CN107034271B - Duox1作为肺腺癌诊治标志物的用途 - Google Patents

Duox1作为肺腺癌诊治标志物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了DUOX1基因作为肺腺癌的诊治标志物的用途。本发明的实验证明DUOX1基因在癌旁组织和肺腺癌组织中的表达存在显著差异，据此可将DUOX1用于开发诊断肺腺癌的产品。本发明还公开了DUOX1基因可作为肺腺癌的治疗靶标。本发明的研究成果为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、并且能够为肺腺癌药物的开发提供新的药物靶点。

Description

DUOX1作为肺腺癌诊治标志物的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及DUOX1在肿瘤诊断、预测预后方面的应用。
背景技术
肺癌是严重危害人类健康和生命的疾病，在世界范围内其发病率和死亡率均已跃居至癌症的首位。在中国，肺癌是发病率和死亡率上升速度最快的恶性肿瘤，已取代肝癌成为恶性肿瘤死亡的首要因素。腺癌是肺癌最主要的组织学类型，占所有病例的50％以上，是肺癌防治和研究的重点之一。与其他恶性肿瘤一样，早发现、早诊断、早治疗是降低肺腺癌死亡率的关键。
虽然既往大量的研究意图阐述和解释肺腺癌患者致病的具体原因，但肺腺癌发生发展的分子生物学机制目前仍不清楚。因此，探索肺腺癌细胞发生和发展中的分子生物学行为的变化，探寻新的有效的肺腺癌分子生物学诊断、治疗和预后检测标志物，阐明肺腺癌细胞侵袭和转移的分子机制是当前肺腺癌临床治疗和研究中面临和亟待解决的严峻课题。近年来，随着分子生物学的不断发展，一些新的生物标志物已经出现，申请号为：201510220102.9、201510233085.2、201510243857、201610202285.6、201610200867、201610200574.2、201610200855.8、201610301281.3、201610201902专利文献均披露了可以用于肺癌诊断的基因标志物。这些生物标志物的发现不仅对肺腺癌的病理诊断提供了很大的帮助，并为其预后判断、治疗方案的选择提供了更全面的依据，在一定程度上发挥了独特的作用。进一步寻找肺腺癌早期诊断和复发转移的分子标志物，对肺腺癌的诊断和治疗具有重要的理论意义和临床应用价值。
发明内容
本发明利用高通量测序技术筛选出了在肺腺癌组织中差异表达的基因并利用大样本PCR进行验证，获得了可以用于肺腺癌诊断和治疗的分子标志物-DUOX1。使用该基因进行肺腺癌的诊断能够在癌症早期即可进行判断，新的诊断方法具有高效、特异的有益效果。
本发明提供了一种诊断肺腺癌的工具，所述工具能够检测DUOX1基因或DUOX1蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合DUOX1基因的核酸或者能够结合DUOX1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测DUOX1基因的表达水平；所述物质能够检测DUOX1蛋白的表达水平。
进一步，所述诊断肺腺癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断肺腺癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群，或者癌症组织和癌旁组织的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知DUOX1基因的异常与肺腺癌相关也属于DUOX1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种预测肺腺癌预后的工具，所述预测肺腺癌预后工具包括能够结合DUOX1基因的核酸或者能够结合DUOX1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测DUOX1基因的mRNA水平；所述物质能够检测DUOX1蛋白的表达水平。
进一步，所述预测肺腺癌预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断肺腺癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群，或者癌症组织和癌旁组织的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知DUOX1基因的异常与肺腺癌相关也属于DUOX1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗DUOX1抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合DUOX1即可。
本发明还提供了检测DUOX1基因或DUOX1蛋白的产品在制备肺腺癌诊断工具中的用途。
本发明还提供了检测DUOX1基因或DUOX1蛋白的产品在制备预测肺腺癌预后工具中的用途。
进一步，所述检测DUOX1基因或DUOX1蛋白的产品包括检测DUOX1基因或DUOX1蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合DUOX1基因的核酸或者能够结合DUOX1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测DUOX1基因的表达水平；所述物质能够检测DUOX1蛋白的表达水平。
本发明的检测DUOX1基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增DUOX1基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测DUOX1蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的检测DUOX1蛋白的产品包括特异性结合DUOX1蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测DUOX1蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
在本发明中，“预后”是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即DUOX1蛋白或编码DUOX1蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。
在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死亡。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中DUOX1基因或DUOX1蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
