CN110554117A - 氧化三甲胺作为脑卒中生物标志物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氧化三甲胺(TMAO)作为脑卒中风险评估和预后判断的生物标志物的用途。本发明还涉及氧化三甲胺作为药物筛选的靶点用于筛选治疗脑卒中的药物的用途。本发明提供了氧化三甲胺在制备用于诊断脑卒中和/或评估罹患脑卒中的风险的试剂盒中的用途，提供了氧化三甲胺在制备用于评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后的试剂盒中的用途，还提供了氧化三甲胺在制备用于筛选预防或治疗脑卒中的药物的试剂盒中的用途。本发明可以提高目前脑卒中风险预测准确度，并有利于促进脑卒中预防措施的完善、预后判别和治疗药物的开发。

Description

氧化三甲胺作为脑卒中生物标志物的用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及氧化三甲胺(trimethylamine oxide,TMAO)的新用途，具体涉及作为脑卒中风险评估和预后判断的生物标志物的用途。本发明还涉及氧化三甲胺作为药物筛选的靶点用于筛选治疗脑卒中的药物的用途。

背景技术

脑卒中具有发病率高、致残致死率高及复发率高的特点，且治疗方法有限，是危害人类健康的严重疾病，所以对脑卒中发病的预测和危险因素控制显得格外重要，且预测是建立在对危险因素充分认知的基础上。脑卒中的危险因素分为可控和不可控两类，前者如高血压、高血脂、糖尿病、肥胖或超重、烟酒嗜好等，后者如年龄(高龄)、性别(男>女)、遗传因素等。预防脑卒中的干预措施主要针对可控危险因素，如进行降压、降脂和降糖药物治疗，饮食调节，戒烟、忌酒等。此外，临床研究提示，可能有一些未被发现的致病因子或危险因素存在，将其纳入脑卒中风险预测的考量将进一步提高预测的准确性，并指导临床制定干预措施。

氧化三甲胺(TMAO)是由三甲胺形成的N-氧化物，人体内肠道菌群可以利用富含胆碱或三甲胺结构的物质(如磷脂酰胆碱、左旋肉碱等)产生TMAO，其中磷脂酰胆碱是最主要食物来源。研究发现(Wang Z,Klipfell E,Bennett BJ,et al.Gut flora metabolism ofphosphatidylcholine promotes cardiovascular disease.Nature,2011；472:57-63)，血液中高TMAO浓度与动脉粥样硬化形成有关。如给刚出生不久的小鼠喂饲含有胆碱类的食物或直接给胆碱、TMAO，在小鼠20周龄后可观察到主动脉根部出现粥样硬化斑块，其面积与血TMAO浓度呈正相关；持续16周的富含TMAO饮食可以促进C57BL/6J-Apoe小鼠泡沫细胞的形成和动脉粥样硬化病变区域增大。TMAO通过增加动脉粥样硬化前清除受体分化抗原36(CD36)和清道夫受体A的表达，造成胆固醇在细胞内堆积；TMAO也能降低Cyp7a1(胆汁酸合成主要酶)的表达，抑制胆固醇的转运，造成细胞内胆固醇堆积及泡沫细胞形成。临床研究发现(Tang WH,Wang Z,Levison BS,et al.Intestinal microbial metabolism ofphosphatidylcholine and cardiovas-cular risk.N Engl J Med,2013；368:1575-1584)，在有心血管高危因素(高龄、糖尿病、高血压、高血脂等)同等条件下，血液TMAO水平高的较血浆水平低的患者动脉粥样硬化的发病率更高。

根据国内外研究最新进展，目前认为血液TMAO水平是动脉粥样硬化的一个危险因子，血液TMAO水平升高可能导致心血管事件(主要指心肌梗塞、心血管死亡)总体发生风险的升高，但研究仅限于此，没有进一步确认TMAO与脑卒中发生风险的关系。

