CN110573626A - 抗体选择方法 - Google Patents
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Abstract
本文中报道了一种用于选择在食蟹猴中具有小于8mL/kg/天的全身清除率的抗体的方法,所述方法包括步骤:采用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱和采用阳性线性电导率/盐梯度上进行肝素亲和色谱,测量抗体的保留时间,并且选择抗体,所述抗体具有比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3保留时间之间的保留时间差异的1.78倍小的FcRn亲和色谱柱上相对保留时间,和比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小的肝素亲和色谱柱上相对保留时间。
Description
本发明属于重组抗体技术领域。本文中报道了一种用于基于两种正交亲和柱上(即FcRn亲和色谱柱和肝素亲和色谱柱上)的保留时间选择抗体的方法。
发明背景
G类人免疫球蛋白(IgG)含有两个赋予靶抗原特异性的抗原结合(Fab)区和一个负责与Fc受体相互作用的恒定区(Fc区)(参见,例如Edelman,G.M.,Scand.J.Immunol.34(1991)1-22;Reff,M.E.和Heard,C.,Crit.Rev.Oncol.Hematol.40(2001)25-35)。人IgG亚类IgG1、IgG2和IgG4具有21天的平均血清半衰期,其长于任何其他已知血清蛋白的平均血清半衰期(参见,例如Waldmann,T.A.和Strober,W.,Prog.Allergy 13(1969)1-110)。这种长半衰期主要由Fc区和新生Fc受体(FcRn)之间的相互作用介导(参见,例如Ghetie,V.和Ward,E.S.,Annu.Rev.Immunol.18(2000)739-766;Chaudhury,C.等人,J.Exp.Med.197(2003)315-322.)。这是为何使用IgG或含有Fc的融合蛋白作为广泛治疗药的类别的原因之一。
新生Fc受体FcRn是涉及IgG和白蛋白稳态、母源IgG跨胎盘转运及抗原-IgG免疫复合物吞噬的膜结合受体(参见,例如Brambell,F.W.等人,Nature 203(1964)1352-1354;Ropeenian,D.C.等人,J.Immunol.170(2003)3528-3533)。人FcRn是由糖基化I类主要组织相容性复合体样蛋白(α-FcRn)和β2微球蛋白(β2m)亚基组成的异二聚体(参见,例如Kuo,T.T.等人,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789)。FcRn与Fc区的CH2-CH3区内的位点结合(参见,例如Ropeenian,D.C.和Akilesh,S.,Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725;Martin,W.L.等人,Mol.Cell 7(2001)867-877;Goebl,N.A.等人,Mol.Biol.Cell 19(2008)5490-5505;Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542-548.)并且两个FcRn分子可以与Fc区同时结合(参见,例如Sanchez,L.M.等人,Biochemistry 38(1999)9471-9476;Huber,A.H.等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083.)。FcRn和Fc区之间的亲和力是pH依赖的,在内体pH 5-6显示纳摩尔亲和力及在生理pH 7.4显示相当弱的结合作用(参见,例如Goebl,N.A.等人,Mol.Biol.Cell 19(2008)5490-5505;Ober,R.J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)11076-11081;Ober,R.J.等人,J.Immunol.172(2004)2021-2029)。赋予IgG长半衰期的基础机制可以由三个基本步骤解释。首先,IgG受到多种细胞类型的非特异性吞饮作用(参见,例如Akilesh,S.等人,J.Immunol.179(2007)4580-4588;Montoyo,H.P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(2009)2788-2793.)。其次,IgG在酸性内体中在pH 5-6遇到并结合FcRn,因而保护IgG免遭溶酶体降解(参见,例如Ropeenian,D.C.和Akilesh,S.,Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725;Rodewald,R.,J.Cell Biol.71(1976)666-669)。最后,IgG在胞外清除率中在生理pH 7.4释放(参见,例如Ghetie,V.和Ward,E.S.,Annu.Rev.Immunol.18(2000)739-766)。这种严格的pH依赖性结合和释放机制对IgG再循环至关重要并且在不同pH值的结合特征的任何偏差可能强烈地影响IgG的循环半衰期(参见,例如Vaccaro,C.等人,Nat.Biotechnol.23(2005)1283-1288)。
随着大部分人用治疗性抗体候选物显示适于临床使用的药代动力学特性,Hoetzel,I.等人(mAbs 4(2012)753-760)公开了具有快速清除率的抗体的风险减轻策略,但有时观察到可能限制临床用途的出乎意料快速的抗体清除率。该文献描述了一种基于ELISA检测与杆状病毒(BV)颗粒结合以评价治疗性蛋白的非特异性结合作用的测定法。
WO 2013/120929中公开了用于功能性表征单克隆抗体的分析性FcRn亲和色谱。Putnam,W.S.等人公开了单克隆抗体的药代动力学、药效动力学和免疫原性可比性评估策略(Trends Biotechnol.28(2010)509-516)。
Sampei,Z.等人(PLoS One 8(2013)e57479)公开了鉴定和多维优化模拟因子VIII辅因子活性的功能的非对称双特异性IgG抗体。
WO 2015/140126公开了一种基于FcRn亲和色谱柱上确定的保留时间预测抗体体内半衰期的方法。
当前文献公开了FcRn色谱(参见,例如Schoch,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA112(2015)5997-6002)或FcRn亲和力(参见,例如Neuber,T.等人,MAbs 6(2014)928-942)作为药代动力学预示的用途。备选地,公开了肝素结合作用,例如,以ELISA样式(参见,例如,Datta-Mannan,A.,et al.,MAbs 7(2015)1084-1093)作为定量与细胞表面结构非特异性相互作用的代用参数。
发明简述
采用本发明方法,可以鉴定增加数目的,即更多的,具有合适治疗性应用的药代动力学特性的抗体;尤其可以更正确地选择具有适于治疗性应用的药代动力学特性的抗体。基于如本文中所报道的方法获得的结果,通过从所提供的多种抗体评价抗体,做到这点。
已经发现,分别与孤立(1维)的FcRn或孤立的肝素色谱相比,可以相对于/基于食蟹猴单剂药代动力学(SDPK)研究中抗体的清除率,通过使用FcRn亲和色谱和肝素亲和色谱的组合,改善对抗体的选择。改善在于减少淘汰的具有可接受PK属性的抗体的数目等等。
已经发现FcRn亲和色谱和肝素亲和色谱的组合允许界定FcRn亲和色谱柱和肝素亲和色谱柱保留时间阈值并且因而界定二维保留时间区域,其中可以找到具有缓慢清除率(即全身循环半衰期长)的抗体。因此,这种组合允许改善对全身循环半衰期长的抗体的选择、允许改善药代动力学预测的准确度并允许减少淘汰的尽管具有长的全身循环半衰期的抗体的数目等等。
已经发现当FcRn亲和色谱柱上和肝素亲和色谱柱上的保留时间基于各自柱上参考抗体的保留时间归一化时,界定了优势包含缓慢清除率的抗体的相对保留时间区域。这个区域由FcRn亲和色谱柱上小于1.78的相对保留时间(以氧化型(H2O2处理的)抗Her3抗体制备物作为参考抗体)和肝素亲和色谱柱上小于0.87的相对保留时间(以抗pTau抗体作为参考抗体)界定。
因此,本发明包括一种选择适合作为治疗剂(在人类中)使用的在食蟹猴中具有全身清除率的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)任选地提供包含抗体的(离体;人工)样品,
b)用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)
i)如果/当相对于FcRn亲和色谱柱上第一参考抗体的保留时间,FcRn亲和色谱柱上抗体的相对保留时间小于第一阈值,并且,
ii)如果/当肝素亲和色谱柱上抗体的保留时间对肝素亲和色谱柱上第二参考抗体的保留时间的比率小于第二阈值,
选择抗体。
在一个实施方案中,第一参考抗体是氧化型抗体制备物。在一个实施方案中,氧化型抗体制备物是包含参考抗体的制备物,所述参考抗体就重链CH2结构域中位置252处的甲硫氨酸残基而言处于非氧化形式、处于单氧化形式(仅位置252处两个甲硫氨酸之一氧化)和处于双氧化形式(位置252处两个甲硫氨酸均氧化)(根据Kabat编号)。在一个实施方案中,基于以下式计算相对保留时间
其中trel,i=抗体的相对保留时间;ti=抗体的保留时间。在一个实施方案中,第一参考抗体是具有以下重链和轻链的抗Her3抗体,所述重链具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列,所述轻链具有SEQ ID NO:04的氨基酸序列。在一个实施方案中,第一阈值是2。在一个实施方案中,第一阈值是1.8。在一个实施方案中,第一阈值是1.78。
在一个实施方案中,第二参考抗体是具有以下重链和轻链的抗pTau抗体,所述重链具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列,所述轻链具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。在一个实施方案中,第二阈值是1。在一个实施方案中,第二阈值是0.8。在一个实施方案中,第二阈值是0.78。
在一个实施方案中,步骤c)是
i)当/如果FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小,并且
ii)当/如果肝素亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小,
选择抗体。
在一个实施方案中,食蟹猴中适于治疗性应用(即抗体可以用作治疗剂)的全身清除率是8mL/kg/天或更小。在一个实施方案中,全身清除率小于8mL/kg/天。在一个实施方案中,全身清除率小于6mL/kg/天。
本发明还包括一种选择合适作为治疗剂(在人类中)使用的(在食蟹猴中)具有全身清除率的与至少一种抗原(特异性)结合的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供处于不同样式的抗体,所述样式选自
i)全长抗体、CrossMab、2:1异二聚T细胞双特异性抗体和与一个、两个或三个附加Fab、scFv、scFab、CrossFab分子直接或借助肽接头融合的前述任一者,和/或
ii)人IgG1 Fc区、具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1 Fc区、
具有结入扣突变的人IgG1 Fc区及其组合,
b)采用a)的每种不同抗体样式,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)
i)如果FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小,并且
ii)肝素亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小,
选择抗体,
并且因而选择抗体
本发明还包括一种选择合适作为治疗剂(在人类中)使用的(在食蟹猴中)具有全身清除率的与至少一种抗原(特异性)结合的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供至少两种与至少一种抗原结合的抗体,所述抗体
