CN110506864A

CN110506864A - 一种猪饲料替抗添加剂及其在猪饲料中的应用

Info

Publication number: CN110506864A
Application number: CN201910864779.4A
Authority: CN
Inventors: 管武太; 任春晓; 王贻江; 林小峰
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2019-11-29

Abstract

本发明一种猪饲料替抗添加剂及其在猪饲料中的应用。该猪饲料替抗添加剂，按照重量份数计，包括以下组分：有机酸600～800份、中链脂肪酸单甘油酯200～350份、水100～200份。本发明通过有机酸和中链脂肪酸单甘油酯的重量配比，有效缓解由肠毒性大肠杆菌诱导的炎症反应，降低仔猪由炎症带来的发热症状，促进仔猪机体蛋白沉积，改善仔猪肠道微生物结构和肠道形态，降低仔猪腹泻，促进仔猪生长发育。因此，可将该猪饲料替抗添加剂用于替代促生长抗生素用于猪饲料中。

Description

一种猪饲料替抗添加剂及其在猪饲料中的应用

技术领域

本发明涉及功能性饲料添加剂技术领域，特别涉及一种猪饲料替抗添加剂及其在猪饲料中的应用。

背景技术

饲用抗生素占总抗生素使用量很大比例，绝大部分用于促生长、预防畜禽病原菌感染。仔猪断奶期间面临各种应激，免疫功能发育不完善，易被病原菌感染。其中，产毒性大肠杆菌ETEC是导致仔猪腹泻、生产中仔猪高死亡率的重要原因，给畜牧业带来巨大经济损失。抗生素能有效预防仔猪断奶期间病原菌感染，然而，抗生素长期使用能够产生大量耐药菌，威胁人类健康。因此，畜牧业生产中迫切需要寻找环境友好性抗生素替代品来维持仔猪健康生长。

有机酸及其盐类，能预防仔猪病原菌感染，改善仔猪健康状况，从而提高仔猪生长性能。同时，有研究报道，仔猪饲粮中添加有机酸能够降低仔猪胃肠道pH值，弥补仔猪胃酸分泌不足，激活胃蛋白酶，提高仔猪蛋白消化率。有机酸降低仔猪胃肠道pH值也能促进肠道有益菌增殖，抑制有害菌的增长，维持仔猪肠道健康。有机酸种类繁多，特性不一，应用效果不同。仔猪饲粮中有机酸应用效果不同与有机酸酸化能力、抑菌能力、溶解性、味道以及物理形态有关。因此，要筛选抑菌能力强，效果稳定的有机酸，用于仔猪饲粮替抗选择。

中链脂肪酸单甘油酯，最早被广泛用做乳化剂和防腐剂。研究发现，中链脂肪酸单甘油酯具有广谱抗菌、抗病毒特性，为一种天然、安全物质，具有抗生素替代潜力。但到目前为止，尚未筛选出有效有机酸和中链脂肪酸单甘油酯组合，用于猪饲料替抗方面的相关报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪饲料替抗添加剂。

本发明的另一目的在于提供所述猪饲料替抗添加剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种猪饲料替抗添加剂，按照重量份数计，包括以下组分：有机酸600～800份、中链脂肪酸单甘油酯200～350份、水100～200份。

