CN110542603A - 一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用，属于鱼类骨骼染色技术领域；所述染色方法包括以下步骤：1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃后，置于多聚甲醛溶液中进行固定；2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明获得肌肉透明样本；4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色获得整体均被染色的样本；5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色获得肌间刺染色的样本。所述方法能够实现对滇池金线鲃肌间刺进行快速染色，达到清晰的观察滇池金线鲃肌间刺的数量、形态，附着位置等预期效果的要求。
Description
技术领域
本发明属于鱼类骨骼染色技术领域，尤其涉及一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用。
背景技术
滇池金线鲃Sinocyclocheilus grahami(Regan,1904)，隶属于鲤形目(Cyprinidformes)鲤科(Cyprinidae)金线鲃属(Sinocyclocheilus)，地方俗称金线鱼、小洞鱼。该种为非典型洞穴生活鱼类，主要分布于滇池及其附属水域的河流、龙潭中，为滇池特有种。因肉质细嫩，味道鲜美，而被列为云南四大名鱼之一。目前，有关滇池金线鲃的研究多集中在亲鱼培育、繁殖力、胚胎的存活率、抗病性、肌肉的营养成分、杂交后代优势、光周期变化带来的影响及基因组学等多个方面，涉及其肌间刺的研究很少，其中，涉及其肌间刺染色的研究还未发现。
肌间刺，也称肌间骨，是指位于肌隔中的膜性硬骨，由肌间结缔组织不经过软骨阶段直接骨化而成，仅存在于真骨鱼类，按附着位置分为3类，分别为髓弓小骨，脉弓小骨和椎体小骨。目前，有关鱼类骨骼的研究方法主要有传统的解剖学方法，骨骼染色法以及射线照射法。相较解剖法与射线法，骨骼染色法具有结果形象直观，能清晰的观察骨骼结构及其位置，实施过程成本低，无需复杂仪器设备。此外，骨骼染色法还具有其他研究方法所不具有的优势，能够应用于较小样本骨骼的研究。
目前对于滇池金线鲃肌间刺的染色上没有一种成熟有效的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用，所述方法能够实现对滇池金线鲃肌间刺进行快速染色，达到清晰的观察滇池金线鲃肌间刺的数量、形态，附着位置等预期效果的要求。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法，包括以下步骤：
1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃，然后将麻醉后的滇池金线鲃置于多聚甲醛溶液中进行固定，获得固定样本；
2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；
3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明，获得肌肉透明样本；
4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色，获得整体均被染色的样本；
5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色，获得肌间刺染色的样本。
优选的，所述酶消化液中包括胰蛋白酶和蛋白酶K。
优选的，所述酶消化液还包括饱和硼酸钠溶液和去离子水；所述硼酸钠溶液、去离子水、胰蛋白酶和蛋白酶K的比例为(25～35)ml：(60～80)ml：1g：(0.1～0.2)g。
优选的，步骤1)中所述多聚甲醛溶液的质量浓度为1.5～2.5％，所述固定的时间为7～15d。
优选的，步骤2)中所述固定样本清洗包括依次进行的第一水洗、TBST溶液深度清洗和第二水洗。
优选的，步骤2)中的所述漂白剂溶液包括质量浓度为0.4～0.6％的KOH溶液和质量浓度为2.5～3.5％的H2O2；所述KOH溶液与H2O2的体积比为(2.5～3.5):1。
优选的，在所述去除体表色素的过程中，使用LED灯照射样本，所述LED灯的照射时间为2～4h，所述LED灯的灯管光通量为15～25W。
优选的，步骤4)中所述的染色液为4.5～5.5g/L的茜素红的乙醇溶液，所述茜素红的乙醇溶液中的溶剂乙醇为质量分数≥99.7％。