发明内容

本发明的目的在于提供氧化三甲胺的新用途，具体是氧化三甲胺作为脑卒中生物标志物的用途，可以提高目前脑卒中风险预测准确度，并有利于促进脑卒中预防措施的完善、预后判别和治疗药物的开发。

根据本发明的第一个方面，本发明提供了氧化三甲胺在制备用于诊断脑卒中和/或评估罹患脑卒中的风险的试剂盒中的用途。

根据本发明所述的用途，所述试剂盒是根据样品中氧化三甲胺的含量或含量的变化趋势来诊断脑卒中和/或评估罹患脑卒中的风险。

优选地，所述的样品为血液，选自血清、血浆或全血。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了氧化三甲胺在制备用于评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后的试剂盒中的用途。

根据本发明所述的用途，所述试剂盒是根据样品中氧化三甲胺的含量或含量的变化趋势来评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后。

优选地，所述的样品为血液，选自血清、血浆或全血。

根据本发明的第三个方面，本发明提供了氧化三甲胺在制备用于筛选预防或治疗脑卒中的药物的试剂盒中的用途。

根据本发明所述的用途，所述试剂盒是通过检测样品中氧化三甲胺的含量或含量的变化趋势来筛选治疗脑卒中的药物。

优选地，所述的样品为血液，选自血清、血浆或全血。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述脑卒中包括出血性脑卒中(脑出血)、缺血性脑卒中(脑梗塞)、一过性脑缺血发作，优选为脑出血。

发明人进行了大量的动物实验和临床研究，后者采用前瞻性巢式病例-对照研究，对于参与研究的2万多名高血压人群分别检测基线血清TMAO浓度、血压、血脂、血糖及其它血生化指标等，平均观察4.5年，然后对血清TMAO水平与脑血管事件及其预后的关联性进行大量数据分析，并校正了各种影响因素，最终确立了本发明所述的用途。

在本发明中，所述血液TMAO的浓度阈值为1.79μmol/L。具体地，当：(1)所述血液TMAO浓度大于或等于1.79μmol/L时，预测个体发生脑卒中的可能性相对较大，预后较差；(2)所述血液TMAO浓度小于1.79μmol/L时，预测个体发生脑卒中的可能性相对较小，预后较好。

本发明的用途中特别涉及个体患有高血压时所述血液TMAO浓度对于脑卒中发生和预后的预测作用，即对于高血压患者而言，血液TMAO浓度对脑卒中发生及预后的预测作用更显著。本发明中的高血压患者是指临床诊断为原发性高血压的个体，即其收缩压(SBP)≥140mmHg和/或舒张压(DBP)≥90mmHg，并排除继发性高血压的可能。即本发明提供的用途和方法在高血压人群中预测效果最好。具体地，当：(1)所述血液TMAO浓度大于或等于1.79μmol/L、并且个体患有高血压时，预测个体脑卒中发生的可能性较大，预后较差；(2)所述血液TMAO浓度小于1.79μmol/L、并且个体患有高血压时，预测个体脑卒中发生的可能性较小，预后较好。

长期的高血压可引起心、脑、肾等靶器官损害，高血压本身也是脑卒中的重要危险因素，但研究表明，心脑血管事件的发生常常是多种危险因素协同或联合作用的结果，较少可能由单一因素导致。因此，TMAO作为一个协同致病因素，可能在高血压基础上的脑卒中发病过程中发挥重要作用。

综上所述，本发明通过实验表明，血液氧化三甲胺(TMAO)水平与脑卒中、尤其出血性脑卒中的发生高度相关。氧化三甲胺可作为脑卒中发生可能性的指示系统，用于制备诊断脑卒中和/或评估罹患脑卒中的风险的试剂盒、评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后的试剂盒以及筛选预防或治疗脑卒中的药物的试剂盒。特别地，通过测定血液TMAO浓度，再结合患者是否有高血压这一基础疾病，可以更好地预测脑卒中的发生，从而达到早期预防脑卒中、降低医疗成本的目的。