所述的猪饲料替抗添加剂，按照重量份数计，优选为包括以下组分：有机酸640～800份、中链脂肪酸单甘油酯200～300份、水100～150份。

所述的猪饲料替抗添加剂，按照重量份数计，更优选为包括以下组分：有机酸640～700份、中链脂肪酸单甘油酯250～300份、水110～150份。

所述的猪饲料替抗添加剂，按照重量份数计，最优选为包括以下组分：637.5份、中链脂肪酸250份、水112.5份。

所述的有机酸为甲酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸和苯甲酸中的至少一种；优选为甲酸。

所述的中链脂肪酸单甘油酯为癸酸单甘油酯和月桂酸单甘油酯的至少一种；优选为月桂酸单甘油酯。

所述的月桂酸单甘油酯的有效成分为90～98％。

所述的猪饲料替抗添加剂在制备猪饲料中的应用。

所述的猪饲料替抗添加剂在制备猪饲料中的应用，为将所述的猪饲料替抗添加剂添加到猪饲料中，猪饲料替抗添加剂可以用于替代促生长抗生素用于猪饲料中，其能够防治仔猪腹泻，降低病原菌诱导的仔猪肠道炎症反应，增加肠道有益菌数量及降低病原菌数量。该猪饲料替抗添加剂可以有效防治产毒性大肠杆菌(ETEC)诱导的仔猪腹泻，降低仔猪直肠温度；预防ETEC诱导的仔猪炎症反应，如降低血浆TNF-α和IL-6水平、降低回肠TNF-α，IL-1β及TLR4基因表达水平；促进蛋白沉积和生长发育，如升高血浆IGF-1水平，降低血浆尿酸氮(PUN)水平；增强肠道屏障功能，如提高空肠屏障蛋白基因Claudin的表达水平；改善肠道形态，如提高仔猪空肠绒毛高度；增加肠道有益菌数量、降低病原菌数量，如增加回肠食糜中厚壁菌门的水平尤其是乳酸乳杆菌属水平、降低病原菌数量包括降低Actinobacillus属(Actinobacillus minor种)，unidentified Enterobacteriaceae属(Escherichia coli种)，Moraxella属(Moraxella catarrhalis种)和Pasteurella属(Pasteurella aerogenes种)等病原菌数量。

所述的猪饲料替抗添加剂的添加量占所述猪饲料重量的0.8％～1.4％(优选为0.8％)。

所述的猪饲料替抗添加剂的使用方法，为将所述的猪饲料替抗添加剂与玉米淀粉或蛋白粉预混，然后(逐级预混)混合于猪饲料中，混合成粉料或制粒成颗粒料。

一种猪饲料，含有所述的猪饲料替抗添加剂。

所述的猪饲料还含有基础饲粮，所述的基础饲粮可根据猪的营养需要设计配方，优选包括玉米淀粉、蛋白粉等常规饲料原料进行配伍。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)为解决抗生素禁用后，仔猪断奶腹泻、生长阻滞主要技术问题，本发明提供了一种饲料替抗添加剂及替抗技术方案，通过有机酸和中链脂肪酸单甘油酯的重量配比，有效缓解由肠毒性大肠杆菌诱导的炎症反应，降低仔猪由炎症带来的发热症状，促进仔猪机体蛋白沉积，改善仔猪肠道微生物结构和肠道形态，降低仔猪腹泻，促进仔猪生长发育。

(2)本发明提供的猪饲料添加剂，采用甲酸和月桂酸单甘油酯复配，两个组分在仔猪体内能够协同缓解由病原菌导致的仔猪炎症，改善肠道健康。因此，其组合也为仔猪饲粮中一种有效的抗生素替代品。

附图说明

图1是外源试验中单甘油酯和中链脂肪酸协同杀死产毒性大肠杆菌的结果图。

图2是腹泻评分和直肠温度结果图；其中，A为腹泻评分；B为直肠温度。

图3是血浆细胞因子结果图；其中，A为血浆细胞因子TNF-α；B为血浆细胞因子IL-6；C为血浆细胞因子IGF-1；D为血浆细胞因子IL-1β；E为血浆细胞因子IFN-γ；F为血浆细胞因子IL-10；G为血浆PUN。

图4是肠道屏障基因表达和肠道形态结果图；其中，A为肠道紧密连接蛋白ZO-1；B为肠道紧密连接蛋白Claudin；C为肠道紧密连接蛋白Occludin；D为肠道绒毛高度；E为肠道隐窝深度；F为肠道绒毛高度与隐窝深度比值。

图5是肠道免疫和腹泻相关基因表达结果图；其中，A为肠道TNF-α基因表达；B为肠道IL-1β基因表达；C为肠道IL-6基因表达；D为肠道IL-12基因表达；E为肠道IL-10表达；F为肠道IFN-γ基因表达；G为肠道TLR4基因表达；H为肠道CFTR基因表达。

