CN110548016A - 抗Epha3抗体修饰修饰的经鼻入脑的纳米粒子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种经鼻入脑的纳米粒。具体而言，本发明涉及一种抗Epha3抗体修饰的含有化药的纳米粒，用于治疗胶质瘤和医学成像中的用途。

Description

抗Epha3抗体修饰修饰的经鼻入脑的纳米粒子及其用途
技术领域
本发明涉及一种经鼻入脑的纳米粒子。具体而言，本发明涉及一种抗Epha3抗体修饰的包括PLGA或其衍生物和化药形成纳米颗粒，及其用于诊断和治疗脑胶质瘤，以及医学成像中的用途。
背景技术
脑胶质瘤(GBM)是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，发病率为每10万人口5-8人。该肿瘤具有高度侵袭性，5年生存率低于5％(Gao,H.等,2014,生物材料,35:2374-2382)。尽管在手术，神经影像学，放疗和化疗方面取得了显著进展，但GBM患者的预后仍然较差，中位生存期小于1年(Attenello,F.J.等,2008,肿瘤外科,15:2887-2893)。替莫唑胺(TMZ)是一种DNA烷化剂，是治疗GBM最有效的抗肿瘤药物，经美国FDA批准用于临床。目前，TMZ是治疗神经胶质瘤的术后一线药物，可口服或静脉注射(SaurabhSharma,K.I.,2017,Ther Deliv,87:475-477)。然而，由于其短暂的血清半衰期和剂量限制副作用，TMZ的全身递送只能作为放射治疗的辅助治疗，带来益处有限(Chakravarti,A.等,2006,Clin Cancer Res,12:4738-4746)。此外，TMZ长期全身给药会导致血液毒性，急性心肌病，口腔溃疡和骨髓抑制等一些毒副作用(Van Anh Trinh,S.P.P.W.-J.H.,2009,药物安全评价，84:493-499)。因此，王永峰等人在TMZ分子引入了4-10个碳的碳链，成功合成了TMZ酯化物，并证明这些酯化物与TMZ具有相当的活性(王永峰,2006；王永峰，侃维，盘娜熙,2006)。但是，迄今为止，还没有研究报道过TMZ酯化物的相关制剂。基于纳米粒子的药物递送系统已经被广泛研究用于GBM的研究和治疗。在这些体系中，聚丙交酯乙交酯(PLGA)由于其可生物降解性，生物相容性和多功能性在药物递送中显示出很大的应用前景。然而，TMZ在水性介质和有机介质中溶解性差，导致其包载于PLGA纳米粒子比较困难(Lee,C.Y.和I.H.Ooi,2016,Pharmaceuticals(Basel),93)。
最近有研究报道制备TMZ微球缓释植入物(Zhang,Y.H.等,2010,Eur J PharmBiopharm,76:371-375)，但患者依从性差。TMZ静脉注射制剂会使得药物在全身分布(Song,S.等,2016,Drug Deliv,23:1404-1408)，且治疗效果不好。还有人提出TMZ制剂的经鼻递送能促进更多药物进入大脑，从而避免全身副作用(Khan,A.等,2016,Mol Pharm,13:3773-3782)。不可否认的是，与其他施用途径相比，鼻-脑递送靶向系统对于治疗GBM有许多优势。鼻黏膜和大脑之间的神经连接为药物的非侵入性递送提供了独特的方法(Khan,A.R.等,2017,J Control Release,268:364-389)。药物通过嗅球和三叉神经途径直接进入大脑，并且绕过血脑屏障避免了全身副作用。然而，在施用期间需要考虑严重影响药物可持续吸收的鼻黏膜的清除作用(Djupesland,P.G.,2013,Drug Deliv Transl Res,3:42-62)。
黏膜粘附性聚合物可用于增加鼻腔滞留时间。壳聚糖通常用作鼻腔粘合剂，但其在中性pH条件下不溶解，也不具有粘附性(Gartziandia,O.等,2015,Colloids Surf BBiointerfaces,134:304-313)。然而，通过还原甲基化壳聚糖制备的N-三甲基化壳聚糖(TMC)显示出良好的粘附性和溶解性(Hagenaars,N.等,2010,J Control Release,144:17-24)。研究人员已经使用过TMC来增强鼻腔粘连并克服鼻腔清除(du Plessis,L.H.等,2010,Drug Deliv,17:399-407)。
