CN110546251A - 成体多能干细胞的制备、扩增及应用 - Google Patents

Abstract

存在于哺乳动物的外周血中的某些相对较小的细胞能够被活化以形成多能干细胞群。这些小细胞通常直径小于5μm，并且是CD45阳性的，在本文中称为CD45⁺细胞或休眠的微小细胞。因此，提供了含有来自血液样品的富集的休眠的微小细胞的细胞群和组合物、以及活化这些休眠的微小细胞的方法和组合物。分化后，活化的干细胞能够被用于各种治疗目的。

Description

成体多能干细胞的制备、扩增及应用

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119(e) 要求2017年4月4日提交的美国临时申请序列号62/481,554的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景

干细胞的鉴定和表征是再生医学的主要焦点。干细胞能够自我更新，这种特性确保其存活和产生维持组织稳态所必需的有丝分裂后的细胞的能力。除了自我更新的能力之外，干细胞还具有能够分化成维持特定组织、器官系统甚至整个生物体内的稳态所需的细胞类型中的一些或全部的能力。

干细胞被分离时所处的发育阶段通常决定了其能够分化成哪种类型的细胞。例如，从胚泡的内细胞团分离的胚胎干（ES）细胞是多能的并且能够分化成三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）中的任何一个。然而，在各种成体组织（例如骨髓、脂肪组织、血液等）中发现的成体或躯体干细胞通常在分化方面受到更多限制，因此被认为是多能的、寡能的或单能的。成体干细胞包括几种类型，如造血干细胞（HSC）、间充质干细胞（MSC）、内皮干细胞（ESC）、乳腺干细胞（MaSC）、肠干细胞（ISC）、神经干细胞（NSC）、成体嗅觉干细胞（OSC）、神经嵴干细胞（NCSC）和睾丸干细胞（TSC）。诱导的多能干细胞（也称为iPS细胞或iPSC）是一种多能干细胞，其能够通过引入特定的多能性相关的基因或“重编程因子”组而直接从体细胞产生。其他类型的干细胞也已经被报道，其存在仍然是有争议的。

30多年来，骨髓已经被用于治疗患有例如白血病和淋巴瘤等疾病的癌症患者。这是广泛实施的干细胞疗法的唯一形式。关于胚胎干细胞，人类胚胎干细胞（hESC）研究在伦理和政治上存在争议，因为它涉及人类胚胎的破坏或至少涉及其操作。hESC的致瘤性也是使用hESC的细胞疗法的临床障碍。此外，迄今为止尚无法建立患者匹配的胚胎干细胞系。关于iPSC，体细胞的重编程产生iPSC避免了hESC研究特有的伦理问题。然而，iPSC的产生需要遗传改变/修饰，其也以某种方式与癌症相关。产生iPSC的非遗传方法（例如，使用重组蛋白）通常具有低效率。因此，iPSC技术尚未发展到治疗性移植被认为是安全的阶段。关于成体干细胞，它们在研究和治疗中的应用不被认为是有争议的。然而，与多能干细胞不同，成体干细胞局限于某些类型或“谱系”。因此，成体干细胞疗法需要所需特定谱系的干细胞来源，并且收获和/或培养它们达到所需数量是一个挑战。

因此，从成体组织中鉴定多能干细胞而不需要遗传操作，并建立体外培养它们的方案，将为实际的基于细胞的组织修复和再生治疗铺平道路。从成体组织分离的这种多能干细胞还将为慢性和衰老相关疾病中未满足的医学需求提供新的治疗方法。

细胞培养系统将是干细胞研究和开发的有力资产。该领域最大的挑战之一是建立一个使得干细胞在体外能够快速扩增以及有效和精确地分化的模型。这种模型必须具有提供大量在某些培养条件下能够经历靶向和可控的分化的同质细胞的能力。目前，没有普遍接受的用于满足治疗要求的多能干细胞的可持续细胞培养模型。此外，目前的多能干细胞在诸如分离、体外扩增和/或分化诱导的过程中具有各种问题和缺陷，这将阻碍目前的多能干细胞在临床应用和治疗用途中的应用。

因此，需要不进行遗传操作而从成体组织中鉴定多能干细胞，其中多能干细胞能够在体外快速扩增、具有高分化效率且是非致瘤性的。还需要建立用于在体外培养多能干细胞用于基于细胞的疗法的方案。

概述

从成体组织中鉴定可扩增的多能干细胞并建立体外培养它们的方案，将为实际的基于细胞的组织修复和再生治疗铺平道路。

本公开提供了一种组合物，其包含至少1000个细胞，并且至少50％的细胞是表达CD45且直径小于5 μm的CD45⁺细胞。在一些方面，CD45⁺细胞进一步被表征为CD34阳性和ABCG2阴性。在一些方面，少于20％的细胞是红细胞。在一些方面，CD45⁺细胞进一步被表征为Lin阴性。在一些方面，CD45⁺细胞进一步表达一种或多种选自以下的标记物：CD44、CD150、Sca1、c-kit、Thy1.1（CD90.1）、Oct4、SSEA1、Nanog、Vasa、CD133和CD105。在一些方面，CD45⁺细胞不表达一种或多种选自以下的标记物：CD41、Lin、E-钙粘蛋白和CD184（CXCR4）。在一些方面，CD45⁺细胞能够被包含一种或多种因子的培养基活化，并且被活化的细胞表达ABCG2。

还提供了制备本文公开的组合物的方法，包含（1）从血液样品中除去至少一部分的红细胞；（2）从样品中除去至少一部分的血小板；（3）以400 xg-3000 xg离心样品；以及（4）获得包含本文公开的组合物的小丸（pellet）。在一些方面，在步骤（3）中，以至少3000xg的速度离心样品。

还提供了培养细胞的方法，包含在培养基中培养多种哺乳动物细胞，所述培养基与选自原代肝细胞、人肝母细胞瘤（HepG2）细胞、肝细胞细胞系和小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞系中的至少一种接触或已经用其进行了调节。在一些方面，肝细胞细胞系包含AML12、HepaRG或其组合。在一些方面，哺乳动物细胞（a）直径小于5 μm，且（b）表达CD45。在一些方面，其中细胞进一步被表征为CD34阳性和ABCG2阴性。在一些方面，哺乳动物细胞包括一种或多种类型的干细胞。

本公开还提供了分离的哺乳动物细胞，其表达CD34和ABCG2并且不表达CD45。在一些方面，哺乳动物细胞进一步被表征为Oct4、Nanog和/或角蛋白上皮（keratinepithelium）阳性，而Lin阴性。在一些方面，哺乳动物细胞进一步表达一种或多种选自以下的标记物：D117、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Sca1、CD31、CD184、巢蛋白和骨钙素。在一些方面，哺乳动物细胞不表达一种或多种选自以下的标记物：CD3、CD4、CD8a、CD11b、CD13、CD140a、E-钙粘蛋白和Lin。还提供了如本文所公开的细胞的群体。

还提供了一种干细胞，其衍生自的细胞（a）具有小于5 μm的直径；（b）表达CD45；且（c）不表达ABCG2，其中干细胞表达ABCG2，并且进一步被表征为（a）CD34⁺/CD45⁺；（b）CD34⁺/CD45^-；（c）CD34^-/CD45⁺；或（d）CD34^-/CD45^-。本公开的实施方案还提供了从本文公开的干细胞分化的细胞。

还提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的如本文所公开的干细胞。在一些实施方案中，还提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的如本文所公开的分化细胞。还提供了治疗有此需要的对象中的疾病或病症的方法，包含向对象施用有效量的如本文所公开的组合物。

附图说明

图1显示了从血液中分离的休眠的微小细胞（dormant tiny cell）的电子显微镜图像。

图2是显示在体外休眠的微小细胞和由其衍生的活化干细胞的细胞核染色长达7天的图解、以及在第7天细胞中GFP表达的图解。

图3A是显示休眠的微小细胞和由其衍生的活化干细胞中ABCG2表达的图解。

图3B是显示表达CD34和CD45的细胞群的图解，该细胞群被分离并被表征为休眠的微小细胞。

图4是显示与作为对照的肝细胞细胞系相比，休眠的微小细胞和由其衍生的活化干细胞中sRNA与rRNA的比例的图解。

图5是显示活化/发育系统中休眠的微小细胞的生长和扩增以及干细胞集落形成的图解。

图6是显示来自干细胞集落的纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群的体外细胞培养的图解。

图7是显示表达CD34标记物但不表达CD45的纯化的干细胞群的图解。

图8是显示纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群能够分化和表达神经细胞特异性标记物的图解。

图9是显示纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群能够表达表皮标记物的图解。

图10是显示纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群能够分化和表达骨组织特异性染色的图解。

图11是显示纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群能够分化和表达心肌细胞特异性标记物的图解。

图12是显示纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群能够分化和表达肝细胞和胆管上皮特异性标记物的图解。

图13是显示当用纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群处理时野生型小鼠中皮肤伤口愈合速度更快的图解。

图14是显示与对照小鼠中的疤痕组织相比，经处理的小鼠中新功能的皮肤的生长的图解。

图15是显示当用纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群处理时糖尿病小鼠中皮肤伤口愈合速度更快的图解。

图16是显示与对照小鼠中几乎不闭合的伤口相比，糖尿病小鼠中治疗16天后新皮肤的生长的图解。

图17是显示衍生自纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群的骨组织的生长的图解。

图18是显示在纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群移植后由CCl₄引起的肝损伤的修复的图解。

图19是显示从与活化/发育系统共培养的血液中分离的休眠的微小细胞的另一种细胞培养物的图解。

图20是显示与活化/发育系统共培养的干细胞中肝细胞特异性标记物的表达的图解。

图21是显示使用从共培养系统获得的干细胞治疗肝损伤的图解。

图22是显示活化干细胞的增殖标记物、生长因子和细胞因子的表达的图解。

详细说明

本文引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书遍及本公开。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用整体并入本公开。

在描述组合物和方法之前，应理解本发明不限于所描述的特定的方法、方案、细胞系、测定和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语旨在描述本发明的特定实施方案，并且决不旨在限制如所附权利要求中阐述的本发明的范围。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见，例如，Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rdedition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in MolecularBiology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.);MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at OxfordUniversity Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach;Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005)Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5^th edition; Gait ed.(1984) Oligonucleotide Synthesis; 美国专利号4,683,195; Hames and Higgins eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic AcidHybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation;Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A PracticalGuide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene TransferVectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed.(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds.(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press,London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of ExperimentalImmunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3^rd edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)); Current Protocols In MolecularBiology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series Methods inEnzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J.MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)); Harlow and Lane, eds.(1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Harlow and Lane, eds. (1999) UsingAntibodies, A Laboratory Manual; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed.(1987)); Zigova, Sanberg and Sanchez-Ramos, eds. (2002) Neural Stem Cells。

所有数字标记（例如pH、温度、时间、浓度和分子量），包括范围，是近似值，其在适当时以0.1或1的增量变化（（+）或（-））。应理解，尽管并非总是明确指出，但所有数字标记前面都有术语“约”。在适当的情况下，术语“约”还包括精确值“X”以及“X”的微小增量，例如，“X + 0.1或1”或“X-0.1或1”。还应理解，尽管并非总是明确说明，但本文所述的试剂仅仅是示例性的，并且其等效物在本领域中是已知的。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所用，以下术语具有以下含义。

如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”，其包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所用，术语“包含”或“含有”旨在表示组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响所要求的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他成分的微量元素和实质性方法步骤。由这些转变术语中的每一个定义的实施方案都在本公开的范围内。

如本文所用，术语“分离的”意指与细胞的和其他的成分分离，其中细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常在性质上相关。例如，分离的多核苷酸与3'和5'连续的核苷酸分离，它在其天然的或自然的环境中（例如在染色体上）通常与其相连。对于本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来将其与其天然存在的对应物区分开。分离的细胞是从不相似的表型或基因型的组织或细胞中分离的细胞。

如本文所用，“干细胞”定义了能够在培养基中无限期分裂并产生特化细胞的细胞。干细胞的类型的非限制性实施例包括体细胞（成体）干细胞、胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞（参见Cibelli et al. (2002) Science 295(5556):819；美国专利公开号20100069251和20080299091）、和/或诱导的多能干细胞（iPS细胞或iPSC）。体细胞干细胞是在分化组织中发现的未分化细胞，其能够自我更新（克隆）和（具有某些限制）分化来产生其起源自的组织的所有特化细胞类型。胚胎干细胞是来自胚胎的原始（未分化）细胞，其有可能成为多种特化细胞类型。胚胎干细胞的非限制性实施例包括：可从ESI, Singapore获得的HES2（也称为ES02）细胞系和可从WiCell, Madison, WI获得的H1或H9（也称为WA01）细胞系。其他细胞系正在等待NIH审查。参见，例如，grants.nih.gov/stem_cells/registry/current.htm（最后访问时间为2017年3月13日）。通过使用包括但不限于以下的标记物能够将多能胚胎干细胞与其他类型的细胞区分开：Oct-4、碱性磷酸酶、CD30、TDGF-1、GCTM-2、Genesis、生殖细胞核因子、SSEA1、SSEA3和SSEA4。诱导的多能干细胞（iPSC）是衍生自非多能细胞的人工衍生的干细胞（通常是成体体细胞），其通过诱导一种或多种干细胞特异性基因的表达而产生。iPSC表达的特异性基因包括但不限于：八聚体转录因子家族，例如Oct-3/4；Sox基因家族，例如Sox1、Sox2、Sox3、Sox15和Sox18；Klf基因家族，例如Klf1、Klf2、Klf4和Klf5；Myc基因家族，例如c-myc和L-myc；Nanog基因家族，例如Octamer-4（OCT4）、NANOG和REX1；或LIN28。iPSC的实施例描述于Takahashi et al. (2007) Cell （ 2007年11月20日提前在线出版）、Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663–76、Okita et al. (2007) Nature 448:260–262、Yu et al. (2007) Science （ 2007年11月20日提前在线出版）、以及Nakagawaet al. (2007) Nat. Biotechnol（2007年11月30日提前在线出版）。

