CN110499366A

CN110499366A - Pi15作为骨关节炎标志物的应用

Info

Publication number: CN110499366A
Application number: CN201910934566.4A
Authority: CN
Inventors: 刘跃洪; 周宇; 陈曦; 王志聪; 张建军; 汪红; 杨灵; 江伟
Original assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Current assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN110499366B; CN109295208A

Abstract

本发明公开了PI15作为骨关节炎标志物的应用。PI15可用于判断受试者是否具有患骨关节炎的风险或者判断受试者是否患有骨关节炎。另外，PI15还可以用于制备治疗骨关节炎的药物。本发明为临床在分子水平上诊断骨关节炎提供了新的诊断方法，同时为骨关节炎的基因治疗提供了新的药物靶点。

Description

PI15作为骨关节炎标志物的应用

技术领域

本发明涉及诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测PI15异常为手段的诊断、预测预后方法。

背景技术

骨关节炎(Osterarthritis，OA)也称为退行性关节炎，是在老年人和肥胖者中最普遍的疾病。OA是关节的疾病，但不同于类风湿性关节炎(RA)，这种疾病不是系统性的，通常只影响一个或数个关节。这种疾病导致关节软骨的总的破坏，下方骨头的硬化，和骨赘形成，造成运动能力丧失和疼痛。最终的结果往往是需要全关节置换。

人口统计学趋势表明，到2020年，受关节疾病影响的人群将增加到50％，全世界将有5.7亿人受到骨关节炎的困扰。我国社会逐渐进入老龄化社会，因此我们将面临骨关节炎发病的普遍流行时期。对该病的研究十分重要和迫切。

骨关节炎的原发异常可以发生在关节软骨、滑膜、软骨下骨、韧带或关节周围的神经肌肉组织。关节软骨的损害是骨关节炎最明显的变化。关节软骨丧失是骨关节炎的关键病变。随着蛋白聚糖含量的下降，关节软骨逐渐缓慢降解。由于骨关节炎患者的蛋白聚糖、胶原和透明质酸合成速率均增加，使得组织的分解代谢活性特别高。通常认为，蛋白溶解酶和中性金属蛋白酶在骨关节炎关节软骨丢失中是最重要的原因。关节软骨组织内没有血管和神经，对创伤、炎症的反应是由关节软骨、滑膜组织或关节液中的蛋白质如细胞因子等介导的。滑膜对于维持关节的正常功能，并且在骨关节炎疾病的发生发展过程中起着重要的作用。

目前临床上对于骨关节炎的诊断主要基于影像学的检查。X线表现主要为关节间隙狭窄，软骨下骨质硬化及囊性变，关节边缘骨赘形成，关节面萎陷、变形和关节半脱位等。MRI可示早期软骨、半月板等关节结构的病变，有利于早期诊断。CT用于椎间盘病的诊断，优于X线。关节间隙变窄，软骨下骨硬化，边缘性骨刺脊椎关节连成骨桥。亦可见骨囊肿以及畸形。如发现这些变化可作为诊断的依据和估计关节损伤的程度。OA一般在早期没有或很少有症状，只在继发炎症、疼痛或影响关节的活动时，病人才找医生。此时，关节损伤发生已久。因为开发用于早期骨关节炎诊断的方法是亟待解决的问题。

在分子水平上尤其是在基因水平上进行骨关节炎的早期诊断已经成为了骨关节炎诊断领域的发展趋势，在诊断方面，申请号为：201510548635.X、2015105495645、2015105486241、201510627048.X、2015107250040、201510724747.6、2015107257552专利文献均披露了可以用于骨关节炎诊断的基因标志物。本申请是在现有技术的启示下寻找新的可以用于骨关节炎诊断的生物标志物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过检测PI15基因或蛋白表达差异来诊断骨关节炎的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过检测PI15基因或蛋白表达差异来预测骨关节炎预后的方法。

本发明的目的之三在于提供一种通过激活PI15基因或PI15蛋白来治疗骨关节炎的方法。

本发明的目的之四在于提供一种用于治疗骨关节炎的药物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测PI15基因或PI15蛋白的产品在制备骨关节炎诊断工具中的用途。

本发明还提供了检测PI15基因或PI15蛋白的产品在制备预测骨关节炎预后工具中的用途。

进一步，所述检测PI15基因或PI15蛋白的产品包括检测PI15基因或PI15蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合PI15基因的核酸或者能够结合PI15蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测PI15基因的表达水平；所述物质能够检测PI15蛋白的表达水平。

本发明的检测PI15基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

上面所述的核酸包括扩增PI15基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的检测PI15蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的检测PI15蛋白的产品包括特异性结合PI15蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测PI15蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的PI15蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对PI15蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。

在本发明中，“预后”是指患者在通过手术处理后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即PI15蛋白或编码PI15蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。