为了促进向GBM的药物递送，研究人员经常使用一些特异性配体靶向GBM中过表达的受体(Fan,K.等,2018,ACS Nano)。Ephrin A型受体3(EPHA3)是一种膜相关受体，特别是在神经胶质瘤中基质和脉管系统中过度表达，但不存在于正常组织中，可用作治疗GBM的功能性靶标(Janes,P.W.等,2014,Growth Factors,32:176-189)。Anti-EPHA3，是一种重要的非岩藻糖基化IgG1κ(人类f-同种异型)单克隆抗体，可以靶向受体酪氨酸激酶EPHA3(Swords,R.T.等,2016,Leuk Res,50:123-131)。此外，anti-EPHA3已被用于临床前模型，并显示出显著的功效和低毒性(Vail,M.E.等,2014,Cancer Res,74:4470-4481)。目前，Anti-EPHA3(KB004)已进入I期临床试验阶段。这些研究结果表明，anti-EPHA3是一种合适的配体，可用于增强鼻-脑递送药物靶向GBM。
目前尚无一种使用anti-EPHA3修饰的PLGA纳米粒子用于治疗GBM的鼻-脑递送靶向纳米系统。Anti-EPHA3修饰旨在靶向GBM，而TMC涂层旨在增加对鼻黏膜的粘附。
发明内容
本发明涉及一种经鼻入脑的纳米粒子，包括PLGA或其衍生物和化药形成纳米颗粒。其特征在于所述纳米颗粒经过抗Epha3抗体修饰。
在本发明的一个方面中，所述抗Epha3抗体是人源的。
在本发明的一个方面中，所述化药是替莫唑胺或其衍生物。
在本发明的一个方面中，所述化药是亲脂性碳化菁DiOC18(7)，即DiR。
在本发明的一个方面中，所述纳米粒子还涂覆有粘性聚合物。
在本发明的一个方面中，所述粘性聚合物是壳聚糖及其衍生物。
在本发明的一个方面中，所述壳聚糖衍生物是N-3甲基壳聚糖。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的经鼻入脑的纳米粒子用于制备治疗脑胶质瘤的方法，包括将本发明的纳米粒给予有需要的受试者。优选地，所述脑胶质瘤选自星型细胞瘤、少枝细胞瘤、混合胶质瘤和室管膜瘤。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的经鼻入脑的纳米粒子用于生物医学成像的方法，包括将本发明的纳米粒给予有需要的受试者。为脑胶质瘤提供诊断方法。
在本发明的一个方面中，本发明涉及的经鼻入脑的纳米颗粒的粒径范围为120-160nm。
在本发明的一个方面中，本发明涉及的经鼻入脑的纳米颗粒由不同乳酸和羟基乙酸的比例的PLGA构成，内部化药的持续释放长达48小时。
在本发明的一个方面中，本发明涉及的经鼻入脑的纳米颗粒抗-EPHA3抗体修饰后，对16HBE细胞系和C6细胞系的活力没有影响，显示了其安全性。
在本发明的一个方面中，本发明涉及的经鼻入脑的纳米颗粒抗-EPHA3抗体修饰后，与未经修饰的TMC-NPs相比，可以极大地增加细胞对NPs的摄取,4h内摄入量近100％。
在本发明的一个方面中，本发明涉及的经鼻入脑的包载DiR纳米的颗粒抗-EPHA3抗体修饰后，与未经修饰的NPs相比，荧光蓄积在脑中，特别是在肿瘤部位。
附图说明
图1示出了TMZ和TBE的1H-NMR的图谱。
图2示出了纳米粒的电子显微镜透视图。
图3示出了TBE制剂的体外释放曲线。
图4示出了胶质瘤组织，C6细胞和16HBE细胞中的EPHA3表达量。
图5A示出了TBE NPs对16HBE细胞的毒性。
图5B示出了空白NPs对16HBE细胞的毒性。
图5C示出了TBE NPs对C6细胞的毒性数值代表平均值±SD(n＝3)。
图5D示出了空白NPs对C6细胞的毒性数值代表平均值±SD(n＝3)。
图6A示出了包载尼罗红NPs孵育的C6细胞的荧光显微镜图像。
图6B示出了通过流式细胞术测定的C6细胞对香豆素-6NPs摄取的平均百分比。