优选的，步骤4)中所述肌间刺染色的时间为12～36h；所述肌间刺染色的温度为20～30℃，所述肌间刺染色的过程中避光。
优选的，步骤5)中所述梯度脱水脱色包括依次进行的一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色；所述脱水脱色液中包括质量浓度0.5％的KOH溶液、去离子水和甘油；所述一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色的脱水脱色液中质量浓度0.5％的KOH溶液、去离子水和甘油的体积比分别为(1.8～2.2):(1.8～2.2):1；(1.8～2.2):1:(1.8～2.2)，1:1:(2.8～3.2)；所述一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色的次数分别为2～4次、1～3次和1～3次；每一次脱水脱色的时间为15～25min。
本发明还提供了所述的染色方法在滇池金线鲃肌间刺形态结构研究中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的滇池金线鲃肌间刺的染色方法，通过麻醉、固定、去除体表色素、酶消化液消化、染色和脱水脱色的步骤，能够实现对滇池金线鲃肌间刺进行快速染色，达到清晰的观察滇池金线鲃肌间刺的数量、形态，附着位置等预期效果的要求；本发明将染色液的脱色步骤与样本脱水步骤合并，简化了染色步骤，缩短了染色时间。
进一步的，本发明所述方法在酶消化液中加入的蛋白酶K不仅能有效缩短肌肉组织的透明时间，同时也避免了因消化时间长而导致的肌间刺与肌肉散离情况。
更进一步的，本发明所述方法在染色阶段，使用质量分数≥99.7％的乙醇配制的茜素红的染色液液质透光度较好，能实时观察到滇池金线鲃肌间刺的染色效果。
附图说明
图1为实施例中滇池金线鲃稚鱼肌间刺的染色方法流程图；
图2为滇池金线鲃稚鱼肌间刺染色效果图，其中A为脉弓小骨，B为髓弓小骨，C为脊椎骨。
具体实施方式
本发明提供了一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法，包括以下步骤：1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃后，置于多聚甲醛溶液中进行固定，获得固定样本；2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明获得肌肉透明样本；4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色获得整体均被染色的样本；5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色获得肌间刺染色的样本。
本发明用麻醉液麻醉滇池金线鲃后，置于多聚甲醛溶液中进行固定，获得固定样本。在本发明中，所述滇池金线鲃优选的为滇池金线鲃稚鱼；本发明中所述麻醉液优选为MS-222溶液，所述MS-222溶液的浓度优选为0.005～0.015g/L，更优选为0.01g/L；所述麻醉液优选的现配现用，本发明中所述麻醉液的用量以鱼体体长与麻醉液的比例计，优选为1cm:(8～12)ml，更优选为1cm:10ml。本发明中所述麻醉的时间优选为3～5min，更优选为4min。本发明在固定样本前选用MS-222进行麻醉，确保了固定后的鱼体姿态规整，提高了整体染色效果。本发明中，所述麻醉后优选的还包括漂洗步骤，所述漂洗优选的用去离子水进行，本发明对所述漂洗的方法和时间没有特殊限定，采用本领域常规方法和时间即可。本发明在所述漂洗后将滇池金线鲃置于多聚甲醛溶液中进行固定，获得固定样本。本发明中所述多聚甲醛溶液的质量浓度优选为1.5～2.5％，更优选为1.8～2.2％，最优选为2.0％；本发明中所述固定的时间优选为7～15d，更优选为8～14d。本发明中，所述固定用的容器优选为塑料材料管。
本发明在获得所述固定样本后，将所述固定样本清洗。在本发明中，所述固定样本清洗包括依次进行的第一水洗、TBST溶液深度清洗和第二水洗。在本发明中所述第一水洗优选的用去离子水进行，所述第一水洗的次数优选为2～4次，更优选为3次；每一次清洗的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明中，所述TBST溶液深度清洗的次数优选为2～4次，更优选为3次；每一次清洗的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述TBST溶液以1000ml体系计，优选的包括Tris(纯度>99％)2.42g，NaCl(纯度>99.9％)8.77g，2％(v/v)TritonX-1002ml；所述2％(v/v)TritonX-100优选的通过将2ml TritonX-100溶于100ml去离子水中制备获得。本发明中，所述第二水洗优选的用去离子水进行，所述第二水洗的次数优选为1～3次，更优选为2次；每一次清洗的时间优选为1～3min，更优选为2min。