如本文所用，术语“繁殖”意指生长或改变细胞或细胞群的表型。术语“生长”或“扩增”是指在获得所需数量的细胞或细胞类型所必需的支持培养基、营养物、生长因子、支持细胞或任何化学或生物化合物的存在下细胞的增殖。在一个实施方案中，细胞的生长/扩增导致组织的再生。

如本文所用，术语“培养”是指细胞或生物体在各种培养基上或培养基中的体外繁殖。应理解，培养中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全相同（即，在形态学上、遗传上或表型上）。“扩增”是指细胞的任何增殖或分裂。

如本文所用并且如下文更详细地陈述，“条件培养基”是与成熟细胞一起培养的培养基，该成熟细胞向培养基提供细胞的因子，例如细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质、以及将会促进细胞生长、发育和分化的一些材料。

如本文所用，术语“分化”描述了非特化细胞通过其而获得特化细胞（例如皮肤、心脏、肝或肌肉细胞）的特征的过程。“定向分化”指操作干细胞培养条件来诱导分化成特定的细胞类型。“去分化”定义了在细胞谱系中恢复到较不固定（committed）位置的细胞。如本文所用，术语“分化或已分化的”定义了在细胞谱系内呈现更固定（“已分化的”）位置的细胞。

如本文所用，细胞的“谱系”定义细胞的遗传，即其前体和后代。细胞的谱系将细胞置于发育和分化的遗传的方案之内。如本文所用，“分化成中胚层（或外胚层或内胚层）谱系的细胞”定义了分别变为特定中胚层（或外胚层或内胚层）谱系的细胞。分化成中胚层谱系或产生特定中胚层细胞的细胞的实施例包括但不限于以下细胞：脂肪生成的、平滑肌生成的、软骨生成的、心源性的、皮肤生成的、造血的、血管生成的、肌源性的、肾源性的、泌尿生成的、成骨的、心包起源的、或基质的。分化成外胚层谱系的细胞的实施例包括但不限于表皮细胞、神经原细胞和神经胶质细胞。分化成内胚层谱系的细胞的实施例包括但不限于产生胰腺、肝、肺、胃、肠和甲状腺的细胞。

如本文所用，术语“多能干细胞”是指具有以下性质的细胞：（i）能够在未分化状态下在体外无限增殖；（ii）通过长期培养维持正常的核型；以及（iii）即使在长时间培养后，仍保持分化为所有三个胚胎胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的衍生物的潜力。目前可获得的多能干细胞的非限制性实施例包括胚胎干细胞和iPSC。如本文所用，术语“胚胎样”干细胞是指衍生自组织、器官或血液的细胞，其具有胚胎干细胞的多能特征。

如本文所用，术语“多谱系干细胞”或“多潜能干细胞（multipotent stem cell）”是指自身繁殖的干细胞和来自不同发育谱系的至少两个进一步分化的子代细胞。谱系可以能够来自相同的胚层（即中胚层、外胚层或内胚层），或来自不同的胚层。来自多谱系干细胞的分化的具有不同发育谱系的两个子代细胞的实施例是肌原细胞和脂肪细胞（两者都来源于中胚层，但产生不同的组织）。另一个实施例是神经源性细胞（来源于外胚层）和脂肪细胞（来源于中胚层）。

如本文所用，术语“可自我再生的”是指细胞能够在多次传代中自我更新而细胞性质没有显著变化。一方面，传代的数量为至少约5，或者至少10，或者替代地至少约15、20、30、50或100。

如本文所用，术语“基本上同源的”描述了一群细胞，其中大于约50％、或者大于约60％、或者大于70％、或者大于75％、或者大于80％、或者大于85％、或者大于90％、或者大于95％、或者大于99％的细胞具有相同或相似的表型。表型能够通过预先选择的细胞表面标记物或其他标记物来确定。

如本文所用，术语感兴趣细胞的“纯化的群体”是指从存在于其天然环境中的基本上所有其他细胞分离出的细胞群，也指当细胞混合物中感兴趣细胞的比例大于其天然环境中发现的比例时的细胞群。例如，纯化的细胞群代表富集的感兴趣的细胞群，即使其他细胞和细胞类型也存在于富集群体中。在一些实施方案中，纯化的细胞群代表至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的混合细胞群，条件是“纯化的”群体中感兴趣的细胞占总细胞群的百分比比其在纯化前的群体中占总细胞群的百分比更大。

如本文所用，术语“细胞群/细胞的群体”是指一种以上的在表型和/或基因型上相同（克隆）或不相同的细胞的集合。

如本文所用，术语“细胞集落”或“集落”是指一群由于细胞生长而形成的紧密相关的细胞。这些术语与构成集落的细胞数无关地使用。

如本文所用，术语“休眠的细胞”旨在包含处于休眠或静止状态的细胞，其需要在它们能够经历生长或分化之前被活化。

如本文所用，术语“休眠的微小细胞”旨在包含处于休眠或静止状态的细胞，其需要在它们能够经历生长和/或分化之前被活化。休眠的微小细胞通常直径小于5 μm。

如本文所用，术语休眠的细胞的“活化/激活”是指细胞的休眠状态中可测量的形态学、表型和/或功能改变。这种活化通常与活化的细胞的特异性标记物的表达同时发生。在一个实施方案中，活化与细胞生长和/或发育中的变化同时发生。

如本文所用，术语“活化的干细胞”旨在包含处于活化状态并且能够在特定条件下经历生长和/或分化的干细胞。

如本文所用，术语“组合物”旨在包含活性剂和另一种载体（例如化合物或组合物，惰性的（例如可检测的试剂或标记）或活性的（例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等））的组合。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物（例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生的糖，例如，醛醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物），它们可以单独存在或组合存在，包含以1-99.99％的重量或体积单独或以组合存在。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白（例如，人血清白蛋白（HSA）、重组人白蛋白（rHA））、明胶、酪蛋白等。代表性的氨基酸/抗体组分（其也能够起缓冲作用）包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也包括在本发明的范围内，其实施例包括但不限于：单糖，例如，果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及醛糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。在某些实施方案中，组合物包括细胞群或细胞混合物。在某些实施方案中，组合物被配制成膜、凝胶、贴剂、3-D结构或液体溶液。

如本文所用，术语“药学上可接受的”，表示考虑到待治疗的疾病或病症以及相应的施用途径，所指出的材料不具有引起合理谨慎的医师避免将该材料施用于患者的性质。例如，通常要求这种材料基本上是无菌的。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体（或培养基）”，其可以与术语“生物相容的载体（或培养基）”互换使用，是指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂量这些形式不仅与治疗上施用的细胞和其他药物相容，而且在健全的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触，没有过多的毒性、刺激、过敏反应、或其他与合理的利益/风险比相称的并发症。适合于本发明的药学上可接受的载体包括液体、半固体（例如，凝胶）和固体材料（例如，细胞支架和基质、管板和本领域已知的并且在本文中更详细描述的其他此类材料）。这些半固体和固体材料可以被设计成抵抗体内降解（不可生物降解），或者它们可以被设计成在体内降解（可生物降解的、可生物腐蚀的）。可生物降解的材料可以进一步是生物可再次吸收的或生物可吸收的，即它可以溶解并被吸收到体液中（水溶性植入物是一个例子），或者可以通过转换成其他材料或通过自然途径分解和消除。对于局部使用，药学上可接受的载体适合于制成乳膏、软膏、果胶、凝胶、溶液、悬浮液等。这些载体在本领域是常规的，例如，局部施用聚乙二醇（PEG）。这些制剂可以任选地包含另外的药学上可接受的成分，例如，稀释剂、稳定剂、和/或佐剂。

如本文所用，术语“溶液”是指溶液、悬浮液、乳液、滴剂、软膏、液体洗液、喷雾剂和脂质体，其是本领域熟知的。在一些实施方案中，液体溶液含有水性pH缓冲剂，当加入少量酸或碱时，其抵抗pH的变化。

如本文所用，术语“pH缓冲剂”是指当向其中加入少量酸或碱时抵抗pH变化的水性缓冲溶液。pH缓冲溶液通常包含弱酸和其共轭碱的混合物，反之亦然。例如，pH缓冲溶液可以包含：磷酸盐，例如，磷酸钠、磷酸二氢钠、二水合磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；硼酸和硼酸盐，例如，硼酸钠和硼酸钾；柠檬酸和柠檬酸盐，例如，柠檬酸钠和柠檬酸二钠；乙酸盐，例如乙酸钠，乙酸钾；碳酸盐，例如，碳酸钠和碳酸氢钠等。pH调节剂可以包括：例如，酸，如盐酸、乳酸、柠檬酸、磷酸和乙酸；以及碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠等。在一些实施方案中，pH缓冲剂是磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（即，含有磷酸钠、氯化钠并且在一些制剂中，含有氯化钾和磷酸钾）。

如本文所用，术语“配方”或“制剂”是指将包括一种或多种药物活性成分的不同物质组合以产生剂型的过程。在某些实施方案中，能够将两种或更多种药物活性成分共同配制成单一剂型或组合剂量单位，或单独配制并随后组合成组合剂量单位。持续释放制剂是一种设计用于在延长的时间内在体内缓慢释放治疗剂的配方，而速释制剂是一种设计用于在缩短的时间内在体内快速释放治疗剂的配方。

如本文所用，术语“治疗”是指在伤害或干预之前、期间和/或之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病或病症的一种或多种临床症状。

如本文所用，术语“患者”或“对象”是指用药物组合物或根据本文所述的方法治疗的动物，包括哺乳动物，例如，鼠、犬、马、牛、猿或人。

如本文所用，术语“递送”是指用于在体内运输药物组合物以便安全地实现其期望的治疗效果的途径、方法、制剂、技术和系统。递送途径可以是任何合适的途径，包括但不限于血管内的、静脉内的、动脉内的、肌肉内的、皮肤的、皮下的、经皮的、皮内的和表皮内的途径。在一些实施方案中，有效量的组合物被配制用于施用于患者的皮肤或递送到患者的皮肤中。在一些实施方案中，有效量的组合物被配制用于递送到患者的血流中。

如本文所用，术语“有效量”是指组合物或试剂（例如，本文所述的组合物、细胞群或其他试剂）的浓度或量，其对于产生预期结果（包括体外或体内的细胞生长和/或分化）是有效的，或对于治疗有此需要的患者的疾病、障碍或病症是有效的。应当理解，待施用的细胞数量将根据待治疗病症的具体情况而变化，包括但不限于待治疗的尺寸或总体积/表面积、以及施用部位与待治疗区域的位置的接近度、以及医学生物学家和/或治疗医师熟悉的其他因素。

如本文所用，术语“有效期（或时间）”和“有效条件”是指药剂或组合物达到其预期结果（例如，细胞分化为预定的细胞类型）所必需或优选的一段时间或其他可控条件（例如，体外方法的温度、湿度）。

如本文所用，术语“对照”或“对照组”是指实验中使用的用于比较目的的替代对象或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。

如本文所用，术语“同时”是指同时（即，联合）施用。在一个实施方案中，施用是共同施用，使得两种或更多种药物活性成分（包括其任何固体形式）一次一起被递送。

如本文所用，术语“顺序地”是指分开（即，在不同时间）施用。在一个实施方案中，交错施用使得两种或更多种药物活性成分（包括其任何固体形式）在不同时间分开被递送。

如本文所用，术语“靶组织”或“靶器官”是指在施用于对象后，如本文所公开的干细胞和/或衍生自如本文所公开的干细胞的分化细胞累积的预期位点。例如，在一些实施方案中，本文公开的方法涉及已经受损（例如，通过局部缺血或其他损伤）的靶组织或靶器官。

如本文所用，术语“自体转移”、“自体移植”、“自身移植”等是指细胞供体也是细胞替代疗法的接受者的治疗。术语“同种异体转移”、“同种异体移植”等是指细胞供体与细胞替代疗法的接受者属于同一物种但不是同一个体的治疗。其中供体的细胞与受体组织相容性匹配的细胞转移有时被称为同源转移。术语异种转移、异种移植等是指细胞供体与细胞替代疗法的受体是不同的物种的治疗。

如本文所用，术语“ABCG2”或“ATP结合盒（ABC）转运蛋白G2”是指属于ABCG/白色亚家族的ABCG家族的半转运蛋白，并且具有基因符号ABCG2。ABCG2也称为MXR（米托蒽醌耐药蛋白，Miyake et al., 1999.）、BCRP（乳腺癌耐药蛋白，Doyle et al.,1998）、或ABCP（胎盘特异性ABC转运蛋白，Allikmets et al.,1998）。GENBANK®数据库公开了来自人（例如，AAG52982）、小鼠（NM_011920.3）、大鼠（BAC76396.1）、猫（XP_019684813.1）、狗（NP_001041486.1）、猪（NP_999175.1）、奶牛（NP_001032555.2）等的ABCG2的氨基酸和核酸序列。

