CN110579388A - 鉴别艾叶贮存年份的模型、建立方法和艾叶贮存年份鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药材检测技术领域，具体涉及鉴别艾叶贮存年份的模型、建立方法和艾叶贮存年份鉴别方法。本发明应用紫外‑可见‑近红外图谱分析不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液，选取图谱中干扰小且具有差异的波段作为变量组成数据矩阵，对不同年份艾叶的乙酸乙酯提取液进行初步分类和鉴别，并将不同年份的艾叶提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS‑DA分析，得出一个PLS‑DA模型，不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液在PLS‑DA模型中分布的区域不同。发明方法的探寻与建立，为艾叶药材的质量控制及贮存年份鉴别提供新的技术和方法。
Description
技术领域
本发明涉及药材检测技术领域，具体涉及鉴别艾叶贮存年份的模型、建立方法和艾叶贮存年份鉴别方法。
背景技术
艾为菊科蒿属草本植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥叶，其性温、辛，味苦，归肝、脾、肾经，具有散寒止痛、温经止血等作用。艾叶主要含有挥发油、黄酮类、鞣质类、三萜类、桉叶烷类等化学成分，具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抑制血小板聚集、镇咳平喘等药理作用。艾叶在我国分布广泛，除极干旱与高寒地区外，几乎遍及全国，主产于湖北、河南、安徽、河北等省份。近年来，艾产业的快速发展带来了艾叶资源需求的激增，尤以“陈艾”备受青睐，其价格不断攀升，但艾叶交易市场现状令人堪忧。市场上不乏鱼目混珠的药商，恣意谎称所售艾叶为“陈艾”以提高经济利润，这种行为严重影响了消费者的权益和临床用药的安全性。因此，一种简便快捷的鉴别方法亟待探寻和建立。遗憾的是，到目前为止，艾叶年份鉴别的方法还未见报道，故本发明具有一定的现实意义。
中药指纹图谱是一种即综合又可量化的鉴定手段，它是在药物化学整体成分的基础上，用以评价和确定中药材的质量，以达到区分和鉴别的目的。本发明的鉴别艾叶贮存年份的模型、建立方法和艾叶贮存年份鉴别方法拟以不同年份的艾叶样品为发明对象，建立艾叶紫外-可见-近红外指纹图谱，挖掘其潜在的差异信息，并结合多种化学计量学方法，最终对艾叶的贮存年份进行分类和鉴别。本发明方法的探寻与建立，为艾叶药材的质量控制及贮存年份鉴别提供新的技术和方法。
发明内容
本发明的目的是提供鉴别艾叶贮存年份的模型、建立方法和艾叶贮存年份鉴别方法，为艾叶贮存年份的鉴别方法提供新的思路和手段。
本发明第一个目的是提供的鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，应用紫外-可见-近红外图谱分析不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液，选取图谱中干扰小且具有差异的波段作为变量组成数据矩阵，对不同年份艾叶的乙酸乙酯提取液进行初步分类和鉴别，并将不同年份的艾叶提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS-DA分析，得出一个PLS-DA模型，不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液在PLS-DA模型中分布的区域不同。
优选地，上述鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，其包括以下步骤：
S1、艾叶样品预处理：
将不同年份的艾叶样品去杂、挑选、剪碎，混匀后备用；
S2、制备艾叶样品提取液：
称取艾叶样品，按照艾叶样品与乙酸乙酯的料液比为1g:50-100mL加入乙酸乙酯，提取后，过滤，滤液即为艾叶样品提取液；
S3、不同年份艾叶样品的紫外-可见-近红外指纹图谱：
应用紫外-可见-近红外图谱分析不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液；
S4、不同年份艾叶样品的偏最小二乘判别分析：
将不同年份的艾叶乙酸乙酯提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS-DA分析，得出一个PLS-DA模型，不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液在PLS-DA模型中分布的区域不同。