本发明在所述清洗后，将清洗后的样本置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本。本发明中所述漂白剂溶液包括质量浓度为0.4～0.6％的KOH溶液和质量浓度为2.5～3.5％的H2O2；优选的包括质量浓度为0.5％的KOH溶液和质量浓度为3％的H2O2；本发明中，所述KOH溶液与H2O2的体积比优选为(2.5～3.5):1，更优选为3:1。本发明在所述去除体表色素的过程中，使用LED灯照射样本，所述LED灯的照射时间为2～4h，所述LED灯的灯管光通量优选为15～25W，更优选为20W；本发明中，所述去除体表色素结束的时间与LED灯照射样本的结束时间一致，优选为所述样本眼睛由黑色转变为黄色时。本发明在所述去除体表色素结束后，优选的还包括对所述去除体表色素样本进行漂洗的步骤；本发明中所述漂洗优选为去离子水漂洗，所述漂洗的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次漂洗的时间为4～6min，更优选为5min。
本发明在得到去除色素样本后，将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明获得肌肉透明样本。本发明所述酶消化液中优选的包括胰蛋白酶和蛋白酶K，更优选为所述酶消化液还包括饱和硼酸钠溶液和去离子水；本发明所述酶消化液中，所述硼酸钠溶液、去离子水、胰蛋白酶和蛋白酶K的比例优选为(25～35)ml：(60～80)ml：1g：(0.1～0.2)g，更优选为30ml:70ml：1g：0.15g。在本发明中，所述胰蛋白酶的酶活力优选的＞250U/mg；所述蛋白酶K优选的以溶液状态存在，所述蛋白酶K溶液的浓度优选为8～12mg/mL，更优选为10mg/mL。在本发明的一个具体实施过程中，所述酶消化液按照饱和硼酸钠溶液(Na2B4O7.10H2O)30ml、胰蛋白酶(酶活>250U/mg)1g，浓度为10mg/ml的蛋白酶K溶液10～20μl、去离子水70ml的组成配制而成。本发明中所述消化优选的在恒温箱中进行，所述消化的温度优选为40～50℃，更优选为42～48℃。本发明对所述消化的时间没有特殊限定，以所述样本头部肌肉透明为准。本发明在所述消化后，优选的还包括肌肉透明样本的漂洗步骤；本发明中所述肌肉透明样本的漂洗优选为去离子水漂洗，所述漂洗的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次漂洗的时间为8～12min，更优选为10min。
本发明在获得所述肌肉透明样本后，将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色获得整体均被染色的样本。本发明中，所述的染色液优选为4.5～5.5g/L的茜素红的乙醇溶液，更优选为5.0g/L的茜素红的乙醇溶液；本发明中，所述茜素红的乙醇溶液中的溶剂乙醇的质量分数优选的≥99.7％。本发明中，所述肌间刺染色的时间优选为12～36h，更优选为14～34h；所述肌间刺染色的温度优选为20～30℃，更优选为24～26℃；本发明所述肌间刺染色的过程中优选的避光，本发明中，所述避光的目的为避免茜素红染料降解。
本发明在获得所述整体均被染色的样本后，将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色获得肌间刺染色的样本。在本发明中，所述梯度脱水脱色包括依次进行的一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色；所述脱水脱色液中包括质量浓度0.5％的KOH溶液、去离子水和甘油；所述一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色的脱水脱色液中质量浓度0.5％的KOH溶液、去离子水和甘油的体积比分别优选为(1.8～2.2):(1.8～2.2):1，(1.8～2.2):1:(1.8～2.2)，1:1:(2.8～3.2)；更优选为2:2:1，2:1:2，1:1:3。本发明中所述一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色的次数分别优选为2～4次、1～3次和1～3次，更优选为3次，2次和2次；每一次脱水脱色的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明对所述脱水脱色的温度优选为20～30℃，更优选为22～28℃。
