CN110573166A - 用于癌症治疗的吉西他滨衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种药物组合物，包含化疗药物吉西他滨(GEM)及其特定的衍生物，一种牛磺胆酸(TCA)制剂，以及一种组氨酸‑赖氨酸多聚物(HKP)共轭物，用于增强RNAi治疗肿瘤的效果。

Description

用于癌症治疗的吉西他滨衍生物
相关专利申请的交叉引用
本申请旨在获得美国专利申请号62/473441的权益和优先权，该专利申请日期为2017年3月19日，其全文以引用方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及基于吉西他滨的化合物、组合物和制剂，以及它们单独或与RNA干扰(RNAi化合物)联合治疗癌症。
发明背景
胰腺癌临床需求未满足，急需新药
胰腺癌侵袭能力强、扩散早，对几乎现有的所有化疗药物和放疗都有耐药性，是预后最差的恶性肿瘤之一(1)。过去几年，采用吉西他滨(2’,2’-双氟脱氧胞苷)改善了胰腺癌病人的临床症状，轻微延长了总生存时间。因此，吉西他滨成为目前治疗胰腺癌的一线选择(2)。然而，对吉西他滨的化学抗性增加，这成为临床治疗胰腺癌失败的主要原因。抗性增加很可能是对凋亡的抗性所致(3)，因此，可诱导凋亡和增强对吉西他滨敏感性的新治疗策略，是目前这一疾病所急需的。
siRNA治疗癌症
RNA干扰(RNAi)是一个内源性的基因抑制过程，为抑制理论上任何基因的表达提供了一种强大的手段。RNAi已经成为广泛接受的细胞培养功能基因组学和动物疾病模型研究的工具，并在治疗领域显示巨大的应用前景。基于对TGF-β1、COX-2、mTOR、EGFR和RAF1在胰腺癌发生和发展中关键作用的深入了解，我们考虑采用RNA干扰(RNAi)作为治疗胰腺癌的新方法。采用小干扰RNA(siRNA)药物的一大优势减少蛋白水平可以扩大抑制作用，因而其对靶标的抑制效果非常强。另外一大优势是可以更有效地评估对信号通路不同成员的效果，从而快速选择最有效的靶标。
miRNA治疗肿瘤
microRNA(miRNA)是一种18-24个核苷酸长度的非编码RNA，其基本功能是调节编码mRNA转录本的翻译。miRNA对细胞转录体的生理学调控在发育和成熟组织动态平衡过程中起到关键作用。人体癌症发生后，miRNA表达普遍出现异常，与相应的正常组织相比，其表达可能升高或降低(4,5)。癌症miRNA表达异常的原因是多方面的，包括基因组改变(扩增或缺失)、表观遗传学机制、或转录因子调控变化(5,6)。许多异常miRNA的编码mRNA靶标已经得到充分阐述，包括其蛋白产物负责调控细胞生长、细胞死亡和癌症细胞扩散机制有关的转录本。
miRNA分子的一种——miR-132，被认为可以通过下调Ras的分子刹车——p120RasGAP而促进病理性血管生成。采用合成的拮抗寡核酸靶向miR-132可以在多个肿瘤模型中降低血管生成和肿瘤负担。近期一项研究表明miR-132在胰腺癌中表达升高，其靶标是视网膜母细胞瘤抑制子(3)。另一种miRNA，miR-155在胰腺癌中表达同样升高，而且与存活率下降有关(4)。miR-155可作为胰腺癌早期发生的标志物，并值得进一步评估是否可以作为胰腺癌的诊断标志物(5)。miR-155的功能与阻断p53介导的肿瘤抑制相关(6)，也参与其他肿瘤类型的促肿瘤活性(7,8)。近期，我们采用组氨酸-赖氨酸多聚物(HKP)包裹修饰的RNA寡聚物antagomir-132和antagomir-155，形成纳米颗粒后，测定这一双靶标抑制剂在病毒诱导的疱疹性间质角膜炎小鼠模型中的效果(10)。在所有治疗的小鼠中都观察到了这一靶向miR-132和miR-155的双靶标方法显著的抗血管生成作用。
开发寡聚核苷酸治疗依赖于诸如antagomir这类活性药物中间体的有效导入。我们继续检测HKP系统导入antagomir-132/155双靶标在人BxPC-3或Panc-1胰腺癌异种移植瘤模小鼠型中的效果(11-14)。
化疗药物和RNAi导入系统
许多化学治疗方法被用于治疗胰腺癌等癌症，但这种化疗耐药性和化药毒性却限制了治疗效果。本发明结合了RNAi治疗和已经在临床上得到应用的药物——吉西他滨的优势，使用吉西他滨衍生物来导入siRNA或miRNA。
吉西他滨(2’,2’-双氟脱氧胞苷)是一种具有抗肿瘤活性的核苷类似物。吉西他滨表现出细胞分裂周期阶段的特异性，主要杀死进行DNA合成(S-阶段)的细胞，阻断细胞通过G1/S期的界线。吉西他滨通过核苷激酶在细胞内代谢为活性二磷酸(dFdCDP)和三磷酸(dFdCTP)核苷。吉西他滨的细胞毒性作用归因于二磷酸和三磷酸核苷两种作用的结合，从而抑制DNA合成。吉西他滨二磷酸抑制核糖核苷酸还原酶，它负责催化生成脱氧核苷三磷酸用于DNA合成的反应。首先，二磷酸吉西他滨可抑制核糖核苷酸还原酶，而该酶催化DNA合成过程中生成三磷酸脱氢核苷的化学反应，从而导致脱氢核苷酸(包括dCTP)的浓度降低。接着，三磷酸吉西他滨可与dCTP竞争性地结合到DNA上。此时，细胞中dCTP浓度降低(二磷酸吉西他滨的作用)，从而促进三磷酸吉西他滨(通过自增强效应)整合到DNA中。吉西他滨核苷酸并入DNA后，只有一个额外的核苷酸被添加到正在复制的DNA链中。这种添加会抑制进一步的DNA合成。DNA聚合酶ε(POLε)不能去除吉西他滨核苷酸并修复复制的DNA链(被遮罩的DNA链终止)。在CEM T淋巴细胞样细胞中，吉西他滨诱导细胞间体DNA断裂，是程序性细胞死亡的特征之一。
吉西他滨首先在美国专利4808614中得到描述，作为抗病毒化合物在此全文引用整合到本发明中。吉西他滨的抗肿瘤性质随后在美国专利5464826中进行了整体描述，在此也做全文引用。以引用方式并入本文中的美国专利4808614和5464826的对制剂说明的规定，所述化合物是可以不经肠给药，优选采用水溶液复溶的干燥粉末。目前，吉西他滨作为冻干的肠外注射物销售，然后由实验人员在注射或输注给药之前用水复溶。
术语“吉西他滨”将在本文中指吉西他滨游离碱及某些吉西他滨衍生物，这些衍生物的化学结构与轻微的改性有关，具有相同的前药性质。
美国食品药品监督管理局(FDA)于1996年首次批准盐酸吉西他滨作为一种可注射制剂在美国销售，商品名mzar@(礼来制药，印第安纳波利斯，印第安纳)。临床制剂以无菌形式提供，仅供静脉使用。GEMzar@小瓶含有200mg或1g盐酸吉西他滨(以游离碱表示)，由甘露醇(分别为200mg或1g)和乙酸钠(分别为12.5mg或62.5mg)配制成无菌冻干粉末。可以添加盐酸和/或氢氧化钠以调整pH值。
吉西他滨与顺铂体外呈剂量依赖性协同作用，顺铂对吉西他滨三磷酸积累和DNA双链断裂无影响。在体内，吉西他滨联合顺铂对LX-1和CALU-6人肺异种移植瘤有抗肿瘤活性，但对NCI-H460或NCI-H520异种移植瘤的活性很低。吉西他滨与顺铂在小鼠的Lewis肺异种移植瘤中具有协同作用。在给予顺铂治疗前4小时用吉西他滨处理可产生最大的相互作用。
GEMzar@与顺铂联合用于局部晚期(ⅢA或ⅢB期)或转移性(Ⅳ期)NSCLC患者的一线治疗。GEMzar@也可作为局部晚期(不可切除的Ⅱ期或Ⅲ期)或转移性胰腺癌(Ⅳ期)患者的一线治疗。然而，吉西他滨的毒性限制了可以给予患者服用的剂量。盐酸吉西他滨的患者半衰期也很短(短输注的半衰期从32到94分钟不等)。半衰期和分布量取决于年龄、性别和输液持续时间。此外，吉西他滨治疗过细胞产生的多药耐药性的发展可能会限制其有效性。因此，需要足够的吉西他滨制剂来延长吉西他滨的半衰期，并最大限度地提高其疗效，治疗细胞的多药耐药性降到最低，限制其毒性。
图表简要说明
图1.使用抗癌药物作为RNAi治疗性导入载体的概念的方案说明。吉西他滨(GEM)与组氨酸赖氨酸多聚物(HKP)化学结合形成新的化学实体GEM-HKP。本发明的GEM-HKP可与针对肿瘤靶基因的特异性siRNA形成纳米制剂导入肿瘤部位。这种采用吉西他滨和具有肿瘤基因抑制活性的siRNA的双抗癌活性，代表一种新的癌症治疗方法。