如本文所用，术语“CD34”是指在某些造血干细胞和非造血干细胞上发现的细胞表面标记物，并且具有基因符号CD34。GENBANK®数据库公开了来自人（例如，AAB25223）、小鼠（NP_598415）、大鼠（XP_223083）、猫（NP_001009318）、猪（MP_999251）、奶牛（NP_776434）等的CD34的氨基酸和核酸序列。

如本文所用，术语“CD45”是指酪氨酸磷酸酶，也称为白细胞共同抗原（LCA），并且具有基因符号PTPRC。该基因对应于GENBANK®登录号NP_002829（人）、NP_035340（小鼠）、NP_612516（大鼠）、XP_002829（狗）、XP_599431（牛）和AAR16420（猪）。其他CD45同源染色体的氨基酸序列也存在于GENBANK®数据库中，其包括来自几种鱼类和几种非人灵长类动物的那些序列。

如本文所用，术语“谱系标记物”或“Lin”是指细胞谱系的特征分子，例如，细胞表面标记物、mRNA或内部蛋白质。谱系阳性（Lin+）细胞是指表达成熟细胞谱系标记物的细胞混合物。谱系阴性（Lin-）细胞包括干细胞和祖细胞，其不是分化的成熟细胞。在一个方面，“Lin”是指一组标记物。如本文所用的小鼠谱系组能够与来自主要造血细胞谱系的细胞（例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、NK细胞和红细胞）反应。如本文所用，FITC抗小鼠谱系抗体混合物被设计用于流式细胞鉴定小鼠骨髓中的造血祖细胞。混合物的成分包括：抗小鼠CD3e，克隆145-2C11；抗小鼠Ly-6G/Ly-6C，克隆RB6-8C5；抗小鼠CD11b，克隆M1/70；抗小鼠CD45R/B220，克隆RA3-6B2；抗小鼠TER-119/红细胞，克隆Ter-119。FITC抗小鼠谱系同种型对照混合物含有等同浓度的同种型匹配的阴性对照免疫球蛋白。

如本文所用，术语“角蛋白上皮标记物”是指包括CK5、CK6、CK8的一组标记物。

2. 休眠的微小细胞的分离

本发明人惊奇和预期地发现，来自哺乳动物对象外周血的某些相对较小的细胞能够被活化而成为多能干细胞。通过细胞的分化成所有三个胚层的能力证明了多能性。此外，利用本文开发的新的活化和发育系统，多能干细胞能够在体外快速有效地扩增。此外，衍生自血液的多能干细胞不被认为是在伦理上和政治上有争议的，并且其不需要遗传操作。本技术的另一个优点是多能干细胞被证明是非致瘤性的。因此，本发明公开的技术将为实际的基于细胞的组织修复和再生治疗铺平道路，并且还将为慢性和年龄相关疾病中未满足的医疗需求提供新的治疗方法。

在一个实施方案中，本公开提供了富含表达CD45并且直径小于5 μm的细胞的细胞群。此类细胞在本文中称为“CD45⁺细胞”或“休眠的微小细胞”。在一些实施方案中，组合物或细胞群包括总共至少100个细胞、1000个细胞、10,000个细胞或100,000个细胞，并且它们中的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％是休眠的微小细胞。在一些实施方案中，所有休眠的微小细胞都是从哺乳动物对象的血液样品中获得的。在一些实施方案中，组合物还包括相对低百分比（例如，小于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％）的血细胞，例如，红细胞和白细胞。

在一些实施方案中，组合物中的休眠的微小细胞包括完整的和破碎的细胞。在一些实施方案中，细胞群中完整的休眠的微小细胞与破碎的休眠的微小细胞的数量之比小于1：1，至少约1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1。

在一些实施方案中，休眠的微小细胞的直径为约2 μm，或者约2.5 μm、或者约3 μm、或者约3.5 μm、或者约4 μm、或者约4.5 μm、或者约5 μm、或者在约2-3 μm之间、或者在约2-4 μm之间、或者在约2-5 μm之间、或者小于5 μm、或者小于4 μm、或者小于3 μm。在一些实施方案中，分离的休眠的微小细胞具有非常高的核质比（nucleus-cytoplasm ratio）（v/v，也称为N：C比，或N/C）。在一些实施方案中，如本文所公开的休眠的微小细胞的核质比可以是至少9：1，或者至少8：1、或者至少7：1、或者至少6：1、或者至少5：1。当在常规细胞培养基（例如，具有20％FBS的α-MEM）中体外接种时，在一些实施方案中，休眠的微小细胞在几天内不会增殖并变得衰老。在一些实施方案中，分离的休眠的微小细胞群表达标记物CD34和CD45，并且不表达标记物ABCG2。在一些实施方案中，休眠的微小细胞进一步被表征为Lin-。

在一些实施方案中，休眠的微小细胞可以具有高的小RNA（sRNA，包括微RNA）与核糖体RNA（rRNA）的比率。在一些实施方案中，小RNA与核糖体RNA的比率是至少22：1，或者至少20：1、或者至少18：1、或者至少15：1、或者可选地至少12：1、或者至少10：1、或者至少9：1、或者至少8：1、或者至少7：1、或者至少6：1、或者至少5：1。在某些方面，线粒体标记物（例如，COX IV）、内质网（ER）标记物（例如，钙联接蛋白）和核糖体标记物（例如，RPS3）的低水平或最小表达也可以表明分离的干细胞群处于休眠/静止状态。

可以使用细胞表面标记物和细胞内标记物（例如，下面表1中所示的那些）分析休眠的微小细胞。

表1

抗原或标记物	示例GenBank 登录号
		CD34	NM_001111059
CD45	NM_011210.4
		CD44	NM_009851
CD150	NM_013730.4
		CD90.1 (Thy1.1)	AY445633.1
CD105	NM_007932.2
		CD133	NM_008935.2
Sca1(Ly6a)	NM_010738
		c-kit (CD117)	NM_001122733.1
Oct4 (Oct3/4, Pou5f1)	BC068268.1
		SSEA1	NM_010242.3
Nanog	AY278951.1
		Vasa	NM_001145885

在一些实施方案中，分离的休眠的微小细胞表达一种或多种早期干细胞标记物（例如，Oct4、Nanog、SSEA1、Vasa）。在一些实施方案中，休眠的微小细胞表达造血标记物组（例如，CD34、CD45、CD133、CD150）的一种或多种标记物和MSC标记物（例如，CD44、CD105、Sca1、CD90.1）。在一些实施方案中，分离的休眠的微小细胞表达表1中鉴定的一种或多种标记物。一方面，存在表1中鉴定的两种标志物，或者三种、或者四种、或者五种、并且增加至所有标记物存在。在一些实施方案中，休眠的微小细胞不表达E-钙粘蛋白、CD184和/或CD41。

在一些实施方案中，提供了从血液样品中分离如本文所公开的休眠的微小细胞的方法。休眠的微小细胞能够通过任何允许细胞分离的方法从外周血中被分离出来。例如，本文公开的方法可以包括从血液样品中除去至少一部分血细胞和血小板，并离心样品以获得包括休眠的微小细胞的小丸。在其他方面，该方法可以包括基于一种或多种识别标记物的细胞分选和细胞分离方法。例如，荧光激活细胞分选（FACS）或磁激活细胞分选（MACS）可以被用于分选和分离休眠的微小细胞。在一些实施方案中，能够使用其他方法来分离如本文所公开的休眠的微小细胞。一些分离程序的实施例在下文的实施例1中提供。

一方面，分离休眠的微小细胞的方法包含：（1）从血液样品中除去至少一部分红细胞；（2）从样品中除去至少一部分血小板；（3）以400 ×g-3000 ×g离心样品；以及（4）获得包含本文所公开的休眠的微小细胞的小丸。在一些方面，步骤（3）中的样品可以以约400 xg离心，或者约500 xg、或者约800 xg、或者约1000 xg、或者约1200 xg、或者约1500 xg、或者约1800 xg、或者约2000 xg、或者约2200 xg、或者约2500 xg、或者约2800 xg、或者约3000xg、或者约3500 xg、或者约4000 xg、或者约4500 xg、或者约5000 xg、或者约5500 xg、或者约6000 xg、或者约6500 xg、或者约7000 xg、或者约7500 xg、或者约8000 xg、或者约9000xg、或者约10,000 xg、或者10,000 xg以上。

在一些实施方案中，提供了基于干细胞的特定标记物来分离特定富集的干细胞群的方法。例如，该方法可以被用于分离富含CD34⁺/CD45⁺/ABCG2^-/Lin^-细胞的细胞群（例如，通过FACS或MACS）。在另一个实施例中，该方法可以被用于分离富含CD34⁺/ABCG2^-细胞的细胞群。在其他实施方案中，该方法可以被用于分离富含具有特定标记物（例如，用于鉴定如本文所公开的休眠的微小细胞的标志物）的特定组合的细胞的细胞群。

在一些实施方案中，休眠的微小细胞可以与其他来源/组织分离，只要该组织含有如本文所公开的有活性的休眠的微小细胞。在一些实施方案中，休眠的微小细胞可以从任何年龄的对象中分离。在一些实施方案中，休眠的微小细胞可以在任何时间与对象分离。在一些实施方案中，休眠的微小细胞可以从动物分离，例如但不限于马、犬、猪、牛、鼠、猿和人。

3. 活化和发育

为了在体外活化和培养分离的休眠的微小细胞群，已经建立了活化/发育系统。在一些实施方案中，活化/发育系统包括选自原代肝细胞、人肝母细胞瘤（HepG2）细胞、肝细胞细胞系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞系的一种或多种细胞类型/细胞系。肝细胞细胞系的非限制性实施例包括AML12和HepaRG。在一些实施方案中，活化/发育系统可以包括其他类型的肝母细胞瘤细胞和/或其他类型的胚胎成纤维细胞系。在一些实施方案中，活化/发育系统可以包括其他类型的细胞和/或细胞系。在一些方面，活化/发育系统可以包括上述细胞/细胞系中的至少一种、或者至少两种、或者至少三种、或者至少四种。

一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞、HepG2细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞、HepG2细胞和肝细胞细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞、HepG2细胞和MEF细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少HepG2细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞和HepG2细胞的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞和肝细胞细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞和MEF细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少HepG2细胞和肝细胞细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少HepG2细胞和MEF细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统包括至少肝细胞细胞系和MEF细胞系的细胞混合物。另一方面，活化/发育系统至少包括原代肝细胞。另一方面，活化/发育系统至少包括HepG2细胞。另一方面，活化/发育系统至少包括肝细胞细胞系。另一方面，活化/发育系统至少包括MEF细胞系。

在一个实施方案中，本文提供了在体外活化和培养休眠的微小细胞的方法。在一些实施方案中，休眠的微小细胞可以使用Transwell板与本文所公开的细胞或细胞混合物共培养。例如，上述细胞/细胞系的细胞或细胞混合物能够被制备并用丝裂霉素C处理来使细胞有丝分裂失活。然后在共培养培养基中细胞/细胞混合物能够被接种在细胞培养板的底部上。分离的休眠的微小细胞能够被接种在Transwell膜上来与细胞/细胞混合物共培养。共培养培养基可以包括含有5-50％FBS（胎牛血清）的α-MEM培养基。例如，共培养培养基可以包括含有约5％、或者约10％、或者约15％、或者约20％、或者约25％、或者约30％、或者约35％、或者约40％、或者约45％、或者约50％FBS的α-MEM培养基。在一些实施方案中，其他培养基可以被用于本文所公开的方法中。任选地，可以将其他试剂和因子添加到共培养培养基中。

另一方面，本文提供了使用条件培养基来活化和培养休眠的微小细胞的方法。在一些方面，培养基可以在用于活化/发育系统之前用上述细胞或细胞/细胞系的混合物处理。例如，上述细胞/细胞混合物能够被悬浮在细胞培养基中，然后被接种在细胞培养皿/平板中。用于培养细胞/细胞混合物的细胞培养基可以包括含有5-50％FBS的DMEM。例如，培养基可以包括含有约5％、或者约10％、或者约15％、或者约20％、或者约25％、或者约30％、或者约35％、或者约40％、或者约45％、或者约50％FBS的DMEM。在一些实施方案中，其他培养基可以被用于本文所公开的方法中。任选地，可以将其他试剂和因子添加到培养基中。条件培养基能够从细胞培养皿/平板收集，并且在使用培养基培养分离的休眠的微小细胞之前，能够除去培养基中的剩余细胞（例如，通过离心和/或过滤）。收集的条件培养基可以与上述共培养培养基混合，用于培养休眠的微小细胞。例如，基于培养基混合物的总体积，本文所公开的条件培养基可以是约5％（v/v）、或者约10％、或者约15％、或者约20％、或者约25％、或者约30％、或者约35％、或者约40％、或者约45％、或者约50％、或者约55％、或者约60％、或者约65％。或者约70％、或者约75％、或者约80％、或者约85％、或者约90％、或者约95％。任选地，可以将其他试剂和因子添加到培养基混合物中。

本公开的实施方案还提供了衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的活化干细胞群。活化的干细胞可以通过在上述活化/发育系统中培养休眠的微小细胞一段有效的时间来获得。在一些方面，有效活化休眠的微小细胞的培养时间可以包括但不限于至少1小时、或者至少2小时、或者至少4小时、或者至少12小时、或者至少1天、或者至少2天、或者至少3天、或者至少4天、或者至少5天、或者至少8天、或者在至少10天、或者至少12天、或者至少15天、或者至少18天、或者至少20天。细胞培养基可以每1天更换一次，或者每2天、或者每3天、或者每4天、或者每5天或更多天更换一次。在一些实施方案中，活化的干细胞可以通过在其他培养系统、培养基或条件下培养休眠的微小细胞一段有效的时间来获得。在一些实施方案中，活化的干细胞被表征为高度异质的细胞混合物，包括通过不同标记物组来表征的各种细胞亚群。