在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。

在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生病理状况。

预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中PI15基因或PI15蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。

进一步，所述检测PI15基因或PI15蛋白的产品可以是检测PI15基因或PI15蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

本发明还提供了一种诊断骨关节炎的工具，所述工具能够检测PI15基因或PI15蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合PI15基因的核酸或者能够结合PI15蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测PI15基因的表达水平；所述物质能够检测PI15蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述诊断骨关节炎的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨关节炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PI15基因的异常与骨关节炎相关也属于PI15基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种预测骨关节炎预后的工具，所述预测骨关节炎预后工具包括能够结合PI15基因的核酸或者能够结合PI15蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测PI15基因的mRNA水平；所述物质能够检测PI15蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述预测骨关节炎预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨关节炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PI15基因的异常与骨关节炎相关也属于PI15基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗PI15抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合PI15即可。

本发明还提供了一种诊断骨关节炎或预测骨关节炎预后的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中PI15基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的PI15基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比，PI15基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为骨关节炎，或该受试者被确定为预后不良。

本发明还提供了一种骨关节炎的治疗方法，所述方法包括激活PI15基因或PI15蛋白。

进一步，所述方法包括促进PI15基因的表达，或促进PI15蛋白的表达或增强PI15蛋白的活性。

本发明还提供了一种含有PI15基因或PI15蛋白的激活剂的药物。

本发明还提供了上述激活剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明的PI15基因或PI15蛋白的激活剂不受限制，只要是可以促进或者增强PI15或涉及PI15上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗骨关节炎有效的药物即可。

进一步，所述激活剂包括PI15基因、PI15蛋白、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

所述激活剂还包括包含携带PI15基因的载体或者宿主细胞。

本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的PI15蛋白的缺失或不足，通过提高PI15蛋白的表达，从而治疗因PI15蛋白缺乏导致的骨关节炎。另一方面可以用于增强PI15蛋白的活性，从而治疗骨关节炎。

本发明还提供了PI15基因或PI15蛋白在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

在本发明的上下文中，“诊断骨关节炎”既包括判断受试者是否已经患有骨关节炎、也包括判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断骨关节炎的分子标志物，使用该分子标志物可以在骨关节炎发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。

另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。

本发明的包括PI15基因或蛋白的激活剂的治疗药物可用作新的骨关节炎的治疗药物。

附图说明

图1显示利用QPCR在mRNA水平上检测PI15基因差异表达情况的统计图；

图2显示利用免疫印迹在蛋白水平上检测PI15基因差异表达情况的统计图；

图3显示PI15基因表达对细胞增殖影响的统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选差异表达基因

1、取材：

5例OA患者的滑膜组织(OA组)来自于行膝关节置换或滑膜切除术的OA病人。所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准。3例正常滑膜组织(Nor组)来自于外伤手术病人关节滑膜组织。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经医院的伦理委员会通过。

选择的研究对象的临床信息如表1所示。

表1临床信息

2、组织RNA的获取

从组织样品中提取total RNA，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、mRNA文库构建

真核生物mRNA 3’末端具有ployA尾的结构，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，使用建好的文库上机测序。

4、上机测序

llumina Hiseq x-ten上机测序流程(mRNA)

(1)文库富集，PCR扩增15个cycles；

(2)2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；

(3)TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；

(4)cBot上进行桥式PCR扩增，生成clusters；

(5)Hiseq x-ten测序平台，进行2*100bp/300bp测序。

5、生物信息学分析

测序数据获得以后的mRNA分析过程如下所示：

(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads(用fastQC看一下测序数据的质量，拿到的数据完成处理时可跳过此步)；

(2)tophat比对到mRNA参考基因组上。mRNA所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；

(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；

(4)cuffdiff包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。

6、结果

显著差异mRNA筛选条件：P<0.05，|log2FC|>1。用以上标准筛选得到在正常滑膜组织和骨关节炎滑膜组织之间存在差异基因1068个，其中表达上调基因516个，表达下调的基因有552个。

实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因

基于前期测序的结果，根据P value的大小，我们选择PI15基因进行验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集骨关节炎滑膜组织和正常滑膜组织各42例。

2、在mRNA水平上进行验证

2.1提取组织RNA

步骤同实施例1。

2.2逆转录

反转录使用Primescript 1^st strand cDNA synthesis kit试剂盒，操作步骤如下进行：

(1)在微量离心管中加入以下反应液体，如表2所示：

表2反应液体

试剂	剂量
		RNA	2.0μg
dNTP	1.0μl
		Oligo(dT)	2.0μl
Rnase free dH<sub>2</sub>O	加至10.0μl

(2)70℃孵育5min，迅速冷却至4℃；

在微量离心管内加入以下反应试剂，制成反应体系，如表3所示：

表3反应体系的配制

试剂	剂量
		5x1st Strand Synthesis Buffer	4.0μl
PrimeScript RTase	1.0μl
		RNase Inhibitor	1.0μl
Rnase free dH<sub>2</sub>O	4.0μl