图6是回肠食糜微生物结构差异结果图；其中，A为各组微生物特有OUTs；B为微生物α-多样性系数ACE；C为微生物α-多样性系数chao1；D为微生物α-多样新系数observed_species；E为β-多样性系数PCoA；F为β-多样性系数NMDS系数。

图7是回肠食糜微生物组成结图果；其中，A为微生物属水平组成；B为微生物种水平组成。

图8是回肠食糜微生物功能性分析结果图。

图9是为总的甲酸和月桂酸单甘油酯组合缓解仔猪ETEC感染作用图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用添加剂均可通过市售获得，且符合国家标准和行业标准。

本发明中实施例涉及的月桂酸单甘油酯(CAS No.:27215-38-9，分子式C₁₅H₃₀O₄)和癸酸单甘油酯(CAS No.:2277-23-8，分子式C₁₃H₂₆O₄)可通过常规市售获得；其中，月桂酸单甘油酯的粒径小于100目。

实施例1

1、试验方法：

(1)在50mL离心管中用营养肉汤(购自广州环凯微生物科技有限公司)分别配制16mg/mL和8mg/mL的柠檬酸溶液，16mg/mL和8mg/mL的乳酸溶液，8mg/mL和4mg/mL的丙酸溶液，8mg/mL和4mg/mL的甲酸溶液各10mL。

(2)癸酸单甘油酯溶液和月桂酸单甘油酯溶液：用无水乙醇配制癸酸单甘油酯和月桂酸单甘油酯储存液，然后利用储存液分别配制1mg/mL，0.5mg/mL和0.25mg/mL的癸酸单甘油酯溶液以及月桂酸单甘油酯溶液，其配制溶液酒精含量低于2％。

(3)利用上述配置的单一有机酸溶液和单一单甘油酯溶液按体积为1:1配制组合溶液，其组合为：

a、0.25mg/mL癸酸单甘油酯+8mg/mL柠檬酸溶液；

b、0.25mg/mL癸酸单甘油酯+8mg/mL乳酸溶液；

c、0.25mg/mL癸酸单甘油酯+4mg/mL丙酸溶液；

d、0.25mg/mL癸酸单甘油酯+4mg/mL甲酸溶液；

e、0.5mg/mL癸酸单甘油酯+8mg/mL柠檬酸溶液；

f、0.5mg/mL癸酸单甘油酯+8mg/mL乳酸溶液；

g、0.5mg/mL癸酸单甘油酯+4mg/mL丙酸溶液；

h、0.5mg/mL癸酸单甘油酯+4mg/mL甲酸溶液；

i、0.25mg/mL月桂酸单甘油酯+8mg/mL柠檬酸溶液；

j、0.25mg/mL月桂酸单甘油酯+8mg/mL乳酸溶液；

k、0.25mg/mL月桂酸单甘油酯+4mg/mL丙酸溶液；

l、0.25mg/mL月桂酸单甘油酯+4mg/mL甲酸溶液；

m、0.5mg/mL月桂酸单甘油酯+8mg/mL柠檬酸溶液；

n、0.5mg/mL月桂酸单甘油酯+8mg/mL乳酸溶液；

o、0.5mg/mL月桂酸单甘油酯+4mg/mL丙酸溶液；

p、0.5mg/mL月桂酸单甘油酯+4mg/mL甲酸溶液。

用10M的HCL溶液分别将上述混合溶液的pH值调节为4，得到待测酸溶液。

(4)过夜培养的产毒性大肠杆菌菌液(CVCC225购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)浓度调整为1×10⁹CFU/mL。取100μL稀释后的菌液，加入到10ml配制好的待测酸溶液中，90rpm、37℃培养1.5h。处理之后，菌液中的活菌数通过平板计数进行测定，结果展示为处理组减去不添加试剂对照组后结果。