图2. 25个核苷酸和21和核苷酸长度的siRNA的沉默能力比较。首先，从针对每个基因的6个序列中选择最有效的25个核苷酸长度和21个核苷酸长度的siRNA。采用两种表达VEGF蛋白(DLD-1，结肠癌和MBA-MD-435，乳腺癌)的肿瘤细胞系进行比较，采用Lipo2000(Invitrogen，CA)进行体外转染后开展RT-PCR分析。在0.3μg或2.0μg剂量下，25个核苷酸长度的siRNA比21个核苷酸长度的siRNA表现出更强的抑制活性，尤其是在2.0μg剂量下。
图3.选择靶向mTOR的有效的siRNA。(A)图片下部标出选择的8个25个核苷酸长度的siRNA与对照siRNA转染人MDA-MB-231细胞和小鼠CT26细胞的情况。24小时后，收集mRNA，用标准对照基因靶标Rigs 15作为内参进行Q-RT-PCR分析。在完成人MDA-MB-231细胞和小鼠CT26细胞转染实验后，用Q-RT-PCR筛选出有效的mTOR-siRNA。
图4.antagomir-132纳米颗粒对小鼠眼组织中的miR-132的敲除作用。(A)antagomir-132治疗方案导致角膜中的miR-132敲低(N＝6只小鼠/组)。采用单因素方差分析结合Bonferroni事后检验计算显著性水平。P≤0.05(*)。收集6只小鼠的角膜，用QPCR或WB进行分析。(B)给予HSV感染小鼠模型结膜下注射antagomir-132和打乱的对照序列，对不同组角膜的RasGAP mRNA进行定量分析(n＝6只/组)。显著性水平通过t检验(未配对)确定。***P≤0.001。
图5.双靶向拮抗剂132/155可观察到有效的抗血管生成活性。WT小鼠和miR-155基因敲除(KO)小鼠单眼感染HSV-1-RE。感染后第12天和第15天，用血管生成评分测量抗血管生成效果。双靶向拮抗剂132/155在感染后第15天表现出最强的活性，其显著性水平通过t检验(未配对)确定。p≤0.001(***)；p≤0.01(**)；p≤0.05(*)。误差棒代表平均值±标准误(SE)。这些实验重复两次。
图6.吉西他滨与牛磺胆酸结合的化学结构示意图。吉西他滨和牛磺胆酸的化学结构，可配制成GEM-TCA，这一剂型具有抗癌药物和RNAi运载工具的双重功能。
图7.GEMzari⑧与GEM-TCA细胞毒性比较。将1×103的Hela细胞接种在96孔板的孔上，接种体积为150μl的EMEM/10％的FBS。第二天，用同样的培养基将GEMZAR@或GEM-TCA稀释成0.1nM-100uM的浓度。在处理细胞72小时后，用细胞效价Glo发光细胞活力测定法(Promega)评估细胞毒性。未经处理的细胞(空白)的值设置为100％。所有值代表每个浓度四个重复的平均值±标准差(SD)。
图8.GEMzari⑧与GEM-TCA细胞毒性比较。将2×103的Panc-1和HepG2细胞接种在96孔板的孔上，接种体积为150μl的EMEM/10％的FBS。第二天，用同样的培养基将GEMZAR@或GEM-TCA稀释成0.1nM-100uM的浓度。在处理细胞72小时后，用细胞效价Glo发光细胞活力测定法(Promega)评估细胞毒性。未经处理的细胞(空白)的值设置为100％。所有值代表每个浓度四个重复的平均值±标准差(SD)。
图9.转染mTORsiRNA后对Panc-1细胞对GEM-TCA化学敏感性的影响。在96孔板的每个孔内接种含5×103个细胞的100μl DMEM/10％FBS悬浮液。第二天，根据操作说明书，采用siRNA/Lipofectamine 2000复合物转染细胞。在5-6小时后，更换细胞培养基。第二天，用不同浓度的GEM-TCA处理转染过细胞。药物处理72小时后，用细胞效价Glo发光细胞活力测定法(Promega)评估细胞毒性。未经处理的细胞(空白)的值设置为100％。所有值代表每个浓度四个重复的平均值±标准差(SD)。*代表与对照非靶向siRNA组有显著性差异(p<＝0.05，由t检验)。
图10.转染TGF-β1siRNA和mTORsiRNA后对Panc-1细胞GEM-TCA化学敏感性的影响。第二天，用同样的培养基将GEMZAR@或GEM-TCA稀释成0.1nM-100uM的浓度。药物处理48小时后，用细胞效价Glo发光细胞活力测定法(Promega)评估细胞毒性。未经处理的细胞(空白)的值设置为100％。所有值代表每个浓度四个重复的平均值±标准差(SD)。采用配对样本双尾学生t检验确定显著性。
图11.GEM-TCA/siRNA纳米颗粒制剂的粒径测量。以GEMZAR@/siRNA剂型为对照，测定不同比例的GEM-TCA与siRNA所形成的纳米颗粒的尺寸。
图12.GEM-TCA/siRNA纳米颗粒制剂的Zeta电位的测量。以GEMZAR@/siRNA剂型为对照，测定不同比例的GEM-TCA与siRNA所形成的纳米颗粒的Zeta电位。
图13.作为一种新抗癌方法的HKP(H3K4P)偶联吉西他滨的化学结构。
图14.吉西他滨与HKP的化学偶联途径。这是一个通过(请在这增加缺失的内容)在吉西他滨和HKP之间形成共价键的常见方法。氮原子上的唯一的电子对转移到羰基上，最终形成性质独特的C＝N双键和羟基。事实上，酰胺会被酸催化水解成羧基，这意味着HKP唯一的“C末端”在酸性条件性会重新转变为羧基。因此，我们可以利用这一点来修饰，即通过C末端的羧基来修饰HKP。
图15.用于吉西他滨和HKP偶联结合的EDC-NHS化学方法。采用EDC-NHS化学交联的优势包括：
1.EDC-NHS反应在酸性条件下效率最高。
2.在酸性条件下HKP会产生羧基。
3.EDC-NHS反应倾向于-NH2而不是-NH3+。
吉西他滨的-NH2具有更低的pKa(约2.8)，因此比HKP的干扰性胺在酸性条件下更活跃，使吉西他滨与HKP偶联而不是HKP自身偶联。
图16.HKP和GEM-HKP的吸收波长。与HKP相比，吉西他滨的分子更小(40倍)，如所提出的反应机理所示，在HKP上添加一个吉西他滨分子不会使HKP峰位延迟太多。此外，尽管吉西他滨在205纳米处也有吸光度，但如果在等摩尔水平下，其吸光度与HKP相比可以忽略不计。而且，在更长或更短的时间点(从0到60分钟)，我们没有发现任何其他强峰值。根据高效液相色谱和紫外光谱的结果，我们可以得出以下结论：成功地合成了所需要的HKP-吉西他滨(GEM-HKP)化合物。新化合物只有一个吉西他滨与一个HKP结合。未观察到明显的副产物。
图17.通过尺寸排除法在不同的紫外吸收率下，测量HKP、吉西他滨、HKP/吉西他滨混合物和GEM-HKP共轭物。HKP和吉西他滨显示不停地分子量：HKP(9.6KD)和吉西他滨(236D)。排除柱子的影响，我们发现HKP和吉西他滨出出峰时间明显不同，HKP峰值出现在19分钟，而吉西他滨峰值出现在5分钟，吉西他滨在19分钟完全没有吸收。然而，当测量GEM-HKP时，该单一化合物在205nm和272nm处均出现吸收，并在19分钟处同时显示出两个峰。
图18.GEM-HKP理化性质的测定。GEM-HKP水溶液和siRNA水溶液以4:1的比例混合时，将形成有特定大小和Zeta电位的纳米颗粒。以顺序打乱的siRNA(scrambled siRNA)与GEM-HKP、以及原来的HKP形成地纳米颗粒作为阳性对照。用Brookhaven 90plus纳米粒径仪测量纳米颗粒的尺寸和Zeta电位：GEM-HKP的平均粒径为78.4nm，Zeta电位为25mV，GEM-HKP/siRNA的纳米颗粒具有与HKP/siRNA相似的Zeta电位，但纳米颗粒较小。
图19.GEM-HKP将siRNA导入到panc-1细胞内。我们使用AF488 siRNA(荧光探针AF488修饰的顺序打乱siRNA)作为报告子，与GEM-HKP一起形成纳米颗粒，以评估其体外siRNA转染的能力。我们的新化合物GEM-HKP具有将siRNA导入细胞的能力，其效率与HKP相似。本次评价以Panc-1细胞系为模型。