图7A示出了在鼻内施用包载DiR NPs后胶质瘤模型鼠的脑部荧光成像。
图7B示出了在鼻内和静脉内给药后4小时，anti-EPHA3修饰的包载DiR NPs的体内和离体组织成像。
图8示出了不同香豆素-6NPs在胶质瘤鼠脑部的分布。
图9A示出了TBE NPs不同制剂处理后的神经胶质瘤大鼠的存活曲线(每个n＝10)。
图9B示出了TBE NPs不同制剂处理后的神经胶质瘤大鼠中肿瘤细胞的凋亡。
图9C示出了各组大鼠肿瘤细胞凋亡的定量表达。
具体实施方式
参照以下实施例可以更好地理解本发明。但是，应理解，以下实施例仅用于举例说明目的，而不应被理解为以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1.替莫唑胺丁酯(TBE)的合成与表征
称取0.5g替莫唑胺(TMZ)(武汉阜新化工有限公司)，在搅拌的状态下缓慢分散于浓硫酸(4ml)中，然后在15℃下逐滴加入饱和亚硝酸钠水溶液(摩尔比为1:10，采取冰水浴控制温度)，待反应释放红棕色气体后继续搅拌5小时。称量适量碎冰(8g)于小烧杯内，将反应液倾倒于碎冰中，搅拌，有白色沉淀析出。收集产物真空抽滤、洗涤，得到白色或米白色中间产物替莫唑胺酸(TMZA)，干燥。
将1.56mmol的TMZA溶解于6mL N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，并依次加入1.56mmol的正丁醇，4.68mmol的二环己基碳化二亚胺脱水剂和0.312mmol的4-二甲基氨基吡啶催化剂。将反应置于室温条件下磁力搅拌，并通过高效液相色谱(HPLC)监测，直至反应不再继续进行。
通过验证TBE的核磁氢谱图(图1)。TBE以d6-CDCl3为溶剂的核磁氢谱图，其中特征峰包括0.98ppm(t,3H,C-CH 3)，1.50ppm(sext,2H,C-CH 2-CH3)，1.80ppm(q,2H,C-CH 2-CH2)，4.48ppm(t,2H,O-CH 2)，在图1中显示了3.88ppm(-CH3)，7.6-7.7ppm(-CONH2)和8.77ppm(-CH)处TMZ的峰。图1显示在4.45ppm(-O-CH2-C-)，1.79ppm(-C-CH2-C-)和1.46ppm(-C-C-CH3-)处的TBE的化学位移，表明成功合成了TBE。基于液相检测，TBE的纯度达到98％。
实施例2.纳米粒的制备和表征
乳化-溶剂挥发法用于制备TBE NPs。本研究采用乳化溶剂挥发法制备包载TBE的纳米粒，制备的纳米粒所用的材料和药物均是精密称量和量取。精密称取PLGA10mg和TBE1mg溶于1mL二氯甲烷和丙酮的混合液中，为油相。配制并量取10mL含有1％聚乙烯醇(PVA)的水溶液，为水相。在冰水浴的条件下，将油相逐滴加入水相中，以一定的功率(300w)和时间(75s)超声均质后，在室温条件下，磁力搅拌约4小时将有机相除尽，即得普通的替莫唑胺丁酯PLGA纳米粒(P-TBE-NPs)。通过离心收集纳米粒并用去离子水洗涤以除去游离的TBE。以颗粒大小和载药量作为评价指标进行油相组成，油/水比率，聚合物浓度和理论载药量的单因素研究。
以相同的方式制备尼罗红，香豆素-6-和DiR(1,1-双十八烷基-3，-3，-3'，-3'-四甲基吲哚三羰花青碘)(阿拉丁)包载的纳米粒，用于评估脑中纳米粒的摄取和分布。
根据孟庆庆等人的报道，合成了TMC和马来酰亚胺(Mal)-TMC并通过1H-NMR验证。TMC用于涂层PLGA-NPs以制备TMC-NPs，并将anti-EPHA3抗体(Monoclonal Anti-EPHA3,货号：SAB1403777-100UG，Sigma-Aldrich)与涂层有Mal-TMC的PLGA-NPs偶联以制备anti-EPHA3-NPs。根据Huwyler方法(Huwyler J,W.D.和Pardridge WM,1996,P NATL ACAD SCIUSA,93:14164-14169)，是通过与过量的Traut's试剂以20:1的摩尔质量反应1小时，将anti-EPHA3硫醇化。使用Sephadex G25柱纯化产物，并将纯化的硫醇化抗体在室温下以1:5的anti-EPHA3：Mal摩尔比与Mal-TMC-NPs偶联8小时。使用凝胶过滤纯化anti-EPA3-NPs以除去未缀合的抗体。使用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)评估抗体偶联效率。