具体实施方式

实施例1：TMAO水平对小鼠血管内皮功能的影响

实验方法：20只8周龄的健康雌性C57BL/6J小鼠(购于第三军医大学动物实验中心)禁食禁水过夜，分为空白组和胆碱组，胆碱组单次灌胃给予胆碱(choline，C7017购自美国Sigma公司，400mg/kg)，空白组给予同等剂量生理盐水，在灌胃后4小时从尾静脉搜集血液样品，离心分离出血浆并储存在-80℃待用。空白组和胆碱组每天灌胃分别给予生理盐水和胆碱，8周后之后从尾静脉搜集血液样品，离心分离出血浆并储存在-80℃待用。

检测方法：利用LC/MS分析检测血浆中TMAO水平。按试剂盒说明书测定一氧化氮NO(硝酸还原酶法)、血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、血清内皮素(ET)水平。一氧化氮、血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶试剂盒、血清内皮素放免试剂盒购于南京建成生物公司。

结果与讨论：相对于空白组，胆碱组小鼠灌胃给药第一天的TMAO水平显著升高，说明高胆碱膳食能显著增加小鼠血浆TMAO的含量，而胆碱组小鼠NO、SOD、CAT、ET水平无显著变化。NO水平可间接反映血管内皮功能；血液中SOD、CAT是清除氧自由基的重要蛋白酶，氧自由基是导致内皮损伤的重要因素；ET是血管内皮细胞分泌的活性物质，是强烈的血管收缩剂。NO、SOD、CAT、ET水平无显著变化，说明此时小鼠血管内皮功能未发生明显变化。结果见表1。

表1.胆碱灌胃第一天小鼠TMAO和血管内皮情况

注：与空白组比较，**P<0.01。

胆碱灌胃8周后，相对于空白组，胆碱组小鼠TMAO水平持续显著增高，NO、SOD水平显著下降、ET水平显著升高，CAT有下降趋势。NO、SOD、CAT、ET是小鼠内皮功能的重要检测指标，NO、SOD、ET水平发生显著改变，CAT有变化趋势，表明小鼠内皮遭到损害，内皮功能受到影响。上述实验数据表明，长期高胆碱膳食造成小鼠TMAO水平持续增高，长期TMAO维持较高水平会严重影响小鼠血管内皮功能。结果见表2。

表2.胆碱灌胃8周后小鼠TMAO水平对血管内皮的影响情况

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

实施例2.TMAO水平对apoE-/-小鼠主动脉粥样硬化的影响

实验方法：16只8周龄的健康雄性apoE-/-小鼠(购于北京大学医学部实验动物中心)随机分为空白组和胆碱组，胆碱组单次灌胃给予胆碱(choline，C7017购自美国Sigma公司，400mg/kg)，空白组给予同等剂量生理盐水，空白组和胆碱组每天灌胃分别给予生理盐水和胆碱，给药16周后处死，眼眶取血。

检测方法：硫代巴比妥酸法测定MDA，主动脉根部连续石蜡切片，5um，40张，每间隔5张取1张，共取8张切片做HE染色，计算机病理图像分析软件测定AS斑块大小；链霉素和素-生物素复合物(SABC法)测定主动脉璧VCAM-1表达。

结果与讨论：apoE-/-小鼠连续16周灌胃给予胆碱，TMAO水平明显升高，表明长期应用高胆碱膳食，造成apoE-/-小鼠TMAO水平异常。相对于空白组，胆碱组小鼠MDA水平显著升高；官腔面积无明显变化，但斑块面积显著增加；VCAM-1表达显著升高。

apoE-/-小鼠可自发形成粥样硬化，目前是探讨粥样硬化发生发展及研究干预手段的动物实验模型。MDA水平的高低可反映机体内脂体过氧化程度，从而反映出细胞损伤程度。相对于空白组，胆碱组小鼠TMAO水平升高可显著提高MDA水平，提示TMAO水平升高促进细胞损伤。空白组和胆碱组的管腔面积相比无明显变化，而斑块面积明显增大，表明TMAO水平升高可促进斑块形成及扩大，同时在胆碱组apoE-/-小鼠可见脂纹、纤维斑块、粥样斑块等粥样硬化不同发展阶段的病变，而空白组则不明显。经计算机图像灰度扫描分析，胆碱组主动脉壁粥样硬化病变中VCAM-1表达显著高于空白组，作为细胞粘附分子的VCAM-1街道了单核细胞、淋巴细胞等慢性炎症下包粘附于血管内皮细胞，诱导粥样硬化的行程与发展，是粥样硬化的重要指标。

