CN110526865A - 一种用于检测HOCl的双分子荧光化合物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测HOCl的双分子荧光化合物(I)及其制备与应用。本发明提供了一种新的双光子性质荧光探针化合物，可用于检测HClO，在生理条件下，该探针对HClO的选择性和敏感性优于其他相关分析物，包括活性氧、离子和生物硫醇。此外，该探针还成功地应用于双光子显微镜成像活细胞中的HClO，表明该探针在分析活细胞中的生物学功能和病理作用方面具有很高的潜力。

Description

一种用于检测HOCl的双分子荧光化合物及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种用于检测HOCl的双分子荧光化合物及其制备与应 用。
(二)背景技术
次氯酸(HOCl)是免疫细胞产生的抗感染活性氧(ROS)的重要组 成部分，另一方面，内稳态中的HOCl对生物分子造成氧化损伤，与炎症、 神经退行性疾病、心血管疾病等多种疾病有关。在微生物入侵时，其杀菌 作用对主体的自主免疫具有很大帮助。但是，由于HOCl的高反应活性和 天然的扩散性，吞噬细胞中HOCl产物的难以控制将会导致多种疾病的发 生，因此，急需建立起可在活细胞内精确检测HOCl的方法。
荧光技术探针作为近年化学研究的热门方向，鉴于荧光探针技术的简 单，高效、便捷，而引起越来越多的药物研究者的关注，因此设计出一种 高灵敏度比色荧光探针定量监测HClO值波动是相当必要和迫切的，目前 虽然有一些通过荧光探针技术用于HClO的检测方法，但其制备都较为复 杂，而且成本较高，缺少一种简单、有效的修饰方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种用于检测HOCl的双分子荧光化合物及其制 备与应用。
本发明采用的技术方案是：
一种用于检测HOCl的双分子荧光化合物，结构如式(I)所示：
双光子成像具有明显的优势，由于其激发波长较长，可以提高穿透深 度，减少样品光损伤。其中，双光子缺失由于其激发波长较长，增加了穿 透深度，降低了样品的光损伤。本发明化合物(I)成功地应用于单光子 和双光子显微镜监测HeLa细胞的HClO变化，表明其在肿瘤细胞检测中 的潜在应用前景。
本发明还涉及制备所述双分子荧光化合物的方法，所述方法包括：以 式(II)所示的2-甲基喹啉化合物和式(III)的硫醚苯甲醛为底物，在无 水二乙酸铁和三氟乙酸存在下，100～120℃反应10～18h，制得式(I)所 示双分子荧光化合物；
具体的，所述反应在甲苯溶液中进行。
优选的，所述2-甲基喹啉化合物、硫醚苯甲醛、无水二乙酸铁和三 氟乙酸物质的量之比为1:1:0.05:0.05。
本发明还涉及所述双分子荧光化合物在制备双分子荧光探针中的应 用。硫醚是HClO的识别基团，通过硫醚和次氯酸的选择性反应可以用来 检测次氯酸。
具体的，所述双分子荧光探针用于检测细胞的次氯酸值。
优选的，所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。
本发明所述化合物(I)可作为双光子荧光探针，应用于HClO的荧 光检测。所述的HClO浓度的荧光检测的方法为：以化合物(I)作为荧 光探针，HAPH(5μM)显示一个广泛吸收带集中在340nm(λabs＝340nm) 和荧光带集中在430nm。荧光发射带在470nm处减小，同时在430nm 处出现一个新的发射带，为ClO-的检测提供了一种比色法；接下来，为 了评估HAPH的选择性，检测了探针对各种生物相关分子的荧光响应， 探针的荧光响应可以忽略不计。其次，用探针HAPH孵育HeLa，0.5mM ClO-处理HAPH后，可观察到细胞明显的颜色变化，此外，在生理条件 下，探针对次氯酸值的变化显示出稳定的荧光输出，这些结果表明，HAPH 对次氯酸离子具有较好的选择性。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的双光子性质荧 光探针化合物，可用于检测HClO，在生理条件下，该探针对HClO的选 择性和敏感性优于其他相关分析物，包括活性氧、离子和生物硫醇。此外， 该探针还成功地应用于双光子显微镜成像活细胞中的HClO，表明该探针 在分析活细胞中的生物学功能和病理作用方面具有很高的潜力。
(四)附图说明
图1为本发明中式(I)化合物的核磁氢谱。
图2为本发明中式(I)化合物的吸收光谱。
图3为本发明中式(I)化合物的发射光谱。
图4为本发明中式(I)化合物在PBS(pH 7.4，10mM)中针对不 同离子的选择性的实验结果；图中小分子分别为次氯酸、甲醛、甲酸，双 氧水、叔丁基过氧化氢、硫氢化钠、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、 葡萄糖。
图5为本发明中式(I)化合物对次氯酸检测的时间梯度曲线。
图6为本发明中式(I)化合物用探针式(1)孵育Hela细胞的比率 荧光图像(λex＝700nm)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：
实施例1：化合物(I)的制备