图20.GEM-HKP对肿瘤细胞的杀伤活性。将非特异性AF488标记siRNA与HKP或GEM-HKP载体以4.5:1的比例混合，转染Panc-1细胞，24小时后用新鲜培养基替换含有siRNA和转染试剂的培养基或含药物的培养基。在转染48小时和72小时后，通过细胞生长图像评估细胞杀伤活性。尽管转染后24小时细胞杀伤活性不高，但携带siRNA纳米颗粒的GEM-HKP已显示出有效的细胞杀伤活性。结果表明，GEM-HKP保留了siRNA导入(HKP功能)和肿瘤细胞杀伤(吉西他滨功能)的功能。因此，GEM-HKP可能是一种新型的抗肿瘤药物，也可用于导入治疗性siRNA药物。
图21.吉西他滨和GEM-HKP共轭物在Panc-1细胞中转染后72小时的剂量依赖性细胞毒性。将Panc-1细胞仅暴露于吉西他滨(GEM-HKP结合物)后，用“细胞滴度-Glo发光细胞活性测定”(Promega)评估每种治疗的细胞毒性。未经处理的细胞(空白)的值设置为100％。所有值代表每个浓度四个重复的平均值±标准差(SD)。在本研究中，每个点的HKP浓度等于其在GEM/HKP中的浓度。如图所示，GEM-HKP的细胞毒性与吉西他滨相近，HKP没有显示出细胞毒性。
图22.用A549(肺癌)细胞异种移植小鼠模型进行肿瘤抑制试验。MOD是未经治疗的肿瘤模型组。GEM是用GemZar治疗的肿瘤组。GEM-TCA是用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗的肿瘤组。每组动物数N＝6。GemZar和GEM-TAC的使用剂量相同。
图23.用PANC-1人胰腺癌异种移植小鼠模型进行肿瘤抑制试验。MOD是未经治疗的肿瘤模型组。GEM是用GemZar治疗的肿瘤组。GEM-TAC是用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗的肿瘤组。每组动物数N＝5。GemZar和GEM-TAC的使用剂量相同。
图24.用PANC-1(人胰腺癌)细胞异种移植小鼠模型进行肿瘤抑制试验。MOD是未经治疗的肿瘤模型组。GEM是用GemZar治疗的肿瘤组。GEM-TAC是用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗的肿瘤组。每组动物数N＝8。GemZar和GEM-TAC的使用剂量相同。GemZar与GEM-TAC治疗效果有显著差异。
图25.用PANC-1(人胰腺癌)细胞异种移植小鼠模型在治疗后第37天进行肿瘤总重量抑制试验。MOD是未经治疗的肿瘤模型组。GEM是用GemZar治疗的肿瘤组。GEM-TAC是用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗的肿瘤组。每组动物数N＝8。GemZar和GEM-TAC的使用剂量相同。GemZar与GEM-TAC治疗效果有显著差异。
图26.用LoVo(人结肠癌)细胞异种移植小鼠模型进行瘤内注射肿瘤抑制试验。MOD是未经治疗的肿瘤模型组。STP302是一种含有mir150/HKP配方的miRNA治疗候选药物。GEM-TAC是用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗的肿瘤组。每组动物数N＝6。GEM-TAC+STP302联合用药疗效优于单独的一种药物治疗。
图27.用LoVo(人结肠癌)细胞异种移植小鼠模型进行瘤内注射肿瘤抑制试验。注射后第16天进行检测。MOD是未经治疗的肿瘤模型组。STP302是一种含有mir150/HKP配方的miRNA治疗候选药物。GEM-TAC是用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗的肿瘤组。每组动物数N＝6。GEM-TAC+STP302联合用药疗效优于单独的一种药物治疗。
图28.用LoVo(人结肠癌)细胞异种移植小鼠模型进行瘤内注射肿瘤抑制试验。MOD是未经治疗的肿瘤模型组。GEM是用GemZar治疗的肿瘤组。GEM-TAC是用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗的肿瘤组。每组动物数N＝8。GemZar和GEM-TAC的使用剂量相同。GemZar与GEM-TAC治疗效果有显著差异。
图29.用LoVo(人结肠癌)细胞异种移植小鼠模型进行瘤内注射肿瘤抑制试验。注射后第18天进行检测。MOD是未经治疗的肿瘤模型组。STP302是一种含有mir150/HKP配方的miRNA治疗候选药物。GEM-TAC是用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗的肿瘤组。每组动物数N＝8。GemZar和GEM-TAC的使用剂量相同。GemZar与GEM-TAC治疗效果有显著差异。
图30.抗PDL-1的阳性siRNA序列的鉴定。利用人宫颈癌细胞系和Caski细胞培养，筛选多个抑制PDL-1基因表达的siRNA序列。阳性siRNA序列用星号标记。
图31.其余的抗PDL-1的阳性siRNA序列的鉴定。利用人宫颈癌细胞系和Caski细胞培养，筛选多个抑制PDL-1基因表达的siRNA序列。阳性siRNA序列用星号标记。
图32.抗PDL-2的阳性siRNA序列的鉴定。利用人宫颈癌细胞系和Caski细胞培养，筛选多个抑制PDL-2基因表达的siRNA序列。阳性siRNA序列用星号标记。
图33.抗PDL-2的阳性siRNA序列的鉴定。利用人宫颈癌细胞系和Caski细胞培养，筛选多个抑制PDL-2基因表达的siRNA序列。阳性siRNA序列用星号标记。
发明详细说明
本发明提供用于癌症治疗和增强RNAi癌症治疗的药物组合物，包括化学药物吉西他滨(GEM)和某些衍生物、牛磺胆酸(TCA或TAC)制剂和组氨酸-赖氨酸聚合物(HKP)偶联物。第一实施例包括GEM和TCA配方(GEM-TCA)，该抗癌治疗组合物用于治疗各种类型的癌症，例如哺乳动物的癌症，尤其是人类的癌症。第二实施例包括用于治疗各种类型癌症的GEM和HKP偶联物(GEM-HKP)，第三实施例包括包含GEM-TCA的治疗组合物，该组合物用于有效的siRNA或miRNA导入，或两者兼而有。第四实施例包括治疗药物组合物，该组合物包括用于有效的siRNA或miRNA导入或两者兼有的GEM-HKP。第五实施例包括使用这些药物化合物配方的方法，以及用于各种治疗条件的组合物，包括癌症疗法。
这里使用的单数形式“a”、“an”和“the”指的是一个或多个，除非上下文清楚地指出了其他情况。
本发明包括吉西他滨衍生物和RNAi触发器的药物组合物。在本实施例的一个方面中，吉西他滨衍生物包含牛磺胆酸分子与吉西他滨分子通过静电吸引偶联。在本实施例的另一个方面，吉西他滨与牛磺胆酸，包括脱氧胆酸与牛磺酸结合。另一方面，吉西他滨和牛磺胆酸的摩尔比约为0.0:0.1到1.0:2.0。在本实施例的另一个方面，吉西他滨衍生物包括包含吉西他滨分子和组氨酸-赖氨酸聚合物的化学共轭物。吉西他滨可以是自由碱的形式。在另一个方面，该组合进一步包括与第一个不同的第二个RNAi触发器。
组氨酸-赖氨酸聚合物在美国专利号7070807B2、7163695B2、7772201B2中有提及，其全部内容通过引用并入本文。在实施案例中，HKP包含结构(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中，R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，K＝赖氨酸，H＝组氨酸。
RNAi触发器是在人类细胞或其他哺乳动物细胞中激活RNAi效应的任何分子。这样的RNAi触发器包括一个小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸、一个微RNA(miRNA)寡核苷酸或一个RNA拮抗剂寡核苷酸。