优选地，所述提取时间为90-150min。
优选地，所述艾叶样品与提取溶剂的料液比为1g:100mL。
本发明第二个目的是提供鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法得到的模型。
本发明第三个目的是利用上述模型鉴别未知艾叶年份的方法，具体为，将未知样品艾叶的乙酸乙酯提取液应用紫外-可见-近红外图谱分析，选取图谱中干扰小且具有差异的波段作为变量组成数据矩阵，对未知艾叶的乙酸乙酯提取液进行初步分类和鉴别，并将未知艾叶提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS-DA分析，得到未知样品艾叶的主成分分布区域，跟已经建立的PLS-DA模型中不同年份艾叶的主成分分布区域进行比对，确定未知艾叶的年份
与现有技术相比，本发明提供的鉴别艾叶贮存年份的模型、建立方法和艾叶贮存年份鉴别方法，具有以下有益效果：
本发明通过逐步分析和探索，当提取溶剂为纯水、甲醇及石油醚时光谱数据分类结果存在多处交叉和混乱，而乙酸乙酯提取液的光谱数据较为理想，艾叶样品被分为四个相对独立且集中的区域；通过偏最小二乘判别分析，不同贮存年份的艾叶样品均被正确的分类，故紫外-可见-近红外指纹图谱技术与PLD-DA相结合的方法适用于艾叶贮存年份的鉴别，且此方法操作简便，可为艾叶及其他药材的等同性发明提供数据基础和有益参考。
附图说明
图1为实施例1、对比例1、对比例2和对比例3中艾叶不同提取液的紫外-可见-近红外图谱，其中A为艾叶的纯水提取液图谱，B为艾叶的甲醇提取液图谱；C为艾叶的石油醚提取液图谱；D为艾叶的乙酸乙酯提取液图谱；
图2为2014～2018年艾叶样品的甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的紫外-可见-近红外指纹图谱，其中A、B、C图分别为不同年份艾叶甲醇提取液、艾叶石油醚提取液及艾叶乙酸乙酯提取液的指纹图谱，A、B、C图中的①、②、③、④、⑤分别代表2014年、2015年、2016年、2017年及2018年的样品均值谱线；
图3为2014～2018年艾叶样品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液中分析得到的PC1和PC2散点图，,其中A为艾叶在甲醇提取液中分析得到的PC1和PC2散点图，B为艾叶在石油醚提取液中分析得到的PC1和PC2散点图；C为艾叶在乙酸乙酯提取液中分析得到的PC1和PC2散点图；
图4为以2016年和2018年的艾叶在乙酸乙酯提取液得到的PC1和PC2散点图和图3中2016年和2018年的待测艾叶在乙酸乙酯提取液得到的PC1和PC2散点图的重合度图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，下文中所用是的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。
需要说明的是，下述试试例中均对不同年份艾叶样品的主成分进行了分析，在石油醚和甲醇提取液的主成分分类中，五个年份的艾叶样品分类效果欠佳，样品分布无序且分散，无法达到理想的分类效果。因此，主成分分析适于不同年份艾叶以乙酸乙酯为提取液的分类和鉴别，故选择乙酸乙酯作为提取液，以乙酸乙酯的光谱数据进行进一步挖掘和分析。
一、下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进行具体的举例说明：
下述实施例中所用发明仪器及试剂如下：
紫外-可见-近红外分光光度计(UV probe工作站，3600Plus，日本岛津)；万分之一分析天平(MS-TS，德国梅特勒-托利多)；超声波清洗仪(SY-3200T，上海声源)；超纯水(ULUP自制)；甲醇、乙酸乙酯及石油醚均为分析纯。
需要说明的是，下述实施例和对比例中紫外-可见-近红外图谱的测定于南阳理工学院河南省方药与免疫调节重点实验室完成，实验环境保持温度在20～25℃之间，湿度在30％～40％之间。
实施例1
鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，包括以下步骤：
S1、艾叶样品预处理：
艾叶样品按照“Z”字采样法于2014～2018年端午前后在河南省安阳市汤阴县伏道镇采集，经南阳理工学院黄显章副教授鉴定为菊科蒿属草本植物艾Artemisia argyilevl.et Vant.
