一束照射到第三反射镜81上被面阵探测器82探测到，并记录荧光信号强度，用于验证时间相关单光子计数采集卡54存储荧光寿命数据的准确性。当然，与前面拍摄样品明场图或荧光图时使用的面阵探测器类似，本实施例中面阵探测器82可以选择CCD探测器，也可以选择CMOS相机或其他灵敏度较高的面阵探测器。本发明既可以分别使用两个面阵探测器，一个用于拍摄样品明场图或荧光图，一个用于记录荧光信号强度。也可以利用图像记录模块8中的面阵探测器82同时拍摄样品明场图或荧光图和记录荧光信号强度，上述实施例均在本发明的保护范围内。

在一具体实施方式中，当使用面阵探测器82拍摄样品明场图或荧光图时，拍摄前需要对显微物镜49进行调焦使得拍摄图片样品结构清晰。图像生成单元2产生样品明场图或宽场荧光图，经过荧光信号产生单元4中的物镜49、二向色镜48和荧光寿命采集单元5中的第二滤光片51，将分束镜10处设为空置状态，由记录模块8进行拍摄并将拍摄的图片存储到控制终端7。当照明光源1为卤素灯、LED灯时，二向色镜48和滤光片51处设为空置状态，用于样品明场图记录；当照明光源1为汞灯、氙灯时，二向色镜48、第二滤光片51根据样品激发荧光发射波长选择合适波段，用于宽场荧光图记录。

在一具体实施方式中，所述数据采集卡6根据获取到的目标区域的像素坐标输出数字信号的同时，会根据目标区域像素坐标输出对应的三路同步信号。所述三路同步信号包括像素信号、行信号和帧信号，这三路同步信号都是模拟脉冲信号。其中，行信号和帧信号只在像素信号达到特定个数时输出，行信号的出现取决于目标区域中每行的像素个数，帧信号则取决于所选区域的总像素个数，且多路输出信号同时出现时他们的上升沿位置要保持一致。所述数据采集卡6通过电缆与时间相关单光子计数采集卡(TCSPC card)54和声光偏转器(AOD)46连接，同时分别向时间相关单光子计数采集卡(TCSPC card)54和声光偏转器(AOD)46输出三路同步信号和数字信号，用于两者之间的同步。

具体实施时，声光偏转器(AOD)46扫描每一帧的第一个像素时，数据采集卡6同时输出像素信号、行信号和帧信号；声光偏转器(AOD)46扫描每一帧除第一个像素以外的各行的第一个像素时，数据采集卡6同时输出像素信号和行信号；声光偏转器(AOD)46扫描每一帧其它像素即每一帧中非各行的第一个像素时，数据采集卡6只输出像素信号。如图2所示，左边为一矩形目标区域，像素大小为5×2，右边为其对应的三路同步信号，声光偏转器(AOD)46从第一排的第一个像素开始扫描，数据采集卡6同时输出像素信号、行信号和帧信号，随后声光偏转器(AOD)46扫描第一排的第二个到第五个像素，数据采集卡6都只输出像素信号。第一排像素扫描完后，声光偏转器(AOD)46开始扫描第二排的第一个像素，数据采集卡6同时输出像素和行信号，随后声光偏转器(AOD)46扫描第二排的第二个到第五个像素，数据采集卡6都只输出像素信号。整帧像素扫描完成后，声光偏转器(AOD)46又重复扫描第一排第一个像素，数据采集卡6同时输出像素、行和帧信号，如此反复循环，直到扫描结束。

在一具体实施方式中，所述控制终端7同时连接数据采集卡6、声光偏转器46、时间相关单光子计数采集卡54和用于拍摄样品明场图和荧光图的面阵探测器82，用于控制同步信号输出、寻址扫描、荧光信号输出、荧光寿命数据存储等。