在一些实施方案中，其他细胞培养基和/或细胞培养条件可以被用于活化和/或培养如本文所公开的干细胞。在一些实施方案中，如本文所公开的活化/发育系统中使用的细胞培养基和/或细胞培养条件可以被用于培养其他类型的细胞和/或其他类型的干细胞。例如，活化/发育系统中使用的细胞培养基和/或细胞培养条件可以被用于培养一种或多种选自以下的细胞：胚胎干（ES）细胞、造血干细胞（HSC）、间充质干细胞（MSC）、内皮干细胞（ESC）、乳腺干细胞（MaSC）、肠干细胞（ISC）、神经干细胞（NSC）、成人嗅觉干细胞（OSC）、神经嵴干细胞（NCSC）和睾丸干细胞（TSC）和诱导多能干细胞（iPSC）。

在一些实施方案中，活化的干细胞表达ABCG2，其不在休眠的微小细胞中表达。在一些方面，核酸染色（例如，Hoechst 33342）逐渐扩散到活化/发育系统中培养的活化干细胞外，而如本文所公开的休眠的微小细胞中的核酸染色不会在常规培养基中扩散。在一些实施方案中，在休眠的微小细胞中高的小RNA与核糖体RNA的比率在干细胞活化后显著降低。在一些实施方案中，活化的干细胞的小RNA与核糖体RNA的比率可以是低于1：4、或者低于1：5、或者低于1：6、或者低于1：7、或者低于1：8、或者低于1：9、或者低于1:10。在一些实施方案中，与休眠的微小细胞相比，活化的干细胞可以具有显著增加的COX IV、RPS3和钙连接蛋白水平。

在一些实施方案中，本文还提供了ABCG2⁺的活化干细胞群，其能够进一步被表征为CD34⁺/CD45⁺、CD34⁺/CD45^-、CD34^-/CD45⁺和/或CD34^-/CD45^-的几个亚群。在一个实施方案中，活化干细胞群的至少约50％、或者至少约55％、或者至少约60％、或者至少约66％、或者至少约70％、或者至少约75％、或者至少约80％、或者至少约85％、或者至少约90％、或者至少约95％、或者至少约99％是CD34⁺/CD45^-。一方面，活化干细胞的小于50％、或者小于45％、或者小于40％、或者小于35％、或者小于30％、或者小于25％、或者小于20％、或者小于15％、或者小于10％、或者小于5％、或者小于2％、或者小于1％、或者小于0.5％是CD34⁺/CD45⁺、CD34^-/CD45⁺、CD34^-/CD45^-或其任何组合。

在一些实施方案中，如本文所公开的活化干细胞的一个或多个亚群能够在体外在活化/发育系统中快速扩增。在一些实施方案中，活化干细胞的亚群的倍增时间可以变化。在一些实施方案中，活化/发育系统中活化干细胞的一个或多个亚群的倍增时间可以是超过50小时、或者小于50小时、或者小于45小时、或者小于40小时、或者小于35小时、或者小于30小时、或者小于25小时、或者约20小时至约50小时之间、或者约20小时至约40小时之间、或者约20小时至约30小时之间。在一些实施方案中，活化干细胞的一个或多个亚群能够在其他细胞培养系统中和/或在体外其他培养条件下扩增。

本文还提供了用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的CD34⁺/CD45⁺活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的CD34⁺/CD45^-活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的CD34^-/CD45⁺活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的CD34^-/CD45^-活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的CD34⁺活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的CD34^-活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的CD45⁺活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的CD45^-活化干细胞亚群的方法。一方面，提供了一种用于纯化衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的具有一组标记物的活化干细胞亚群的方法。

在一个实施方案中，在活化/发育系统中培养一段时间（例如，10-20天）后，发育为一种或多种细胞集落。在一些方面，在常规培养基（例如，含有20％FBS的α-MEM培养基）中培养的休眠的微小细胞不生长和扩增，并且不发育成细胞集落。

在一些实施方案中，本文提供了用于分离衍生自本文所公开的休眠的微小细胞的细胞集落的方法。例如，细胞集落能够使用克隆柱获得。或者，细胞集落能够通过胰蛋白酶消化和从细胞培养板/培养皿中分离集落来分离。应该理解，其他方法也能够被用于分离细胞集落。分离的干细胞集落中的至少60％、或者至少70％、或者至少80％、或者至少95％、或者至少99％细胞确定（例如，通过FACS）是CD34⁺/CD45^-。一方面，分离的干细胞集落中的至少90％的干细胞是CD34⁺/CD45^-。

本文还提供了从如本文所公开的分离的集落中纯化活化干细胞群的方法。一方面，分离的干细胞集落中的至少约60％、或者至少约70％、或者至少约80％、或者至少约90％、或者至少约95％、或者至少约99％、或者至少约99.9％的细胞是CD34⁺/CD45^-。在一些实施方案中，除CD34⁺/CD45^-细胞外，集落中的细胞可以包括可以是CD34⁺/CD45⁺、CD34^-/CD45⁺和/或CD34^-/CD45^-的细胞亚群。一方面，分离的干细胞集落中小于约40％、或者小于约30％、或者小于约20％、或者小于约10％、或者小于约5％、或者小于约2％、或者小于约1％的细胞是CD34⁺/CD45⁺、CD34^-/CD45⁺、CD34^-/CD45^-或其任何组合。在一些实施方案中，基于细胞总数，纯化细胞群中小于约40％、或者小于约30％、或者小于约20％、或者小于约10％、或者小于约5％、或者小于约2％、或者小于约1％、或者小于约0.1％的细胞不是CD34⁺/CD45^-。在一些实施方案中，诸如MACS或FACS的方法能够被用于从活化的干细胞中纯化特定的群体或富集的细胞群。在一些实施方案中，其他方法能够被用于从活化的干细胞中纯化特定的群体或富集的细胞群。

在一些实施方案中，能够进行活化干细胞的单细胞稀释，然后在如本文所公开的活化/发育系统中培养。在一段时间（例如，约10-20天）之后，可以发育为一种或多种衍生自单细胞的集落。衍生自单细胞的细胞集落具有胚状体样（EB样）结构（图6，D）。一方面，单细胞集落中基本上100％的细胞是CD34⁺/CD45^-。一方面，单细胞集落中至少约90％、或者至少约95％、或者至少约99％、或者至少约99.9％的细胞是CD34⁺/CD45^-。

本文还提供了用于从如本文所公开的分离的细胞集落或单细胞集落中纯化CD34⁺/CD45^-干细胞群的方法。在一个实施方案中，CD34⁺/CD45^-干细胞群能够使用例如MACS或FACS纯化。纯化方法在下文实施例2中提供。应当理解，也能够采用其他方法从细胞集落中纯化CD34⁺/CD45^-干细胞群。在一些实施方案中，本文所公开的方法或其他方法能够被用于从集落中纯化其他细胞群。

纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞的直径约为20-30 μm，大于休眠的微小细胞。例如，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞的直径可以是小于20 μm、或者约20 μm、或者约22 μm、或者约24 μm、或者约26 μm、或者约28 μm、或者约30 μm、或者大于30 μm。纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞进一步被表征为相对高的核质比，为约5：1、或者约6：1、或者约7：1、或者约8：1、或者约9：1。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞的细胞核占细胞总体积的至少约50％、或者至少约60％、或者至少约70％、或者至少约80％、或者至少约90％。纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够在常规细胞培养基（例如，含有20％FBS的α-MEM）中在体外快速（例如，以约26小时的倍增时间）扩增。在其他方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞的倍增时间可以在其他培养条件下变化。在一些方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞可以作为贴壁细胞培养物和/或悬浮细胞培养物在体外培养。当纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞附着于细胞培养皿/平板并达到融合时，细胞排列类似于上皮细胞培养物（图6，A和B）。

一方面，通过如下表2中列出的标记物进一步分析纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞。在一些实施方案中，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞表达表2中鉴定的一种或多种标记物。一方面，存在表2中鉴定的两种标记物、或者三种、或者四种、或者五种、以及增加至存在所有标记物。其他确定的抗原在表2中举例说明并在下面描述。

表2

抗原或标记物	示例GenBank 登录号
		CD34	NM_001111059
CD14	NM_009841.4
		CD19	NM_009844.2
CD117	NM_001122733.1
		CD29	NM_010578.2
CD44	NM_009851
		CD73	L12059.1
CD90.1 (Thy1.1)	AY445633.1
		CD31	NM_008816.3
CD105	NM_007932.2
		CD106	NM_011693.3
CD133	NM_008935.2
		CD184	NM_009911.3
Sca1(Ly6a)	NM_010738
		Oct4 (Oct3/4, Pou5f1)	BC068268.1
SSEA1	NM_010242.3
		Sox2	AB044284.1
Nanog	AY278951.1
		Vasa	NM_001145885
角蛋白上皮	(如前所述)
		CK18	NM_010664.2
CK19	M28698.1
		Nestin	NM_016701.3
骨钙素 (BGLAP)	NM_007541.3
		ABCG2	NM_011920.3

在一些方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞可以表达以下群组中的一种或多种标记物：早期标记物（例如，Oct4、Sox2、Nanog、Vasa、SSEA1）、造血标记物（例如，CD34、CD14、CD19、CD117）、MSC标记物（例如，CD44、CD73、Thy1.1（CD90.1）、CD105、CD106、Sca1）、上皮标记物（例如，角蛋白上皮、CK18、CK19）、神经干细胞标记物（例如，Nestin）、成骨细胞标记物（例如，骨钙素）、内皮细胞标记物（例如，CD31）、细胞迁移标记物（例如，CD184）、细胞整联蛋白标记物（例如，CD29）、多种类型干细胞（例如，神经元、HSC、内皮）标记物（例如，CD133）。

在一些实施方案中，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群表达一种或多种以下标记物：Oct4、Nanog、ABCG2、CD117、CD29、CD44、CD73、CD90.1、CD105、Sca1、CD31、CD184、角蛋白上皮、巢蛋白和骨钙素。一个方面，存在标记物Oct4、Nanog、ABCG2、CD117、CD29、CD44、CD73、CD90.1、CD105、Sca1、CD31、CD184、角蛋白上皮、巢蛋白和骨钙素中的两个、或者三个、或者四个、或者五个、以及增加至全部。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞至少表达ABCG2、Oct4、Nanog、CD117、CD29、CD44、Sca1、CD31、CD184、CD133、角蛋白上皮、巢蛋白和骨钙素。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞至少表达ABCG2、Oct4、Sox2、CD19、CD29、CD90、CD31、CD184、CK18、巢蛋白和骨钙素。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞至少表达ABCG2、SSEA1、CD14、CD29、CD105、CD31、CD184、CK19、巢蛋白和骨钙素。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞至少表达ABCG2、Nanog、CD117、CD29、CD90、CD31、CD184、角蛋白上皮、巢蛋白和骨钙素。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞至少表达ABCG2、Nanog、CD117、CD90、CD31、CD133、巢蛋白和骨钙素。

在一些实施方案中，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞进一步被表征为Lin^-。在一些实施方案中，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞在CD3、CD4、CD8a、CD11b、CD13、CD45、Lin和CD140a中的一种或多种中被鉴定为阴性。在一些实施方案中，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞不表达CD3、CD4、CD8a、CD11b、CD13、CD45、Lin和CD140a中的至少一种、或者至少两种、或者至少三种、或者至少四种、或者至少五种、或者增加至所有。

早期胚胎阶段标记物（例如，Oct4、Sox2、Nanog、Vasa、SSEA1）的表达表明纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞处于早期阶段。在纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞中也观察到角蛋白上皮标记物的表达。已知角蛋白上皮标记物在胚胎早期阶段在外胚层细胞中表达，但在成体血细胞中不表达。

4. 活化的干细胞的分化

纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群也能够通过它们的多能性进行鉴定，例如使用适当的培养条件和培养基从所有三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）分化成细胞类型的能力。细胞的分化状态能够通过鉴定本领域技术人员已知的细胞类型特异性标记物来确认。

本公开提供了用于诱导纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群体分化为外胚层谱系的方法。还提供了外胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为外胚层谱系中的至少一种细胞类型。例如，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为神经细胞和上皮细胞。另一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为外胚层谱系中的至少两种、至少三种、以及增加至所有细胞类型。分化成外胚层谱系的细胞的非限制性实施例包括但不限于表皮细胞、神经原细胞和神经胶质细胞。

在其他方面，还提供了诱导衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群分化为外胚层谱系的方法。还提供了源自衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群的外胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。在其他方面，还提供了诱导衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群中的各种亚群分化为外胚层谱系的方法。还提供了源自衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群中的各种亚群的外胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。在其他方面，还提供了诱导如本文所公开的活化的干细胞亚群分化为外胚层谱系的方法。还提供了衍生自如本文所公开的活化的干细胞的亚群的外胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。

本公开提供了用于诱导纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群体分化为中胚层谱系的方法。还提供了中胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为中胚层谱系中的至少一种细胞类型。例如，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为心肌细胞和成骨细胞。另一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化成中胚层谱系中的至少两种、或者至少三种、或者至少四种、以及增加至所有细胞类型。分化成中胚层谱系的细胞的非限制性实施例包括但不限于脂肪生成的、平滑肌生成的、软骨生成的、心源性的、皮肤生成的、造血的、血管生成的、肌源性的、肾源性的、泌尿生成的、成骨的、心包起源的或基质的细胞。