i)具有不同的CDR序列,或
ii)具有相同的CDR序列和不同的可变结构域序列,或
iii)具有处于不同抗体样式的相同CDR序列,
b)采用a)的每种不同抗体,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)选择抗体,所述抗体具有
i)相对于FcRn亲和色谱柱上第一参考抗体的保留时间,FcRn亲和色谱柱上相对保留时间小于第一阈值,并且
ii)肝素亲和色谱柱上保留时间对肝素亲和色谱柱上第二参考抗体的保留时间的比率小于第二阈值。
在一个实施方案中,第一参考抗体是氧化型抗体制备物。在一个实施方案中,氧化型抗体制备物是包含抗体的制备物,所述抗体就重链CH2结构域中位置252处的甲硫氨酸残基而言处于非氧化形式、处于单氧化形式(仅位置252处两个甲硫氨酸之一氧化)和处于双氧化形式(位置252处两个甲硫氨酸均氧化)(根据Kabat编号)。在一个实施方案中,基于以下式计算相对保留时间
其中trel,i=抗体的相对保留时间;ti=抗体的保留时间。在一个实施方案中,第一参考抗体是具有以下重链和轻链的抗Her3抗体,所述重链具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列,所述轻链具有SEQ ID NO:04的氨基酸序列。在一个实施方案中,第一阈值是2。在一个实施方案中,第一阈值是1.8。在一个实施方案中,第一阈值是1.78。
在一个实施方案中,第二参考抗体是具有以下重链和轻链的抗pTau抗体,所述重链具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列,所述轻链具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。在一个实施方案中,第二阈值是1。在一个实施方案中,第二阈值是0.8。在一个实施方案中,第二阈值是0.78。
在一个实施方案中,步骤c)是
i)当/如果FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小,并且
ii)当/如果肝素亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小,
选择抗体。
在一个实施方案中,该方法还包括以下步骤:
d)如果提供的抗体或抗体样式无一符合步骤c)的标准,则提供至少一个其他抗体样式或抗体并且重复步骤b)和c)。
本发明包括一种用于产生抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)培养表达抗体(包含一种或多种编码抗体的核酸)的哺乳动物细胞,并且
c)从细胞或培养基回收抗体,
其中已经选择抗体(从多种抗体和/或抗体样式),以具有i)比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小的FcRn亲和色谱柱上相对保留时间,和ii)比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小的肝素亲和色谱柱上相对保留时间。
本发明包括一种用于选择具有在食蟹猴中小于8mL/kg/天的全身清除率的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)任选地提供包含抗体的样品,
b)用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)
i)如果FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小,并且
ii)如果肝素亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小,
选择抗体。
本发明还包括一种用于产生抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供包含一种或多种核酸的细胞,所述核酸编码用根据本发明方法选择的抗体,并且
b)在培养基中培养细胞并从细胞或培养基回收抗体,并且因而产生该抗体。
在全部方法的一个实施方案中,根据以下等式计算FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间:
基于根据图1的峰定义(trel,i:峰i的相对保留时间;ti:峰的保留时间i;t峰2:根据图1的部分氧化的抗Her3抗体的峰2的保留时间;t峰3:根据图1的抗Her3抗体的峰3的保留时间)。
在全部方法的一个实施方案中,根据以下式式计算肝素亲和色谱柱上的相对保留时间:
(trel,i:峰i的相对保留时间;ti:峰i的保留时间;tpTau:抗pTau抗体峰的保留时间)。
在全部方法的一个实施方案中,抗体或抗体样式选自包含两条抗体轻链和两条抗体重链的全长抗体、CrossMab、2:1异二聚T细胞双特异性抗体、抗体-细胞因子融合多肽、Fc区-细胞因子融合多肽和抗体-Fab融合多肽。
在全部方法的一个实施方案中,抗体包含Fc区,所述Fc区选自人IgG1 Fc区、具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1 Fc区、具有结入扣突变的人IgG1 Fc区及其组合。
在采用阳性线性pH梯度的FcRn亲和色谱的一个实施方案中,使用新生Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的固定化非共价复合物作为亲和色谱配体,
其中新生Fc受体和β-2-微球蛋白的非共价复合物与色谱材料结合并且该非共价复合物经特异性结合对与固相缀合,
其中pH梯度是从第一pH值到第二pH值,其中第一pH值是pH 3.5至pH 6.4并且第二pH值是pH 7.4至pH 9.5,并且
其中新生Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是单生物素酰化的并且固相用链霉亲和素衍生化。
在一个实施方案中,pH梯度是从第一pH值到第二pH值,因而第一pH值是pH 5.5并且第二pH值是pH 8.8。
在一个实施方案中,β-2-微球蛋白来自与FcRn相同的物种。
在一个实施方案中,FcRn选自人FcRn、食蟹猴FcRn、小鼠FcRn、大鼠FcRn、羊FcRn、犬FcRn、猪FcRn、微型猪FcRn和兔FcRn。
在一个实施方案中,β-2-微球蛋白来自与FcRn相同的物种。
在一个实施方案中,β-2-微球蛋白来自与FcRn不同的物种。
在一个实施方案中,抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体。
在一个实施方案中,抗体是嵌合抗体。
通常,在哺乳动物细胞中将带C末端His-Avi Tag(SEQ ID NO:32)的FcRn(对于人FcRn,SEQ ID NO:31)的可溶性胞外结构域与β2-微球蛋白(对于人β-2-微球蛋白,SEQ IDNO:33)共表达。将非共价FcRn-微球蛋白复合物生物素酰化并且加载于链霉亲和素衍生化的琼脂糖凝胶上。
原则上,任何缓冲物质可以用于如本文中报道的方法中。
在一个实施方案中,用于FcRn亲和色谱的参考抗体是具有SEQ ID NO:03(重链)和SEQ ID NO:04(轻链)的抗HER3抗体。
在一个实施方案中,用于肝素亲和色谱的参考抗体是具有SEQ ID NO:01(重链)和SEQ ID NO:02(轻链)的抗pTau抗体。
在一个实施方案中,抗体是融合多肽的单特异性抗体或抗体片段、或融合多肽的双特异性抗体或抗体片段、或融合多肽的三特异性抗体或抗体片段、或融合多肽的四特异性抗体或抗体片段。
在一个实施方案中,抗体是IgG类抗体。在一个实施方案中,抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的抗体。在一个实施方案中,抗体是IgG1或IgG4亚类的抗体。
具体实施方案
发明至少部分地基于以下结果:分别与孤立(1维)的FcRn色谱或肝素色谱相比,可以相对于/基于食蟹猴单剂药代动力学(SDPK)研究中抗体的清除率,通过使用FcRn亲和色谱和肝素亲和色谱的组合,改善对抗体的选择。改善在于减少淘汰的尽管具有可接受PK属性的抗体的数目等等。
本发明至少部分地基于以下结果:FcRn亲和色谱和肝素亲和色谱的组合允许界定FcRn亲和色谱柱和肝素亲和色谱柱保留时间阈值并且因而界定保留时间区域,其中可以找到具有缓慢清除率(即全身循环半衰期长)的抗体。因此,这种组合允许改善对全身循环半衰期长的抗体的选择、允许改善药代动力学预测的准确度并允许减少淘汰的尽管具有长的全身循环半衰期的抗体的数目,等等。
本发明至少部分地基于以下结果:当FcRn亲和色谱柱上和肝素亲和色谱柱上的保留时间基于各自柱上参考抗体的保留时间归一化时,界定了优势包含具有缓慢清除率的抗体的相对保留时间区域。这个区域由FcRn亲和色谱柱上小于1.78的相对保留时间(以抗Her3抗体作为参考抗体)和肝素亲和色谱柱上小于0.87的相对保留时间(以抗pTau抗体作为参考抗体)界定。
I.定义
如本文所用,重链和轻链的全部恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号并且在本文中称作“根据(Kabat)编号”。具体而言,Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号体系(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL并且Kabat EU index编号体系(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链区、CH2和CH3,这种情况下,其在本文中通过提到“根据Kabat EU索引编号”进一步澄清)。
Carter P.;Ridgway J.B.B.;Presta L.G.:Immunotechnology,第2卷,第1期,1996年二月,第73-73(1)页中描述了结入扣二聚化模块及其在抗体工程化中的用途。
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出。
例如在以下文献中描述了实施本发明的可用方法和技术:Ausubel,F.M.(编著),Current Protocols in Molecular Biology,第I至第III卷(1997);Glover,N.D.和Hames,B.D.编著,DNA Cloning:A Practical Approach,第I至第II卷(1985),Oxford UniversityPress;Freshney,R.I.(编著),Animal Cell Culture–a practical approach,IRL PressLimited(1986);Watson,J.D.等人,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press(1992);Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers(1987);Celis,J.编著,Cell Biology,第2版,Academic Press(1998);Freshney,R.I.,Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,第2版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
重组DNA技术的使用能够实现核酸衍生物的产生。这类衍生物可以例如在独立或几个核苷酸位置借助置换、改变、交换、缺失或插入受到修饰。可以例如借助位点定向诱变实施修饰或衍生化。这类修饰可以容易地由本领域技术人员实施(参见,例如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,USA;Hames,B.D.和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRL Press,Oxford,Englandd)。