本发明在获得所述肌间刺染色的样本后，优选的将所述肌间刺染色的样本置于甘油中保存；所述甘油的质量分数优选的≥99％；所述甘油的用量以样本体长和甘油的体积比计，优选为1cm:(8～12)mL，更优选为1cm:10mL。
本发明还提供了所述的染色方法在滇池金线鲃肌间刺形态结构研究中的应用。本发明中所述染色方法获得的肌间刺整体均被染色的样本能够清晰的观察滇池金线鲃肌间刺的数量、形态，附着位置等，可以应用于滇池金线鲃肌间刺形态结构的深入研究中。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供的滇池金线鲃稚鱼肌间刺的染色方法，包括以下步骤：
1、样本固定：采集的滇池金线鲃稚鱼首先用浓度为0.01g/L的MS-222溶液进行麻醉，麻醉时间为4min，待鱼麻醉后，用去离子水漂洗2次，每次2min；随后转入盛有2％多聚甲醛溶液的塑料材料管内进行固定；
条件：25℃鱼体体长:麻醉剂＝1cm:10ml进行；
麻醉剂的配制：称取纯度为98％的MS-222 0.1mg溶于10ml去离子水；
注意事项：麻醉剂为现配现用，在2％多聚甲醛溶液内的固定时间为7天。
2、多聚甲醛溶液的去除：用去离子水清洗经2％多聚甲醛溶液固定的稚鱼样本3次，每次10min，随后转入TBST溶液中进行深度清洗3次，每次10min，随后用去离子水清洗2次，每次5min；
条件：25℃；
TBST溶液配制方法：1000ml体系中，Tris(纯度>99％)2.42g，NaCl(纯度>99.9％)8.77g，2ml 2％的TritonX-100；2％TritonX-100：2ml TritonX-100溶于100ml去离子水中。
3、色素去除：为去除鱼体体表色素，清洗过后的样本转入由0.5％KOH与3％H2O2混合而成的漂白剂中，经LED灯管照射后，待样本眼睛由黑色转变为黄色时停止照射，并用去离子水清洗样本3次，每次5min，以便去除多余漂白剂；
条件：25℃；LED灯管光通量为20W；灯管照射时间为2h；
溶液的配制：0.5％KOH：0.61g质量分数为82％的KOH溶于100ml去离子水；漂白剂：0.5％KOH：3％H2O2(体积比)＝3:1。
4、肌肉的透明：去除体表色素后的样本转入酶消化液内，置于恒温箱内进行肌肉透明，待鱼体头后部肌肉透明后，转入去离子水内漂洗3次，每次10min；
条件：恒温箱温度为40℃；
酶消化液的配制：饱和硼酸钠溶液(Na2B4O7.10H2O)30ml、胰蛋白酶(酶活>250U/mg)1g，浓度为10mg/ml的蛋白酶K 10μl、去离子水70ml；饱和硼酸钠溶液的配制为固态饱和硼酸钠溶于去离子水中至饱和状态；10mg/ml的蛋白酶K溶液的配制为100mg蛋白酶K加入9.5ml水中，待蛋白酶K完全溶解后加去离子水定容到10ml。
5、肌间刺染色：肌肉透明后的样本转入茜素红染色液内进行肌间刺染色；
条件：25℃、避光；染色时间为12h；
染色液的配制：0.5g茜素红溶于100ml质量分数≥99.7％的乙醇中配制而成。
6、脱色与脱水：经染色后的样本置于兼并脱色与脱水的梯度处理液中去除多余染色液与水分；
条件：25℃；
梯度溶液处理步骤为(下述比例为体积比)：
1)0.5％KOH:去离子水:甘油(丙三醇含量≥99.0％)＝2:2:1，处理3次，每次20min；
2)0.5％KOH:去离子水:甘油(丙三醇含量≥99.0％)＝2:1:2，处理2次，每次20min；
3)0.5％KOH:去离子水:甘油(丙三醇含量≥99.0％)＝1:1:3，处理2次，每次20min。
7、样本保存：脱色后的样本能清晰看见肌间刺，随后将样本至于甘油内保存；
条件：25℃；鱼体体长:保存液＝1cm:10ml，甘油质量分数为99.0％。
在解剖镜下对滇池金线鲃稚鱼肌间刺整体均被染色的样本进行观察，结果如图2所示，其中A为脉弓小骨，B为髓弓小骨，C为脊椎骨；能够清晰的观察滇池金线鲃肌间刺的数量、形态，附着位置等。
实施例2
本实施例提供的滇池金线鲃稚鱼肌间刺的染色方法，包括以下步骤：
1、样本的固定在23℃下进行，所采集的滇池金线鲃稚鱼样本依次用浓度为0.01g/L的MS-222溶液进行麻醉4min，去离子水漂洗2次，每次2min，随后转入盛有2％多聚甲醛溶液的塑料材料管内进行固定，其中麻醉剂的配制为取纯度98％的MS-222 0.1mg溶于10ml去离子水中配制而成，用量按鱼体体长:麻醉剂＝1cm:10ml进行，麻醉剂现配现用，2％多聚甲醛溶液固定时间为11天；