如本文所用，siRNA寡核苷酸，“一个”siRNA分子或“siRNA双链体”是双链寡核苷酸，其是短的双链多核苷酸，其在分子之后干扰细胞中基因的表达。引入细胞，或干扰病毒基因的表达。例如，它靶向并结合单链(ss)靶RNA分子中的互补核苷酸序列。通过本领域技术人员已知的技术化学合成或以其他方式构建siRNA分子。这些技术描述于美国专利No.5898031、6107094、6506559、7056704和欧洲专利No.1214945和1230375，其全部内容通过引用并入本文。按照惯例，当通过特定核苷酸序列鉴定siRNA寡核苷酸时，该序列是指双链体分子的有义链。
由该分子组成的一个或多个核糖核苷酸可以通过现有技术进行化学修饰。除了在一个或多个核苷酸的水平上被修饰外，寡核苷酸的主干还可以被修饰其他修饰包括使用小分子(如糖分子)、氨基酸、多肽、胆固醇和其他大分子结合到siRNA上
一方面，siRNA分子是双链寡核苷酸，其长度为约17至约27个碱基对。另一方面，该分子是双链寡核苷酸，长度为19至25个碱基对。再一方面，它是具有25个碱基对长度的双链寡核苷酸。在所有这些方面，分子可以在两端具有平端，或者在两端具有突出端的粘性末端(不成对的碱基延伸超过主链)，或者在一端具有钝端而在另一端具有粘性末端。在一个特定方面，它在两端具有钝端。在另一个特定方面，该分子具有25个碱基对(25mer)的长度并且在两端具有平端。
在本实施例的一个方面，siRNA分子是表1中根据其正义序列标示的分子。
在本实施例的另一个方面，siRNA寡核苷酸与mTOR基因mRNA具有特定的序列同源性(优选为100％)，并且对mTOR基因表达具有抑制活性。这种siRNA寡核苷酸的一个例子是mTOR-siRNA：
有义：5’-r(CACUACAAAGAACUGGAGUUCCAGA)-3’，
反义：5’-r(UCUGGAACUCCAGUUCUUUGUAGUG)-3’。
在该实施方案的另一个方面，siRNA寡核苷酸与TGF-β1基因mRNA具有特异性序列同源性(优选100％)，并且对TGF-β1基因表达具有抑制活性。这种siRNA寡核苷酸的一个例子是TGF-β1-siRNA：
有义：5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’，
反义：5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’。
在该实施方案的另一个方面，siRNA寡核苷酸与COX-2基因mRNA具有特异性序列同源性(优选100％)，并且对COX-2基因表达具有抑制活性。这种siRNA寡核苷酸的一个例子是COX-2-siRNA：
有义：5’-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3’，
反义：5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’。
在本实施例的进一步方面，miRNA寡聚物包括或具有与miR-132(accguggcuuucgauuguuacu)、miR-150(ucucccaacccuuguaccagug)或miR-155(uuaaugcuaaucgugauagggguu)的同源性(优选100％)。
在本实施例的进一步方面，所述RNA拮抗剂包括或具有与antagomir-132(accguggcuuucgauuguuacu)、antagomir-150(ucucccaacccuuguaccagug)或antagomir-l55(uuaaugcuaaucgugauagggguu)的同源性(优选100％)。
在该实施方案的另一个方面，组合物与药学上可接受的载体组合。鉴于本文包含的指导，这些载体可由本领域技术人员确定。
本发明还包括含有吉西他滨分子和牛磺胆酸分子的药物组合物。吉西他滨可以是游离碱的形式。在该实施方案的一个方面，牛磺胆酸包含具有牛磺酸的脱氧胆酸。在该实施方案的另一个方面，组合物还包含如上所述的RNA干扰(RNAi)触发器。该实施方案的又一方面，该组合物包含不同于第一种的第二RNAi触发器。在该实施方案的另一个方面，组合物与药学上可接受的载体组合。考虑到本文包含的教导，这些载体可由本领域技术人员确定。
本发明进一步包括药物组合物，其包含吉西他滨分子和组氨酸-赖氨酸多聚物(HKP)。吉西他滨可以是游离碱的形式。在该实施方案的一个方面，组合物还包含如上所述的RNA干扰(RNAi)触发器。在该实施方案的另一个方面，组合物包含与第一RNAi触发器不同的第二RNAi触发器。在该实施方案的另一方面，组合物与药学上可接受的载体组合。考虑到本文包含的教导，这些载体可由本领域技术人员确定。
本发明的组合物可用于治疗人和其他哺乳动物的癌症和其他肿瘤疾病。
本发明提供了一种治疗哺乳动物癌症或抑制哺乳动物体内肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，包括向哺乳动物提供本发明的任何组合物的治疗有效量的步骤。在本发明的一个方面，肿瘤细胞或肿瘤细胞是胰腺癌细胞。
本发明还提供了一种诱导哺乳动物肿瘤细胞或肿瘤细胞凋亡的方法，该方法包括将本发明的任何组合物的有效量给予哺乳动物的步骤。在本发明的一个方面，肿瘤细胞是胰腺癌细胞。
本发明还提供了一种提高患有癌症的哺乳动物对GEM的化学敏感性的方法，包括将本发明的任何组合物的有效量给予哺乳动物的步骤。在本发明的一个方面，癌症是胰腺癌。
哺乳动物包括人类和实验动物，如非人灵长类动物、狗和啮齿动物。在本发明的一个实施例中，哺乳动物是人类。
以下实施例说明了本发明的某些方面，不应将其解释为限制其范围。
具体实施例1.靶向癌症治疗与化疗药物导入siRNA
许多化学疗法已被用于治疗胰腺癌和其他类型的癌症。化疗耐药性和化疗药物毒性问题限制了它们的治疗潜力。本发明结合了RNAi疗法和吉西他滨的优点，吉西他滨是一种已经在临床应用的化学药物，用于导入siRNA或miRNA。图1展示了一个示意性过程，其中吉西他滨和多肽载体HKP可以结合两种成分的特征——肿瘤细胞杀伤、siRNA或miRNA在体外和体内导入，当这种新化合物，GEM-HKP，与在具有一定比例的水溶液中的mTOR特异性siRNA，将形成具有m个TOR靶向的siRNA治疗剂和吉西他滨介导的肿瘤细胞杀伤特性的自组装纳米颗粒(图1)。
具体实施例2. 25个碱基对的siRNA比21个碱基对的siRNA表现出更强的抑制活性
首先，我们发现25个碱基对的siRNA比21个碱基对的siRNA更有效用于靶基因沉默。在一个实验中，我们比较了从每组6个双链体中选择的25个碱基对的和21个碱基对的siRNA之间的沉默效力。使用Lipo2000体外转染，然后进行RT-PCR分析，用预先施用人VEGF蛋白(DLD-1，人结肠癌和MBA-MD-435，人乳腺癌)的两个肿瘤细胞系进行比较。如图2所示，25个碱基对的siRNA在0.3ug和2.0ug剂量下均显示出比21个碱基对的siRNA更强的抑制活性。此外，我们通过眼部血管生成小鼠模型证明，靶向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的鸡尾酒siRNA表现出比单一siRNA抑制剂更强的抗血管生成活性。包装siRNA导入HKP纳米颗粒为我们提供一种全身性的siRNA导入系统。MBA-MD-435异种移植瘤模型显示HKP-Raf1-siRNA和HKP-EGFR-siRNA的抗肿瘤活性，有力支持我们利用HKP增强EGFR-RAF1-mTOR或VEGFR2-RAF1-mTOR siRNA鸡尾酒治疗胰腺癌的疗效。
具体实施例3.选择靶向mTOR基因表达的有效siRNA