必须指出,除非上下文另外明确指出,否则如本文中和所附权利要求中所用,单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(an)”包括复数称谓。因此,例如,对“细胞”的提及包括一个细胞、多个此类细胞及本领域技术人员已知的其等同物等。同样,术语“a”(或“an”)、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文互换使用。还应指出,术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
术语“约”指下文数值的+/-20%范围。在一个实施方案中,术语“约”指下文数值的+/-10%范围。在一个实施方案中,术语“约”指下文数值的+/-5%范围。
如本文所用的术语“确定”还涵盖术语“测量”和“分析”。
术语“包含”也包括术语“由……组成”。
术语“抗体”在本文中以广意使用并且涵盖多种抗体结构物,包括但不限于单克隆全长抗体和多特异性抗体(例如,双特异性抗体、三特异性抗体),只要它们具有Fc区即可。
“多特异性抗体”指对相同抗原上的至少两个不同表位或两种不同抗原具有结合特异性的抗体。可以将多特异性抗体作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)或其组合(例如全长抗体加额外的scFv或Fab片段)制备。还已经报告了具有二个、三个或更多个(例如四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体(参见,例如US 2002/0004587A1)。
术语“与抗原结合”指抗体在体外测定法中的结合。在一个实施方案中,在抗体与表面结合并通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原与抗体结合的结合测定法中测定结合作用。结合意指例如10-8M或更小、在一些实施方案中10-13至10-8M、在一些实施方案中10-13至10-9M的结合亲和力(KD)。术语“结合”也包括术语“特异性结合”。
可以通过BIAcore测定法(GE Healthcare Biosensor AB,乌普萨拉,瑞典)研究结合作用。结合作用的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合速率常数)、kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。
术语“缓冲物质”指在溶液中时可以改变溶液的pH值水平的物质,例如因添加或释放酸性或碱性物质所致。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型),例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“Fc-融合多肽”指结合结构域(例如抗原结合结构域如单链抗体,或多肽如受体的配体)与抗体Fc区的融合物。
术语“人源Fc区”指人源免疫球蛋白重链的C端区域,其至少含有一部分的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。在一个实施方案中,Fc区具有SEQ ID NO:05的氨基酸序列。然而,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。Fc区由两条重链Fc区多肽组成,所述重链Fc区多肽可以借助形成链间二硫键的铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接。
术语“FcRn”指人新生Fc-受体。FcRn起到再利用来自溶酶体降解途径的IgG的作用,导致清除率减少和半衰期增加。FcRn是由两条多肽:50kDa I类主要组织相容性复合体样蛋白(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)组成的异二聚体蛋白。FcRn以高亲和力与IgG的Fc区的CH2-CH3部分结合。在IgG和FcRn之间的相互作用严格依赖pH并且以1:2化学计量发生,即一个IgG通过其两条重链与两个FcRn分子结合(Huber,A.H.等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。FcRn结合作用在内体中酸性pH(pH<6.5)发生并且IgG在中性细胞表面(pH约7.4)释放。这种相互作用的pH敏感性质促进FcRn介导保护胞饮入细胞的IgG通过在内体酸性环境内部与受体结合而免遭胞内降解。FcRn随后促进IgG再循环到细胞表面并随后在FcRn-IgG复合物暴露于细胞外部中性pH环境时释放入血流。
术语“Fc区的FcRn结合部分”指抗体重链多肽的部分,所述部分从大约EU位置243延伸至EU位置261,并且从大约EU位置275延伸至EU位置293,并且从大约EU位置302延伸至EU位置319,并且从大约EU位置336延伸至EU位置348,并且从大约EU位置367延伸至EU位置393及EU位置408,并且从大约EU位置424延伸至EU位置440。在一个实施方案中,改变根据Kabat EU编号的以下一个或多个氨基酸残基:F243,P244,P245,K246,P247,K248,D249,T250,L251,M252,I253,S254,R255,T256,P257,E258,V259,T260,C261,F275,N276,W277,Y278,V279,D280,V282,E283,V284,H285,N286,A287,K288,T289,K290,P291,R292,E293,V302,V303,S304,V305,L306,T307,V308,L309,H310,Q311,D312,W313,L314,N315,G316,K317,E318,Y319,I336,S337,K338,A339,K340,G341,Q342,P343,R344,E345,P346,Q347,V348,C367,V369,F372,Y373,P374,S375,D376,I377,A378,V379,E380,W381,E382,S383,N384,G385,Q386,P387,E388,N389,Y391,T393,S408,S424,C425,S426,V427,M428,H429,E430,A431,L432,H433,N434,H435,Y436,T437,Q438,K439,和S440(EU编号)。
术语“全长抗体”指这样的抗体,所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构。全长抗体包含两条全长抗体轻链和两条全长抗体重链,所述全长抗体轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域,所述全长抗体重链包含重链可变结构域、第一恒定结构域、铰链区、第二恒定结构域和第三恒定结构域。全长抗体可以包含其他结构域,例如与全长抗体的一个条或多条链缀合的额外scFv或scFab。这些缀合物也由术语全长抗体涵盖。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞,包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”,这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代,而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同,反而可以含有突变。本文中包括突变子代,所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物活性。
术语“衍生自”指通过在至少一个位置引入改变而衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列。因此,衍生的氨基酸序列在至少一个相应位置(根据抗体Fc区的Kabat EU index)处与相应的亲本氨基酸序列不同。在一个实施方案中,衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至15个氨基酸残基。在一个实施方案中,衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至10个氨基酸残基。在一个实施方案中,衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至6个氨基酸残基。同样地,衍生的氨基酸序列与其亲本氨基酸序列具有高氨基酸序列同一性。在一个实施方案中,衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有80%或更大的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中,衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有90%或更大的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中,衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有95%或更大的氨基酸序列同一性。
术语“人Fc区多肽”指与“天然”或“野生型”人Fc区多肽相同的氨基酸序列。术语“变异(人)Fc区多肽”指因至少一个“氨基酸改变”而衍生自“天然”或“野生型”Fc区多肽的氨基酸序列。“人Fc区”由两条人Fc区多肽组成。“变异(人)Fc区”由两条Fc区多肽组成,因而二者均可以是变异(人)Fc区多肽或一个是人Fc区多肽并且另一个是变异(人)Fc区多肽。
在一个实施方案中,人Fc区多肽具有SEQ ID NO:05的人IgG1 Fc区多肽的氨基酸序列、或SEQ ID NO:06的人IgG2 Fc区多肽的氨基酸序列、或SEQ ID NO:07的人IgG3 Fc区多肽的氨基酸序列、或SEQ ID NO:08的人IgG4 Fc区多肽的氨基酸序列。在一个实施方案中,Fc区多肽衍生自SEQ ID NO:05、或06、或07、或08的Fc区多肽并且与SEQ ID NO:05、或06、或07、或08的Fc区多肽相比具有至少一个氨基酸突变。在一个实施方案中,Fc区多肽包含/具有从约1个至约10个氨基酸突变,并在一个实施方案中具有约1个至约5个氨基酸突变。在一个实施方案中,Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:05、或06、或07、或08具有至少约80%同源性。在一个实施方案中,Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:05、或06、或07、或08具有至少约90%同源性。在一个实施方案中,Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:05、或06、或07、或08具有至少约95%同源性。
从SEQ ID NO:05、或06、或07、或08的人Fc区多肽衍生的Fc区多肽由含有的氨基酸改变进一步限定。因此,例如,术语P329G指从相对于SEQ ID NO:05、或06、或07、或08的人Fc区多肽在氨基酸位置329具有脯氨酸至甘氨酸突变的人Fc区多肽衍生的Fc区多肽。
人IgG1 Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:05)。
人IgG1 Fc区衍生的具有突变L234A、L235A的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:09)。
人IgG1 Fc区衍生的具有Y349C、T366S、L368A和Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)。