在一具体实施方式中，所述控制终端7中会根据目标区域像素坐标建立一个N*M大小的寿命图像文件，时间相关单光子计数采集卡54对电信号进行处理得到荧光寿命数据后，根据数据采集卡6输出的三路同步信号将荧光寿命数据保存在所述寿命图像文件中，即像素、行、帧这三路同步信号分别控制荧光寿命数据存储到寿命图像文件时的像素与像素、行与行、帧与帧之间切换。例如，继续以图2进行说明，控制终端7中会根据5×2像素大小的矩形目标区域建立一个5*2的寿命图像文件，数据采集卡6同时输出像素信号、行信号和帧信号时，时间相关单光子计数采集卡54会将得到的荧光寿命数据保存在寿命图像文件中的第一个像素中，随后数据采集卡6都只输出像素信号，时间相关单光子计数采集卡54会将得到的荧光寿命数据依次保存在与第一个像素同一行的其它像素中；然后数据采集卡6同时输出像素信号和行信号，荧光寿命数据的存储由寿命图像文件的第一行切换到下一行，从而实现荧光寿命数据按照三路同步信号进行存储。

在一具体实施方式中，由于荧光寿命值需要足够多的荧光寿命数据累加计算。当声光偏转器(AOD)46扫描完目标区域内的所有像素后，声光偏转器(AOD)46又会从目标区域的第一个像素开始扫描，以继续积累每个像素中的荧光寿命数据，使得每个像素中的荧光寿命数据足以用于计算荧光寿命值，此时像素、行、帧这三路同步信号又同时输出，其中帧信号触发寿命数据的存储从寿命图像文件的最后一个像素切换回到第一个像素，并将寿命数据累加计入第一个像素，更新第一个像素中的荧光寿命信息(即光子数-时间分布)。荧光寿命数据存储顺序按照以上规律循环下去，直至采集结束，最后多帧采集得到的荧光寿命信息自动堆叠就形成了目标区域的荧光寿命信息。

具体实施时，当目标区域形状如图2为规则矩形时，通过三路同步信号存储的荧光寿命数据得到的目标区域的荧光信号是完全正确的，无需进行后期重构。当目标区域形状如图3所示为不规则图形时，控制终端7根据目标区域形状分析得到的外接矩形像素坐标和目标区域像素坐标的比对结果，控制数据采集卡6输出对应不规则图像的像素信号、行信号和帧信号，此时每两个行信号之间像素信号的个数取决于每一行的像素数，对于不规则图形，行像素不再以规则的周期规律出现，时间相关单光子计数采集卡54按照三路同步信号将荧光寿命数据存储在寿命图像文件中时，当荧光寿命数据的存储仍在行信号与像素信号同时到达时实现从一行到下一行的切换，即荧光寿命数据仍然是按行进行存储的，但每一行存储的像素数则不相同，同时由于存储时每行均从寿命图像文件的第一个像素开始存储，最终得到的荧光寿命图像虽然仍然为畸变的荧光寿命图像，但每行的像素个数与正确荧光寿命图像中的像素个数一致，只是相对位置发生偏移，只需要通过控制终端7进一步对各行像素进行X方向和Y方向移位即可得到正确的荧光寿命数据，操作简单。

在一具体实施方式中，如图4所示，前述步骤中提到控制终端7获取到目标区域后，会进行目标区域形状分析生成外接矩形，并获取目标区域及其外接矩形像素坐标。根据寿命图像文件中存储的荧光寿命数据生成畸变的荧光寿命图像后，控制终端7进一步将目标区域外接矩形区域与目标区域重合部分标记为1，将目标区域外接矩形区域与目标区域不重合部分标记为0，形成一个二值化矩阵。然后根据外接矩形每行第一个像素坐标为基准来确定所选目标区域每行各像素的相对位置，即最终需要重构达到的正确荧光寿命图像的像素排列。随后将正确荧光寿命图像中各行各像素的位置与对应像素在畸变荧光寿命图像中的位置进行相减运算，得到一个X方向的移位矩阵，该矩阵蕴含畸变寿命图像中每个像素的位置畸变量信息，即每个像素该向右平移多少个像素才能到正确的存储位置。获得上述二值化矩阵和移位矩阵后，将这两个矩阵先后作用于该图像文件的每个像素上，即可对畸变的荧光寿命图像进行校正。