在其他方面，还提供了诱导衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群分化为中胚层谱系的方法。还提供了源自衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群的中胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。在其他方面，还提供了诱导衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群中的各种亚群分化为中胚层谱系的方法。还提供了源自衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群中的各种亚群的中胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。在其他方面，还提供了诱导如本文所公开的活化的干细胞亚群分化为中胚层谱系的方法。还提供了衍生自如本文所公开的活化的干细胞的亚群的中胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。

本公开提供了用于诱导纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群体分化为内胚层谱系的方法。还提供了内胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群。一方面，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为内胚层谱系中的至少一种细胞类型。例如，纯化的CD34+/CD45-干细胞能够分化为肝细胞。另一方面，纯化的CD34+/CD45-干细胞能够分化成内胚层谱系中的至少两种、或者至少三种、或者至少四种、或者至少五种、以及增加至所有细胞类型。分化成内胚层谱系的细胞的非限制性实施例包括但不限于胰腺、肝、肺、胃、肠和甲状腺中的细胞。

在其他方面，还提供了诱导衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群分化为内胚层谱系的方法。还提供了源自衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群的内胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。在其他方面，还提供了诱导衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群中的各种亚群分化为内胚层谱系的方法。还提供了源自衍生自如本文所公开的休眠的微小细胞的活化的干细胞群中的各种亚群的内胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。在其他方面，还提供了诱导如本文所公开的活化的干细胞亚群分化为内胚层谱系的方法。还提供了衍生自如本文所公开的活化的干细胞的亚群的内胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体。

5. 使用方法

本公开提供了使用本文所公开的活化的干细胞来治疗有此需要的对象中的疾病的方法。在一些实施方案中，提供了使用衍生自本文所公开的活化的干细胞的分化的细胞来治疗有此需要的对象中的疾病的方法。再生医学包括旨在帮助受损细胞、组织或器官修复、替换或再生的疗法。本文所公开的方法可以被用于生殖医学中基于细胞的疗法。

在一些方面，本文公开的方法和组合物可以被用于治疗疾病或病症，例如，退化性疾病、增生性疾病、遗传性疾病、损伤和/或器官衰竭。疾病或病症的非限制性实施例包括神经退行性疾病、神经系统疾病（例如，认知障碍和情绪疾病）、听觉疾病（例如，耳聋）、骨质疏松症、心血管疾病、糖尿病、代谢紊乱、呼吸道疾病、药物敏感性疾病、眼部疾病（如黄斑变性）、免疫性疾病、血液疾病、肾脏疾病、增生性疾病、遗传疾病、外伤、中风、器官衰竭或肢体缺失。疾病的其他实施例包括神经退行性疾病、神经系统疾病、眼部疾病、情绪疾病、呼吸疾病、听觉疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢疾病、肾脏疾病、增殖性疾病、遗传疾病、自身免疫性疾病、药物敏感性疾病、认知障碍、抑郁症、耳聋、骨质疏松症、糖尿病、黄斑变性、肥胖症、亚历山大氏病（Alexander's disease）、阿尔珀氏病（Alper's disease）、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、巴顿病（Battendisease）、卡纳万病（Canavan disease）、柯凯因氏症候群（Cockayne syndrome）、皮质基底变性、克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease）、亨廷顿氏病（Huntington's disease）、HIV相关痴呆、肯尼迪病（Kennedy's disease）、克拉贝病（Krabbe's disease）、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease）、多发性硬化症、多系统萎缩、发作性睡病、神经型疏螺旋体症（neuroborreliosis）、帕金森氏病、Pelizaeus-Merzbacher病、Pick病、原发性侧索硬化、朊病毒病、Refsum病、Sandhoffs病、Schilder病、继发于恶性贫血的脊髓亚急性合并变性、精神分裂症、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症（SMA）、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓痨、后天性免疫缺乏、白血病、淋巴瘤、超敏反应（过敏）、严重的合并免疫缺陷、急性弥漫性脑脊髓炎、艾迪生氏病（addison's disease）、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、大疱性类天疱疮、乳糜泻、皮肌炎、1型糖尿病、2型糖尿病、肺出血肾炎综合症（Goodpasture's syndrome）、格雷夫斯病（Graves' disease）、格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome）、桥本病（Hashimoto's disease）、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、干燥综合征（Sjogren's syndrome）、颞关节炎、血管炎、韦格纳氏（Wegener's）肉芽肿病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、钙化主动脉瓣疾病（CAVD）、脑血管意外（中风）、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、冠状动脉瓣膜病、心肌病、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压、肥厚型心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞、静脉血栓栓塞、酸性脂肪酶病、淀粉样变性、Barth综合征、生物素酶缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症II型、桥脑中央髓鞘溶解、肌营养不良症、Farber's病、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症、神经节苷脂沉积症、三甲基胺尿症、Lesch-Nyhan综合征、脂质贮积病、代谢性肌病、甲基丙二酸尿症、线粒体肌病、黏多醣贮积症、粘脂质贮积病、粘脂质贮积病、黏多醣贮积症、多种CoA羧化酶缺乏症、非酮性高甘氨酸血症、庞贝氏症（Pompe disease）、丙酸血症、肝糖原累积症I型、尿素循环代谢障碍、高草酸尿症、草酸盐沉积症、癌、肉瘤、生殖细胞肿瘤、母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌。

一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的皮肤伤口的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的肝损伤的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的骨损伤或病症（例如，关节炎、骨质疏松等）的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的神经损伤或神经元退行性疾病的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的心脏组织损伤或心力衰竭的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的慢性疾病（例如，糖尿病）的方法。

一方面，提供了本文所公开的活化的或分化的细胞的自体转移方法。一方面，提供了本文所公开的活化的或分化的细胞的同种异体转移的方法。一方面，提供了本文所公开的活化的或分化的细胞的同源转移的方法。

实施例

实施例1

从血液分离休眠的微小细胞

使用以下方法从小鼠外周血中分离出本文所公开的休眠的微小细胞。从4-10周龄时收获的FVB-Tg（CAG-luc-eGFP）L2G85Chco/J（L2G）雄性或雌性小鼠中收集外周血（TheJackson Laboratory，Sacramento, CA, http://www.jax.org）。luc-eGFP转基因由表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP）的CAG启动子（具有鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白杂交启动子的人巨细胞病毒立即早期启动子增强子）引导。为了收集外周血，将小鼠在供有3％异氟烷（ButlerSchein Animal Health，Encinitas, CA）的腔室中进行麻醉，然后通过眼眶后静脉，注射稀释于100 µl生理盐水中的4U肝素。5分钟后，从每只小鼠的眶后窦收集血液到含有100 μl盐水中的1U肝素的1.5 ml微量离心管中。从每只小鼠收集的血液通常为约1 ml至1.5 ml。

为了裂解红细胞，将1 ml收集的血液与9 ml裂解缓冲液（例如，8.3 g/L的NH₄Cl，1g/L的KHCO₃和3.7 g/L的EDTA）混合。然后将悬浮液在4℃下以3,000 xg离心10分钟。洗涤沉淀，并重悬于3 ml PBS中。为了耗尽血小板，将细胞悬浮液转移至含有用PBS以1∶4.4稀释至密度为1.063的Optiprep密度梯度培养基（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）的管中。收集有核细胞悬浮液，并在4℃下以350 g离心15分钟。除去上清液，并将沉淀重悬于10 mlPBS或培养基（例如，含20％FBS的α-MEM）中，以进行进一步分析。

进行细胞计数，并且重悬的沉淀中的细胞数在800,000-1,000,000/ml之间。破碎的干细胞的百分比低于25％。在电子显微镜（EM）下观察分离的干细胞。分离的休眠的微小细胞的直径小于5 µm。例如，一个分离的休眠的微小细胞的直径约为2.5 µm（图1）。对分离的干细胞的核酸用Hoechst 33342进行染色。结果表明，分离的干细胞具有非常高的核质比，例如，约为9∶1（图2）。当在常规培养基（例如，含20％FBS的α-MEM）中培养达到5-10天时，分离的休眠的微小细胞没有生长，并且Hoechst 33342核酸染色没有扩散到细胞膜的外面（图2）。使用免疫荧光（IF）和荧光激活细胞分选（FACS）分析来测试由分离的休眠的微小细胞表达的细胞标记物，其被表征为CD34⁺/CD45⁺和ABCG2^-（图3A和3B）。

使用Trizol试剂法从分离的休眠的微小细胞和对照细胞（野生型肝细胞）中提取总RNA，然后用无RNase的DNase处理以去除受污染的DNA。使用基于微流体的Agilent 2100生物分析仪（Agilent Genomics）平台来分析总RNA，以检测和分析sRNA和rRNA的水平。结果显示，在分离的休眠的微小细胞的群体中，sRNA与rRNA的比率约为22：1，而在肝细胞系（例如，AML12）中该比率约为1：10（图4）。还检测了COX IV（线粒体内膜蛋白）、钙连接蛋白（ER驻留分子伴侣）和RPS3（核糖体标记物）的水平。结果表明，分离的休眠的微小细胞表达的COXIV和钙连接蛋白水平非常低，且RPS3的水平最低。结果表明分离的干细胞处于休眠状态。

还通过FACS研究了休眠的微小细胞表达各种干细胞标记物。结果表明，休眠的微小细胞除了表达CD34和CD45外，还表达了以下标记物中的一部分或全部：CD44、CD150、Sca1、c-kit、Thy1.1（CD90.1）、Oct 4、SSEA1、Nanog、Vasa、CD133和CD105。休眠的微小细胞进一步被表征为Lin阴性。此外，休眠的微小细胞不表达CD41、CD184和E-钙粘着蛋白中的一些或全部。

实施例2

休眠的微小细胞的体外活化及发育

使用以下方法活化和培养如以上实施例1中所述地从血液中获得的休眠的微小细胞。

为了在体外活化和培养休眠的微小细胞，使用包括原代肝细胞、人肝母细胞瘤（HepG2）细胞、肝细胞细胞系（例如，AML12、HepaRG等）以及小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞系中的一种或多种的材料来制备活化/发育系统。可以将其他试剂和因子添加到活化/发育系统中。活化/发育系统可以是使用Transwells的共培养系统，也可以使用条件培养基，如下所述。

体外活化

对于共培养系统，制备了包括上述细胞/细胞系中的一种或多种的细胞或细胞混合物。例如，基于细胞总数，细胞混合物包括约65-90％的上述肝细胞系和约35-10％的原代肝细胞。用丝裂霉素C处理细胞混合物2小时以使细胞有丝分裂失活。然后将细胞混合物接种在6孔板上含有10％FBS的DMEM/F12中。接种后约十六小时，细胞粘附于孔并且有约80％融合。然后将分离的休眠的微小细胞放入Transwell（24 mm-insert，Corning, Corning, NewYork）的上腔室中，从而与上述细胞混合物一起在含有20％FBS的α-MEM的共培养基中共培养。通过Transwell膜（孔径为0.4 μm）从失活的细胞混合物中分离出休眠的微小细胞。上下腔室使用相同的培养基并且隔日更换，持续约10至20天。

或者，制备可以被用于体外培养分离的休眠的微小细胞的条件培养基。例如，将上述细胞或细胞混合物悬浮在含有10％FBS的DMEM培养基中，然后接种在细胞培养皿中。每两天从细胞培养皿中收集一次培养基，然后将新培养基添加到细胞培养皿中，直到细胞达到100％融合为止。可以将在不同时间收集的培养基混合在一起，并且将其在-20°C下短期存储，或在-80°C下长期存储。使用前，将条件培养基以3000 xg离心，以沉淀培养基中剩余的细胞。条件培养基也能够用0.22 μm过滤器过滤以除去剩余的细胞。然后将条件培养基与常规培养基（例如，具有20％FBS的α-MEM）以约1∶3至约3∶1的比率（v/v）混合。将分离的休眠的微小细胞轻轻悬浮在上述培养基混合物中，然后接种到培养皿或平板中。培养基可以每隔一天更换一次。每天在显微镜下观察细胞培养物中细胞生长和细胞集落的形成。

研究活化的干细胞在上述活化/发育系统中培养4-12小时后各种标记物的表达。在活化的干细胞中观察到ABCG2的表达（图3A），ABCG2是未分化细胞的标记物并且在休眠的微小细胞中不表达。RNA分析表明，活化的干细胞中小RNA与核糖体RNA的比例约为1：6，显著低于休眠的微小细胞中小RNA与核糖体RNA的比例（图4）。活化的干细胞在活化/发育系统中培养长达15天，并且观察到活化的干细胞的Hoechst 33342核酸染色逐渐扩散到细胞膜外（图2）。活化的干细胞的大小也变得大于休眠的微小细胞。活化的干细胞进一步显示出COXIV、RPS3和钙连接蛋白的高水平表达，如下表3所示。ABCG2的表达表明活化的干细胞是未分化的干细胞。线粒体标记物COX IV的表达增加，表明休眠的微小细胞已经被唤醒。核糖体RNA（rRNA）标记物RPS3的高表达表明细胞的新陈代谢活跃。ER标记物钙连接蛋白的表达表明活化的干细胞中的转运系统繁忙。这些结果表明，先前处于休眠状态的干细胞在活化/发育系统中被活化，并且细胞功能和活性得以恢复。