在我们使用纳米颗粒介导的siRNA鸡尾酒进行癌症治疗的概念验证和可行性研究中，我们首先通过细胞培养发现了靶向EGFR、VEGFR2、RAF-1和mTOR基因(人和小鼠)的最有效的siRNA双链体，然后通过Q-RT-PCR和Western Blot分析进行验证。为了选择mTORsiRNA，我们首先使用计算机筛选程序选定8个siRNA序列，进行siRNA寡聚物合成。然后我们将这些siRNA转染到人MDA-MB-231细胞和小鼠CT26细胞中。二十四小时后，收集总mRNA并用标准对照基因靶标Rigs15进行qRT-PCR分析。从图3中我们可以看出，选择了靶向mTOR(人和小鼠mRNA)的有效siRNA双链体。
具体实施例4.miR-132和miR-155在潜在抗癌治疗中的下调
拮抗寡核酸-132(antagomir-132)治疗导致miR-132的峰值下调(A)(合用n＝6只小鼠/组)，使用Bonferroni事后检验的单向ANOV A来计算显着性水平。P≤0.05(*)。收集6个角膜，用QPCR或WB进行分析；(B)将antagomir-132和乱序序列分别注射于HSV感染小鼠的角膜中，对不同组角膜的RasGAP mRNA进行定量(n＝6只/组)。显著性水平由t检验(非配对)决定。***P≤0.001(图4)。
使用qRT-PCR观察小鼠胰腺癌组织和胰腺癌患者血浆中miR-155的增加，并观察到小鼠正常和胰腺癌组织(PDAC)中靶基因mRNA和miR-155的表达之间的相关性。检测胰腺癌患者，非癌症对照和其他胃肠癌患者的人血浆样本中的miR-155水平，其中胰腺癌与非癌症对照胰腺疾病，非癌症对照无胰腺疾病，上消化道癌，结肠癌和肝癌。*p，0.05。在一只眼睛中用HSV-1RE感染野生型(WT)小鼠和miR-155基因敲除(KO)小鼠。在第12天和第15天用血管生成评分测量抗血管生成作用。在目标第15天，双靶向的antagomir-132/155在所有三组中表现出最有效的活性。显着性水平由t检验(未配对)确定。P≤0.001(***)；P≤0.01(**)；P≤0.05(*)。误差棒代表平均值±SE(图5)。
具体实施例5.吉西他滨与牛黄胆酸的组合配方
吉西他滨(dFdC)是一种新型的抗癌核苷类药物，与脱氧胞苷类似。它是一种前药，一旦进入细胞，就必须被脱氧胞苷激酶磷酸化为活性形式。二磷酸吉西他滨(dFdCTP)和三磷酸吉西他滨(dFdCTP)都抑制DNA合成所需的过程。dFdCTP与DNA结合可能是吉西他滨导致细胞死亡的主要机制。在延长的DNA链末端加入吉西他滨核苷酸后，再加入一个脱氧核苷酸，DNA聚合酶就无法发挥功能。这种作用(“掩蔽终止”)显然将药物锁定在DNA中，因为校对酶无法将吉西他滨从这个位置移除。此外，吉西他滨代谢物对细胞调控过程的独特作用有助于增强细胞生长的整体抑制活性。这种相互作用被称为“自我增强”，并且在极少数其他抗癌药物中得到证实。
吉西他滨(2'-脱氧-2',2'-双氟胞苷；1-(4氨基-2-oxo-11H-嘧啶-l-yl)-2-脱氧-2,2-双氟-D-胞苷；dFdC；CAS No.95058-81-4；C9HUF2N3O4，相对分子质量263.2)是美国药典(官方专著，USP 27第一版附录USP NF，第3060-61页，关于“盐酸吉西他滨”和“注射用吉西他滨”)中无官方标记的物质。吉西他滨的化学结构如图6所示；化学式：C26H45NO7S；摩尔质量：515.7058g/mol；熔点：125.0℃(257.0°F；398.1K)。
牛磺胆酸是一种功能强大的生物洗涤剂，可用来溶解脂质和游离膜结合蛋白。它是一种细菌学培养基成分，用于某些形式的麦康凯肉汤培养基中。它还可以加速脂肪酶的活性。它在疫苗生产和作为一种辅助药物和疫苗交付的载体方面具有潜力。牛磺胆酸是胆汁酸，是胆酸与牛磺酸结合的产物。它的钠盐是食肉动物胆汁的主要成分。它是一种溶解性黄色结晶胆汁酸，参与脂肪的乳化。它作为一种钠盐存在于哺乳动物的胆汁中。在医学上，它作为促胆剂和催胆剂使用。牛磺酸水解产生牛磺酸。T型胆甾醇酸的结构如图6所示。
本发明提供一种牛头胆酸与吉西他滨配位的组合物，其中脂质体可以包含各种带负电荷的分子，如siRNA或miRNA寡核苷酸。复合形成材料为糖胆酸、和甘胆酸、牛磺酸、神经酰胺-1磺酸盐等两亲性分子。这里使用的“吉西他滨”一词是指吉西他滨游离碱和吉西他滨衍生物。
该组合物可与吉西他滨以外的辅助治疗药物(包括siRNA和miRNA)、抗肿瘤药、抗真菌药、抗生素以及其他活性药物(尤其是顺铂、反义寡核苷酸、奥沙利铂、紫杉醇、长春瑞滨、表阿霉素)联合使用。本发明具体设想了一种方法，在该方法中，在药物可接受的赋形剂中所述发明配合物的治疗有效量被给予哺乳动物，如人类。我们将这个新形成的结构命名为GEM-TCA，如图6所示。
具体实施例6.吉西他滨-牛磺胆酸(GEM-TCA)的合成
合成过程包括以下两个步骤：
吉西他滨游离碱的制备：盐酸吉西他滨是多种商品名称销售的药品中的活性成分。将盐酸吉西他滨(5.0g)和碳酸钾(4.0g，1.5摩尔当量)加入1.0L圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(350mL)和乙醇(300mL)制备吉西他滨的游离基。室温下剧烈搅拌整晚。用漏斗将乳白色溶液过滤到干净的瓶子中。在强制干燥空气的帮助下，通过蒸发除去大部分溶剂。将固体置于30℃高真空下8小时，游离基为白色固体粉末，用1核磁共振氢谱(H-NMR)进行验证。
吉西他滨-牛磺胆酸盐(1:1)前药的制备：在50℃下将0.30g(1.139mmol)吉西他滨游离碱溶于乙醇(20mL；100％)中。在另一个烧瓶中，将牛磺胆酸(0.58g；1.124mmol)溶于乙醇(10mL；100％)中。逐滴添加TC溶液至吉西他滨。加入10mL乙醇并在50℃(约30分钟)搅拌溶液直至发生沉淀。在室温下冷却溶液。通过真空过滤收集沉淀的固体并使其在真空干燥器下干燥，最终得到外观为白色的固体。
可取的是，该组合物和方法具有以下一个或多个优点：1)在阴离子类固醇和吉西他滨之间实现强静电相互作用；2)避免溶解度问题；3)吉西他滨-牛磺胆酸盐复合物的高稳定性；4)施用吉西他滨的能力如下：高浓度推注或短暂输注；5)延长吉西他滨的半衰期；6)降低吉西他滨毒性；7)提高吉西他滨的治疗效果；8)调节癌细胞中的多药耐药性。
具体实施例7.和GEM-TCA之间的细胞毒性比较
在获得GEM-TCA制剂后，我们测试了其与批准的抗癌药物相比的肿瘤细胞杀伤效力。在处理前一天，将1×103个HeLa细胞悬浮在150μl的补充有10％FBS的EMEM培养基中，接种在96孔板的孔内。第二天，将50μL的或GEM-TCA在相同培养基中稀释并加入细胞(0.1nM-100μM)。在化学暴露后72小时，用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测(Promega)评估细胞毒性。将未处理细胞(空白)的值设定为100％。所有值代表每个稀释度的四次重复的平均值±标准差(SD)。(图7)显然，GEM-TCA在Hela细胞培养研究中表现出与相同的抗癌(肿瘤细胞杀伤)活性，其浓度为0.1nM至100nM。
具体实施例8.HepG2和Panc-1细胞培养中和GEM-TCA的比较
我们进一步比较了和GEM-TCA与HepG2(一种由人肝癌细胞组成的永久细胞系，取自一名患有高分化肝癌的15岁白人男性的肝脏组织)、以及Panc-1(由56岁白人男性的导管来源的胰腺癌建立的细胞系)细胞培养物的肿瘤细胞杀伤效力，然后测量细胞活力。用以下步骤进行和GEM-TCA之间的细胞毒性比较。将2x103 Panc-1和HepG2细胞接种在96孔板的孔中的150μlEMEM/10％的FBS中。第二天，培养基补充有在相同培养基中稀释的0.1nM-100μ或GEMTc。在化学暴露后72小时，用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测(Promega)评估细胞毒性。将未处理细胞(空白)的值设定为100％。所有值代表每个稀释度的四次重复的平均值±标准差(SD)。同样，GEM-TCA在0.1nM至100nM的浓度下用HepG2和Panc-1细胞培养研究证明了相同的肿瘤细胞杀伤效力(图8)。