使用动态光散射粒度分析仪(Deisa TM Nano C；Beckman Coulter，Brea，CA，USA)测量纳米粒的平均直径，多分散指数和ζ电位。用透射电子显微镜(TEM)(H-600；日立，东京，日本)用1％(w/v)磷钨酸钠溶液负染色来研究纳米粒的形状和表面形态。通过紫外(UV)分光光度法测量纳米粒的载药量。将样品置于超滤装置(100-kDa截留分子量；Sartorius，Gttingen，德国)中，并在4℃以3600rpm离心10分钟以分离游离药物。用相同体积的样品测定总的药物量。流动相由甲醇和0.5％乙酸(3:1，v/v)组成，流速保持在1mL/min，并且在327nm进行UV检测。使用HPLC系统(LC-20AVP；Shimadzu，Kyoto，Japan)测量TBE和香豆素-6的浓度，而通过UV分光光度法测量尼罗红和DiR的浓度。
如表1所示，基于单因素研究的结果，选择了制备TBE纳米粒子的条件。TBE NPs的粒径范围为120-170nm，由于TMC的修饰和anti-EPHA3的结合，TMC-NPs和anti-EPHA3-NPs的平均直径比PLGA-NPs的大，但其符合用于鼻腔给药的NPs的直径要求。正如预期的那样，TMC涂层的NPs带正电荷，而PLGA-NPs是负电位(Sheng,J.等,2015,ACS Appl MaterInterfaces,7:15430-15441)。多分散指数小于0.2表明纳米粒子的粒径分布均匀。
表1.TBE NPs制备单因素的考察结果
表2.L9(33)正交试验结果
主体间效应的检验
因变量载药量
a.R方＝.998(调整R方＝.992)
由方差分析可知，影响因素中聚合物浓度对替莫唑胺丁酯纳米粒的载药量具有显著的影响，而油水比和理论载药量对其的影响较小，三个因素的主次关系是：聚合物浓度>油水比>理论载药量。由此可知，各因素的最优组合为A2B1C2,按照最佳工艺，乳化-溶剂挥发法制备的anti-EPHA3-NPs的载药量为29.02±0.68％。Anti-EPHA3的结合效率为8.1±1.5％。如图2所示，所制备的纳米粒子全部为球形颗粒，没有粘附或聚集，并且三种类型的纳米粒子在粒度分布上没有显着差异。
实施例3.体外TBE释放研究
取TBE纳米粒置于透析袋中，透析袋置于0.1M PBS(pH 7.4)中，在37℃的摇床上透析。在预定时间间隔，从透析袋外取出1mL PBS，并用等体积的PBS补充。在不同的时间(0至96小时)收集样品并使用如上所述的HPLC分析TBE。TBE溶液在PBS中的释放作为对照。
图3显示了样品的药物释放曲线。TBE溶液从透析袋中快速释放(4小时内)，而包载TBE的PLGA-NPs，TMC-NPs和anti-EPHA3-NPs持续释放长达48小时。
实施例4.分析EPHA3的表达
为了证实EPHA3在GBM上的特异性表达，通过ELISA人EPHA3酶联免疫吸附试验试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)检测人支气管上皮细胞(16HBE)、C6细胞(中国北京中原有限公司)和神经胶质瘤组织中的EPHA3定量表达。根据试剂盒手册使用双抗体夹心ELISA方法，并将抗人EPHA3抗体包被在酶标记板上。收集细胞和组织并匀浆，通过BCA试剂盒测定上清液中总蛋白质浓度。根据制造商的说明书，使用ELISA测定总蛋白浓度相同的上清液确定EPHA3的浓度。
EPHA3仅在胶质瘤细胞中表达，特别是在肿瘤基质和脉管系统中，但在正常细胞中不表达(Janes,P.W.等,2014,Growth Factors,32:176-189)。在我们的研究中，我们选择了C6(EPHA3+)和16HBE(EPHA3—)作为模型细胞，并首先证实了EPHA3的表达。在胶质瘤组织，C6细胞和16HBE细胞中通过ELISA测定EPHA3表达水平。如图4所示，EPHA3在胶质瘤组织和C6细胞中的表达水平显着高于胶质瘤组织，而在16HBE细胞中几乎没有表达。