人IgG1 Fc区衍生的具有S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:11)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:12)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:13)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P329G突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:14)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A突变和P329G突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:15)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P329G突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:16)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P329G突变和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:18)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A、P329G突变和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:19)。
人IgG4 Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:08)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P和L235E突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:20)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E突变和P329G突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:21)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:22)。
人IgG4 Fc区衍生的具有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:23)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:24)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:25)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P329G突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:26)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:27)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P329G和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:28)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:29)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E、P329G和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:30)。
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部,其中全部或基本上全部的HVR(例如,CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”例如,非人抗体,指已经历过人源化的抗体。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中,将抗体纯化至大于95%或99%纯度,如通过例如电泳(例如,SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如,大小排阻色谱或离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述,参见,例如,Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括在细胞内所含的核酸分子,所述细胞通常含有该核酸分子,但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体,即,构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位,除了可能的变体抗体之外(例如,含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现),这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反,单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此,修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得,并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如,可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体,所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“天然抗体”指具有不定结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端,每条重链具有一个可变区(VH),也称作可变重结构域或重链可变结构域,随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地,从N端至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),也称作可变轻链域或轻链可变结构域,随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一,称作κ(κ)和λ(λ)。
术语“药物制剂”指一种制备物,所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物学活性有效,并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用,术语“质粒”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的质粒以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的质粒。某些质粒能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类质粒在本文中称作“表达质粒”。
术语“正线性pH梯度”指在低(即更酸性)pH值开始并在较高(即酸性更小、中性或碱性)pH值结束的pH梯度。在一个实施方案中,正线性pH梯度始于pH值约5.5并止于pH值约8.8。
如本文所用,术语“重组抗体”指通过重组手段制备、表达、产生或分离的全部抗体(嵌合、人源化和人抗体)。这包括从宿主细胞如NS0、HEK、BHK或CHO细胞或从相对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体或使用转染至宿主细胞中的重组表达质粒所表达的抗体。此类重组抗体具有重排形式的可变区和恒定区。如本文中报道的重组抗体可以经历体内体细胞超变。因此,重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管源自人种系VH和VL序列并且与之相关,但可以不天然存在于体内人抗体种系库内部的序列。
“固相”指非流体物质并且包括由多种材料如聚合物、金属(顺磁性、铁磁性粒子)、玻璃和陶瓷制成的粒子(包括微粒子和珠);凝胶物质如二氧化硅、氧化铝和聚合物凝胶;可以由聚合物、金属、玻璃、和/或陶瓷构成的毛细管;沸石和其他多孔物质;电极;微量滴定板;固态条;和比色皿、管或其他谱仪样品容器。测定法的固相组分与惰性固体表面的区别在于,“固相支持物”在其表面上含有意在与分子发生化学相互作用的至少一种部分。固相可以是固定组分,如芯片、管、条、比色皿或微量滴定板,或可以是非固定组分,如珠和微粒子。微粒子也可以用作均相分析模式的固相支持物。可以使用允许与蛋白质和其他物质非共价或共价接合的多种微粒子。这类粒子包括聚合物粒子如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯);金粒子如金纳米粒子和金胶体;和陶瓷粒子如石英玻璃,和金属氧化物粒子。参见例如Martin,C.R.等人,Analytical Chemistry-News&Features,May 1(1998)322A-327A,所述文献通过引用方式并入本文。在一个实施方案中,固相支持物是琼脂糖凝胶。
如本申请中所用,术语“价态”指(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。就这一点而论,术语“双价”、“四价”和“六价”指(抗体)分子中分别存在2个结合位点、4个结合位点和6个结合位点。在一个优选的实施方案中,如本文中报道的双特异性抗体是“双价的”。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与使抗体结合其抗原的结构域。抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构,每种结构域包含四个构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见,例如Kindt,T.J.等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外,结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见,例如,Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887;Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。
术语“变体”、“修饰的抗体”和“修饰的融合多肽”指具有与亲本分子的氨基酸序列不同的氨基酸序列的分子。一般,这类分子具有一个或多个改变、插入或缺失。在一个实施方案中,修饰的抗体或修饰的融合多肽包含这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列包含Fc区的非天然存在的至少一部分。这类分子具有小于100%的与亲本抗体或亲本融合多肽序列的同一性。在一个实施方案中,变异抗体或变异融合多肽具有这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与亲本抗体或亲本融合多肽的氨基酸序列具有从约75%至小于100%、尤其从约80%至小于100%、尤其从约85%至小于100%、尤其从约90%至小于100%和尤其从约95%至小于100%的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中,亲本抗体或亲本融合多肽与变异抗体或变异融合多肽相差一个(单个)、两个或三个氨基酸残基。
II.如本文报告的方法
具有相同Fc区的抗体的清除率覆盖宽大范围。存在相应Fv区的影响,即生物物理特性区分快速清除的抗体与缓慢清除的抗体。
在不受这种理论约束的情况下假设,直接、电荷介导的Fv和FcRn相互作用损害抗体在pH 7.4从FcRn的释放。
现在已经发现,吞饮作用和FcRn结合作用评估的组合可以用来预测/更多精确地评价抗体的药代动力学。已经通过FcRn亲和色谱(pH梯度洗脱)和肝素亲和色谱(盐梯度洗脱)的组合实现这点。
在肝素亲和色谱柱上分离静脉用免疫球蛋白(IVIG,从汇集的人供体血清(>1000位供体)分离的IgG多克隆混合物),产生了覆盖宽大保留时间范围的几个宽峰。在FcRn柱上,相同材料显示狭窄洗脱峰,提示FcRn对其中所含抗体的结合亲和力相似(参见图4)。
肝素是高度带负电荷的糖胺聚糖(多糖)及覆盖内皮细胞的糖杯(glycocalix)的主要组分。
在FcRn野生型小鼠和FcRn敲除小鼠中测试了具有最高(图4:2)和最低(图4:1)肝素保留时间的级分。下表中显示观测的清除率:
清除率[mL/天/kg] | FcRn-野生型小鼠 | FcRn-敲除小鼠 |
IVIG肝素级分1 | 4 | 32 |
IVIG肝素级分2 | 5 | 76 |
在两种环境下均发现强肝素结合物的清除率较高,表明吞饮率较高。
在表达与内源mIgG相比对huIgG具有显著更高亲和力的鼠FcRn的小鼠模型中,FcRn再循环支配药代动力学(不受这种理论约束的情况下,与患者中的场景相比,内源性mIgG与注射的huIgG的竞争强烈地减弱)。在FcRn敲除小鼠中,FcRn再循环无助于药代动力学并且每个吞饮事件导致吞饮的IgG降解。因此,因而测定的清除率应当与注射的IgG样品的吞饮速率成正比,产生显著更明显的清除率。这些数据与肝素柱预测值充分相关,因而借助吞饮作用增加了肝素柱作为抗体药代动力学预测者的有效性的证据。
已经用如当前实例中报道的方法产生并分析以下35种具有不同样式和不同特异性的抗体:
具有野生型-Fc区的双价、单特异性IgG1抗体是这样的抗体,其包含两条抗体轻链(各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域)和两条抗体重链(各自包含重链可变结构域、铰链区和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3),因而Fc区是人IgG1 Fc区,因而Fc区C端氨基酸残基K或GK可以在两条抗体重链中彼此独立地存在或不存在。在一个实施方案中,人IgG1Fc区具有SEQ ID NO:05的氨基酸序列。
具有KiH-Fc区的双价、双特异性IgG1抗体是这样的抗体,其包含两条抗体轻链(各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域)和两条抗体重链(各自包含重链可变结构域、铰链区和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3),因而Fc区是人IgG1 Fc区,因而Fc区C端氨基酸残基K或GK可以在两条抗体重链中彼此独立地存在或不存在,因而重链之一包含扣突变并且相应的另一条重链包含结突变。在一个实施方案中,重链Fc区分别具有SEQ ID NO:09和10的氨基酸序列。
可以通过“结入扣(knob-into-hole)”技术改变双价双特异性抗体的重链Fc-区中的CH3结构域,所述技术以例如WO 96/027011、Ridgway J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617-621和Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中的几个例子详述。在这种方法中,改变两个CH3结构域的相互作用面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域的一者可以是“结”,而另一者是“扣”。二硫键的引入进一步稳定异二聚体(Merchant,A.M等人,Nature Biotech.16(1998)677-681;Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。
抗体重链的CH3结构域中的突变T366W称作“结突变”并且抗体重链的CH3结构域中的突变T366S、L368A、Y407V称作“扣突变”(根据Kabat EU索引编号)。也可以例如通过以下方式利用CH3结构域之间的额外链间二硫键(Merchant,A.M等人,Nature Biotech.16(1998)677-681):向具有“结突变”的重链的CH3结构域引入Y349C突变并且向具有“扣突变”的重链的CH3结构域引入E356C突变或S354C突变,或反之亦然。
具有KiH LALAPG-Fc区的双价、单特异性IgG1抗体细胞因子融合物是这样的抗体,其包含两条抗体轻链(各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域)和两条抗体重链(各自包含重链可变结构域、铰链区和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3),因而Fc区是人IgG1 Fc区,因而Fc区C端氨基酸残基K或GK可以在两条抗体重链中彼此独立地存在或不存在,因而重链之一包含扣突变并且相应的另一条重链包含结突变,因而两条重链还包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G。在一个实施方案中,重链Fc区分别具有SEQ ID NO:18和19的氨基酸序列。
具有KiH-Fc区的双价、双特异性CrossMab是这样的抗体,其包含
a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链,和与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链,其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换,或
b)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链,和与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链,其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换,
因而Fc区是人IgG1 Fc区,因而Fc区C端氨基酸残基K或GK可以在两条抗体重链中彼此独立地存在或不存在,因而重链之一包含扣突变并且相应的另一条重链包含结突变。在一个实施方案中,重链Fc区分别具有SEQ ID NO:09和10的氨基酸序列。
具有KiH-LALAPG-Fc区的2:1异二聚T细胞双特异性抗体是这样的抗体,其包含
a)与第一抗原特异性结合的第一Fab片段;
b)与第二抗原特异性结合的第二Fab片段,并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1相互替换;
c)与第一抗原特异性结合的第三Fab片段;和
d)由第一和第二重链Fc区组成的Fc区;
其中
(iii)a)下的第一Fab分子在Fab重链的C末端与b)下第二Fab分子的Fab重链的N末端融合,并且b)下的第二Fab分子和c)下的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端与d)下的重链Fc区之一的N末端融合,
因而Fc区是人IgG1 Fc区,因而Fc区C端氨基酸残基K或GK可以在两个抗体重链Fc区中彼此独立地存在或不存在,因而重链Fc区之一包含扣突变并且相应的另一个重链Fc区包含结突变,因而两个重链Fc区还包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G。在一个实施方案中,重链Fc区分别具有SEQ ID NO:18和19的氨基酸序列。
具有KiH-LALAPG-Fc区的三价、双特异性IgG1-Fab融合物包含
a)与第一抗原特异性结合(并包含二个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链,
b)与第二抗原特异性结合的抗体的一个附加Fab片段,其中所述附加Fab片段借助肽接头与a)的重链的之一的C末端融合,
其中在附加的Fab片段中,可变结构域VL和VH是相互替换,和/或恒定结构域CL和CH1相互替换,
因而Fc区是人IgG1 Fc区,因而Fc区C端氨基酸残基K或GK可以在两条抗体重链中彼此独立地存在或不存在,因而重链之一包含扣突变并且相应的另一条重链包含结突变,因而两条重链还包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G。在一个实施方案中,重链Fc区分别具有SEQ ID NO:18和19的氨基酸序列。
具有LALAPG-Fc区的Fc区-细胞因子融合物是这样的抗体Fc区融合物,其包含两个抗体重链Fc区片段(各自至少包含铰链区和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的片段),因而Fc区是人IgG1 Fc区,因而Fc区C端氨基酸残基K或GK可以在两个抗体重链Fc区片段中彼此独立地存在或不存在,因而两个抗体重链Fc区片段包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G。在一个实施方案中,重链Fc区具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
为了拉平日间、人员间和实验室间变异,已经将保留时间对每种亲和柱上的参考抗体归一化。
对于肝素亲和色谱柱,选择具有SEQ ID NO:01的重链和SEQ ID NO:02的轻链的抗pTau抗体。这种抗体在肝素亲和色谱柱上显示相对长的保留时间,产生稳健的相对保留时间计算。
对于FcRn亲和色谱柱,选择这样的制备物,其包含具有SEQ ID NO:03的重链和SEQID NO:04的轻链的抗Her3抗体的氧化型变体。选择这种抗体,因为它具有与Stracke,J.等人(mAbs 6(2014)1229-1242)中所用抗体可比的AUC分布。已经测定35种抗体在FcRn亲和色谱柱和肝素亲和色谱柱上的保留时间。此外,在食蟹猴中确定单剂量药代动力学。下表中展示结果(与前述相同的抗体序列)。
清除率排序如下:
快速:>12mL/kg/天;
界值:8-12mL/kg/天;
可接受的:2.5≤X<8mL/kg/天;
非常好的:<2.5mL/kg/天。
下表中显示,基于两种亲和力色谱的独自、孤立结果,已经淘汰括号内的抗体;基于药代动力学确定,列“清除率”中括号内的抗体本已淘汰。
下表中,基于各自柱上的相对保留时间,给出结果。括号内显示淘汰的抗体。
图2中显示保留时间和药代动力学行为的相关性。可以见到在两种亲和色谱柱上的相对保留时间和药代动力学行为之间存在迄今未知的相关性。已经发现,优势包含具有缓慢清除率的抗体的区域由FcRn亲和色谱柱上小于1.78的相对保留时间(以抗Her3抗体作为参考抗体)和肝素亲和色谱柱上小于0.87的相对保留时间(以抗pTau抗体作为参考抗体)界定。图3中显示与所标出阈值的各自相关性。
下表中,分别显示通过四种方法淘汰(括号内)的抗体:基于孤立的肝素亲和色谱(柱1)、基于孤立的FcRn亲和色谱(柱2)、基于SDPK清除率(柱3)和如本文报告的发明方法中基于两种正交亲和柱上的相关保留时间。
因此,采用本发明的方法,可以实现对全身循环半衰期长的抗体的选择改善、药代动力学预测的准确度改善和淘汰的尽管具有长的全身循环半衰期抗体的数目减少。
当使用从现有技术已知的基于杆状病毒的测定法时,仅正确预测约50%抗体。
因此,本发明的方法可以用来鉴定具有良好药代动力学特性的抗体,包括Fc区融合多肽,无需进行动物药代动力学研究。
因此,本发明包括一种选择适合作为治疗剂(在人类中)使用的(在食蟹猴中)具有全身清除率的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)任选地提供包含抗体的样品,
b)用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)
i)如果相对于FcRn亲和色谱柱上第一参考抗体的保留时间,FcRn亲和色谱柱上抗体的相对保留时间小于第一阈值,并且,
ii)如果肝素亲和色谱柱上抗体的保留时间对肝素亲和色谱柱上第二参考抗体的保留时间的比率小于第二阈值,
选择抗体。
本发明还包括一种选择合适作为治疗剂(在人类中)使用的(在食蟹猴中)具有全身清除率的与至少一种抗原(特异性)结合的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供处于不同样式的抗体,
b)采用a)的每种不同抗体样式,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)选择抗体样式,所述抗体样式具有
i)相对于FcRn亲和色谱柱上第一参考抗体的保留时间,小于第一阈值的FcRn亲和色谱柱上相对保留时间,并且
ii)小于第二阈值的肝素亲和色谱柱上保留时间对肝素亲和色谱柱上第二参考抗体的保留时间的比率。
本发明还包括一种选择合适作为治疗剂(在人类中)使用的(在食蟹猴中)具有全身清除率的与至少一种抗原(特异性)结合的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供至少两种与至少一种抗原结合的抗体,所述抗体