2、为去除样本多余多聚甲醛溶液，23℃下经过固定后的样本依次用去离子水清洗3次，每次10min，随后用TBST溶液中深度清洗3次，每次10min，在1000mlTBST溶液中含Tris(纯度>99％)2.42g，NaCl(纯度>99.9％)8.77g，2％TritonX-1002ml，2％TritonX-100的配制为2ml TritonX-100溶于100ml去离子水中，为去除多余TBST溶液，样本还需用去离子水清洗2次，每次5min；
3、色素的去除在23℃下进行，用由0.5％KOH与3％H2O2混合而成的漂白剂进行处理，经LED灯管照射后，待样本眼睛由黑色转变为黄色时停止照射，并用去离子水清洗样本3次，每次5min，以便去除多余漂白剂，其中0.5％KOH为0.61g质量分数为82％的KOH溶于100ml去离子水中配制而成，漂白剂中0.5％KOH与3％H2O2的比例为3:1，LED灯管光通量为20W；灯管照射时间为3h；
4、肌肉的透明用酶消化液来完成，消化过程在恒温箱内进行，待鱼体头后部肌肉透明后，转入去离子水内漂洗3次，每次10min，酶消化液中饱和硼酸钠溶液(Na2B4O7.10H2O)，胰蛋白酶(酶活>250U/mg)，浓度为10mg/ml的蛋白酶K，去离子水的比例为30ml，1g，15μl，70ml，恒温箱温度为45℃，其中，饱和硼酸钠溶液的配制为固态饱和硼酸钠溶于去离子水中至饱和状态，10mg/ml的蛋白酶K溶液的配制为100mg蛋白酶K加入9.5ml水中，待蛋白酶K完全溶解后加去离子水定容至10ml；
5、肌间刺的染色，为在0.5g茜素红溶于100ml质量分数≥99.7％的乙醇配制而成的染色液中进行，染色时间为24h，染色过程处于23℃、避光环境；
6、经染色后的样本随后置于梯度处理液中进行脱色与脱水，处理液有三级，各级中0.5％KOH、去离子水与甘油(丙三醇含量≥99.0％)的比例分别为2:2:1，2:1:2，1:1:3，第一级处理3次，每次20min，第二级处理2次，每次20min，第三级处理2次，每次20min，处理时为23℃；
7、脱色与脱水处理后的样本能清晰看见肌间刺，随后将样本至于甘油(丙三醇含量≥99.0％)内保存，甘油的用量按鱼体体长:甘油＝1cm:10ml来进行，保存环境为23℃。
实施例3
本实施例提供的滇池金线鲃稚鱼肌间刺的染色方法，包括以下步骤：
1、样本的固定在26℃下进行，所采集的滇池金线鲃稚鱼样本依次用浓度为0.01g/L的MS-222溶液进行麻醉，麻醉时间为4min，去离子水漂洗2次，每次2min，随后转入盛有2％多聚甲醛溶液的塑料材料管内进行固定，其中麻醉剂的配制为取纯度98％的MS-222 0.1mg溶于10ml去离子水中配制而成，用量按鱼体体长:麻醉剂＝1cm:10ml进行，麻醉剂现配现用，2％多聚甲醛溶液固定时间为15天；
2、为去除样本多余多聚甲醛溶液，26℃下经过固定后的样本依次用去离子水清洗3次，每次10min，随后用TBST溶液中深度清洗3次，每次10min，在1000mlTBST溶液中含Tris(纯度>99％)2.42g，NaCl(纯度>99.9％)8.77g，2％TritonX-100 2ml，2％TritonX-100的配制为2ml TritonX-100溶于100ml去离子水中，为去除多余TBST溶液，样本还需用去离子水清洗2次，每次5min；
3、色素的去除在26℃下进行，用由0.5％KOH与3％H2O2混合而成的漂白剂进行处理，经LED灯管照射后，待样本眼睛由黑色转变为黄色时停止照射，并用去离子水清洗样本3次，每次5min，以便去除多余漂白剂，其中0.5％KOH为0.61g质量分数为82％的KOH溶于100ml去离子水中配制而成，漂白剂中0.5％KOH与3％H2O2的比例为3:1，LED灯管光通量为20W；灯管照射时间为4h；
4、肌肉的透明用酶消化液来完成，消化过程在恒温箱内进行，待鱼体头部肌肉透明后，转入去离子水内漂洗3次，每次10min，酶消化液中饱和硼酸钠溶液(Na2B4O7.10H2O)，胰蛋白酶(酶活>250U/mg)，浓度为10mg/ml的蛋白酶K，去离子水的比例为30ml，1g，20μl，70ml，恒温箱温度为50℃。其中，饱和硼酸钠溶液的配制为固态饱和硼酸钠溶于去离子水中至饱和状态，10mg/ml的蛋白酶K溶液的配制为100mg蛋白酶K加入9.5ml水中，待蛋白酶K完全溶解后加去离子水定容到10ml；
5、肌间刺的染色，为在0.5g茜素红溶于100ml质量分数≥99.7％的乙醇配制而成的染色液中进行，染色时间为36h，染色过程处于26℃、避光环境；
6、经染色后的样本随后置于梯度处理液中进行脱色与脱水，处理液有三级，各级中0.5％KOH、去离子水与甘油(丙三醇含量≥99.0％)的比例分别为2:2:1，2:1:2，1:1:3，第一级处理3次，每次20min，第二级处理2次，每次20min，第三级处理2次，每次20min，处理时为26℃；