轻轻震荡，快速离心后，42℃反应1h，70℃10min终止反应，4℃冷却，-20℃保存。

采用SYBP Premix Ex Tap^TM II试剂盒，在Eppendorf Real-time PCR分析仪进行，具体操作如下：

(1)在冰上配制以下PCR反应液，如表4所示：

表4 PCR反应液的配制

试剂	剂量
		SYBR	10.0μl
正向引物	1.0μl
		反向引物	1.0μl
cDNA	2.0μl
		ddH<sub>2</sub>O	6.0μl
总量	20.0μl

引物序列设计如下：

PI15基因：

5’-GGACCTTCTTACTTACTG-3’(SEQ ID NO.1)；

5’-TTCACTTCATCATACCAT-3’(SEQ ID NO.2)

β-actin：

5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；

5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQ ID NO.4)

(2)上机，执行下述程序：95℃预变性3min；95℃变性15s。49.9℃退火20s，72℃延伸20s，共43个循环。

结果釆用相对定量法，运用公式2^-△△ct计算。实验重复3次。

△ct＝ct(A)-ct(β-actin)

△△ct＝△ct(实验组)-△ct(对照组)

结果显示，42例骨关节炎滑膜组织中有40例骨关节炎滑膜组织中的PI15基因mRNA水平相比正常滑膜组织的平均值显著下降；统计结果如图1所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织中PI15基因的mRNA水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

利用受试者工作特征曲线探讨PI15对骨关节炎的诊断价值，分析结果如表5所示。

表5ROC结果统计

实施例3 PI15基因对骨关节炎滑膜细胞增殖影响

1、PI15基因过表达

按照常规方法将PI15基因编码序列插入到真核细胞表达载体中，构建表达载体pcDNA3.1-PI15。

2、细胞培养

人骨关节炎滑膜细胞(货号：408OA-05A，Cell applications，INC.)生长在含有10％FBS和青链霉素的滑膜细胞生长培养基中(货号：415-500，Cell applications，INC.)，置于37℃，5％CO₂湿润的培养箱中培养。

3、细胞转染和表达水平检测

按照2*10⁵/孔细胞接种于6孔板，待细胞生长密度至75％左右时进行pcDNA3.1-PI15和空载体pcDNA3.1转染。转染步骤按照脂质体2000的说明书进行。转染48小时后将6孔板置于冰上，每孔加入RIPA裂解液(含1mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF)150μl作用1min，提取总蛋白，4℃、12000r·min^-1离心15min，取上清液，BCA蛋白试剂盒蛋白定量后，再进行SDS-PAGE电泳，转膜，5％脂奶粉室温封闭1h，4℃孵育抗体抗体；过夜后，TBST洗膜3次，每次10min，二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL化学发光曝光3-5min，显影。结果显示，pcDNA3.1-PI15可有效提高PI15基因表达，表达水平提升至少6倍，差异具有统计学意义P<0.05。

4、细胞增殖

人骨关节炎滑膜细胞接种于96孔板中，每孔加入100μl(2000个细胞)，次日细胞贴壁后按照上面的方法进行细胞转染，细胞培养液作为对照组。在培养结束前16个小时加入1u Ci的³H收集细胞B液闪仪检测增殖。结果如图3所示，pcDNA3.1-PI15可明显抑制滑膜细胞增殖，差异具有统计学意义P<0.05。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 德阳市人民医院

<120> PI15作为骨关节炎标志物的应用

<150> 201811260578.5

<151> 2018-10-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaccttctt acttactg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcacttcat cataccat 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggggcgcc ccaggcacca 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctccttaatg tcacgcacga ttt 23

Claims

1.检测PI15基因或PI15蛋白的产品在制备诊断骨关节炎或预测骨关节炎预后的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测PI15基因或PI15蛋白的产品包括检测PI15基因或PI15蛋白的表达水平的产品。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合PI15基因的核酸或者能够结合PI15蛋白的物质；所述核酸能够检测PI15基因的表达水平；所述物质能够检测PI15蛋白的表达水平。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增PI15基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

5.一种诊断骨关节炎或预测骨关节炎预后的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测PI15基因或PI15蛋白的表达水平的工具。

6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合PI15基因的核酸或者能够结合PI15蛋白的物质；所述核酸能够检测PI15基因的表达水平；所述物质能够检测PI15蛋白的表达水平。

7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增PI15基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

8.一种治疗骨关节炎的药物，其特征在于，所述药物包含PI15基因或PI15蛋白的激活剂。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述激活剂能够促进或增强PI15或涉及PI15上游或下游途径的物质的表达或活性。

10.PI15基因或PI15蛋白在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。