i)具有不同的CDR序列,或
ii)具有相同的CDR序列和不同的可变结构域序列,或
iii)具有处于不同样式的相同CDR序列,
b)采用a)的每种不同抗体,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)选择抗体,所述抗体具有
i)相对于FcRn亲和色谱柱上第一参考抗体的保留时间,FcRn亲和色谱柱上相对保留时间小于第一阈值,并且
ii)肝素亲和色谱柱上保留时间对肝素亲和色谱柱上第二参考抗体的保留时间的比率小于第二阈值。
在一个实施方案中,第一参考抗体是氧化型抗体制备物。在一个实施方案中,氧化型抗体制备物是包含抗体的制备物,所述抗体就重链CH2结构域中位置252处的甲硫氨酸残基而言处于非氧化形式、处于单氧化形式(仅位置252处两个甲硫氨酸之一氧化)和处于双氧化形式(位置252处两个甲硫氨酸均氧化)(根据Kabat编号)。在一个实施方案中,基于以下式计算相对保留时间
其中trel,i=抗体的相对保留时间;ti=抗体的保留时间。在一个实施方案中,第一参考抗体是具有以下重链和轻链的抗Her3抗体,所述重链具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列,所述轻链具有SEQ ID NO:04的氨基酸序列。在一个实施方案中,第一阈值是2。在一个实施方案中,第一阈值是1.8。在一个实施方案中,第一阈值是1.78。
在一个实施方案中,第二参考抗体是具有以下重链和轻链的抗pTau抗体,所述重链具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列,所述轻链具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。在一个实施方案中,第二阈值是1。在一个实施方案中,第二阈值是0.8。在一个实施方案中,第二阈值是0.78。
在一个实施方案中,食蟹猴中适于(人类中)治疗性应用(即抗体可以用作治疗剂)的全身清除率是8mL/kg/天或更小。在一个实施方案中,全身清除率小于8mL/kg/天。在一个实施方案中,全身清除率小于6mL/kg/天。
在一个实施方案中,用于选择在食蟹猴中具有小于8mL/kg/天的全身清除率的抗体的方法包括以下步骤:
a)任选地提供包含抗体的样品,
b)用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)
i)如果FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小,并且
ii)如果肝素亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小,
选择抗体。
在一个实施方案中,根据以下等式计算步骤c)i)中的相对保留时间:
基于根据图1的峰定义(trel,i:峰i的相对保留时间;ti:的保留时间峰i;t峰2:根据图1的部分氧化的抗Her3抗体的峰2的保留时间;t峰3:根据图1的抗Her3抗体的峰3的保留时间)。
在一个实施方案中,根据以下式计算步骤c)ii)中的相对保留时间:
(trel,i:峰i的相对保留时间;ti:峰i的保留时间;tpTau:抗pTau抗体峰的保留时间)。
在一个实施方案中,将新生Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的固定化非共价复合物作为亲和色谱配体用于采用阳性线性pH梯度的FcRn亲和色谱中,
其中新生Fc受体和β-2-微球蛋白的非共价复合物与色谱材料结合并且该非共价复合物经特异性结合对与固相缀合,
其中pH梯度是从第一pH值到第二pH值,其中第一pH值是pH 3.5至pH 6.4并且第二pH值是pH 7.4至pH 9.5,并且
其中新生Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是单生物素酰化的并且固相用链霉亲和素衍生化。
在一个实施方案中,pH梯度是从第一pH值到第二pH值,因而第一pH值是pH 5.5并且第二pH值是pH 8.8。
在一个实施方案中,抗体与两种抗原结合。
在一个实施方案中,该方法还包括步骤:
d)如果提供的抗体或抗体样式无一符合步骤c)的标准,则提供至少一个其他抗体样式或抗体并且重复步骤b)和c)。
在一个实施方案中,用FcRn亲和色谱柱进行FcRn亲和色谱,所述FcR亲和色谱柱包含与FcRnβ-2-微球蛋白复合物(3mg复合物/1ml琼脂糖凝胶)缀合的链霉亲和素琼脂糖凝胶并且具有约50mm的长度和约4.6mm的内径。在一个实施方案中,FcRn亲和色谱如下进行:i)将30μg样品施加到采用补充有140mM NaCl、调节至pH 5.5的20mM MES缓冲液平衡的FcRn亲和柱上;ii)用缓冲液以0.5mL/分钟的流速洗涤色谱柱10分钟,所述缓冲液包含(v/v)80%补充有140mM NaCl、调节至pH 5.5的20mM MES缓冲液和20%有140mM NaCl、调节至pH 8.8的20mM Tris/HCl;iii)用这样的线性梯度以0.5mL/分钟的流速洗脱并且测量保留时间用,所述线性梯度是从步骤ii)的缓冲液至包含(v/v)30%补充有140mM NaCl、调节至pH 5.5的20mM MES缓冲液和70%有140mM NaCl、调节至pH 8.8的20mM Tris/HCl的缓冲液。
在一个实施方案中,通过将抗Her3抗体在室温与0.02%过氧化氢溶液温育18小时,获得氧化型抗Her3抗体制备物。
在一个实施方案中,用肝素亲和色谱柱进行肝素亲和色谱,所述肝素亲和色谱柱包含与羟化甲基丙烯酸聚合物上的硫酸化糖胺聚糖缀合的肝素并且具有约50mm的长度和约5mm的内径。在一个实施方案中,肝素亲和色谱如下进行:i)施加低盐缓冲液(≤25mM离子强度)中的20至50μg蛋白质样品至肝素亲和色谱柱,所述肝素亲和色谱柱室温用调节至pH7.4的50mM TRIS缓冲液预平衡;ii)用补充有1000mM NaCl并调节至pH 7.4的0-100%50mMTRIS缓冲液的线性梯度历经32分钟以0.8mg/mL的流速洗脱。
在一个实施方案中,β-2-微球蛋白来自与FcRn相同的物种。
本中使用的FcRn亲和色谱柱包含基质和基质结合的色谱官能团,其中基质结合的色谱官能团包含新生Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物。
在本文的一个实施方案中,FcRn选自人FcRn、食蟹猴FcRn、小鼠FcRn、大鼠FcRn、羊FcRn、犬FcRn、猪FcRn、微型猪FcRn和兔FcRn。
在一个实施方案中,β-2-微球蛋白来自与FcRn相同的物种。
在一个实施方案中,β-2-微球蛋白来自与FcRn不同的物种。
在一个实施方案中,抗体选自全长抗体、CrossMab、2:1异二聚T细胞双特异性抗体、抗体-细胞因子融合多肽、Fc区-细胞因子融合多肽和抗体-Fab融合多肽。
在一个实施方案中,抗体包含Fc区,所述Fc区选自人IgG1 Fc区、具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1 Fc区、具有结入扣突变的人IgG1 Fc区及其组合。
在一个实施方案中,抗体样式选自全长抗体、CrossMab、2:1异二聚T细胞双特异性抗体和与一个、两个或三个附加Fab、scFv、scFab、CrossFab分子直接或借助肽接头融合的前述任一者。
在一个实施方案中,抗体样式包含Fc区,所述Fc区选自人IgG1 Fc区、具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1 Fc区、具有结入扣突变的人IgG1 Fc区及其组合。
在一个实施方案中,抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体。
在一个实施方案中,抗体是嵌合抗体。
通常,在哺乳动物细胞中将带C末端His-Avi Tag(SEQ ID NO:32)的FcRn(对于人FcRn,SEQ ID NO:31)的可溶性胞外结构域与β2-微球蛋白(对于人β-2-微球蛋白,SEQ IDNO:33)共表达。将非共价FcRn-微球蛋白复合物生物素酰化并且加载于链霉亲和素衍生化的琼脂糖凝胶上。
原则上,任何缓冲物质可以用于如本文中报道的方法中。
为了进一步阐明电荷与肝素/FcRn-结合作用及因而与药代动力学的关系,合成第5号抗体的变体,其覆盖抗体Fv中正常情况下所见的电荷和疏水性的生物物理空间。
携带正电荷块(positively charged patch)的变体显示预测快速清除的强烈肝素柱保留和FcRn柱保留(FcRn柱的相对保留为0.5和更大,并且肝素柱上的相对保留为0.8或更大)。
携带负电荷块(negatively charged patch)的变体显示预测缓慢清除的弱肝素柱保留和FcRn柱保留(FcRn柱的相对保留为0.25和更小,并且肝素柱上的相对保留为0.6或更小)。
当组合负电荷块和正电荷块时,所得的抗体变体如同其仅携带正电荷块那样行为。
对于野生型第5号抗体及其四个变体,测定FcRn敲除小鼠中的清除率(图5和图6)。在FcRn敲除小鼠中,与野生型第5号抗体相比,携带正电荷块的全部三个受检变体均显示极高清除率,与柱保留良好相关。在这个小鼠模型中,携带负电荷块的变体显示清除率显著降低,也与柱保留良好相关。
为了确定“不规则(patchiness)”对清除率的影响(即与均匀电荷分布相反,形成电荷块的表面电荷的浓度的影响),生成第5号抗体的五种变体,其中正电荷和负电荷的总数保持不变,同时Fab表面上的电荷分布从“均匀”递增性改变成“不规则”。
尽管,正电荷块和负电荷块均产生,但肝素柱保留随不规则增加而增加。这提示,与负电荷块相比,正电荷块的影响更大或甚至占优势,如上文已经所见。这些变体的计算pI几乎未改变,同时FcRn敲除小鼠中最不规则的变体的清除率显著高于具有最均匀电荷分布的那些变体(几乎加倍;图7)。这些数据提示,在不受这种理论约束的情况下,与作为药代动力学的相当宽泛和因此不良预测物的pI相比,“不规则”或进而正电荷块的影响决定清除率。
为了确定用pH依赖的带电荷的组氨酸替换永久带正电荷的氨基酸-赖氨酸和精氨酸的影响,生成了第5号抗体的变体,其中全部HC Fv带正电荷的氨基酸残基均替换为组氨酸(总计7个改变)。依据肝素柱和FcRn柱相对保留时间和体内药代动力学,将这种变体与野生型第5号抗体比较。
在不受这种理论约束的情况下,假定在血清里中性pH时,组氨酸的电荷大多是中性,因此减少与带负电荷的糖杯结合并随后降低吞饮速率。在酸性内体内部,组氨酸带有最多正电荷并因此有助于借助Fv-FcRn亲合力与FcRn结合。再循环的同时,将组氨酸突变的IgG带至细胞表面,在此,良好药代动力学需要与FcRn高效解离。现在暴露于血清的中性pH的组氨酸变得去质子化并因此削弱与FcRn的亲合力相互作用,允许改善向血清释放。
已经发现,组氨酸突变体显示肝素保留减少,而FcRn保留大多保持未改变(图8)。在不受这种理论约束的情况下,这反映pH依赖性。
在体内,与FcRn敲除小鼠中的野生型抗体相比,组氨酸突变体的清除率显著降低(图9和清除10)。
本发明还包括一种用于选择亲本抗体的变体抗体的方法,所述变体抗体(特异性)结合与亲本抗体相同的抗原,具有与亲本抗体的全身清除率不同的全身清除率并且基于其药代动力学特性,适合(在人类中)作为治疗剂,所述方法包括以下步骤:
a)提供亲本抗体的至少一个变体抗体,其中已经通过以下方式改变Fv片段中的电荷分布
i)将至少一个(永久)带负电荷的或不带电荷的氨基酸残基变成(永久)带正电荷的氨基酸残基,或
ii)将至少一个(永久)带正电荷的或不带电荷的氨基酸残基变成(永久)带负电荷的氨基酸残基,或
iii)将至少一个(永久)带电荷的氨基酸残基变成具有相反电荷的氨基酸残基,或
iv)将至少一个永久带电荷的氨基酸残基变成pH依赖的带电荷的氨基酸残基,或
v)i)至iv)的组合,
b)选择变体抗体,所述变体抗体具有与亲本抗体的全身清除率不同的全身清除率并且适合(在人类中)作为治疗剂。
在一个实施方案中,该方法包括以下额外步骤:
b)采用亲本抗体和至少一种变体抗体,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)选择变体抗体,所述变体抗体具有
i)小于(相同洗脱条件下)(相同)FcRn亲和色谱柱上亲本抗体的保留时间的FcRn亲和色谱柱上相对保留时间,或