2、试验结果：

体外筛选试验结果如图1，从图1可知，4mg/mL的甲酸效果强于4mg/mL的丙酸和8mg/mL的柠檬酸，与8mg/mL的乳酸作用效果相当。因此，甲酸杀菌效果要强于其它三种酸。在与有机酸的组合杀菌效果中，月桂酸单甘油酯要强于癸酸单甘油酯。因此，对甲酸和月桂酸单甘油酯进行仔猪的体内试验。

实施例2

1、试验设计：30头断奶仔猪(杜×长×大，体重7.5±0.5kg)随机分配到5个饲粮处理(每个处理6头仔猪)：

(1)基础饲粮(CONT)；

(2)基础饲粮+抗生素(50ppm喹烯酮，75ppm金霉素，50ppm吉他霉素，以抗生素有效含量计)(ATB)；

(3)基础饲粮+0.6％(w/w)有机酸溶液(有机酸由85％(w/w)甲酸+15％(w/w)水组成)(FA)；

(4)基础饲粮+0.2％(w/w)月桂酸单甘油酯(ML)；

(5)基础饲粮+0.6％(w/w)有机酸溶液(有机酸由85％(w/w)甲酸+15％(w/w)水组成)+0.2％(w/w)月桂酸单甘油酯(FA+ML)

基础饲粮的成分和营养水平见表1。仔猪单笼饲喂，每个笼子配有料槽和饮水乳头，仔猪自由采食，室内温度控制在26～30℃。

表1基础饲粮的成分及营养水平

日粮成分	含量(％)	营养指标	含量
				玉米	47.25	消化能(MJ/kg)	15.05
小麦粉	7.50	粗蛋白(％)	19.20
				乳清粉	7.50	粗脂肪(％)	8.03
蔗糖	2.50	粗纤维(％)	1.76
				乳糖	1.25	灰分(％)	3.01
豆粕	8.50	钙(％)	0.77
				脱脂大豆	10.00	磷(％)	0.53
鱼粉	7.00	有效磷	0.34
				豆油	2.00	赖氨酸(％)	1.35
酵母提取物	2.50	蛋氨酸+半胱氨酸	0.74
				氯化胆碱(饲料级50％)	0.10	苏氨酸(％)	0.79
磷酸氢钙	0.38	色氨酸(％)	0.22
				石粉(饲料级)	0.8
食盐	0.30
				L-赖氨酸盐酸	0.50
DL-蛋氨酸	0.22
				L-苏氨酸	0.25
L-色氨酸	0.02
				L-缬氨酸	0.1
维生素预混料<sup>1</sup>	0.035
				矿质元素预混料<sup>2</sup>	0.23
统糠	1.065
				总计	100.00

注：维生素预混料¹：每kg复合多维提供维生素：维生素A11375IU；维生素D33500IU；维生素E 26.3IU；维生素K3 3.5mg；维生素B₁ 3.5mg；核黄素8.8mg；维生素B₁₂0.03mg；泛酸17.5mg；烟酸35mg；叶酸1.75mg；生物素0.14mg。

矿质元素预混料²：每kg复合多矿提供微量矿质元素：铜(甘氨酸铜)68.04mg；铁(甘氨酸铁)118.58mg；锰(甘氨酸锰)39.6mg；锌(甘氨酸锌)90.09mg；硒(酵母硒)0.54mg；碘(碘酸钙)0.68mg；钴(硫酸钴)0.68mg。

2、试验过程

(1)仔猪适应3天，然后按照体重随机分配到5个饲粮处理组中，饲喂相应试验饲粮7天，总试验期的第11天所有仔猪攻毒10mL 5×10⁹CFU/mL大肠杆菌菌液。其中，大肠杆菌CVCC225购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，接种于NB液体培养基中，在37℃恒温摇床上160rpm转速培养18h后收集菌液，调整菌液浓度为5×10⁹CFU/mL。

(2)检测各项指标

各项指标及检测方法如下：

直肠温度和腹泻评分的测定：在攻毒后0，9，24h测定所有仔猪直肠温度(OmronMC-347)。根据Marquardt等(1999)报道方法(0-正常；1-软粪；2-中度腹泻；3-重度腹泻)，观测仔猪粪便进行评分。