将不同年份的艾叶样品去杂、挑选、剪碎，混匀后备用；
S2、制备艾叶样品提取液：
称取艾叶样品，按照艾叶样品与乙酸乙酯的料液比为1g:100mL加入乙酸乙酯，提取后，过滤，滤液即为艾叶样品提取液；
S3、不同年份艾叶样品的紫外-可见-近红外指纹图谱：
以乙酸乙酯作为背景进行参比，并调整基线，稳定后进行测定，设定扫描波长为：190～1500nm，狭缝为1.0nm，采样间隔为0.2nm，样品重复试验3次，以其均值作为检测结果；
以不同年份艾叶混合样品为发明对象，精密称取0.5g剪碎后的样品5份，精密加入乙酸乙酯20ml，稳定后，超声90min，过滤，滤液于200～1500nm下进行测定，以其吸收峰数考察4种溶剂对艾叶样品化学成分的提取效果并进行记录，结果见下图1的D图；
S4、不同年份艾叶样品的主成分分析：
选取S3得到的紫外-可见-近红外图谱中干扰小且具有差异的波段作为变量，每个年限抽样5次，乙酸乙酯提取液的波段选择250～800nm，其紫外-可见图谱相应组成25×551的数据矩阵，借助SPSS软件和SIMCA-P软件进行分析，分析结果见表2；
S5、不同年份艾叶样品的偏最小二乘判别分析：
将不同年份的艾叶提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS-DA分析，鉴别结果表明不同贮存年份的艾叶样品均被正确的分类。
实施例2
本实施例鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，与实施例1的步骤相同，不同的是艾叶样品与乙酸乙酯的料液比为1g:50mL。
实施例3
本实施例鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，与实施例1的步骤相同，不同的是艾叶样品与乙酸乙酯的料液比为1g:80mL。
实施例4
本实施例鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，与实施例1的步骤相同，不同的是S2中制备艾叶样品提取液的提取时间为120min。
实施例5
本实施例鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，与实施例1的步骤相同，不同的是S2中制备艾叶样品提取液的提取时间为150min。
对比例1
本对比例鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，与实施例1的步骤相同，不同的是S2中制备艾叶样品提取液采用的提取剂是纯水。
对比例2
本对比例鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，与实施例1的步骤相同，不同的是S2中制备艾叶样品提取液采用的提取剂是甲醇。
对比例3
本对比例鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，与实施例1的步骤相同，不同的是S2中制备艾叶样品提取液采用的提取剂是石油醚。
对比例4
本对比例鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，与实施例1的步骤相同，不同的是不进行步骤4和步骤5，步骤3之后，进行的是紫外-可见-近红外指纹图谱相似度评价，即将同种溶剂提取的不同年份艾叶紫外-可见-近红外指纹图谱中相似度较高的吸收峰，采用正态检验法进行识别，并对组内吸收峰波长极差值与该组和相邻组的平均波长差值大小进行比较。
二、结果与分析
2.1精密度的考察
以不同年份的艾叶混合样品为发明对象，以实施例1、对比例2和对比例3的艾叶提取液，按照实施例1、对比例2和对比例3的方法平行测定5次紫外-可见-近红外光谱，计算相对标准偏差，其RSD均小于0.52％，精密度良好。
2.2稳定性的考察
以不同年份采集的艾叶混合样品为发明对象以实施例1、对比例2和对比例3的艾叶提取液，分别在0h、1.0h、2.0h、4.0h、8.0h、24.0h进行的测定，计算相对标准偏差，其RSD均小于1.08％，样品提取液在24.0h内稳定。
2.3重复性的考察
以不同年份采集的艾叶混合样品为发明对象，准确称量艾叶样品5份，以
实施例1、对比例2和对比例3的艾叶提取液，按照实施例1、对比例2和对比例3的方法紫外-可见-近红外光谱，计算相对标准偏差，其RSD均小于0.83％，重复性良好。
2.4、不同提取剂的选择
由实施例1、对比例1、对比例2和对比例3的鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，是通过以不同年份艾叶混合样品为发明对象，精密称取0.5g剪碎后的样品5份，精密加入纯水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯各20ml，稳定后，超声90min，过滤，滤液于200～1500nm下进行测定，以其吸收峰数考察4种溶剂对艾叶样品化学成分的提取效果并进行记录，结果见图1。