i)小于(相同洗脱条件下)(相同)肝素亲和色谱柱上亲本抗体的保留时间的肝素亲和色谱柱上相对保留时间,或
iii)i)和ii)二者。
在一个实施方案中,该方法包括以下额外步骤:
b)采用亲本抗体和至少一种变体抗体,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)选择变体抗体,所述变体抗体具有
i)大于(相同洗脱条件下)(相同)FcRn亲和色谱柱上亲本抗体的保留时间的FcRn亲和色谱柱上相对保留时间,或
i)大于(相同洗脱条件下)(相同)肝素亲和色谱柱上亲本抗体的保留时间的肝素亲和色谱柱上相对保留时间,或
iii)i)和ii)二者。
在一个实施方案中,该方法包括以下额外步骤:
b)采用亲本抗体和至少一种变体抗体,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)选择变体抗体,所述变体抗体具有
i)小于或大于(相同洗脱条件下)(相同)FcRn亲和色谱柱上亲本抗体的保留时间的FcRn亲和色谱柱上相对保留时间,或
i)小于或大于(相同洗脱条件下)(相同)肝素亲和色谱柱上亲本抗体的保留时间的肝素亲和色谱柱上相对保留时间,或
iii)i)和ii)二者,其中在i)中,相对保留时间更小并且在ii)中,它更大,或反之亦然。
在一个实施方案中,变体抗体在其(溶剂暴露的)表面上具有至少一个附加的负电荷块。
本领域技术人员已知确定抗体的(溶剂暴露)表面上带电荷块的不同方法和工具。存在不同供应商或学术小组提供的工具。例如,本文中使用一种基于X射线结构或同源性模型的计算机计算方法,继以酸性氨基酸侧链和碱性氨基酸侧链的pH质子化及使用如软件套件Discovery Studio(供应商:Dassault系统)中执行的软件CHARMM和Delphi计算3D电荷分布。
在一个实施方案中,变体抗体在其(溶剂暴露的)表面上具有至少一个附加的正电荷块。
在一个实施方案中,变体抗体具有与亲本抗体相同的(表面)净电荷。
在一个实施方案中,(永久)带负电荷的氨基酸残基选自谷氨酸和天冬氨酸。
在一个实施方案中,(永久)带正电荷的氨基酸残基选自精氨酸和赖氨酸。
在一个实施方案中,pH依赖的带电荷的氨基酸残基是组氨酸。
在一个实施方案中,永久带电荷的氨基酸残基在pH 6至pH 8的pH范围内具有相同的(净)电荷。
在一个实施方案中,pH依赖的带电荷的氨基酸残基在pH 6具有第一(净)电荷并且在pH8具有相反的第二(净)电荷。
附图简述
图1计算FcRn柱上相对保留时间的峰定义。
图2FcRn相对保留对肝素柱相对保留作图。叉号:清除率>12mL/kg/天(“快速”);实心正方形:在8和12mL/kg/天之间的清除率(“边界”);实心圆圈:大于2.5mL/kg/天但小于8mL/kg/天的清除率;实心星号:2.5mL/kg/天或更小的清除率。
图3FcRn相对保留对肝素柱相对保留作图。叉号:清除率>12mL/kg/天(“快速”);实心正方形:在8和12mL/kg/天之间的清除率(“边界”);实心圆圈:大于2.5mL/kg/天但小于8mL/kg/天的清除率;实心星号:2.5mL/kg/天或更小的清除率;垂线标记治疗上适宜清除率的保留时间范围(左下象限,FcRn<1.78;肝素:<0.87)。
图4IVIG(静脉用免疫球蛋白)的FcRn相对保留对肝素柱相对保留作图。2:具有最高肝素结合作用的级分;1:具有最低肝素结合作用的级分。
图5第5号抗体及其变体的FcRn相对保留对肝素柱相对保留作图。1:野生型抗体;20:负电荷不规则(patched)的HC变体;27:正电荷不规则的HC变体;112:正电荷不规则的LC变体;183:正电荷不规则的HC变体。
图6FcRn敲除小鼠中第5号抗体及其变体的清除率。1:野生型抗体;20:负电荷不规则的HC变体;27:正电荷不规则的HC变体;112:正电荷不规则的LC变体;183:正电荷不规则的HC变体。
图7FcRn敲除小鼠中第5号抗体的无不规则(non-patchy)和不规则(patchy)变体的时间依赖性血清浓度。
图8第5号抗体及其组氨酸变体的FcRn相对保留对肝素柱相对保留作图。
图9FcRn敲除小鼠中第5号抗体和其HC组氨酸变体的时间依赖性血清浓度。
图10FcRn敲除小鼠中第5号抗体和其HC组氨酸变体的清除率。
提供以下实施例、附图和序列以辅助理解本发明,本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解,可以对所述方法作修改而不脱离本发明的精神。
材料和方法
抗体
实验中所用的参考抗体是具有SEQ ID NO:01的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:02的轻链氨基酸序列的抗pTau抗体和具有SEQ ID NO:03的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:04的轻链氨基酸序列的抗Her3抗体。
在Geneart(Life technologies GmbH,Carlsbad,CA,USA)产生合成性基因。
本文所用的单克隆抗体在HEK293细胞中瞬时表达(参见下文)和使用标准程序通过蛋白A色谱进行纯化(参见下文)。
生物化学表征包括大小排阻色谱(Waters BioSuiteTM 250 7.8x 300mm,洗脱:200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 7.0)和使用BioAnalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Clara,CA,美国)分析分子量分布。
表达质粒
为了表达上述的抗体,使用了基于采用或不采用CMV-内含子A启动子的cDNA组织化或基于采用CMV启动子的基因组组织化的表达质粒变体以瞬时表达(例如在HEK293-F细胞中)。
除了抗体表达盒之外,质粒还含有:
-允许该质粒在大肠杆菌中复制的复制起点,
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因,和
-作为真核细胞中选择标记的来自小家鼠(Mus musculus)的二氢叶酸还原酶基因。
抗体基因的转录单位由以下元件组成:
-在5'末端的一个或多个独特限制性位点
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子,
-在cDNA组织化的情况下后续内含子A序列,
-人抗体基因的5'非翻译区,
-免疫球蛋白重链信号序列,
-作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组织化的基因组组织化的人抗体链
-具有多聚腺苷化信号序列的3’非翻译区,和
-在3'末端的独特限制性位点
包含抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成法生成并通过连接相应的核酸区段,例如利用相应质粒中的独特限制性位点连接,通过已知的重组方法和技术装配。通过DNA测序验证亚克隆核酸序列。为了瞬时转染,从转化的大肠杆菌培养物(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)制备质粒,制得较大量的质粒。
细胞培养物技术
使用如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编著),John Wiley&Sons,Inc.中所述的标准细胞培养物技术。
HEK293-F系统中的瞬时转染
使用HEK293-F系统(Invitrogen),根据制造商的说明书,通过用相应质粒(例如编码重链以及相应轻链的质粒)瞬时转染,产生抗体。简而言之,将摇瓶中或搅拌式发酵器中无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)内以悬浮方式生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)用相应表达质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染。对于2L摇瓶(Corning),将HEK293-F细胞以密度1*106个细胞/mL接种在600mL中并且以120转/分钟,8%CO2温育。该日之后,将约1.5*106个细胞/mL细胞密度的细胞用大约42mL以下的混合物转染:A)20mL Opti-MEM(Invitrogen),其具有600μg以等摩尔比率分别编码重链及相应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)以及B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μL/mL)。在发酵过程期间根据葡萄糖消耗量,添加葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌型抗体的上清液并且将抗体直接从上清液纯化或将上清液冷冻并存储。因此已经产生以下抗体:
纯化
通过使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare,瑞典)的亲和色谱、使用丁基-琼脂糖凝胶(GE Healthcare,瑞典)的疏水相互作用色谱和Superde x 200大小排阻(GEHealthcare,瑞典)色谱,从细胞培养上清液纯化抗体。
简而言之,在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂上捕获无菌过滤的细胞培养上清液,用平衡缓冲液洗涤并且用25mM pH 3.0柠檬酸钠洗脱。将洗脱的抗体级分汇集并用2M Tris,pH 9.0中和。通过添加1.6M硫酸铵溶液至终浓度0.8M硫酸铵并使用乙酸调节pH至pH 5.0,将抗体汇集物制备好用于疏水相互作用色谱。用35mM乙酸钠,0.8M硫酸铵,pH 5.0平衡丁基-琼脂糖凝胶树脂后,将抗体施加至树脂,用平衡缓冲液洗涤并且用线性梯度洗脱至35mM乙酸钠pH 5.0。将含有抗体的级分汇集并且使用以20mM组氨酸,140mM NaCl,pH 6.0平衡的Superde x 200 26/60GL(GE Healthcare,瑞典)柱,进一步通过大小排阻色谱纯化。将含有抗体的级分汇集,使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim Biotech S.A.,法国)浓缩至要求的浓度并贮存在-80℃。
每种纯化步骤后使用微流体Labchip技术(Caliper Life Science,美国)通过CE-SDS分析纯度和抗体完整性。根据制造商的说明,使用HT蛋白质表达试剂盒,制备5μl用于CE-SDS分析的蛋白质溶液,并使用HT蛋白质表达芯片,在LabChip GXII系统上分析。使用LabChip GX软件分析数据。
小鼠
将小鼠FcRnα-链基因缺陷、但是对人FcRnα-链基因为半合子转基因的B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)276Dcr小鼠(muFcRn-/-huFcRn tg+/-,品系276)用于药代动力学研究。小鼠饲养在无特定病原体条件下实施。小鼠从Jackson实验室(Bar Harbor,ME,美国)(雌性,年龄4-10周,在给药时体重17-22g)获得。全部动物实验均由德国上巴伐利亚政府(许可编号55.2-1-54-2532.2-28-10)批准并根据欧洲联盟实验动物护理与使用规范在AAALAC认证的动物设施中开展。动物圈养在标准笼舍中并且在整个研究期间自由摄食和饮水。
药代动力学研究
将单次剂量的抗体经由外侧尾静脉以剂量水平10mg/kg进行静脉内注射。将小鼠分成3各组,每组6只小鼠,以涵盖总计9个血清采集时间点(在给药后0.08、2、8、24、48、168、336、504和672小时)。每只小鼠接受2次眶后出血,在IsofluraneTM(CP-Pharma GmbH,Burgdorf,德国)轻度麻醉下进行;在安乐死时采集第三份血液样品。采集血液至中血清管(Microvette 500Z-Gel,Sarstedt,Nümbrecht,德国)。在2小时温育后,将样品以9,300g离心3分钟以获得血清。在离心后,血清样品冷冻贮藏在-20℃直至分析。
人抗体血清浓度的测定