具体实施时，对于单个任意形状区域以及多个任意形状且在Y方向上连续分布的区域，荧光寿命图像的校正可以按照如图4所示进行X方向上像素的正确移位即可。而对于多个任意形状但在Y方向上不连续分布的情况，在对X方向上移位后，还需要根据离散分布区域在Y方向上的间隔来对其Y方向上进行移位。如图5所示，多个任意形状但在Y方向上不连续的目标区域，经过X方向移位和Y方向移位后得到正确的荧光寿命图像。本发明通过将输出的三路同步信号与所选目标区域形状紧密联系，再借助简单的后期图像处理，即将像素重新按目标区域的形状特征进行排列，就可以将成像区域形状从单一的矩形推广到一个或多个任意形状，极大地拓展了成像的灵活性，也在一定程度上提高了成像速度。

在一具体实施例中，发明人利用本发明提供的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统对铃兰根茎标准样品进行荧光成像，得到的荧光寿命图像如图6所示，图6(a)为从铃兰根茎标准样品中选择多个需要进行荧光寿命成像的不同区域，图6(b)为面阵探测器82拍摄到的荧光强度图像，图6(c)为时间相关单光子计数采集卡(TCSPC card)54根据三路同步信号存储荧光寿命数据得到的荧光寿命图像，可以看到严重的畸变，图6(d)为校正畸变的荧光寿命图像得到正确的荧光寿命图像，可以看出与面阵探测器82拍摄到的荧光强度图像一致，说明校正效果准确。

在一具体实施方式中，本发明还提供一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，如图7所示，所述方法包括步骤：

S1、将照明光源产生的照明光束照射到样品面上生成样品明场图或荧光图；

S2、根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号；

S3、根据所述数字信号将激光器产生的激光光束投射到样品面上，激发所述目标区域产生荧光信号；

S4、采集并处理所述荧光信号得到所述目标区域的荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中；

S5、根据所述荧光寿命数据生成所述目标区域的畸变荧光寿命图像，并根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像。

在一具体实施方式中，所述步骤S1之后还包括步骤：

R1、拍摄所述样品明场图或荧光图；

R2、在所述样品明场图或荧光图上选取至少一个用于进行荧光寿命成像的所述目标区域。

在一具体实施方式中，步骤S2中所述根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号的步骤包括：

S21、根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标与声波频率的线性对应关系计算所述目标区域的像素坐标对应的声波频率；

S22、根据所述目标区域的像素坐标对应的声波频率输出所述数字信号。

在一具体实施方式中，所述三路同步信号包括像素信号、行信号和帧信号，步骤S2中所述根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出三路同步信息的步骤包括：

S21＇、根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标确定扫描像素是否为所述目标区域的第一个像素，若是，则同时输出像素信号、行信号和帧信号；

S22＇、若否，则根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标确定所述扫描像素是否为各行像素中的第一个像素，若是，则同时输出像素信号和行信号；若否，则输出像素信号。

在一具体实施方式中，步骤S5中所述根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像的步骤包括：

S51、根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标，依次计算将所述目标区域内各行的各个像素移到正确存储位置的移位数值，形成移位矩阵；

S52、根据所述移位矩阵对所述畸变荧光寿命图像中的各个像素进行X方向移位和Y方向移位，得到所述目标区域的荧光寿命图像。

综上所述，本发明提供了一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统及方法，所述系统包括：照明光源和激光器；用于将所述照明光源产生的照明光束照射到样品面上生成样品明场图或荧光图的图像生成单元；用于根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号的数据采集卡；用于根据所述数字信号将所述激光器产生的激光光束投射到样品面上，激发所述目标区域产生荧光信号的荧光信号产生单元；用于采集并处理所述荧光信号得到所述目标区域的荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中的荧光寿命采集单元；用于根据所述荧光寿命数据生成所述目标区域的畸变荧光寿命图像，并根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像的控制终端。本申请通过目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号，通过对声光偏转器加载数字信号对应的声波频率，可以使声光偏转器将光束快速偏转到样品指定位置，实现快速灵活的寻址扫描成像；通过与目标区域形状密切关联的三路同步信号控制时间相关单光子计数采集卡同步对荧光寿命数据进行保存，并利用目标区域及其外接矩形的像素坐标对荧光寿命图像进行校正，从而实现任意形状目标区域的寻址扫描快速荧光寿命成像。