表3

条件	ABCG2	COX IV	RPS3	钙连接蛋白
					普通培养基(4小时 (hrs))	-	非常低	-	非常低
活化/发育系统(4 hrs)	++++	++++	++++	++++

如上所述，FACS被用于鉴定活化的干细胞的标记物。活化/发育系统中活化的干细胞被表征为以下亚群：CD34⁺/CD45⁺、CD34⁺/CD45^-、CD34^-/CD45⁺和/或CD34^-/CD45^-。

活化的干细胞的亚群的富集和表征

使用以下方法来获得富含CD34⁺活化的干细胞的亚群。在如上所述的共培养系统中共培养分离的休眠的微小细胞两周后，按照制造商（Miltenyi Biotec Inc. San Diego, CA）推荐的方案，通过MACS富集CD34⁺细胞部分。简而言之，将胰蛋白酶消化的细胞与抗CD34（大鼠）抗体一起温育30分钟，然后在4°C与抗大鼠微珠一起温育15分钟。用PBS洗涤后，将细胞重悬于500 μl的分离缓冲液中，并施加到MACS色谱柱（Miltenyi Biotec）上。通过FACS分析富集和扩增的细胞的CD34阳性以及其他表面标记物（例如，CD45、CD44、CD29、CD38、CD3、Lin、Sca-1、Thy1.1、c-kit）。同种型IgG被作为阴性对照。使用FlowJo（Tree Star,Ashland, Oregon）分析数据。或者，FACS也可以被用于分类和分离具有特定标记物的细胞的亚群。类似的方法能够被用于获得以其他标记物为特征的富集的细胞亚群，例如，CD45⁺细胞亚群、CD34⁺/CD45⁺细胞亚群、CD34⁺/CD45^-细胞亚群、CD34^-/CD45⁺细胞亚群、或者CD34^-/CD45^-细胞亚群。

免疫荧光染色

使用标准程序进行间接免疫荧光染色。简要地说，用1％BSA/PBS封闭5 μm厚的水化石蜡切片或固定的冷冻组织切片（30分钟），用PBS洗涤3次。切片用特异性一抗和荧光标记的二抗染色。将样品用含有密封剂的DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；VectorLaboratories）固定。小鼠IgG和兔IgG抗体被作为阴性对照。用Leica DMRA显微镜观察染色的切片。

细胞集落分离和纯化

分离的休眠的微小细胞在活化/发育系统中培养10-20天，并在显微镜下观察到一个或多个细胞集落（图5）。然后使用克隆柱或通过胰蛋白酶消化和分离菌落来分离细胞集落。FACS分析显示，分离的集落中至少有90％的干细胞是CD34⁺/CD45^-（图7）。按照制造商（Miltenyi Biotec Inc. San Diego, CA）推荐的方案，通过MACS从分离的细胞集落中纯化出富含CD34⁺/CD45^-细胞的亚群。例如，将分离的集落的细胞与抗CD45抗体一起温育30分钟，然后在4℃与抗大鼠微珠一起温育15分钟。用PBS洗涤后，将细胞重悬于500 μl的分离缓冲液中，并施加到MACS柱（Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA）上。收集CD45耗尽的细胞群，并与抗CD34抗体进一步温育30分钟，然后在4℃与抗大鼠微珠温育15分钟。用PBS洗涤后，将细胞重悬于500 μl分离缓冲液中，并施加到MACS色谱柱上。收集CD34⁺细胞群，其被表征为CD34⁺/CD45^-。或者，将分离的集落中的细胞用抗CD34和抗CD45抗体标记。然后进行荧光激活细胞分选（FACS）来分选和收集CD34⁺/CD45^-细胞群。

当在显微镜下观察时，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞呈大体的纺锤形或椭圆形，具有高的核质比（例如，约5~8：1）（图6，A和B），直径为约20-30 μm。纯化的干细胞表达GFP（图6，A），并且能够在含有20％FBS的α-MEM中快速（例如，以约26小时的倍增时间）扩增。纯化的干细胞可以以贴壁细胞培养物和/或悬浮细胞培养物在体外培养。当纯化的附着于细胞培养皿/平板的纯化的干细胞达到融合时，细胞排列类似于上皮细胞培养物（图6，B）。对活化的干细胞进行单细胞稀释。在具有胚状体样（EB样）结构的如上所述的条件培养基中培养时，可以从单个细胞获得集落（图6，C和D）。

使用免疫荧光（IF）染色进一步研究了CD34⁺/CD45^-细胞群的干细胞标记物。结果表明，纯化的细胞群还表达一种或多种早期标记物（例如，Oct4、Sox2、Nanog、Vasa、SSEA1）、造血标记物（例如，CD34、CD14、CD19、CD117）、MSC标记物（例如，CD44、CD73、Thy1.1（CD90.1）、CD105、CD106、Sca1）、上皮标记物（例如，角蛋白上皮、CK18、CK19）、神经干细胞标记物（例如，Nestin）、成骨细胞标记物（例如，骨钙素）、内皮细胞标记物（例如，CD31）、细胞迁移标记物（例如，CD184）、细胞整联蛋白标记物（例如，CD29）、多种类型干细胞（神经元、HSC、内皮）标记物（例如CD133）。纯化的细胞群进一步被表征为CD3、CD4、CD8a、CD11b、CD13和CD140a中的一种或多种呈阴性。

实施例3

诱导活化的干细胞分化

使用以下方法诱导如实施例2中所述的活化的干细胞分化。研究了来自集落的纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞群的多能分化潜能。

外胚层

为了研究分化成神经元衍生物（例如，神经元、少突胶质细胞、神经胶质细胞）的潜力，将纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞（24孔板中3,000/孔）接种在细胞培养皿/板中，并在补充有10ng/ml rhEGF、20 ng/ml FGF-2和20 ng/ml NGF（所有生长因子来自R&D Systems,Minneapolis, MN, USA）的NeuroCult基础培养基（干细胞技术公司，Vancouver, BC,Canada）中温育。阴性对照组使用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）。每两天更换一次培养基。约2周后形成神经元团和神经球（图8，A和E-G）。在分化的细胞中观察到神经细胞特异性标记物巢蛋白和β3-微管蛋白的表达（图8，B-D）。还观察到一堆神经细胞的形成，其中包括在巢蛋白和β3-微管蛋白中呈阳性的神经细胞（图8，H）。结果表明，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为来自外胚层的神经细胞。

皮肤也起源于外胚层。使用IF染色来测试活化的干细胞中的表皮标记物。纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞经被表征为表达角蛋白上皮标记物CK18和CK19（图9）。在纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞中也观察到泛角蛋白的表达（使用抗泛细胞角蛋白抗体，小鼠单克隆C-11），其与CD34染色重叠（图9）。纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞中也表达上皮细胞粘附分子EpCam，并与GFP信号重叠。因此，结果表明，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞表达上皮细胞标记物，具有分化为皮肤细胞的潜力。

中胚层

为了研究分化为成骨细胞（中胚层）的潜力，将纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞（每个培养皿1,000、3,000和5,000）接种到细胞培养皿中，并与成骨细胞分化培养基（ODM）温育两周。ODM可以包括含有10％FBS的α-MEM、1X青霉素-链霉素、0.1 μM地塞米松、10mM β-甘油磷酸酯、50 μM抗坏血酸。在阴性对照组中，将5,000个纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞接种在含10％FBS的α-DMEM中。每两天更换一次培养基。两周后，洗涤并用10％福尔马林固定，然后用骨组织特异性染色剂（茜素红）染色。结果显示，在ODM中培养的CD34⁺/CD45^-干细胞的培养皿中，形成了骨化中心样结构且茜素红染色呈阳性（图10，A和B）。在对照组中没有形成这样的骨化结构且茜素红染色为阴性（图10，A和B）。因此，结果表明，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为成骨细胞（来自中胚层的细胞）。

为了进一步研究分化为心肌细胞（来自中胚层的另一种细胞类型）的潜力，将纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞（约10,000）接种在细胞培养皿中，并与心肌细胞分化培养基（CDM）温育2周。在阴性对照组中使用含有20％FBS的α-DMEM。每两天更换一次培养基。两周后，将细胞用CD34、肌间线蛋白（肌肉干细胞标记物）、连接蛋白43（心肌细胞特异性标记物）和肌钙蛋白I（心肌细胞特异性标记物）染色。所有标记物（肌间线蛋白、连接蛋白43和肌钙蛋白I）均为阳性，并与CD34重叠（图11）。因此，结果表明，纯化的干细胞能够分化为心肌细胞（来自中胚层的细胞）。

内胚层

为了研究分化为肝细胞（内胚层）的潜力，将纯化的干细胞接种到细胞培养皿中，并与肝细胞分化培养基（HDM）温育两周。在阴性对照组中使用含有20％FBS的α-DMEM。每两天更换一次培养基。两周后，将细胞用白蛋白和CK18（特异性肝细胞标记物）和CK19（胆管上皮标记物）染色。所有标记物（白蛋白、CK18和CK19）均为阳性（图12）。进一步的测试表明白蛋白染色与CD34染色重叠。因此，结果表明，纯化的CD34⁺/CD45^-干细胞能够分化为肝细胞样和胆汁样上皮细胞。

实施例4

皮肤伤口的治疗

使用下面的方法来使用实施例2中讨论的活化干细胞群来治疗皮肤伤口。

纤维蛋白凝胶支架和3-D构建体的制备

通过将纤维蛋白原和凝血酶的储备溶液解冻，并将最终浓度为12.5 mg/ml的纤维蛋白原和2.5 U/ml的凝血酶加CaCl₂（最终浓度：45 mM）在1.5 ml试管中混合，制成纤维蛋白凝胶。将200 μl混合物轻轻移液至24孔板中。使纤维蛋白原含量在37℃下2小时以形成纤维蛋白凝胶支架。活化的干细胞（例如富集的CD34⁺细胞群体、或从集落纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群、或其他亚群中）以每孔5 x 10⁵接种在24孔板上纤维蛋白凝胶支架顶部，然后在每孔2ml含1％热灭活胎牛血清（FCS，BioWest）和1％青霉素-链霉素（Gibco）的α-MEM中培养一晚。然后将细胞/支架3-D构建体准备好进行移植。在实验之前，还进行了流式细胞术来表征细胞/支架3-D构建体中的培养的细胞。

全层皮肤伤口的治疗

皮肤准备后，通过在异氟烷麻醉下使用6 mm活检打孔器（Acuerm Inc., FortLauderdale, FL）对20只10周龄的野生型FVB雄性小鼠的背部中部皮肤进行直径6 mm的全层切除伤口。

为了抑制伤口收缩，将由1.6 mm厚的硅胶片（Press-to-Seal Silicone SheetJTR-S-2.0, Grace Bio-Labs, Bend, OR）制成的甜甜圈形夹板（内径10毫米，外径14毫米）放在伤口区域周围，并使用6-0尼龙缝线（6-0 Ethilon Nylon Suture, Ethicon LLC.,Cornelia, GA）用八根间断缝线固定。然后将上述细胞/支架3-D构建体（约500,000个细胞/单位）移植到创面中（n = 5）。不含干细胞的纤维蛋白凝胶（仅支架）也被移植到创面中作为对照（n = 5）。将修剪过的无菌塑料盖玻片（Fischer Scientific, Pittsburgh, PA）放在夹板的顶部，并在动物的躯干周围沿周向施加半封闭敷料（Tegaderm Film 9506 W, 3 MHealth Care, St. Paul, MN）。

皮肤伤口愈合分析

伤口产生后，每天使用固定距离的数码相机（Sony cyber-shot DSC-TX 7, New York,NY, USA）拍摄伤口的图像。为了大致评估伤口面积，通过计算当前伤口相对于原始伤口面积的百分比来分析伤口面积。当伤口面积大致等于零时，认为伤口完全闭合。

在治疗后第15天（D15）和D23通过CO₂使小鼠安乐死。收集皮肤伤口区域和邻近组织（约2.5 cm），并在10％（v/v）的甲醛缓冲液中于4°C固定16小时以上或在液氮中速冻，然后进行石蜡包埋或冷冻切片。将样品切成5 μm厚的切片，并用苏木精和曙红（H＆E）染色以检查局部细胞变性和炎症。进行Masson三色胶原蛋白染色以评估伤口区域的组织纤维化。考虑的组织学参数是伤口闭合率、表皮细胞再生、真皮再生、纤维沉积和炎症。通过计算创面中毛囊或皮脂腺的数量来评估皮肤附件的再生。对一些石蜡皮肤切片（5 μm）进行进一步处理以进行免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）。

糖尿病皮肤伤口模型

使用糖尿病小鼠（FVB(Cg)-Tg(Ins2-CALM1) 26Ove Tg(Cryaa-TAg)1Ove/PneJ,Jackson Labs）来研究上述细胞/支架3-D构建体的伤口愈合效果。皮肤准备后，在异氟烷麻醉下使用手术剪刀在6只12月龄的糖尿病小鼠的背部皮肤上进行1.5 cm x 1.5 cm的全层皮肤伤口。然后将上述细胞/支架3-D构建体（约500,000个细胞/单位）移植到创面中。不含干细胞的纤维蛋白凝胶（仅支架）也被移植到创面中作为对照。伤口产生后，每天使用固定距离的数码相机（Sony cyber-shot DSC-TX 7, New York, NY, USA）拍摄伤口的图像，持续50天。为了大致评估伤口面积，通过计算当前伤口相对于原始伤口面积的百分比来分析伤口面积。当伤口面积大致等于零时，认为伤口完全闭合。