图1为实施例1、对比例1、对比例2和对比例3中艾叶不同提取液的紫外-可见-近红外图谱，该图谱已去除噪音背景和阈值异常的干扰。由图1可知，A纯水提取液在200～1400nm之间噪音和干扰较少，但此区域的图谱几乎没有吸收峰的存在，在进一步分析其数据后，仍并未发掘其潜在有效的信息，故后续试验予以舍去。B为甲醇提取液、C为石油醚提取液、D为乙酸乙酯提取液分别在200～1200nm、200～800nm及200～1400nm的之间紫外-可见-近红外图谱，以上三种提取溶剂图谱中吸收峰较多，且受到干扰较小，故本发明将选用甲醇、石油醚和乙酸乙酯为提取溶剂对不同年份的艾叶进行下一步分析。
2.5、不同年份艾叶样品的紫外-可见-近红外指纹图谱分析
2014～2018年艾叶样品的甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的紫外-可见-近红外指纹图谱见图2。由图2可知，同一溶剂提取的不同年份的艾叶样品紫外-可见-近红外指纹图谱相似度较高，单从峰位、峰强和峰形难以对不同贮存年份艾叶进行区分和鉴别。
2.6、紫外-可见-近红外指纹图谱相似度评价
全谱相似度评价指将同种溶剂提取的不同年份艾叶紫外-可见-近红外指纹图谱中相似度较高的吸收峰采用正态检验法进行识别，并对组内吸收峰波长极差值与该组和相邻组的平均波长差值大小进行比较。分析结果显示，不同年份艾叶的甲醇提取液提取的共有峰有2组；石油醚提取液的共有峰6组；乙酸乙酯的共有峰共有2组。若仅以共有峰差异评判不同年份艾叶的分类效果过于片面，且不具有代表性，说服力不强，故采用全谱相似度评价代替特征峰相似度评价以探索年份之间的差别。
以共有模式建立艾叶对照紫外-可见-近红外指纹图谱，以均值作为对照图谱的吸收强度，分析结果见表1。从表1可以看出不同贮存年份的艾叶样品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯的紫外-可见-近红外图谱的相似度较高，其中甲醇提取液不同年份间的相似度分别为99.95％、99.70％、98.11％、99.43％、99.77％、98.53％、99.58％、99.09％、99.03％、98.63％；石油醚提取液不同年份间的相似度分别为99.95％、99.70％、98.11％、99.43％、99.77％、98.53％、99.58％、99.09％、99.63％、98.64％；乙酸乙酯提取液不同年份间的相似度分别为63.88％、88.29％、96.92％、97.54％、98.09％、98.49％、98.84％、99.15％、99.38％及99.56％。以上结果表明，不同贮存年份艾叶的紫外-可见区峰位、峰强、峰数等参数差异很小，故全光谱相似度评价体系也不能对年份进行区分和鉴别，应进一步考虑其他计量学方法挖掘潜在和有效的差异。
表1艾叶全波段相似度评价
2.7、不同年份艾叶样品的主成分分析
主成分分析是利用降维的方式将原始的多个变量通过线性变换转化为新的少数综合指标的分析方法，即从原始变量中导出少数的几个主成分，使它们尽可能多地保留原始变量的信息，在二维或三维空间中直观反映样品性质，该方法具有信息损失少、相关最优和回归最优等特点。
选取干扰小且具有差异的波段作为发明基础(每个年限抽样5次，甲醇提取液350～800nm、乙酸乙酯提取液250～800nm、石油醚提取液200～700nm)，其紫外-可见图谱相应组成25×451、25×551及25×501的数据矩阵，借助SPSS软件和SIMCA-P软件进行分析，分析结果见表2。从表2中可以看出，甲醇提取液所提取的前5主成分累计可信度为99.77％，石油醚提取液所提取的前5主成分累计可信度为99.95％，乙酸乙酯提取液所提取的前10主成分累计可信度为99.71％，三种提取液主成分的特征值及累计可信度均较高，即可替代原始的紫外可见图谱。
表2主成分的特征值及累计可信度
图3为不同年份艾叶样品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液中得出PC1(第一主成分)和PC2(第二主成分)得分的散点图。从图3可看出，在乙酸乙酯中，5个年份的艾叶样品被分为四个相对独立且集中的区域。其中，2018年样品集中于第二象限，且第一主成分距离偏差不大，分类效果较为理想；2015年和2017年艾叶样品分布在第一象限，在第一主成分的分类距离偏差不大，样品分布相对集中，分类效果较为理想；2014年和2016年艾叶样品分布在第三象限，其第一主成分距离偏差也较小，分布相对集中分类效果也较为理想。在石油醚和甲醇提取液的主成分分类中，五个年份的艾叶样品分类效果欠佳，样品分布无序且分散，无法达到理想的分类效果。因此，主成分分析适于不同年份艾叶以乙酸乙酯为提取液的分类和鉴别，故以乙酸乙酯的光谱数据进行进一步挖掘和分析。