应当理解的是，本发明的系统应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述系统包括：

照明光源和激光器；

用于将所述照明光源产生的照明光束照射到样品面上生成样品明场图或荧光图的图像生成单元；

用于根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号的数据采集卡；

用于根据所述数字信号将所述激光器产生的激光光束投射到样品面上，激发所述目标区域产生荧光信号的荧光信号产生单元；

用于采集并处理所述荧光信号得到所述目标区域的荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中的荧光寿命采集单元；

用于根据所述荧光寿命数据生成所述目标区域的畸变荧光寿命图像，并根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像的控制终端。

2.根据权利要求1所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述荧光信号产生单元包括：

用于接收所述激光器产生的激光光束，并对所述激光光束的空间色散和时间色散进行预校正的色散补偿棱镜；

用于接收预校正后的所述激光光束，并根据所述数字信号将预校正后的所述激光光束投射到样品面上，激发所述目标区域产生荧光信号的声光偏转器。

3.根据权利要求2所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述荧光寿命采集单元包括：

用于采集所述荧光信号，并将所述荧光信号转换为相应的电信号的光电倍增管；

用于对所述光电倍增管转换的电信号进行处理得到荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中的时间相关单光子计数采集卡。

4.根据权利要求3所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述数据采集卡通过电缆线同时与所述时间相关单光子计数采集卡和所述声光偏转器连接，用于同时分别向所述时间相关单光子计数采集卡输出三路同步信号和所述声光偏转器输出数字信号。

5.根据权利要求3所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述控制终端同时连接所述数据采集卡、声光偏转器和时间相关单光子计数采集卡。

6.一种寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其特征在于，所述方法包括：

将照明光源产生的照明光束照射到样品面上生成样品明场图或荧光图；

根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号和三路同步信号；

根据所述数字信号将激光器产生的激光光束投射到样品面上，激发所述目标区域产生荧光信号；

采集并处理所述荧光信号得到所述目标区域的荧光寿命数据，并根据所述三路同步信号将所述荧光寿命数据存储到预先设置的寿命图像文件中；

根据所述荧光寿命数据生成所述目标区域的畸变荧光寿命图像，并根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像。

7.根据权利要求6所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其特征在于，所述将照明光源产生的照明光束照射到样品面上生成样品明场图或荧光图的步骤之后，还包括：

拍摄所述样品明场图或荧光图；

在所述样品明场图或荧光图上选取至少一个用于进行荧光寿命成像的所述目标区域。

8.根据权利要求6所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其特征在于，所述根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出数字信号的步骤包括：

根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标与声波频率的线性对应关系计算所述目标区域的像素坐标对应的声波频率；

根据所述目标区域的像素坐标对应的声波频率输出所述数字信号。

9.根据权利要求6所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其特征在于，所述三路同步信号包括像素信号、行信号和帧信号；

所述根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标输出三路同步信号的步骤包括：

根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标确定扫描像素是否为所述目标区域的第一个像素，若是，则同时输出像素信号、行信号和帧信号；

若否，则根据所述样品明场图或荧光图上所选目标区域的像素坐标确定所述扫描像素是否为各行像素中的第一个像素，若是，则同时输出像素信号和行信号；若否，则输出像素信号。

10.根据权利要求6所述的寻址扫描快速荧光寿命显微成像方法，其特征在于，所述根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标对所述畸变荧光寿命图像进行校正，得到所述目标区域的荧光寿命图像的步骤包括：

根据所述目标区域及其外接矩形像素坐标，依次计算将所述目标区域内各行的各个像素移到正确存储位置的移位数值，形成移位矩阵；

根据所述移位矩阵对所述畸变荧光寿命图像中的各个像素进行X方向移位和Y方向移位，得到所述目标区域的荧光寿命图像。