在治疗后第55天（D55）通过CO₂使小鼠安乐死。收集皮肤伤口区域和邻近组织（约2.5 cm），并在10％（v/v）的甲醛缓冲液中于4°C固定16小时以上或在液氮中速冻，然后进行石蜡包埋或冷冻切片。将样品切成5 μm厚的切片，并用苏木精和曙红（H＆E）染色以检查局部细胞变性和炎症。进行Masson三色染色以评估伤口区域的组织纤维化。考虑的组织学参数是伤口闭合率、表皮细胞再生、真皮再生、纤维沉积和炎症。结果还表明，再生的表皮层是光滑的，并且胶原蛋白的分布与正常皮肤的相似。皮下组织（例如脂肪组织）的结构和分布是清晰的，并且与正常皮肤的结构和分布相似。还观察到肌肉组织新生。

统计分析

使用基于Java的图像处理程序的图像分析软件（ImageJ, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, USA）对图像进行分析，来计算伤口闭合率百分比、疤痕面积百分比。通过ImageJ中的度量设置拆分颜色通道的方法，胶原蛋白沉积分析基于红色区域（细胞结构区域）除以蓝色区域（胶原沉积）。使用配对、两尾Student t检验对两组进行比较，以进行统计分析。p<0.05的值被认为具有统计学显著性。

结果

为了确定活化的干细胞在伤口愈合中的治疗潜力，制造了三维（3-D）构建体，其在半固体纤维蛋白凝胶支架上包含活化的干细胞。将构建体施加到在具有与来自L2G小鼠的供体细胞相同的菌株背景的FVB小鼠上造成的全层切除皮肤伤口中。在移植前，将GFP⁺干细胞接种在预制的纤维蛋白凝胶上24小时，显示这些细胞生长强劲，并在纤维蛋白凝胶上融合。

处理组（使用细胞/支架3-D构建体）表现出闭合时间、疤痕面积和纤维组织沉积显著减少（图13）。形态图像分析表明，早在受伤后第3天，用3-D构建体进行的治疗显著改善了伤口闭合，并且在受伤后第6天变得更加明显（图13，A）。累积图像分析显示，与对照组相比，治疗后第3、5、7和9天伤口愈合具有统计学上的显著改善。用3-D构建体治疗的所有伤口均在第10天闭合，而对照组中的伤口直到第15天仍然开放（图13A）。

组织学评估显示，在处死最后一天（第23天），与对照组相比，治疗组的动物伤口中发生了增强的表皮细胞再生。在第6天，与对照组相比，伤口表面积或疤痕区域明显较小（图13，B）。在治疗组的伤口中还观察到更高的细胞活性，表明这些再生区域中细胞再生增强。所有治疗的动物的皮肤显示出接近正常的表皮和真皮的组织学结构（图14）。虚线描出伤口区域的轮廓。3-D构建体粘附在伤口表面上。三色染色表明，在3-D构建体下方，有许多新的附件，皮脂腺和毛囊结构生长到创面上并出现在被治疗小鼠的伤口区域（图14）。

在糖尿病皮肤伤口模型中，结果表明，用细胞/支架3-D构建体治疗的糖尿病小鼠中的皮肤伤口在D16-D19完全闭合（图15）。对照组（仅支架）中的皮肤伤口直到D50才闭合。组织学评估表明，在处死的最后一天（第55天），与对照组相比，在治疗组中的小鼠的伤口中出现了增强的表皮细胞再生（图16）。经治疗的小鼠的皮肤显示出接近正常的皮肤组织结构，具有表皮层、皮下组织和肌肉组织。相比之下，对照组中的伤口仅被角质化的表皮层封闭，而没有皮下组织和肌肉组织（图16）。

实施例5

人工骨模型

以下方法用于使用纯化的干细胞在体外发育人造骨组织。将纯化的多能干细胞接种在骨基质中，并且加入成骨细胞分化培养基（ODM）并培养两周。在两周结束时，观察到矿物质沉积（图17，A）。在第三周，一些分化的成骨细胞已经连接在一起以形成骨化中心样结构（图17，B，由箭头指示）。四周后，骨组织已经生长，并从原始骨基质中伸出并延伸出去（图17，C，虚线上方）。结果表明，纯化的干细胞可以生长为骨组织并在基质上形成人造骨。

实施例6

肝损伤的治疗

使用如实施例3所述的纯化的CD34⁺/CD45^-细胞群，采用以下方法治疗肝损伤。

为了建立肝损伤模型，在8周龄时，对20只成年的受体野生型FVB小鼠进行一次用橄榄油1：1稀释CCl₄的腹膜注射。施用CCl₄一天后，随机选择实验小鼠来接受一次经由眶后窦静脉而注射悬浮于150 μl盐水中的2.5×10⁵个纯化的CD34⁺/CD45^-细胞（n=10）。对照小鼠通过相同的途径用150 µl盐水处理（n=10）。在纯化的CD34⁺/CD45^-细胞移植后第7天处死所有小鼠。收集小鼠内部器官，并固定在10％福尔马林缓冲液中。分离肝组织样品以进行速冻和石蜡包埋。

结果表明，与正常肝相比，在第7天，在对照小鼠肝中，小叶中心区域的肝细胞表现出空炮的、水肿的和脂肪的变性，并伴有核固缩、核破裂和核溶解（图18，A和B）。相反，用纯化的CD34⁺/CD45^-细胞处理的小鼠在中央静脉区域显示出几乎具有正常的结构完全再生（图18，C）。这些结果表明，使用纯化的CD34⁺/CD45^-细胞治疗显著减轻CCl₄损伤，并大大促进肝再生。用纯化的CD34⁺/CD45^-细胞治疗后，炎症细胞没有渗透再生的肝区域和周围组织，表明几乎没有排斥反应或免疫反应发生。

荧光显微镜证实在中央静脉区域中有相当数量的GFP⁺细胞，其是CCl₄损伤的靶标（图18，D、E和F）。移植的GFP⁺细胞表达白蛋白和增殖标记物Ki-67。这些结果表明，移植的纯化的CD34⁺/CD45^-细胞被宿主肝所接受并且不是短暂的，而是在结构和功能上活跃地增殖并重新填充受损区域。肝组织的PCR分析表明，GFP基因在移植肝中长期（至少3个月）存在。在所有时间点在经治疗的肝中均未发现肝肿瘤形成的总体或组织学证据。

实施例7

培养干细胞和治疗肝损伤的替代方法

使用替代的方法来活化和培养从血液中分离出来的休眠的微小细胞，并用活化的干细胞治疗肝损伤。

干细胞分离和共培养

在8周龄时收集FVB-Tg (CAG-luc-eGFP) L2G85Chco/J (L2G)雄性小鼠（The JacksonLaboratory, Sacramento, CA）。luc-eGFP转基因由表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP）的CAG启动子（具有鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白杂交启动子的人巨细胞病毒立即早期启动子增强子）指导。将小鼠在供有3％异氟烷（Butler Schein Animal Health, Encinitas, CA）的腔室中完全麻醉，然后注射稀释于100 µl盐水中的3U肝素。使用肝素化的毛细管通过每只小鼠的眶后窦收集血液。通过向50 ml管中的全血中以10：1加入裂解缓冲液（8.3 g/l NH₄Cl、1 g/l KHCO₃、3.7 g/l EDTA）来去除红细胞，然后在4℃下以3,000 g高速离心10分钟。将沉淀重悬于3 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中。为了耗尽血小板，将细胞悬浮液转移至含有用PBS以1：4.4稀释至密度为1.063的Optiprep密度梯度培养基的管中。收集有核细胞悬浮液，并在4℃以350 g离心15分钟。将沉淀重悬于PBS中以进行进一步的荧光激活细胞分选（FACS）分析，或重悬于培养基（含有20％FBS、13 mg的抗生素-抗真菌药、20 mg的庆大霉素的a-MEM）中用于体外研究。用30 mg/l丝裂霉素C预处理AML12肝细胞（ATCC, Manassas, VA）2小时。然后将有丝分裂失活的AML12肝细胞接种在六孔板上含有10％FBS的DMEM中。接种后十六小时，AML12细胞已经粘附至培养孔的底室，并已融合约80％。将来源于0.5 ml血液的有核细胞悬液放入Transwell（24 mm插入物，0.4 mm孔径，Corning, Corning, New York）的上腔室中。每隔一天更换一次培养基。

磁激活细胞分选（MACS）和FACS分析

与丝裂霉素C处理的AML12细胞共培养3周后，扩增的细胞用磁激活细胞分选（MACS）纯化，以富集CD34阳性细胞（Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA）。简而言之，经培养的细胞用胰蛋白酶消化，并与抗CD34大鼠抗体一起温育30分钟，用PBS洗涤，并在4℃与抗大鼠微珠一起温育30分钟。用PBS洗涤后，将细胞重悬于500 μl分离缓冲液中，并施加到MACS柱上。对来自原始的、阴性的和阳性的部分的细胞进行计数并接种到如上所述的Transwell膜上。通过FACS分析经扩增的细胞的CD34阳性和不同的表面标记物，包括CD45、Sca-1、Thy1.1、c-kit和CD41。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst33342染色。使用FlowJo（Tree Star, Ashland, OR）分析数据。

肝损伤模型与细胞移植

在8周龄时，对20只成年的受体野生型FVB小鼠进行了一次用橄榄油1：1稀释CCl₄的腹膜注射（1.2 ml/kg）。施用CCl₄的一天后，随机选择实验小鼠接受一次通过眶后的窦静脉注射2.5×10⁵个CD34⁺细胞群，该细胞群从共培养的干细胞中纯化、悬浮于150 µl盐水中（n=10）。对照小鼠通过相同的途径用150 µl盐水处理（n=10）。在纯化的CD34⁺细胞群移植后第7天处死所有小鼠。收集血液用于实验室测量。收集小鼠内部器官，并固定在10％福尔马林缓冲液中。分离肝组织样品以进行速冻和石蜡包埋。为了研究细胞转分化的机制，将mT/mG小鼠（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）与白蛋白Cre转基因小鼠（由Dr. KarlSylvester, Stanford, CA提供）杂交。

聚合酶链反应（PCR）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和RNA分析

使用GENJET基因组DNA纯化试剂盒（ThermoScientific, Vilnius, Lithuania），从共培养的干细胞、eGFP小鼠或移植的小鼠肝脏的新鲜或冷冻肝脏组织中提取DNA。在3周时，使用Trizol试剂法从MACS分选的、Hoechst 33342阳性的、新鲜或培养的干细胞或对照细胞（未经任何处理的培养的AML12细胞）中提取总RNA，然后用无RNase的DNase处理以去除受污染的DNA。使用SuperScript II逆转录酶（Life Technologies, Carlsbad, CA）从每100 µl反应体积的总RNA的4 µg中获得第一链cDNA。在20 µl反应体积中，使用标准方案和1,000ng模板DNA或cDNA、每种引物10 mM以及PCR Master Mix（Promega, Madison, WI）进行聚合酶链反应（PCR）和逆转录PCR。18S rRNA被作为内部对照基因。

蛋白质印迹分析

将共培养的细胞和AML12细胞用PBS洗涤3次，然后用RIPA缓冲液裂解，并在冰上孵育15分钟。离心裂解物，蛋白质定量后，将上清液用于蛋白质印迹分析。通过电泳将细胞裂解物转移到硝酸纤维素膜上。洗涤后，将载有蛋白质的膜与奶粉一起孵育以阻断非特异性结合。一抗孵育使用兔抗白蛋白抗体和β-肌动蛋白抗体进行内部量控制，在4℃过夜。洗涤后，将膜与结合有HRP的山羊抗兔二抗孵育，并通过增强的化学发光（GE Healthcare, LittleChalfont, Buckinghamshire, UK）进行可视化。使用的抗体靶向A6、甲胎蛋白（AFP）、白蛋白、β-肌动蛋白、CD117（c-kit）、CD34、CD41、CD45、CK8、CK18、CK19、CD29（整合素β1）、Ki-67、增殖细胞核抗原（PCNA）、Sca-1、Thy1.1（CD90.1）和DNA抗体。

组织学和免疫学染色

将石蜡包埋的组织标本在载玻片上切成5 µm的厚度，并脱蜡和重新水化。将新鲜分离的细胞、共培养的干细胞和培养的AML12细胞涂片到载玻片上，或直接在Transwell膜上测试。用苏木精和曙红或高碘酸希夫（PAS）对组织或细胞载玻片和Transwell膜染色。IHC和IF染色的简要说明如下：将载玻片在微波炉中的0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中进行抗原提取5分钟，然后与0.03％H₂O₂孵育30分钟以阻断内源性过氧化物酶。将载玻片和膜与1％马血清孵育30分钟以阻断非特异性结合，然后在4℃与一抗孵育过夜。用PBS洗涤后，将载玻片用针对IHC的生物素化二抗或针对IF的结合荧光染料的抗体处理。Alexa Fluor的抗小鼠、抗兔或抗大鼠IgG1抗体（1 mg/ml）被作为抗体对照。用DAPI固定IF染色的载玻片并通过共聚焦显微镜分析。将IHC样品与ABC复合物孵育，然后与DAB显影。用DAB（棕色）和镍/DAB（深蓝色或灰色）显影了双重染色。为每个测试设置不同的对照组（包括阳性、阴性和空白对照组），以确保抗体的特异性。在Leica DMRA显微镜（Leica, Heerbrugg, Switzerland）下观察图像。