表3.apoE-/-小鼠TMAO水平对主动脉粥样硬化的影响

注：与空白组比较，**P<0.01。

实施例3：血清TMAO水平与脑卒中风险关系的巢式病例对照研究(一)方法

本研究期间为2008年至2013年，患者(研究对象)入选标准为：1)年龄45～75岁(含)，男女不限；2)符合原发性高血压诊断标准，排除继发性高血压；3)既往无脑卒中和心肌梗死病史；4)自愿参加并签署知情同意书。病例数为20702人，其中依那普利叶酸组(A组)、依那普利组(B组)各占半数，两组患者分别口服“依叶”(10mg/0.8mg)或依那普利片(10mg)，均为每日1次、每次1片，连续服用4.5年(中位数)。主要疗效指标(主要终点)为首次症状性脑卒中发作(缺血性或出血性，排除蛛网膜下腔出血)，次要疗效指标(次要终点)包括首发缺血性脑卒中(致死或非致死)、首发出血性脑卒中(致死或非致死)。应用上述CSPPT资源，发明人实施本项巢式病例-对照研究，其中病例组为622例首发脑卒中患者，对照组来自同一CSPPT队列，为配对的622例未发生脑卒中的健在患者，并在性别、年龄(±1岁)、治疗干预(组)和研究地点等方面与前者1:1匹配。

实验室检查：对全部病例的基线空腹静脉血样本进行检测，包括：

1)生化常规(血糖、血脂三项、同型半胱氨酸等)：应用全自动生化分析仪(BeckmanCoulter公司)测定(南方医院肾脏病国家临床研究中心实验室)；

2)血清TMAO、胆碱、肉毒碱水平：应用同位素液相色谱串联质谱仪(6460系列LC/MS；美国安捷伦科技公司)进行测定。

统计方法：采用R软件3.4.1版本及Empower(R)进行统计分析，基线资料一般采用均数(标准差)表示，连续变量用中位数(第25,75百分位数)表示，分类变量用占比表示。两组间基线特征比较时分类变量采用条件Logistic回归分析，连续变量采用一般配对t检验，脑卒中相对风险(RR)与血清TMAO(连续或分类变量)关系的分析采用条件Logistic回归模型，不校正或校正年龄、性别、体重指数(BMI)、吸烟、收缩压(SBP)、血糖、总胆固醇(TC)、胆碱等；此外，血清TMAO二分变量(<1.79μmol/L与≥1.79μmol/L)与脑卒中关系的可能修饰作用采用分层分析和交互检验进行评估。

(二)结果与讨论

1、基线特征

病例组622个脑卒中事件中，502例为首发缺血性卒中，118例为首发出血性卒中，剩余2例为病理类型不明确的卒中。两组人群的基线特征见表4和表5，其中在年龄、性别、吸烟、甘油三酯等方面两组基本相似，无显著差异，但病例组BMI、糖尿病人数及血糖值、血压、TC大于或高于对照组；如果对血清TMAO水平进行三分位比较，可以看出，年龄越大、血糖越高(与糖尿病例数多有关)或者TC及胆碱水平越高者，其血清TMAO水平倾向于越高。