血浆细胞因子、血浆尿素氮及胰岛素样生长因子测定：在攻毒后0，9，24h通过前腔静脉采集所有仔猪血液样本，置于EDTA抗凝管中。通过1000×g离心10分钟获得血浆样本，储存-20℃冰箱保存，一个月内测定。血浆中的IL-1β，IL-6，IL-10，IFN-γ和TNF-α利用猪多因子Elisa试剂盒测定(Millipore Multiplex；Billerica,MA,#PCYTMAG-23K-05)。血浆胰岛素样生长因子1(IGF-1)浓度和血浆尿素氮(PUN)浓度使用武汉华美试剂盒(华美，武汉)测定。

肠道形态测定：攻毒后24h，杀死所有仔猪。分别取约2cm空肠和回肠组织样本，用冷PBS冲洗去内容物，然后固定于4％多聚甲醛中。通过多聚甲醛固定，小肠组织固定于石蜡切片中，伊红和美蓝染色，随机选取5个肠道绒毛形态完好视野测量小肠绒毛高度和隐窝深度，计算小肠绒毛高度和隐窝深度比值。

基因表达：刮取空肠和回肠黏膜组织样本，置于-80℃冰箱中用于抽取mRNA，分析基因表达。采用氯仿试剂抽取总RNA，利用1％凝胶电泳测定RNA质量和纯度，利用核酸浓度测定仪(Nano-Drop-1000)测定RNA浓度。取1μg RNA样本，利用反转录试剂盒(TakaRa)，反转录完整DNA。利用SYBR荧光染料和7500定量仪(Applied Biosystems and LifeTechnologies,Inc)进行定量PCR。采用Primer3.0(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)进行引物设计，所用引物见表2。管家基因β-actin作内源对照，定量PCR程序：起始温度95℃30s，40个循环变性温度95℃15s，退火温度60℃；定量结果采用2^-ΔΔCt方法进行分析。

表2试验所用PCR引物序列

回肠食糜微生物分析：

回肠食糜微生物DNA提取：总核酸DNA采用CTAB/SDS方法进行提取，采用1％琼脂糖凝胶电泳验证DNA浓度和纯度，根据浓度，DNA被稀释至1ng/μL。16S rRNA的V4区利用下列引物515F和806R进行扩增。PCR程序为：98℃1分钟，30个循环98℃10s、50℃30s、72℃30s，最终72℃5分钟。其中，涉及的引物序列如下：

515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；

806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；

注：M＝A or C；H＝A,C or T；V＝A,C or G。

回肠食糜微生物DNA测序和序列分析：利用Ion Plus Fragment LibraryKit48rxns(Thermo Scientific)根据说明书进行序列文库构建。文库序列在Ion S5TM XL平台进行测序。根据Cutadap(Martin.,2011，版本1.9.1)质控过程对粗数据进行筛选。筛选得到的序列数据根据Uparse software(Uparse v7.0.1001)认定相似度≥97％分类属于同一个OUTs。对于每一个代表序列，基于Mothur algorithm的Silva数据库对分类信息进行注释。Alpha多样性包括Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Good-coverage利用Mothur program(version 1.31.2)分析反映微生物多样性。利用QIIME软件(Version1.7.0)对基于weighted和unweighted unifrac的Beta多样性进行统计。利用R软件(版本Version 2.15.3)进行主成分分析(PCoA)和non-metric multidimensional scaling(NMDS)分析使得复杂数据可视化。利用Tax4Fun对微生物序列进行功能性分析。

数据统计：所有数据采用Excel 2013计算，使用SPSS 17.0软件进行统计分析。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验组间的差异显著性，多重比较采用LSD法，以P<0.05作为差异显著性判断标准，试验数据均以平均值±标准误表示。