7、脱色与脱水处理后的样本能清晰看见肌间刺，随后将样本至于甘油(丙三醇含量≥99.0％)内保存，甘油的用量按鱼体体长:甘油＝1cm:10ml来进行，保存环境为26℃。
由上述实施例可知，本发明所述的滇池金线鲃肌间刺的染色方法，利用常规实验器材(塑料材料管，烧杯、量筒、电子天平)及相关试剂(茜素红、KOH、甘油等)，对滇池金线鲃稚鱼肌间刺进行染色，最后通过解剖镜对滇池金线鲃稚鱼肌间刺进行观察。在整个染色过程中，操作简单，耗时较短，无需复杂试剂与仪器设备，染色效果显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法，包括以下步骤：
1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃，然后将麻醉后的滇池金线鲃置于多聚甲醛溶液中固定，获得固定样本；
2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；
3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明，获得肌肉透明样本；
4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色，获得整体均被染色的样本；
5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色，获得肌间刺染色的样本。
2.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，所述酶消化液中包括胰蛋白酶和蛋白酶K。
3.根据权利要求2所述的染色方法，其特征在于，所述酶消化液还包括饱和硼酸钠溶液和去离子水；所述硼酸钠溶液、去离子水、胰蛋白酶和蛋白酶K的比例为(25～35)ml：(60～80)ml：1g：(0.1～0.2)g。
4.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤1)中所述多聚甲醛溶液的质量浓度为1.5～2.5％，所述固定的时间为7～15d。
5.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤2)中所述固定样本清洗包括依次进行的第一水洗、TBST溶液深度清洗和第二水洗。
6.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤2)中的所述漂白剂溶液包括质量浓度为0.4～0.6％的KOH溶液和质量浓度为2.5～3.5％的H2O2；所述KOH溶液与H2O2的体积比为(2.5～3.5):1。
7.根据权利要求1或6所述的染色方法，其特征在于，在所述去除体表色素的过程中，使用LED灯照射样本，所述LED灯的照射时间为2～4h，所述LED灯的灯管光通量为15～25W。
8.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤4)中所述的染色液为4.5～5.5g/L的茜素红的乙醇溶液，所述茜素红的乙醇溶液中的溶剂乙醇的质量分数≥99.7％。
9.根据权利要求1或8所述的染色方法，其特征在于，步骤4)中所述肌间刺染色的时间为12～36h；所述肌间刺染色的温度为20～30℃，所述肌间刺染色的过程中避光。
10.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤5)中所述梯度脱水脱色包括依次进行的一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色；所述脱水脱色液中包括质量浓度0.5％的KOH溶液、去离子水和甘油；所述一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色的脱水脱色液中质量浓度0.5％的KOH溶液、去离子水和甘油的体积比分别为(1.8～2.2):(1.8～2.2):1；(1.8～2.2):1:(1.8～2.2)，1:1:(2.8～3.2)；所述一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色的次数分别为2～4次、1～3次和1～3次；每一次脱水脱色的时间为15～25min。
11.权利要求1～10任意一项所述的染色方法在滇池金线鲃肌间刺形态结构研究中的应用。
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