表4.两组人口的基线特征比较*

*数值表达为均数(标准差)；数值表达为均数(四分位范围)。

表5.按TMAO三分位划分的人口特征*

*数值表达为均数(标准差)；数值表达为均数(四分位范围)。

2、血清TMAO水平与脑卒中风险关系

本研究随访周期平均4.5年。发明人分析一下血清TMAO水平与脑卒中的关系，如表3所示：总体来看，首发脑卒中风险随血清TMAO水平升高而增加(每增加一个自然对数TMAO:RR＝1.22，95％CI:1.02-1.46)；当对TMAO水平三分位时，与最低分位水平(<1.79μmol/L)相比,中分位(1.79～<3.19μmol/L)和最高分位(≥3.19μmol/L)首发脑卒中风险的校正OR值(95％CI)分别是1.27(0.91-1.77)和1.43(1.02-2.01)。合并到一起，TMAO高分位(≥1.79μmol/L)患者比最低分位(<1.79μmol/L)患者的首发脑卒中风险增高34％(OR＝1.34，95％CI:1.00-1.81,P＝0.049，表3)；同样，TMAO≥1.79μmol/L患者比<1.79μmol/L患者的首发出血性脑卒中(OR＝2.34，95％CI:1.09-5.00)、缺血性脑卒中(OR＝1.25，95％CI:0.90-1.74)风险均有显著增高,尤其出血性脑卒中更为显著。分别校正血压、血糖、总胆固醇、吸烟等传统危险因素(模型1)以及在此基础上进一步校正胆碱和L-肉毒碱(模型2)的影响后，上述TMAO水平与脑卒中相关性仍然成立(表6)。但需要指出的是，血清胆碱或L-肉毒碱水平与首发脑卒中风险之间并无明显相关性。

表6.基线TMAO水平与卒中风险的关系

模型1校正了血压、血糖、总胆固醇、吸烟等传统危险因素；模型2校正了模型1所有变量以及胆碱和L-肉毒碱。

3、协变量分层分析

根据协变量，我们对亚组中血清TMAO水平与首发脑卒中、出血性脑卒中、缺血性脑卒中风险的关系也进行了分层分析，发现与高肉毒碱水平组(≥47.8μmol/L)相比，低肉毒碱水平组(<47.8μmol/L)患者血清TMAO二分位水平(≥1.79vs.<1.79μmol/L)与首发脑卒中风险之间存在更显著的正相关，而在出血性脑卒中、缺血性脑卒中患者中也观察到类似趋势；但其它变量，如TC、糖尿病、胆碱等并未发现这种对血清TMAO水平与首发脑卒中关系的修饰作用。

总之，本项巢式病例-对照研究结果提示，在成年高血压患者中，血清TMAO水平升高与首发症状性脑卒中风险增加之间有显著的正相关，尤其与首发出血性脑卒中的相关性更为显著，即使调整了各种混杂因素(如血压、血糖、总胆固醇、胆碱、吸烟等)，这种关联性仍十分明显，这些结果提示TMAO可能是一个新型的脑卒中危险因子或生物标记物，在高血压基础上，具有预测脑卒中发生风险的应用价值，即：当TMAO≥1.79μmol/L时，预测高血压个体脑卒中发生的可能性较大，预后较差；当TMAO<1.79μmol/L时，预测高血压个体脑卒中发生的可能性较小，预后较好。

Claims (10)

1.氧化三甲胺在制备用于诊断脑卒中和/或评估罹患脑卒中的风险的试剂盒中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂盒是根据样品中氧化三甲胺的含量或含量的变化趋势来诊断脑卒中和/或评估罹患脑卒中的风险。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的样品为血液，选自血清、血浆或全血。

4.氧化三甲胺在制备用于评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后的试剂盒中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述试剂盒是根据样品中氧化三甲胺的含量或含量的变化趋势来评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的样品为血液，选自血清、血浆或全血。

7.氧化三甲胺在制备用于筛选预防或治疗脑卒中的药物的试剂盒中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述试剂盒是通过检测样品中氧化三甲胺的含量或含量的变化趋势来筛选治疗脑卒中的药物。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的样品为血液，选自血清、血浆或全血。

10.根据权利要求1-9之一所述的用途，其特征在于：所述脑卒中包括出血性脑卒中(脑出血)、缺血性脑卒中(脑梗塞)、一过性脑缺血发作。