肝中GFP表达的原位成像

肝标本用冷盐水（4℃，10 ml）冲洗并直接包埋在Cryo-OCT化合物（Sakura Finetek,Tokyo, Japan）中，无需固定，以避免醛交联引起的自发荧光。通过荧光显微镜测量肝组织中GFP信号的荧光。

统计分析

使用配对的、双尾Student’s t检验对两组进行了统计学分析。使用基于Java的图像处理程序的ImageJ（NIH, Bethesda, MD）进行图像分析。当p<0.05时，差异被认为是显著的。

结果

从L2G或野生型FVB小鼠的外周血中新鲜分离的有核细胞的FACS分析表明，红细胞裂解和血小板耗尽后，细胞混合物高度异质。一小部分CD34阳性细胞共表达CD45（在两个合并的小鼠部分中为0.04％）。来自L2G（GFP⁺）小鼠的外周血的有核（DAPI⁺）细胞混合物在与AML12肝细胞共培养期间迅速扩增（图19）。然而，与共培养细胞相比，没有与AML12细胞共培养的细胞混合物不增殖并变得衰老，到第5天GFP表达丧失。

经过MACS富集后，CD34⁺细胞显性基团（> 90％）随着时间的推移在肝环境中的扩增速度更快。FACS分析表明，扩增的细胞不仅表达CD34，还表达CD45、c-kit、Sca-1和Thy1.1，但不表达血小板的分子标记物CD41。溴脱氧尿苷标记显示CD34⁺/CD45⁺细胞倍增时间约为48小时。

观察到AML12共培养过程中扩增细胞随时间的形态学变化显著。共培养4周后，共培养的细胞变得细长、扁平和多边形、核质比降低。共培养的细胞表达了多种肝细胞标记物，例如α-甲胎蛋白（AFP）、CK8、CK19和CK18。肝内干细胞的特异性标记物A6与增殖细胞核抗原（PCNA）和CK19共表达。肝上皮标记物CK8或CK18和CD34在同一共培养细胞中的共表达表明发生了肝上皮分化。一些共培养的细胞表现出PCNA与A6的共定位，表明原始肝细胞样细胞的活跃增殖。在Transwell膜上原位生长的共培养细胞上CD45阳性表明其造血起源。与AML12肝细胞相比，共培养细胞中活化了肝特异性转录因子和肝代谢功能相关的细胞色素P450（CYPs）基因，例如肝核因子1a（HNF1a）、CYP3A16和CYP1B1。

观察到在肝环境的诱导下，共培养细胞从造血细胞向肝上皮化的、表达白蛋白的细胞的转分化过程。如所预期的，来自mT/mG小鼠的新鲜分离的有核细胞均表达番茄红转基因（图20，A）。在与AML12细胞共培养期间，由于在第7天表达白蛋白/Cre转基因，一些细胞转换为绿色荧光（图20，B和C）。随着时间的推移，大多数细胞逐渐变成绿色并表达GFP。肝功能分化的重要调节者CD29在GFP⁺细胞中表达（图20，D）。PAS阳性染色表明，除白蛋白表达（图20，F）外，细胞还具有合成和储存糖原的功能活性（图20，E）。用细胞增殖标记物Ki-67探索纯化的CD34⁺细胞的生长状态。一些细胞显示具有白蛋白表达的增殖活性（Ki-67）（图20，G）。免疫印迹证明在共培养的细胞中白蛋白表达随时间增加（图20，H）。

通过大剂量CCl₄注射创建急性肝损伤小鼠模型。从注射CCl₄后的第1天开始，每只小鼠每天损失1-2 g体重（BW）。未使用共培养细胞处理（以盐水作为对照）的小鼠的BW持续降低，直到第7天将小鼠处死，这与肝损伤恶化相一致（图21，A）。CCl₄注射后的第二天和第三天，两只小鼠（死亡率为20％）死亡。由于炎症性肝肿大，对照小鼠还具有较高的肝重与BW比率，这是急性肝损伤的特征（图21，B）。相反，所有用共培养细胞处理的小鼠均存活并显示出显著的恢复模式：BW降低1或2天，然后BW稳定或升高至基线。CCl₄注射后第5天（或用共培养细胞处理后第4天），所有处理过的小鼠均已恢复丢失的BW。在施用CCl₄后1天，观察到所有小鼠的血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平增加至正常水平的350倍以上（图21，C），表明有严重的肝细胞损伤。在处死之日（第7天），与经处理的小鼠相比，对照小鼠中的天冬氨酸转氨酶（AST）水平、AST/ALT比率和尿素水平显著更高（图21，D和E）。对区域坏死的分析表明，在经处理的小鼠中基于经处理的和对照的小鼠肝之间的坏死细胞计数存在显著差异（p＜0.001；图21，F）。

一致地，组织学分析显示对照小鼠肝中CCl₄肝毒性的小叶坏死特征。与正常肝相比，在第7天，在对照小鼠肝中小叶中心区域的肝细胞表现出空泡的、水肿的和脂肪的变性，并伴有核固缩、核破裂和核溶解。相反，用共培养的细胞处理的小鼠在中心静脉区域显示出几乎具有正常结构的完全再生。这些结果表明，使用共培养的细胞进行处理显著减轻CCl₄损伤并大大促进肝再生。使用共培养细胞处理后，炎性细胞没有渗透再生的肝区域和周围组织，表明几乎没有排斥反应或免疫反应发生。

荧光显微镜证实在中央静脉区域有相当数量的GFP⁺细胞，其是CCl₄损伤的靶标。移植的GFP⁺细胞表达白蛋白和增殖标记物Ki-67。这些结果表明，移植的共培养的细胞被宿主肝所接受并且不是短暂的，而是在结构和功能上都活跃地增殖并重新填充受损区域。肝组织的PCR分析表明，GFP基因在移植肝中长期（至少3个月）存在。在所有时间点在治疗的肝中均未发现肝肿瘤形成的总体或组织学证据。

实施例8

增殖标记物、生长因子和细胞因子的表达

使用以下方法评估活化的干细胞中增殖标记物、生长因子和细胞因子的表达水平。进行RT-PCR检测以下物质的表达水平：细胞周期蛋白D-1（一种增殖标记物）、胰岛素样生长因子1（IGF-1，一种调节生长激素作用的激素）、胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R，IGF-1的受体）、以及生长因子和细胞因子（例如转化生长因子α（TGF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）和Notch-1）。18S rRNA被作为内部对照。还通过IF和其他方法评估了生长因子和细胞因子的水平。

结果显示在图22中。显示了细胞周期蛋白D-1的高表达水平，表明活化的干细胞正在迅速增殖。IGF-1及其受体IGF-1R的表达表明，活化干细胞的增殖可能受自分泌机制的调节。还显示了活化的干细胞表达TGF-α、VEGF和Notch-1。IF结果还显示了活化的干细胞中肝细胞生长因子（HGF）和成纤维细胞生长因子9（FGF9）的表达。

实施例9

致瘤性测试

以下方法被用于评估活化的干细胞的致瘤性。5只10周龄的裸鼠皮下注射了100万个活化的干细胞。对5只10周龄的裸鼠进行了具有100万个活化的干细胞的肾囊注射。注射后第1天（D1），进行萤光素酶测定以原位追踪活化的干细胞。注射后连续观察3个月。在三个月末，处死裸鼠以评估肿瘤发生作用和以原位定位注入的活化的干细胞。使用病理学方法检查裸鼠的全身组织和器官。结果表明，活化的干细胞在整个体内是非致瘤的。

Claims (54)

1.一种组合物，其包含至少1000个细胞，其中至少50％的所述细胞是表达CD45且直径小于5 µm的CD45⁺细胞。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞进一步被表征为CD34阳性且ABCG2阴性。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中至少75％的所述细胞是CD45⁺细胞。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中至少95％的所述细胞是CD45⁺细胞。

5.根据权利要求1-4的任一项所述的组合物，其包含至少10,000个细胞。

6.根据权利要求1-5的任一项所述的组合物，其中少于20％的所述细胞是红细胞。

7.根据权利要求1-6的任一项所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞的直径小于3 μm。

8.根据权利要求1-6的任一项所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞的直径是约2 μm至约3μm。

9.根据权利要求1-8的任一项所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞进一步被表征为Lin阴性。

10.根据权利要求1-9的任一项所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞包含小RNA和核糖体RNA，其中小RNA与核糖体RNA的比例为至少约20：1、或至少约15：1、或至少约10：1、或至少约5：1。

11.根据权利要求1-10的任一项所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞的核质比（v/v）是至少约9：1、或至少约8：1、或至少约7：1、或至少约6：1、或至少约5：1。

12.根据权利要求1-11的任一项所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞进一步表达一种或多种选自以下的标记物：CD44、CD150、Sca1、c-kit、Thy1.1(CD90.1)、Oct 4、SSEA1、Nanog、Vasa、CD133和CD105。

13.根据权利要求1-12的任一项所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞不表达一种或多种选自以下的标记物：CD41、Lin、E-钙粘蛋白和CD184。

14.根据权利要求1-13的任一项所述的组合物，其中所述CD45⁺细胞能够被包含一种或多种因子的培养基活化，其中被活化的细胞表达ABCG2。

15.一种培养细胞的方法，其包含：在培养基中培养多种哺乳动物细胞，该培养基与选自原代肝细胞、人肝母细胞瘤（HepG2）细胞、肝细胞细胞系和小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞系中的至少一种接触或已经用其进行了调节。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞（a）直径小于5 μm，且（b）表达CD45。

17.根据要求要求15所述的方法，其中所述细胞进一步被表征为CD34阳性和ABCG2阴性。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞在培养之后表达ABCG2。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述培养至少持续1小时。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包含至少一种选自以下的细胞：胚胎干（ES）细胞、造血干细胞（HSC）、间充质干细胞（MSC）、内皮干细胞（ESC）、乳腺干细胞（MaSC）、肠干细胞（ISC）、神经干细胞（NSC）、成体嗅觉干细胞（OSC）、神经嵴干细胞（NCSC）、睾丸干细胞（TSC）和诱导的多能干细胞（iPSC）。

21.根据权利要求15-20的任一项所述的方法，其中所述肝细胞细胞系包含AML12、HepaRG、或其组合。

22.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞、HepG2细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。

23.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞、HepG2细胞和肝细胞细胞系接触或已经用其进行了调节。

24.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞、HepG2细胞和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。

25.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。

26.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与HepG2细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。

27.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞和HepG2细胞接触或已经用其进行了调节。

28.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞和肝细胞细胞系接触或已经用其进行了调节。

29.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。

30.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与HepG2细胞和肝细胞细胞系接触或已经用其进行了调节。

31.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与HepG2细胞和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。

32.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与肝细胞细胞系和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。

33.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞接触或已经用其进行了调节。

34.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与HepG2细胞接触或已经用其进行了调节。

35.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与肝细胞细胞系接触或已经用其进行了调节。

36.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。

37.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基同时或依次与选自原代肝细胞、HepG2细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系中的至少两种接触或已经用其进行了调节。

38.一种分离的哺乳动物细胞，其表达CD34和ABCG2，但不表达CD45。

39.根据权利要求38所述的分离的哺乳动物细胞，其进一步被表征为Oct4、Nanog和/或角蛋白上皮阳性，以及Lin阴性。

40.根据权利要求38或39所述的分离的哺乳动物细胞，其进一步表达一种或多种选自以下的标记物：CD117、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Sca1、CD31、CD184、巢蛋白和骨钙素。

41.根据权利要求38或39所述的分离的哺乳动物细胞，其进一步表达至少2种选自以下的标记物：CD117、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Sca1、CD31、CD184、巢蛋白和骨钙素。

42.根据权利要求38或39所述的分离的哺乳动物细胞，其进一步表达至少3种选自以下的标记物：CD117、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Sca1、CD31、CD184、巢蛋白和骨钙素。

43.根据权利要求38或39所述的分离的哺乳动物细胞，其进一步表达至少4种选自以下的标记物：CD117、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Sca1、CD31、CD184、巢蛋白和骨钙素。

44.根据权利要求38-43的任一项所述的分离的哺乳动物细胞，其中所述细胞不表达一种或多种选自以下的标记物：CD3、CD4、CD8a、CD11b、CD13、CD140a、E-钙粘蛋白和Lin。

45.根据权利要求38-44的任一项所述的分离的哺乳动物细胞，其中所述细胞是Lin-。

46.根据权利要求38-45的任一项所述的分离的哺乳动物细胞，其中所述细胞在包含一种或多种因子的培养基中培养一段时间后发育为集落。

47.一种权利要求38-46的任一项所述的细胞的群体。

48.一种组合物，其包含权利要求38-46的任一项所述的细胞。

49.一种干细胞，其衍生自的细胞（a）直径小于5 μm、b）表达CD45、且（c）不表达ABCG2；其中所述干细胞表达ABCG2，并进一步被表征为（a）CD34⁺/CD45⁺、（b）CD34⁺/CD45^-、（c）CD34^-/CD45⁺或（d）CD34^-/CD45^-。

50.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的权利要求49所述的干细胞。

51.一种细胞，其分化自权利要求49所述的干细胞。

52.一种组合物，其包含权利要求51所述的分化的细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。

53.一种治疗有此需要的对象中的疾病或病症的方法，其包含向所述对象施用有效量的权利要求50或51所述的组合物。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述疾病或病症选自：退行性疾病、增生性疾病、遗传性疾病、损伤和器官衰竭。