具体实施例9.mTOR基因mRNA特异性的siRNA对Panc-1细胞对GEM-TCA的化学敏感性的影响
胰腺肿瘤是最致命的消化道肿瘤，5年生存率为5％。辅助化疗仍然是单用吉西他滨或与注射用5-氟尿嘧啶联合放疗。一旦胰腺癌发生转移将是致命的，总体生存率通常为6个月。吉西他滨已经成为局部晚期和转移性疾病的标准药物。酪氨酸激酶抑制剂埃洛替尼的加入只能延长中位生存2周。虽然以吉西他滨为基础的治疗方案目前被接受为局部晚期或转移性胰腺腺癌患者的标准一线治疗方案，但在二线治疗方面还没有共识。近年来，两种靶向药物，异型酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼和mTOR抑制剂埃佛洛利姆已被美国食品药品监督管理局批准用于胰腺神经内分泌肿瘤。
我们通过对人类乳腺癌细胞株MDA-MB-231和小鼠CT26细胞的细胞培养研究，确定了有效的mTOR特异性siRNA，然后进行QRT-PCR分析：mTOR-siRNA：
有义：5’-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3’，
反义：5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’。
为了验证原假设，即致癌基因靶基因敲除可能导致Panc-1细胞对GEM-TCA具有化学敏感性，本实验采用以下步骤进行。将悬浮于100μl DMEM/10％FBS的5x103个Panc-1细胞接种在的96孔板内。第二天，根据制造商的推荐，用siRNA/Lipofectamine 2000复合物转染细胞。在5-6小时后更换培养基。第二天，各种浓度的GEM-TCA区域与转染的细胞相对应。在化学暴露后72小时，用Cell Titer-Glo发光法细胞活力检测(Promega)评估细胞毒性。将来自未处理细胞(空白)的值设定为100％。所有值以平均值±标准差(SD)表示，每个稀释度做四个平行，与转染了对照、非靶向siRNA组有明显差异(p<0.05，t检验)。基于对图9的观察，我们可以看到，在两种固定的mTOR-siRNA浓度：10nM和20nM时，GEM-TCA对肿瘤细胞的杀伤作用在12.3nM至1μM时显着改善。
具体实施例10.TGF-β1siRNA和mTORsiRNA对Panc-1细胞暴露于低剂量GEM-TCA的化学敏感性的影响
为了更好地理解TGF-β1siRNA和mTORsiRNA诱导Panc-1细胞对GEM-TCA的化学敏感性，我们将这两种siRNA的浓度固定在30nM，然后用3.9nM-1μM的不同浓度的GEM-TCA处理细胞。第二天，补充添加有相应浓度的3.9nM-1000nM的GEMTc的培养基。药物处理48小时候，采用Cell Titer-Glo荧光细胞活力实验(Promega)测定细胞毒性。未处理组细胞(Blank)的活力值设定为100％。每个浓度设四个平行重复，所有值以“平均值±标准差(Mean±SD)”表示。用配对样品双尾学生t检验分析显著性。TGF-β1siRNA之前已经为大量体外和体内实验所鉴别和验证：
正义：5′-r(CCUCAAUUCAGUCUCUCAUCUGCAA)-3′
反义：5′-r(UUGCAGAUGAGAGACUGAAUUGAGG)-3′
从图10中可以看出，TGF-β1siRNA和mTORsiRNA都可以明显提高Panc-1细胞对低浓度GEM-TCA(3.9nM的敏感性)。当GEM-TCA浓度升高到15.6nM时，mTORsiRNA的致敏感效应消失。然而，即使GEM-TCA浓度升高到62.5nM，致敏感效应依然显著。两种情形下，最大细胞杀伤能力均为60％。根据上述结果，说明GEM-TCA保留了肿瘤杀伤能力，并且mTORsiRNA或抑制其他肿瘤靶标的siRNA会提高其抗肿瘤活性。
具体实施例11.GEM-TCA/siRNA纳米颗粒的表征
我们进一步检测了GEM-TCA/siRNA以各种比例(10/1、20/1、30/1、40/1或50/1)制备的制剂的颗粒直径和Zeta电位。结果表明，当GEM-TCA/siRNA比例为10/1时，纳米颗粒大小约为153.2nm(图11)，Zeta电位约为-10.62(图12)。因此，当按分子量比例为10/1时，GEM-TCA可以将siRNA包裹形成纳米颗粒。
具体实施例12.设计吉西他滨和HKP的偶联策略
作为一种多胺、残基重复和分支装的多肽，HKP很难被修饰。有三种功能胺(排除肽键内的胺)：48个咪唑基、20个己胺(epsilon-amine)和5个N-末端甲胺(alpha-amine)。如果想通过这些胺来修饰HKP，它们之间可能会相互干扰，从而产生多个不同分支的中间产物。我们发现在HKP的C末端有一个不同于其他功能胺的特殊的胺，HKP中原本这一位置是C末端羧基的羟基(-OH)，现在变为胺，名为酰胺(图13)。它具有独特的结构，氮上唯一的电子对重定位进入羰基形成一个C＝O双键和一个羟基。实际上，酰胺会被酸催化水解成羧基，这意味着HKP唯一的“C末端”在酸性条件性会重新转变为羧基。因此，我们可以利用这一点来修饰，即通过C末端的羧基来修饰HKP。
吉西他滨是一种核苷类似物，大多数吉西他滨的化学修饰主要通过两个位点，即4-(N)和5’-(OH)，目前也有各种吉西他滨的衍生物得到开发。作为一种前药，通过前述两个位点的修饰可以吉西他滨在体内释放出活性药物，提高导入效率。如图14所示，我们决定采用EDC-NHS化学作为吉西他滨与HKP偶联的策略，这是一种碳二亚胺交联剂，EDC(又名EDAC)是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，而NHS则是N-羟基琥珀酰亚胺。
采用EDC-NHS化学交联的优势有：
1.EDC-NHS反应在酸性条件下效率最高。
2.在酸性条件下HKP会产生羧基。
3.EDC-NHS反应倾向于-NH2而不是-NH3+。
4.吉西他滨的-NH2具有更低的pKa(约2.8)，因此比HKP的干扰性胺在酸性条件下更活跃，使吉西他滨与HKP偶联而不是HKP自身偶联(图15)。
具体实施例13.GME-HKP的结构和分子量的表征
如图16所示，HKP分子由于含有组氨酸，具有在200nm左右的吸收峰特征，而吉西他滨则在209nm和272nm有两个吸收峰，分别为糖基和胞核嘧啶所产生的。因此，我们选择272nm来指示吉西他滨，205nm来代表HKP。纯的HKP和吉西他滨的HPLC分析如图17所示。由于HKP(9.6kD)和吉西他滨(235D)之间的分子量差异巨大，它们在不同时间点从柱中分离出来。HKP峰值出现在大约19分钟，而吉西他滨大约是5分钟。吉西他滨在19分钟无吸收。然而，当检测GEM-HKP时，这个单一化合物在205nm和272nm显示吸收峰，两个峰的柱分离时间均是19分钟左右。
HKP与吉西他滨偶联后，所形成的化合物在205nm和272nm有两个吸收峰，柱分离时间均为约19分钟。与HKP相比，吉西他滨是一种小分子(比HKP小40倍左右)，根据反应机理，一个吉西他滨分子加到HKP上对HKP的峰位置影响很小。尽管吉西他滨在205nm也有吸收，但与相同当量的HKP比，这一吸收可以忽略不计。此外，我们在更长或更短的时间点(从0到60分钟)都没有发现任何强的峰值。
根据HPLC和UV(紫外)检测结果，可以得到如下结论：
1.成功合成了预期的HKP-吉西他滨(HKP-GEM)化合物。
2.新的化合物是一个吉西他滨分子连接到一个HKP上。
3.没有明显的副产物形成。
具体实施例14.GME-HKP/siRNA的剂型特征
当HKP-GEM水溶液和siRNA水溶液以4:1比率混合形成纳米颗粒后，我们进一步分析了这些颗粒的理化性质(颗粒大小和Zeta电位)。采用序列打乱的siRNA(scrambledsiRNA)与GEM-HKP形成纳米颗粒，相同条件下的HKP作为阳性对照。Brookhaven 90Plus粒径仪测定粒径和Zeta电位。如图16所示，GEM-HKP的平均粒径是79nm，Zeta为25mV。GEM-HKP/siRNA纳米颗粒与HKP/siRNA有相近的电位，但粒径有明显差异(图18)。然而，由于这是一个新的化合物，最佳的配比可能会有细微改变，这将在后续研究中探讨。根据粒径仪检测结果，新化合物HKP-GEM纳米颗粒制剂得到了证实。