(3)试验结果与分析：

直肠温度和腹泻评分结果见图2。攻毒后24h，与对照组相比，除了月桂酸单甘油酯组(ML)，其它所有添加组均显著降低了仔猪的腹泻评分(P<0.05)(图2A)。但是从数值上看，相对单一使用甲酸或月桂酸单甘油酯，其组合能够进一步降低仔猪的腹泻评分，甚至组合组(FA+ML)比抗生素组(ATB)更低，说明甲酸和月桂酸单甘油酯组合能够缓解由产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)诱导的仔猪腹泻。在攻毒后9h，甲酸和月桂酸单甘油酯组合组仔猪直肠温度显著低于对照组(P<0.05)，而抗生素组、甲酸组、月桂酸单甘油酯组均不能显著降低仔猪直肠温度(P>0.05)(图2B)。说明单一使用甲酸或月桂酸单甘油酯时并不能缓解仔猪由ETEC感染导致的发热，但甲酸和月桂酸单甘油酯一同使用能够降低仔猪的发热。

血浆细胞因子结果见图3。攻毒后9h，单独添加甲酸或者月桂酸单甘油酯并未显著降低血浆TNF-α和IL-6水平(P>0.05)，但甲酸和月桂酸单甘油酯组合组显著降低血浆TNF-α和IL-6水平(P<0.05)，其水平与抗生素组无显著差异(P>0.05)(图3A,2B)。仔猪攻毒后血浆TNF-α和IL-6水平变化说明：饲粮单独添加甲酸或月桂酸单甘油酯不能有效缓解仔猪炎症反应，但其组合能够有效预防仔猪ETEC诱导的炎症反应，为仔猪饲粮有效的替抗产品。攻毒后9h，所有添加组均显著降低了IL-1β水平(P<0.05)，甲酸和月桂酸单甘油酯组合组显著低于单独甲酸组或月桂酸单甘油酯组(P<0.05)，与抗生素组无显著差异(P>0.05)(图3D)。血浆IL-1β为促炎性细胞因子，反映仔猪炎症水平。ETEC攻毒后，单独添加甲酸或月桂酸单甘油酯降低了仔猪的炎症水平，甲酸和月桂酸单甘油酯一同使用，更进一步降低仔猪炎症水平，与饲粮添加抗生素效果一致。其结果说明，仔猪饲粮添加甲酸和月桂酸单甘油酯能够协同缓解仔猪由ETEC诱导的炎症，其应用效果与抗生素相当。各处理组之间的血浆IFN-γ和IL-10水平差异不显著(P>0.05)(图3E,3F)。血浆IGF-1和PUN浓度结果分别见图3C和图3G。攻毒之后，仔猪血浆胰岛素样生长因子1(IGF-1)并没有显著变化(P>0.05)。IGF-1反映仔猪的生长发育状况，攻毒后，仔猪处于应激状态，由于饲粮处理时间较短，所以并没有显著影响生长发育情况，但从数值上可以看出，饲粮添加甲酸和月桂酸单甘油酯组合能够升高仔猪的血浆IGF-1水平。在攻毒0h，饲粮中添加甲酸或甲酸与月桂酸单甘油酯组合显著降低仔猪血浆尿酸氮(PUN)水平(P<0.05)。血浆尿素氮为机体蛋白代谢产物，其水平升高反映仔猪机体蛋白代谢升高，不利于仔猪蛋白沉积和生长。说明仔猪添加甲酸或甲酸与月桂酸单甘油酯组合能提高蛋白沉积。在攻毒后24h，所有添加组的PUN水平都显著低于对照组(P<0.05)。在攻毒条件下，仔猪动用机体蛋白代谢生成免疫物质，其侧面反映所有添加组在攻毒后的炎症水平低于对照组，增强了蛋白沉积。