2.7、偏最小二乘判别分析
在主成分分析的基础上，选取不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液作为发明对象，进行偏最小二乘判别分析。将乙酸乙酯光谱数据代入SIMCA软件进行有监督模式的PLS-DA分析，并将2014年样品数据设置为“class 1”，2015年样品数据设置为“class 2”，2016年样品数据设置为“class 3”，2017年样品数据设置为“class 4”，2018年样品数据设置为“class 5”。
表3为不同年份艾叶样品的PLS-DA模型分类结果，从表3可以看出，5个不同年份艾叶样品均被正确的进行了分类，表明紫外-可见指纹图谱技术结合化学计量学方法可以有效的鉴别不同年份的艾叶，分类正确率达到100％，分类效果良好。
表3 PLS-DA模型分类结果
此外，我们另外取了一批2016和2018年的艾叶样品，将2016年和2018的年的艾叶的乙酸乙酯提取液应用紫外-可见-近红外图谱分析，选取图谱中干扰小且具有差异的波段作为变量组成数据矩阵，对艾叶的乙酸乙酯提取液进行初步分类和鉴别，并将未知艾叶提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS-DA分析，得到未知样品艾叶的主成分分布区域，跟已经建立的PLS-DA模型中不同年份艾叶的主成分分布区域进行比对，如图4所示，2016年和2018年的艾叶样品和已经建立好的PLS-DA模型中2016年和2018年艾叶样品在模型中分布的区域重合度较高。
需要说明的是，本发明中涉及到数值范围时，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (6)
1.鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，其特征在于，应用紫外-可见-近红外图谱分析不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液，选取图谱中干扰小且具有差异的波段作为变量组成数据矩阵，对不同年份艾叶的乙酸乙酯提取液进行初步分类和鉴别，并将不同年份的艾叶提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS-DA分析，得出一个PLS-DA模型，不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液在PLS-DA模型中分布的区域不同。
2.根据权利要求1所述的鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、艾叶样品预处理：
将不同年份的艾叶样品去杂、挑选、剪碎，混匀后备用；
S2、制备艾叶样品提取液：
称取艾叶样品，按照艾叶样品与乙酸乙酯的料液比为1g:50-100mL加入乙酸乙酯，提取后，过滤，滤液即为艾叶样品提取液；
S3、不同年份艾叶样品的紫外-可见-近红外指纹图谱：
应用紫外-可见-近红外图谱分析不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液；
S4、不同年份艾叶样品的偏最小二乘判别分析：
将不同年份的艾叶乙酸乙酯提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS-DA分析，得出一个PLS-DA模型，不同年份艾叶样品的乙酸乙酯提取液在PLS-DA模型中分布的区域不同。
3.根据权利要求2所述的鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，其特征在于，S2中，所述提取时间为90-150min。
4.根据权利要求2所述的鉴别艾叶贮存年份模型的建立方法，其特征在于，S2中，所述艾叶样品与提取溶剂的料液比为1g:100mL。
5.利用权利要求1所述的方法得到的模型。
6.利用权利要求5所述的模型鉴别未知艾叶年份的方法，具体为，将未知样品艾叶的乙酸乙酯提取液应用紫外-可见-近红外图谱分析，选取图谱中干扰小且具有差异的波段作为变量组成数据矩阵，对未知艾叶的乙酸乙酯提取液进行初步分类和鉴别，并将未知艾叶提取液光谱数据重命名，代入SIMCA软件进行PLS-DA分析，得到未知样品艾叶的主成分分布区域，跟已经建立的PLS-DA模型中不同年份艾叶的主成分分布区域进行比对，确定未知艾叶的年份。
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