进一步，所述检测DUOX1基因或DUOX1蛋白的产品可以是检测DUOX1基因或DUOX1蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
本发明还提供了一种含有DUOX1基因或DUOX1蛋白的激活剂的药物。
本发明还提供了上述激活剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。
本发明的DUOX1基因或DUOX1蛋白的激活剂不受限制，只要是可以促进或者增强DUOX1或涉及DUOX1上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。
进一步，所述激活剂包括DUOX1基因、DUOX1蛋白、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
所述激活剂还包括包含携带DUOX1基因的载体或者宿主细胞。
本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的DUOX1蛋白的缺失或不足，通过提高DUOX1蛋白的表达，从而治疗因DUOX1蛋白缺乏导致的肺腺癌。另一方面可以用于增强DUOX1蛋白的活性，从而治疗肺腺癌。
本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明还提供了一种肺腺癌的治疗方法，所述方法包括激活DUOX1基因或DUOX1蛋白。
进一步，所述方法包括促进DUOX1基因的表达，或促进DUOX1蛋白的表达或增强DUOX1蛋白的活性。
本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量DUOX1基因或者DUOX1蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当DUOX1基因或者DUOX1蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。
本发明还提供了一种诊断肺腺癌或预测肺腺癌预后的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中DUOX1基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的DUOX1基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与对照相比，DUOX1基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为肺腺癌，或该受试者被确定为预后不良。
在本发明的上下文中，“诊断肺腺癌”既包括判断受试者是否已经患有肺腺癌、也包括判断受试者是否存在患有肺腺癌的风险。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断肺腺癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在肺腺癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。
本发明的包括DUOX1基因或蛋白的激活剂的治疗药物可用作新的肺腺癌的治疗药物。
附图说明
图1显示利用QPCR在mRNA水平上检测DUOX1基因过表达情况的统计图；
图2显示利用免疫印迹在蛋白水平上检测DUOX1基因过表达情况的统计图；
图3显示DUOX1基因过表达对肺腺癌细胞增殖影响的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选差异表达基因
1、取材：
8例原发肺腺癌患者的手术切除癌组织和癌旁组织作为实验样本。所有癌组织均术后病理证实为肺腺癌。全部原发肺腺癌患者术前均未行放、化疗，全部病例临床资料完整。
2、组织RNA的获取
从组织样品中提取total RNA，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
3、去除rRNA
细胞内一部分(>24％)的长链非编码RNA都是缺少传统poly A尾的，因此采用去除rRNA的方式建库可以获得更加全面的lncRNA信息。
4、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，去除rRNA得到的mRNA和lncRNA是完整的RNA序列，平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
6、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
7、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
8、Illumina Hiseq4000上机测序
文库富集，PCR扩增15个cycles；
2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；
TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；
cBot上进行桥式PCR扩增，生成clusters；
Hiseq4000测序平台，进行2*150bp测序。
9、原始测序数据过滤
将序列末端(5’端和3’端)低质量(质量值小于20)的碱基修剪掉；
去除含N比率超过10％的reads；
10、mRNA差异表达分析
分析软件：Cuffdiff:(http://Cufflinks.cbcb.umd.edu/)
Cuffdiff是Cufflinks套件里用来计算差异表达的一个工具，Cuffdiff利用Tophat比对的结果，调用Cufflinks计算每个基因/转录本的表达量。通常采用默认参数运行软件，同时根据实际情况，如测序数据量，基因组情况对参数做适当的调整。
显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05，两组的count平均值之差大于10。
11、结果
测序结果显示：与癌旁组织相比，肺腺癌组织中差异表达基因为1321个，其中上调的为587个，下调的为734个。
实施例2 大样本验证筛选出的差异表达基因
基于前期高通量转录组深度测序的结果，根据P value的大小，我们选择DUOX1基因进行验证。
1、样本收集
按照实施例1的方法收集肺腺癌组织及其对应的癌旁组织各45例。
2、在mRNA水平上进行验证
2.1 提取组织RNA
步骤同实施例1。
2.2 逆转录
逆转录体系共 20μL，包括细胞总RNA 2μg/2μL，50U/μL Rnasin 1μL，5×逆转录反应缓冲液 4μL，10m M d NTP 2μl，50μg/mL随机引物 2μL(promega)，200U/μL M-MLV逆转录酶 1μL，DEPC 8μL。
37℃反应 60分钟，95℃5分钟终止反应。cDNA在-80℃保存或进行PCR扩增。
2.3 PCR