肠道屏障基因表达和肠道形态结果见图4。饲粮添加FA+ML显著升高了空肠屏障蛋白基因Claudin的表达。说明甲酸和月桂酸单甘油酯组合提升了仔猪肠道屏障功能。肠道形态结果见图4D,4E,4F。与对照组相比，饲粮添加甲酸或甲酸与月桂酸单甘油酯组合能显著提高仔猪空肠绒毛高度(P<0.05)，与抗生素组差异不显著(P>0.05)。仔猪小肠形态绒毛高度反映仔猪对营养物质的吸收能力和肠道健康程度。绒毛高度结果也反映，饲粮添加甲酸和月桂酸单甘油酯组合能够增加仔猪小肠对营养物质的吸收能力，改善仔猪肠道健康状态。在回肠中，饲粮单独添加甲酸或月桂酸单甘油酯未显著提高绒毛高度与隐窝深度比值(P>0.05)，但其组合能显著升高仔猪绒毛高度与隐窝深度比值(P<0.05)，与抗生素组差异不显著(P>0.05)。说明仔猪饲粮添加甲酸和月桂酸单甘油酯组合能改善仔猪对营养物质吸收能力，维持肠道健康，与抗生素作用效果相当。

免疫状态和腹泻相关基因表达结果见图5。FA组和ML组中回肠TNF-α，IL-1β，TLR4和空肠TLR4、CFTR基因表达与CONT组差异不显著(P>0.05)，但是FA+ML组显著降低了这些基因表达(P<0.05)，其与抗生素组差异不显著(P>0.05)(图5A,5B,5G,5H)。说明甲酸和月桂酸单甘油酯组合能够降低仔猪肠道炎症反应，其效果与抗生素相当，同时其组合降低了与腹泻相关基因CFTR(P<0.05)。在回肠中，所有添加组均降低了IL-6基因表达(P<0.05)(图5C)。

回肠食糜微生物结果见图6、图7、图8。所有回肠食糜样品中，总计3321OTUs被检测到，其中，CONT组、ATB组、FA组、ML组和FA+ML组分别具有241，797，183，43，104个特异性OTUs(图6A)。从ACE，chao1和observed_species的α-多样性指数反映，与ATB组和FA组相比，FA+ML组具有降低回肠食糜群体多样性的趋势(图6B,6C,6D)。为了分析各组微生物群体结构相似性的程度，β-多样性指数被测定。基于加权Unifrac distance的PCoA结果和NMDS结果分析揭示了FA+ML仔猪回肠食糜微生物群体结构各重复间差异较小，揭示出FA+ML处理对仔猪具有稳定的影响(图6E)。UPGMA树分析展示出了所有组别中回肠食糜微生物丰度前5的门，分别为厚壁菌门、变形菌门、蓝藻细菌、拟杆菌门、放线菌门(图6F)。随着FA+ML的处理，回肠食糜微生物多集中在厚壁菌门。

丰度前5的门水平微生物占总微生物群体95％以上，然而，各门水平在处理组之间分布存在差异。与对照组相比，FA或ML处理，回肠食糜中厚壁菌门水平分别由48.09％提升至57.60％和63.03％，当FA+ML处理时，厚壁菌门水平提升至89.75％(图6F)。在各处理组厚壁菌门水平差异中，在属水平，FA+ML组和ML组的乳酸乳杆菌属水平分别为72.10％和52.6％，而对照组为35.58％。在各处理组属水平差异中，种水平差异最大的为淀粉乳杆菌、唾液乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。属水平结果展示，FA+ML处理降低Actinobacillus属(Actinobacillus minor种)，unidentified Enterobacteriaceae属(Escherichia coli种),Moraxella属(Moraxella catarrhalis种)和Pasteurella属(Pasteurella aerogenes种)。

在此试验中，回肠食糜微生物相关丰度前5的信号通路包括Transporters，DNA_repair_and_recombination_proteins，Two_component_system，Transfer_RNA_biogenesis，Purine_metabolism，ABC_transporters。改变的信号通路中丰度前10的，FA+ML处理主要升高的信号通路有Two_component_system，DNA_repair_and_recombination_proteins，purine_metabolism，pyrimidine_metabolism，amino_acid_related_enzymes；主要降低信号通路有transporters。