实施例5.体外细胞毒性测定
使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)(Sigma-Aldrich)测定评估包载TBE的NPs对C6和16HBE细胞的毒性。简而言之，将细胞以5×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中并在37℃和5％CO2下的培养箱里温育24小时。然后，将16HBE细胞用包载TBE的NPs或空白NPs孵育6小时，而C6细胞用上述制剂孵育48小时。温育预定时间后，向每个孔中加入MTT溶液(20μL)，然后温育4小时。然后，除去培养基，加入200μL的DMSO(Sigma-Aldrich)。在轻轻振荡10分钟后，使用酶标仪(SpectraMax M2，Molecular Devices，SanJose，CA，USA)在570nm波长下测量吸光度。通过比较NPs处理的细胞与对照样品的吸光度来确定细胞活力。
为了评价鼻用anti-EPHA3-NPs的安全性，将16HBE细胞系用作鼻粘膜细胞的模型(Bi,C.等,2016,Int J Nanomedicine,11:6547-6559)。考虑到鼻清除能力，将细胞毒性实验的持续时间设定为6小时。图5A和5B显示，包载TBE或空白的PLGA-NPs，TMC-NPs和anti-EPHA3-NPs对细胞活力的影响方面没有显著差异，表明通过使用抗-EPHA3-NPs作为载体将TBE经鼻递入脑是安全可行的。
为了评估包载TBE的NPs对肿瘤细胞的细胞毒性，如图5C所示，将C6细胞与不同浓度的包载TBE的不同NPs一起温育48小时，NPs以浓度依赖性方式抑制细胞活力。在每个预设浓度下，anti-EPHA3-TBE-NPs显示出对C6细胞最强的生长抑制，其次是TMC-TBE-NPs，表明anti-EPHA3修饰的NPs具有靶向C6细胞的能力，这可能是由于anti-EPHA3与受体结合，从而增加了NPs的细胞摄取。此外，在0.23-2.35mg/mL的PLGA浓度范围内发现载体相关的细胞毒性可忽略不计(图5D)。此外，TMC-NPs对细胞活力的影响比未涂布组更强，这可能是由于带正电荷的TMC-NPs更易于附着带负电荷的细胞。
实施例6.细胞摄取研究
为了研究NPs的细胞摄取，将C6细胞与包载尼罗红的NPs一起孵育并通过荧光显微镜(Eclipse E400；Nikon Corporation，Tokyo，Japan)进行定性分析，同时使用流式细胞仪(BD Accuri TM C6Plus；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)对包载香豆素-6的NPs进行定量分析。
为了定性分析，将C6细胞接种到24孔板(每孔1mL培养基中1×105个细胞)中，并在37℃，5％CO2下孵育。24小时后，将细胞与相同浓度(1μg/mL)包载尼罗红的PLGA-NPs，TMC-NPs和anti-EPHA3-NPs孵育0.5，1和2h。温育后，将细胞用PBS洗涤三次，并用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟。使用荧光显微镜进行图像分析。
为了定量分析，将C6细胞接种到6孔板(每孔2mL培养基中4×105个细胞)中，并在37℃和5％CO2下温育。24小时后，将细胞与相同浓度(4ng/mL)包载香豆素-6的PLGA-NPs，TMC-NPs和anti-EPHA3-NPs温育0.25、0.5、1和2h。然后用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，并用PBS洗涤三次。最后，通过流式细胞术分析1×104个细胞以确定香豆素-6的摄取。