1.0mmol 2-甲基喹啉化合物(II)，对1.0mmol硫醚苯甲醛(III)溶 于10ml的甲苯溶液中，向其中加入0.05mmol的无水二乙酸铁，0.05mmol 的三氟乙酸，100摄氏度加热12小时。利用减压旋转蒸发仪抽干甲苯， 所得反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无 水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:8的溶液为流动相，TLC跟踪 收集Rf值为0.3～0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干 燥，得到化合物(I)，其核磁氢谱参见图1。
实施例2：
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成 浓度为1mM的探针母液，用移液枪吸取2.5μL加入到997.5μL超纯水中， 摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的吸收光谱，结果 见图2。
实施例3：本发明中化合物(I)(5μM)在PBS缓冲液(pH＝7.4)条件下 加入不同次氯酸后的荧光光谱检测。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓 度为1mM的探针母液，移液枪吸取2.5μL加入到0.995mL PBS缓冲液 (pH＝7.4)中，分别加入0，5μL次氯酸溶液(使次氯酸的最终浓度分别 为0、5mM)，37℃下反应3h后，加入到96孔板中，然后测定化合物 (I)的荧光光谱，结果见图3。
实验结果表明，在以340nm波长激发时，随着次氯酸浓度的提高， 化合物(I)在430nm处的荧光强度增加，而在470nm处的荧光减弱。
实施例4：本发明中化合物(I)(5μM)在PBS缓冲液(pH＝7.4)条件下 选择性结果的荧光光谱检测。
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的母 液，移液枪吸取5μL加入到0.995mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，分别加 入4μL次氯酸水溶液(最终甲醛在水中的浓度均1mM)和生物相关活性 小分子水溶液(乙醛、丙酮、甲酸、4-羟基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、苯甲 醛、双氧水、叔丁基过氧化氢、硫氢化钠、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱 氨酸、葡萄糖，最终浓度均为1mM)，37℃下反应1h，测定其荧光值。 荧光激发波长为340nm，发射波长为430nm和470nm。
荧光图谱见图4。实验结果表明，除了次氯酸，化合物(I)在其它 相关生物活性分子存在下荧光强度基本没有变化，表明其抗干扰能力十分 好，即对次氯酸的专一性比较好。
实施例5：本发明中化合物(I)(5μM)在PBS缓冲液(pH＝7.4，)条件 下加入0.5mmol次氯酸，荧光强度随时间变化的线性关系。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓 度为1mM的探针母液，移液枪吸取5μL加入到0.995mL PBS缓冲液 (pH＝7.4)中，加入4μL次氯酸溶液，使最终次氯酸在缓冲液的浓度为 0.5mmol，加入到96孔板中，在37℃下每反应10min，即测一次荧光强 度，共反应2h，统计数据，并做线性关系的相关曲线。荧光激发波长为 340nm，发射波长为430nm。
荧光图谱见图5。数据表明，次氯酸荧光探针的荧光强度，随时间的 增加而增强。
实施例6：本发明中化合物(I)在宫颈癌细胞中内次氯酸的成像分析
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的 母液，移液枪吸取2μL加入到0.198mLDMEM培养基中。取1mL含有次 氯酸最终浓度为0.2mmol)分别在37℃下孵化0.5h。随后将化合物(I) 的培养液加入到HeLa细胞中，37℃下孵化0.5h，用DMEM培养基洗涤 两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜成像。图6为细胞 共聚焦荧光成像效果图：(a)不加次氯酸的空白探针对照，(b):次氯酸 浓度为0.2mmol(见图6)
实验结果表明，随着细胞内次氯酸浓度的不断增加，能观察到细胞内 的荧光强度不断增强，说明化合物(I)能够检测细胞内的次氯酸浓度的 变化。

Claims (7)

1.一种用于检测HOCl的双分子荧光化合物，结构如式(I)所示：
2.制备权利要求1所述双分子荧光化合物的方法，所述方法包括：以式(II)所示的2-甲基喹啉化合物和式(III)的硫醚苯甲醛为底物，在无水二乙酸铁和三氟乙酸存在下，100～120℃反应10～18h，制得式(I)所示双分子荧光化合物；
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述反应在甲苯溶液中进行。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述2-甲基喹啉化合物、硫醚苯甲醛、无水二乙酸铁和三氟乙酸物质的量之比为1:1:0.05:0.05。
5.权利要求1所述双分子荧光化合物在制备双分子荧光探针中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述双分子荧光探针用于检测细胞的次氯酸值。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。
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