表A.纳米颗粒特征
粒径(nm) Zeta电位(mV)
HKP 125 26
HKP-GEM 79 25
具体实施例15.GME-HKP将siRNA导入Panc-1细胞
接着采用AF488 siRNA(荧光探针AF488标记的序列打乱的siRNA)作为报告子，来评估GEM-HKP与siRNA形成纳米颗粒后在体外的siRNA转染能力。以HKP-siRNA纳米颗粒作为对照。如图19所示，我们的新化合物GEM-HKP，可以将siRNA导入到细胞内，效果与HKP接近。评估中使用的细胞系是Panc-1胰腺癌细胞。
具体实施例16.GME-HKP显示肿瘤细胞杀伤活性
根据图19的结果，我们进一步检查GEM-HKP杀伤肿瘤细胞的细胞毒活性。非编码的AF488标记的siRNA与HKP或GEM-HKP以4.5:1(载体:siRNA)比例混合，转染Panc-1细胞。24小时候，新鲜培养基替换掉含siRNA及转染试剂的培养基或含单独的药物的培养基。转然后48小时和72小时，对细胞拍照，分析细胞杀伤活性(图20)。尽管转染后24小时的细胞杀伤活力未检测，但是GEM-HKP携带的siRNA显示了强大的细胞杀伤能力。这些结果意味着GEM-HKP依然有siRNA导入能力(HKP的功能)，也有强大的肿瘤细胞杀伤功能(吉西他滨的功能)。因此，GEM-HKP代表一种新型的抗肿瘤分子，同时可以将siRNA药物导入肿瘤。
具体实施例17.GME-TAC是活性肿瘤生长抑制剂，对A549细胞移植瘤模型的效力比GEMZar(吉西他滨)更强
采用A549(肺癌)细胞移植瘤模型来检测肿瘤抑制效果，MOD组为无治疗的模型组，GEM组采用GEMZar治疗，GEM-TCA采用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗。每组6只动物，GEMZar和GEM-TCA采用相同的给药方案(图22)。
具体实施例18.GME-TAC是活性肿瘤生长抑制剂，对PANC-1细胞移植瘤模型的效力比GEMZar(吉西他滨)更强
采用PANC-1(胰腺癌)细胞移植瘤模型来检测肿瘤抑制效果，MOD组为无治疗的模型组，GEM组采用GEMZar治疗，GEM-TCA采用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗。每组6只动物，GenZar和GEM-TCA采用相同的给药方案(图23，24，25)。
具体实施例19.GME-TAC与STP302联用可以增强对Lovo细胞移植瘤的抗肿瘤活性
采用Lovo(大肠癌)细胞移植瘤模型来检测肿瘤抑制效果，MOD组为无治疗的模型组，STP302组采用miR150/HKP组成的miRNA制剂进行治疗，GEM-TCA采用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗。每组6只动物。GEM-TAC+STP302联合治疗比这两种药物任一种单独治疗效果更好(图26，27)。
具体实施例20.GME-TAC与STP302联用可以增强对Lovo细胞移植瘤的抗肿瘤活性
采用Lovo(大肠癌)细胞移植瘤模型来检测肿瘤抑制效果，MOD组为无治疗的模型组，GEM组采用GEMZar治疗，GEM-TCA采用吉西他滨-牛磺胆酸制剂治疗。每组8只动物。GEMZar和GEM-TCA采用相同的给药方案。GEMZar组和GEM-TAC组之间治疗效果差异显著(图28，29)。
具体实施例21.采用Caski细胞研究选择针对人PDL-1基因的有效siRNA序列
采用人宫颈癌Caski细胞系筛选抑制PDL-1基因表达的多个siRNA序列。阳性siRNA序列以星号标记(图30，31)。人_PDL1_3：5’-UCGCCAAACUAAACUUGCUGCUUAA-3’(1533)；人_PDL1_6：5’-AAGCAUAAAGAUCAAACCGUUGGUU-3’(1635)**。
具体实施例22.采用Caski细胞研究选择针对人PDL-2基因的有效siRNA序列
采用人宫颈癌Caski细胞系筛选抑制PDL-2基因表达的多个siRNA序列。阳性siRNA序列以星号标记(图32，33)。人_PDL1_6：5’-AAGCAUAAAGAUCAAACCGUUGGUU-3’(1635)***；人_PDL2(918)：5’-CAGGACCCATCCAACTTGGCTGCTT-3’。
表1：siRNA抑制剂的正义链序列
EGFR： 5’-GAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGAUA-3’
VEGF： 5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’
PDGF： 5’-GCCUGCUGCUCCUCGGCUGCGGAUA-3’
RAF1： 5’-GCCUGCUGCUCCUCGGCUGCGGAUA-3’
VER2： 5’-CAUGGAAGAGGAUUCUGGACUCUCU-3’
表2：siRNA寡核酸的正义链序列
EGFR： 5’-GAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGAUA-3’
VEGF： 5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’
PDGF： 5’-GCCUGCUGCUCCUCGGCUGCGGAUA-3’
RAF1： 5’-GCCUGCUGCUCCUCGGCUGCGGAUA-3’
VER2： 5’-CAUGGAAGAGGAUUCUGGACUCUCU-3’
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此处列出的所有出版物，包括已授权或已申请的专利，和所有可以通过链接地址，编码或者其他方式访问的数据库条目，都通过参考文献的形式在此处全部披露。
尽管本发明描述了特定的具体实施例，并且为了阐述清楚而列举了许多细节，显而易见的是对熟悉这一领域的技术人员来说，此发明容易受到额外实施例的影响，并且在不违背本发明的基本原理下，本文中某些特定的细节可以有各种不同的描述形式。

Claims (53)

1.一种含有吉西他滨(GEM)衍生物和RNA干扰(RNAi)触发器的药物组合物。
2.权利要求1所述的组合物，其中吉西他滨衍生物包含一个吉西他滨分子，该分子与牛磺胆酸(TCA)分子通过静电吸引。
3.权利要求1所述的组合物，其中吉西他滨衍生物含有一个由吉西他滨分子和组氨酸-赖氨酸多聚物(HKP)构成的化学共轭结构。
4.权利要求1-3中任意一条所述的组合物，其中RNAi触发器包括小干扰RNA(siRNA)寡聚物、microRNA(miRNA)寡聚物、或拮抗寡核酸(antagomir)，可以在哺乳动物细胞内激活RNA效应。
5.权利要求4所述的组合物，其中哺乳动物细胞是人的细胞。
6.权利要求4或5所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与mTOR基因mRNA同源的特异性序列，具有抑制mTOR基因表达的活性。
7.权利要求4或5所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与mTOR基因mRNA同源的特异性序列：正义链，5’-r(CACUACAAAGAACUGGAGUUCCAGA)-3’，反义链，5’-r(UCUGGAACUCCAGUUCUUUGUAGUG)-3’，有抑制mTOR基因表达的活性。
8.权利要求4或5所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与TGF-β1基因mRNA同源的特异性序列，具有抑制TGF-β1基因表达的活性。