通过特异性酶联免疫测定法测定鼠血清中优特克单抗(Ustekinumab)、布雷奴单抗(Briakinumab)、mAb 8和mAb 9的浓度。对抗体特异的生物素酰化白介素12和洋地黄甙标记的抗人-Fc小鼠单克隆抗体(Roche Diagnostics,彭茨贝格,德国)分别用于捕获和检测。链霉亲和素包被的微量滴定板(Roche Diagnostics,彭茨贝格,德国)用分析缓冲液(RocheDiagnostics,彭茨贝格,德国)中稀释的生物素酰化的捕获抗体包被1小时。洗涤后,以各种稀释度添加血清样品,随后是另一个温育步骤1小时。在反复洗涤后,通过后续与检测抗体温育,随后与缀合于辣根过氧化物酶(HRP;Roche Diagnostics,彭茨贝格,德国)的抗洋地黄甙抗体温育,检测结合的人抗体。使用ABTS(2,2'联氮-双[3-乙基苯并噻唑啉磺酸];Roche Diagnostics,德国)作为HRP底物以形成有色反应产物。使用Tecan sunrise平板读数仪(瑞士),采用490nm处的参考波长,在405nm读取所产生的反应产物的吸光度。
将全部血清样品、阳性对照样品和阴性对照样品一式两份分析并且针对提供的参考标准校准。
药代动力学(PK)分析
使用WinNonlinTM1.1.1(Pharsight,CA,美国),通过非房室分析计算药代动力学参数。
简而言之,因抗体的非线性减少而通过对数梯形法计算曲线下面积(AUC0-inf)值并且使用表观终末速率常数λz,将所述值外推至无限,从最后时间点处的观测浓度外推。
将血浆清除率计算为剂量速率(D)除以AUC0-inf。从等式T1/2=ln2/λz推算表观终末半衰期(T1/2)。
实施例1
FcRn亲和柱的制备
在HEK293细胞中表达FcRn
通过用含有FcRn和β-2-微球蛋白的编码性序列的两种质粒转染HEK293细胞,瞬时表达FcRn。转染的细胞在摇瓶中在36.5℃,120转/分钟(振荡器幅度5cm),80%湿度和7%CO2培养。每2-3天将细胞稀释至密度3至4*105个细胞/ml。
对于瞬时表达,以培养物体积8升在36.5℃,pH 7.0±0.2,pO2 35%(以N2和空气通气,气体总流速200ml min-1)和搅拌器速度100-400转/分钟启用14l不锈钢生物反应器。当细胞密度达到20*105个细胞/ml时,10mg质粒DNA(等摩尔量的两种质粒)稀释于400mlOpti-MEM(Invitrogen)中。将20ml 293fectin(Invitrogen)添加至这种混合物,随后所述混合物在室温温育15分钟并随后转移至发酵器中。从次日起,向细胞以连续模式供应养分:饲养溶液以500ml/日的速率添加并根据需要添加葡萄糖以维持高于2g/l的水平。转染后7天使用带1l吊篮的吊篮离心机(swing head centrifuge)以4000转/分钟持续90分钟收获上清液。通过Sartobran P滤器(0.45μm+0.2μm,Sartorius)净化上清液(13L)并从中纯化FcRnβ-2-微球蛋白复合物。
新生Fc受体的生物素酰化
将3mg FcRnβ-2-微球蛋白复合物溶解/稀释于含有150mM氯化钠的5.3mL 20mM磷酸二氢钠缓冲液中并添加至250μl PBS和1片完整蛋白酶抑制剂(完整ULTRA片,RocheDiagnostics GmbH)。使用来自Avidity的生物素酰化试剂盒根据制造商说明书(BulkBIRA,Avidity LLC),使FcRn生物素酰化。生物素酰化反应在室温过夜进行。
将生物素酰化的FcRn在4℃对包含140mM NaCl的pH 5.5(缓冲液A)的20mM MES缓冲液透析过夜以移除过量的生物素。
偶联于链霉亲和素琼脂糖凝胶
为了偶联至链霉亲和素琼脂糖凝胶,将1mL链霉亲和素琼脂糖凝胶(GEHealthcare,英国)添加至生物素酰化和透析的FcRnβ-2-微球蛋白复合物并在4℃温育过夜。将FcRnβ-2-微球蛋白复合物衍生化的琼脂糖凝胶填充入4.6mm x 50mm色谱柱(Repligen)。该柱储存在80%缓冲液A和20%缓冲液B(20mM三(羟甲基)氨基甲烷pH 8.8,140mM NaCl)中。
实施例2
使用FcRn亲和柱和pH梯度的色谱
条件:
柱尺度:50mm x 4.6mm
载量:30μg样品
缓冲液A:20mM MES,含140mM NaCl,调节至pH 5.5
缓冲液B:20mM Tris/HCl,含140mM NaCl,调节至pH 8.8
将30μg样品施加到缓冲液A平衡的FcRn亲和柱上。在20%缓冲液B中流速0.5mL/分钟的一个10分钟洗涤步骤后,用从20%至70%缓冲液B的线性梯度历经70分钟进行洗脱。波长280nm处的紫外线吸收用于检测。在每次运行后,使用20%缓冲液B使柱再生10分钟。
为了计算相对保留时间,将根据(Bertoletti-Ciarlet,A.等人,Mol.Immunol.46(2009)1878-1882)用0.02%过氧化氢氧化18小时的标准样品(抗Her3抗体(SEQ ID NO:03和04)在系列的开始时和每10次样品注射后运行。
简而言之,将10mM磷酸钠pH 7.0中的抗体(9mg/mL)与H2O2混合至终浓度0.02%并且在室温温育18小时。为猝灭反应,将样品彻底透析入预冷却的10mM乙酸钠缓冲液pH5.0。
根据以下等式计算相对保留时间:
关于峰定义,参见图1。
实施例3
使用肝素亲和柱和pH梯度的色谱
条件:
柱尺度:50mm x 5.0mm
载量:20-50μg样品
缓冲液A:50mM TRIS pH 7.4
缓冲液B:50mM TRIS pH 7.4,1000mM NaCl
将低盐缓冲液(≤25mM离子强度)中的20至50μg蛋白质样品施加至在室温经缓冲液A预平衡的TSK凝胶肝素-5PW玻璃柱,5.0x 50mm(Tosoh Bioscience,东京/日本)。以流速0.8mg/mL,用0-100%缓冲液B的线性梯度历经32分钟进行洗脱。波长280nm处的紫外线吸收用于检测。每个上样序列始于用来根据以下式计算相对保留时间的保留时间标准品(抗pTau抗体):
(trel,i:峰i的相对保留时间;ti:峰i的保留时间;tpTau:抗pTau抗体峰的保留时间)。
实施例4
食蟹猴SDPK研究
在食蟹猴中按0.3mg/kg至150mg/kg的剂量水平单次静脉内施用后,测定供试化合物的药代动力学。历经几周从猴采集系列血液样品并且从采集的血液样品制备血清/血浆。通过ELISA测定供试化合物的血清/血浆水平。在线性药代动力学的情况下,通过标准非房室方法测定药代动力学参数。根据以下式计算清除率:
清除率=剂量/浓度-时间曲线下面积
在非线性药代动力学的情况下,借助以下备选方法测定清除率的线性比率:按照实际上使额外非线性清除路径饱和的高剂量水平静脉内施用后,估计任一个清除率值。备选地,建立了包含线性和非线性、可饱和清除术语的PK模型。在这些情况下,模型确定的线性清除比率用于相关性。
结果:
Claims (11)
1.一种用于产生抗体的方法,包括以下步骤:
a)培育表达抗体的哺乳动物细胞,并且
c)从细胞或培养基回收抗体,
其中已经选择抗体(选自多种抗体和/或抗体样式),以具有i)比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小的FcRn亲和色谱柱上相对保留时间,和ii)比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小的肝素亲和色谱柱上相对保留时间。
2.用于选择在食蟹猴中具有8mL/kg/天的全身清除率的抗体的方法,包括以下步骤:
a)在FcRn亲和色谱柱用阳性线性pH梯度并在肝素亲和色谱柱上用阳性线性电导率/盐梯度测量抗体的保留时间,并且
b)
i)如果FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小,并且
ii)如果肝素亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小,
选择抗体。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中抗体选自全长抗体、CrossMab、2:1异二聚T细胞双特异性抗体、抗体-细胞因子融合多肽、Fc区-细胞因子融合多肽和抗体-Fab融合多肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中抗体包含Fc区,所述Fc区选自人IgG1Fc区、具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1 Fc区、具有结入扣突变的人IgG1Fc区及其组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中新生Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的固定化非共价复合物作为亲和色谱配体用于采用阳性线性pH梯度的FcRn亲和色谱中,
其中新生Fc受体和β-2-微球蛋白的非共价复合物与色谱材料结合并且该非共价复合物经特异性结合对与固相缀合,
其中pH梯度是从第一pH值到第二pH值,其中第一pH值是pH 3.5至pH 6.4并且第二pH值是pH 7.4至pH 9.5,并且
其中新生Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是单生物素酰化的并且固相用链霉亲和素衍生化。
6.根据权利要求5所述的方法,其中pH梯度是从第一pH值到第二pH值,因而第一pH值是pH 5.5并且第二pH值是pH 8.8。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中根据以下等式计算FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间:
基于根据图1的峰定义(trel,i:峰i的相对保留时间;ti:峰i的保留时间;t峰2:根据图1的部分氧化的抗Her3抗体的峰2的保留时间;t峰3:根据图1的抗Her3抗体的峰3的保留时间)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中根据以下式计算肝素亲和色谱柱上的相对保留时间:
(trel,i:峰i的相对保留时间;ti:峰i的保留时间;tpTau:抗pTau抗体峰的保留时间)。
9.用于选择合适作为治疗剂使用的具有全身清除率的与至少一种抗原结合的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供处于不同样式的抗体,所述样式选自
i)全长抗体、CrossMab、2:1异二聚T细胞双特异性抗体和与一个、两个或三个附加Fab、scFv、scFab、CrossFab分子直接或借助肽接头融合的前述任一者,和/或
ii)人IgG1 Fc区、具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1 Fc区、具有结入扣突变的人IgG1 Fc区,及其组合。
b)采用a)的每种不同抗体样式,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)
i)如果FcRn亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:03和04的氧化型抗Her3抗体制备物的峰2和峰3之间的保留时间差异的1.78倍小,并且
ii)如果肝素亲和色谱柱上的相对保留时间比SEQ ID NO:01和02的抗pTau抗体的保留时间的0.87倍小,
选择抗体样式。
10.用于选择合适作为治疗剂使用的具有全身清除率的与至少一种抗原结合的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供至少两种与至少一种抗原结合的抗体,所述抗体
i)具有不同的CDR序列,或
ii)具有相同的CDR序列和不同的可变结构域序列,或
iii)具有处于不同样式的相同CDR序列,
b)采用a)的每种不同抗体,用阳性线性pH梯度进行FcRn亲和色谱并用阳性线性电导率/盐梯度进行肝素亲和色谱,并且
c)选择抗体,所述抗体具有
i)相对于FcRn亲和色谱柱上第一参考抗体的保留时间,FcRn亲和色谱柱上相对保留时间小于第一阈值,并且
ii)肝素亲和色谱柱上保留时间对肝素亲和色谱柱上第二参考抗体的保留时间的比率小于第二阈值。
11.根据权利要求书9至10中任一项所述的方法,还包括以下步骤:
d)如果提供的抗体或抗体样式无一符合步骤c)的标准,则提供至少一个其他抗体样式或抗体并且重复步骤b)和c)。
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