3、总结

从总结图9可以看出，仔猪饲粮添加甲酸和月桂酸单甘油酯组合能缓解由ETEC诱导的发热，降低仔猪机体炎症反应，促进蛋白沉积和生长发育，改善肠道形态，增加肠道有益菌数量、降低病原菌数量，增强肠道屏障功能，维持肠道健康，降低仔猪腹泻。其效果与抗生素相当，是一安全、有效的抗生素替代品。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种猪饲料替抗添加剂及其在猪饲料中的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TNF-α 正向引物

<400> 1

ccaccaacgt tttcctcact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TNF-α 反向引物

<400> 2

tagtcgggca ggttgatctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-1β正向引物

<400> 3

ccaaagaggg acatggagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-1β反向引物

<400> 4

ttatatcttg gcggcctttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-6正向引物

<400> 5

tggctactgc cttccctacc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-6反向引物

<400> 6

cagagatttt gccgaggatg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-12正向引物

<400> 7

caaccctgtg ccttagcagt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-12反向引物

<400> 8

agagcctgca tcagctcagt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-10正向引物

<400> 9

gctgaagacc ctcaggctga 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-10反向引物

<400> 10

ttgctcttgt tttcacaggg c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IFN-γ正向引物

<400> 11

aatgggacaa aagtggcttg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IFN-γ反向引物

<400> 12

ccagctgtgt gtttgcaagt 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TLR4正向引物

<400> 13

gccatcgctg ctaacatcat c 21

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TLR4反向引物

<400> 14

ctcatactca aagatacacc atcgg 25

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CFTR正向引物

<400> 15

ttcctcgtag tcctcgcc 18

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CFTR反向引物

<400> 16

ggtcagtttc agttccgttt g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ZO-1正向引物

<400> 17

aagatctgct tccgtggaga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ZO-1反向

<400> 18

ttcacttggg gtttttgagg 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Claudin正向引物

<400> 19

gatttactcc tacgctggtg ac 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Claudin反向引物

<400> 20

cacaaagatg gctattagtc cc 22

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Occludin正向引物

<400> 21

gtagtcgggt tcgtttcc 18

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Occludin反向引物

<400> 22

gacctgattg cctagagtgt 20

Claims

1.一种猪饲料替抗添加剂，其特征在于，按照重量份数计，包括以下组分：有机酸600～800份、中链脂肪酸单甘油酯200～350份、水100～200份。

2.根据权利要求1所述的猪饲料替抗添加剂，其特征在于，按照重量份数计，包括以下组分：有机酸640～800份、中链脂肪酸单甘油酯200～300份、水100～150份。

3.根据权利要求2所述的猪饲料替抗添加剂，其特征在于，按照重量份数计，包括以下组分：有机酸640～700份、中链脂肪酸单甘油酯250～300份、水110～150份。

4.根据权利要求1～3任一项所述的猪饲料替抗添加剂，其特征在于：

所述的有机酸为甲酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸和苯甲酸中的至少一种；

所述的中链脂肪酸单甘油酯为癸酸单甘油酯和月桂酸单甘油酯的至少一种。

5.根据权利要求4任一项所述的猪饲料替抗添加剂，其特征在于：

所述的有机酸为甲酸；

所述的中链脂肪酸单甘油酯为月桂酸单甘油酯。

6.权利要求1～5任一项所述的猪饲料替抗添加剂在制备猪饲料中的应用。

7.根据权利要求6所述的猪饲料替抗添加剂在制备猪饲料中的应用，其特征在于：为将猪饲料替抗添加剂添加到猪饲料中；其中，所述的猪饲料替抗添加剂的添加量占猪饲料重量的0.8％～1.4％。

8.权利要求1～5任一项所述的猪饲料替抗添加剂的使用方法，其特征在于：为将所述的猪饲料替抗添加剂与玉米淀粉或蛋白粉预混，然后混合于猪饲料中，混合成粉料或制粒成颗粒料。

9.一种猪饲料，其特征在于：含有权利要求1～5任一项所述的猪饲料替抗添加剂。

10.根据权利要求9所述的猪饲料，其特征在于：

所述的猪饲料还含有基础饲粮；

所述的基础饲粮包括玉米淀粉和蛋白粉。