荧光显微镜用于定性评估C6细胞对NPs的摄取，如图6A所示。NPs的细胞摄取呈现时间依赖性方式。用anti-EPHA3修饰的NPs处理的C6细胞比未修饰的NPs处理的细胞发出更强的荧光，并且TMC-NP处理组的荧光强度高于PLGA-NP组。这与流式细胞术定量分析的结果类似(图6B)，在每个测试时间点TMC-NPs的摄取显着高于PLGA-NPs(p<0.01)，表明TMC粘附可以改善细胞摄取，和以前的研究有相似的结果(Drin,G.等,2003,J Biol Chem,278:31192-31201)。此外，anti-EPHA3-NPs和TMC-NPs之间在0.5到4小时之间存在显着差异(p<0.01)，表明用抗-EPHA3修饰可以极大地增加细胞对NPs的摄取。
不同时间点各组纳米粒的荧光摄取百分比(％)
时间(min) 15 30 60 120 240
PLGA-NP 13 18.6 25.9 28.3 40.5
TMC/PLGA-NP 26 57.9 68.2 64.6 71
EphA3-TMC/PLGA-NP 32.3 78.2 92.3 86.3 97.3
实施例7.体内成像分析
7.1大鼠脑胶质瘤模型
将雄性Sprague-Dawley大鼠(体重180-220g)(山东绿叶制药有限公司)喂养在聚乙烯笼中，12小时光照/黑暗循环下维持22℃，使其随意取用食物和水。通过C6细胞的颅内植入诱导GBM生成。简言之，通过腹膜内(ip)注射10％水合氯醛(0.4mL/kg)麻醉大鼠，然后将C6细胞(6μL DMEM培养基(美国Gibco公司)中的1×106个细胞)使用微量注射器立体定向注入右侧尾状核(前囟外侧3毫米，硬脑膜深5毫米)(Hua,H.等,2018,Int J Pharm,543:179-189)。伤口缝合并用碘伏消毒。肌内注射青霉素，仔细监测大鼠直至麻醉恢复。所有的动物实验都是根据烟台大学动物实验伦理委员会(中国烟台)的指导方针进行的，符合欧盟指令2010/63/EU和国家卫生研究院的动物实验指南。
7.2体内成像
将颅内带胶质瘤的大鼠随机分为4组，其中三组分别经鼻黏膜给予包载DiR的PLGA-NPs，TMC-NPs和anti-EPHA3-NPs，最后一组尾静脉注射包载DiR的anti-EPHA3-NPs(0.5mg/kg)。使用体内成像系统在预定时间点(1，2，4和8h)进行实时成像。随后，处死一部分大鼠，收集器官，包括脑，心脏，肝脏，脾脏，肺脏和肾脏，用于成像。
为了评估体内anti-EPHA3-NPs的胶质瘤靶向效果，将包载DiR的PLGA-NPs，TMC-NPs和anti-EPHA3-NPs给予胶质瘤模型鼠，并进行实时体内成像。分别将荧光强度进行分级表示：从弱到强分别是1、2、3、4、5五级。图7A显示了经鼻给药后1，2，4和8h时，NPs在大鼠体内的荧光分布。4小时时，Anti-EPHA3-NPs在脑内的荧光信号(5级)高于TMC-NPs(3级)和PLGA-NPs(2级)，表明anti-EPHA3修饰的NPs可通过鼻内给药将更多药物递送到脑中。为了证明鼻腔给药可以促进药物递送到脑中并减少全身分布，进行比较了静脉和鼻内给药后大鼠体内荧光的分布。在图7B中显示了在鼻内和静脉内施用包载DiR的anti-EPHA3-NPs 4小时后的大鼠和离体组织中的荧光分布。鼻内给药的大鼠体内，NP荧光蓄积在脑中，特别是在肿瘤部位，荧光显示4级强度，由于从鼻腔吸入所以在肺中也显示了少量荧光(1级)。同时，静脉注射后，荧光分布在全身器官中，肝脏是4.5级，胰脏是3级，肺是2级，脑部是1.5级。这些现象表明鼻腔给药可以促使更多药物进入大脑并减少周边分布。总体而言，上述结果表明anti-EPHA3修饰的NPs通过鼻-脑递送途径可以增强药物靶向于胶质瘤。因此，通过这种递送方式来评估anti-EPHA3修饰的NPs靶向治疗GBM的效用。
实施例8.纳米粒的脑内分布