反应体系按照Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)配置，SYBR反应体系共 25μL，2.5×Real Master Mix 10μL，20×SYBR solution1.25μL，上游引物 0.5μL，下游引物 0.5μL，去离子水10.75μL，cDNA 2μL。反应条件为 94℃5min，94℃45s，60℃1min，30个循环，设空白对照。
PCR反应前10个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调节基线至适宜处，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为Ct值。根据ΔC(t)＝C(t)目的基因-C(t)β-actin，ΔΔC(t)＝2-ΔC(t)，计算目的基因与β-actin相对表达量。
PCR引物序列如下：
DUOX1基因：
5’-TGCTTCCAGACTTCAGAA-3’(SEQ ID NO.1)；
5’-CCAACACACATACAGACAT-3’(SEQ ID NO.2)
β-actin：
5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；
5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQ ID NO.4)
结果显示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中DUOX1基因的mRNA相对表达量为0.21±0.012，表明肺腺癌组织中DUOX1基因的mRNA水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。
3、在蛋白水平上进行验证
3.1 提取组织总蛋白
按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
3.2 Western blot检测
将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。
3.3 统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将DUOX1蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3.4 结果
结果显示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中DUOX1蛋白的相对表达量为0.35±0.015，结果表明肺腺癌组织中DUOX1蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3 DUOX1基因过表达
1、质粒构建
根据DUOX1基因的编码序列设计扩增引物，引物的设计为本领域技术人员所熟知。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的DUOX1基因的编码序列，上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-DUOX1用于后续实验。
2、肺腺癌细胞的培养与转染
2.1 细胞培养
将肺腺癌细胞株A549于RPMI1640培养基和10％胎牛血清中培养。
2.2 细胞转染
(1)转染前一天将0.5-2*105个肿瘤细胞悬浮于500μl不含抗生素的培养基，接种至24孔培养板。
(2)转染当天细胞密度应达80％-90％，准备以下复合物A：将1μg质粒DNA稀释于无血清培养基中，轻轻混匀；复合物B：取4μl Lipofectamine2000稀释于无血清培养基中，混匀。
(3)将复合物A和B混合，轻轻混匀，室温孵育。
(4)将100μl脂质体复合体加入肿瘤细胞中，上下左右轻轻混匀，将细胞放入37℃含5％CO2培养箱孵育5-7小时。
(5)加1ml含有2倍正常血清和抗生素浓度的生长培养基，继续培养细胞18-24小时。
3、利用QPCR实验检测pcDNA3.1-DUOX1的过表达情况
3.1 提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
3.2 逆转录
步骤同实施例2。
3.3 QPCR
步骤同实施例2。
3.4 结果
结果如图1所示，pcDNA3.1-DUOX1能够成功过表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
3、Western blot实验检测pcDNA3.1-DUOX1过表达情况
步骤同实施例2。
结果如图2所示，与转染pcDNA3.1组相比，转染pcDNA3.1-DUOX1的细胞中DUOX1蛋白的含量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 DUOX1基因的表达对肺腺癌细胞增殖能力的测定
1、步骤：
将转染24小时后的肺腺癌细胞A549接种于96孔细胞培养板中，每孔2*103个细胞/孔/200μl，细胞分组如下：
实验组1(对照组)：肺腺癌细胞转染pcDNA3.1；
实验组2：肺腺癌细胞转染pcDNA3.1-DUOX1。
将细胞在37℃、5％CO2培养箱再次孵育24小时后，根据Brd U细胞增殖试剂盒(Chemicon International)的说明书，测量细胞增殖速率。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如图3所示，相比于实验组1，实验组2的细胞增殖减缓，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，DUOX1表达可以抑制肺腺癌细胞增殖。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北医科大学第四医院（河北省肿瘤医院）
<120> DUOX1作为肺腺癌诊治标志物的用途
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcttccaga cttcagaa 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaacacaca tacagacat 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtggggcgcc ccaggcacca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctccttaatg tcacgcacga ttt 23

Claims (1)

1.DUOX1基因的激活剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述激活剂是在pcDNA3.1载体中导入DUOX1基因编码序列所获得的重组表达载体。
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