9.权利要求4或5所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与TGF-β1基因mRNA同源的特异性序列：正义链，5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’，反义链，5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’，具有抑制TGF-β1基因表达的活性。
10.权利要求4或5所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与COX-2基因mRNA同源的特异性序列，具有抑制COX-2基因表达的活性。
11.权利要求4或5所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与COX-2基因mRNA同源的特异性序列：正义链，5’-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3’，反义链，5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’，具有抑制COX-2基因表达的活性。
12.权利要求1所述组合物还进一步包含不同于第一种RNAi触发器的第二种RNAi触发器。
13.权利要求4或5所述的组合物，其中miRNA寡聚物包括miR-132、miR-150或miR-155，或者与这些miRNA同源的序列。
14.权利要求4或5所述的组合物，其中拮抗寡核酸包括antagomir-132、antagomir-150或antagomir-155，或者与这些miRNA同源的序列。
15.权利要求2所述的组合物，其中牛磺胆酸包括含有牛磺酸的脱氧胆酸。
16.权利要求2或3所述的组合物，其中吉西他滨包括吉西他滨游离碱。
17.权利要求2所述的组合物，其中GEM和TCA之间的摩尔比率大约在0.0：0.1到1.0：2.0之间。
18.权利要求3所述的组合物，其中GEM和HKP通过EDC-NHS化学技术偶联成GEM-HKP。
19.权利要求1、2、4或5中任意一条所述的组合物，其中GEM-TCA本身能够作为化学药用于肿瘤治疗，也可以包裹RNAi或DNA寡聚物，联合治疗肿瘤。
20.权利要求1、3、4或5中任意一条所述的组合物，其中GEM-HKP本身能够作为化学药用于肿瘤治疗，也可以包裹RNAi或DNA寡聚物，联合治疗肿瘤。
21.权利要求4、5、19或20中任意一条所述的组合物，其中的siRNA寡聚物包括表1中的序列。
22.权利要求4、5、19或20中任意一条所述的组合物，其中的siRNA寡聚物包括表2中的序列。
23.前述权利要求中的任意一条所述的组合物，进一步包含一种药学上可接受的载体。
24.一种包含吉西他滨分子和牛磺胆酸的药物组合物。
25.权利要求24所述的组合物，其中牛磺胆酸包括含有牛磺酸的脱氧胆酸。
26.权利要求24或25所述的组合物，其中吉西他滨包括吉西他滨游离碱。
27.一种包含吉西他滨分子和组氨酸-赖氨酸多聚物的药物组合物。
28.权利要求27所述的组合物，其中吉西他滨包括吉西他滨游离碱。
29.权利要求24-28中任意一条所述的组合物，进一步包含RNA干扰的触发器。
30.权利要求29所述的组合物进一步包含不同于第一种RNAi触发器的第二种触发器。
31.权利要求29或30所述的组合物，其中RNA干扰触发器选自包含小干扰RNA(siRNA)寡聚物、microRNA(miRNA)寡聚物、或拮抗寡核酸(antagomir)组成的集合。
32.权利要求31所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与mTOR基因mRNA同源的特异性序列，具有抑制mTOR基因表达的活性。
33.权利要求31所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与mTOR基因mRNA同源的特异性序列：正义链，5’-r(CACUACAAAGAACUGGAGUUCCAGA)-3’，反义链，5’-r(UCUGGAACUCCAGUUCUUUGUAGUG)-3’，有抑制mTOR基因表达的活性。
34.权利要求31所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与TGF-β1基因mRNA同源的特异性序列，具有抑制TGF-β1基因表达的活性。
35.权利要求31所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与TGF-β1基因mRNA同源的特异性序列：正义链，5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’，反义链，5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’，具有抑制TGF-β1基因表达的活性。
36.权利要求31所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与COX-2基因mRNA同源的特异性序列，具有抑制COX-2基因表达的活性。
37.权利要求31所述的组合物，其中siRNA寡聚物具有与COX-2基因mRNA同源的特异性序列：正义链，5’-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3’，反义链，5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’，具有抑制COX-2基因表达的活性。
38.权利要求31所述的组合物，其中miRNA寡聚物包括miR-132、miR-150或miR-155，或者与这些miRNA同源的序列。
39.权利要求31所述的组合物，其中拮抗寡核酸包括antagomir-132、antagomir-150或antagomir-155，或者与这些miRNA同源的序列。
40.权利要求24-39中的任意一条所述的组合物，进一步包含一种药学上可接受的载体。
41.一种治疗哺乳动物癌症，或抑制哺乳动物肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，包含给予哺乳动物有效治疗剂量的上述权利要求1-40所述的药物组合物。
42.一种诱导哺乳动物肿瘤或肿瘤细胞凋亡的方法，包含给予哺乳动物有效治疗剂量的上述权利要求1-40中任意一条所述的药物组合物。
43.一种增强哺乳动物肿瘤对GEM敏感性的方法，包含给予哺乳动物有效治疗剂量的上述权利要求1-40中任意一条所述的药物组合物。
44.权利要求41-43中任意一条所述的方法，其中癌症是胰腺癌。
45.权利要求41-44中任意一条所述的方法，其中哺乳动物是实验动物。
46.权利要求41-44中任意一条所述的方法，其中哺乳动物是人类。
47.权利要求24所述的组合物，对肺癌异种移植瘤(A549细胞)的抑制效果优于GEMZar。
48.权利要求24所述的组合物，对胰腺癌异种移植瘤(PANC-1细胞)的抑制效果优于GEMZar。
49.一种包含GEM-TAC和STP302的药物组合物。
50.一种包含针对人PDL-1基因表达的siRNA寡聚物与GEM-TAC联合的药物组合物。
51.一种包含针对人PDL-2基因表达的siRNA寡聚物与GEM-TAC联合的药物组合物。
52.一种治疗人类癌症，或抑制人类肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，包含给予人体有效治疗剂量的权利要求47-51中任意一条所述的药物组合物。
53.权利要求52所述的方法，其中癌症是胰腺癌。
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