为了定性分析NPs的脑生物分布，在C6细胞植入后第14天将胶质瘤模型大鼠随机分成三组，并且使用包载香豆素-6的PLGA-NPs，TMC-NPs和anti-EPHA3-NPs(0.5mg/kg)经鼻递送。给药后4小时，通过腹膜内注射10％水合氯醛麻醉大鼠，然后用生理盐水和4％多聚甲醛溶液进行心脏灌注。将鼠的大脑取出，在4％多聚甲醛中固定24小时，并在15％和30％蔗糖溶液中脱水。然后将大脑嵌入OCT(Sakura Finetek USA)化合物，在-80℃冷冻，然后制备10μm厚度的切片。切片用赫斯特33342(阿拉丁)染色5分钟并用PBS洗涤三次。最后，使用荧光显微镜对切片进行成像和分析。
为了观察NP在脑中的分布，在鼻腔给予NPs 4小时后，制备胶质瘤模型鼠的大脑的冷冻切片。在图8中，细胞核用赫斯特33342(蓝色)染色，而NP是绿色的。将纳米粒的荧光强度进行分级表述，分别是1、2、3、4级。在PLGA-NP组的切片中观察到荧光是比较弱而且均匀(荧光强度1级)，而在TMC-NP组的切片中可以观察到明显的荧光强度(荧光2级)，表明TMC粘附可促进NP递送至脑中。尤其anti-EPHA3-NP在胶质瘤部分处显示出比TMC-NP和PLGA-NP更高的荧光信号(荧光4级)，在正常组织分布荧光强度为1.5级。表明anti-EPHA3修饰的NP更可能多的入脑并在肿瘤内累积。
实施例9.体内抗胶质瘤活性
为了评估各种制剂的体内抗胶质瘤活性，将具有颅内胶质瘤的大鼠分成五组，经鼻给予盐水，TBE溶液，PLGA-TBE-NPs，TMC-TBE-NPs和anti-EPHA3-TBE-NPs(5mg/kg)。在C6细胞植入后6，7，8，9和10天进行给药。在第15天，每组处死一只大鼠，分离大脑以制备石蜡切片(10μm)(Kumari,S.等,2017,Sci Rep,7:6602)。使用TUNEL凋亡检测试剂盒(碧云天显色方法)检测凋亡的神经胶质瘤细胞，使用Image-Pro Plus 5软件(Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA)对其进行计数。其他大鼠(每组10只)用于计算存活时间。
通过胶质瘤模型鼠来评估具有或不具有靶向配体包载TBE的NPs的抗神经胶质瘤效果。如图9A所示，生理盐水，TBE溶液，PLGA-TBE-NP组、TMC-TBE-NPs组和anti-EPHA3-TBE-NPs的模型鼠的中位生存时间分别为17，18，19 22，26天。基于脑肿瘤的TUNEL染色也可得出同样的结论(图9B)，这些图像表明，与用其他制剂处理的大鼠相比，用anti-EPHA3-TBE-NPs处理的胶质瘤模型鼠中神经胶质瘤细胞的凋亡显著增加。图9C的结果显示anti-EPHA3-TBE-NP组中凋亡神经胶质瘤细胞的百分比显着高于TMC-TBE-NP组(p<0.05)，也显著高于PLGA-TBE-NP组中神经胶质瘤细胞的凋亡(p<0.01)。这些结果证实anti-EPHA3修饰可以增强抗胶质瘤效应。

Claims (10)

1.一种经鼻入脑的纳米粒子，包括PLGA或其衍生物和化药形成纳米颗粒。其特征在于所述纳米颗粒经过抗Epha3抗体修饰。
2.根据权利要求1所述的经鼻入脑的纳米粒子，其特征在于，所述抗Epha3抗体是人源的。
3.根据权利要求1所述的经鼻入脑的纳米粒子，其特征在于，所述化药是替莫唑胺或其衍生物。
4.根据权利要求1所述的经鼻入脑的纳米粒子，其特征在于，所述化药是亲脂性碳化菁DiOC18(7)。
5.根据权利要求1所述的经鼻入脑的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子还涂覆有粘性聚合物。
6.根据权利要求5所述的经鼻入脑的纳米粒子，其特征在于，所述粘性聚合物是壳聚糖及其衍生物。
7.根据权利要求6所述的经鼻入脑的纳米粒子，其特征在于，所述壳聚糖衍生物是N-3甲基壳聚糖。
8.根据权利要求1-7中任一项的经鼻入脑的纳米粒子用于制备治疗胶质瘤的药剂的用途。
9.根据权利要求1-7中任一项的经鼻入脑的纳米粒子用于制备生物医学成像试剂中的应用。
10.一种经鼻入脑的纳米粒子的制备方法，乳化-溶剂挥发法制备含有PLGA或其衍生物和化药的纳米颗粒，所述纳米颗粒表面涂覆粘性聚合物用三甲基壳聚糖，用加成反应方法偶联抗Epha3抗体。
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