CN110499313B - 抑制MITF的siRNA分子及其应用 - Google Patents

抑制MITF的siRNA分子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110499313B
CN110499313B CN201810466264.4A CN201810466264A CN110499313B CN 110499313 B CN110499313 B CN 110499313B CN 201810466264 A CN201810466264 A CN 201810466264A CN 110499313 B CN110499313 B CN 110499313B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sirna
mitf
rna
gene
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810466264.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110499313A (zh
Inventor
杨振军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomics Biotechnologies Co Ltd
Original Assignee
Biomics Biotechnologies Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomics Biotechnologies Co Ltd filed Critical Biomics Biotechnologies Co Ltd
Priority to CN201810466264.4A priority Critical patent/CN110499313B/zh
Publication of CN110499313A publication Critical patent/CN110499313A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110499313B publication Critical patent/CN110499313B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于抑制MITF基因的siRNA分子，由序列为SEQ ID NO:1的正义链和序列为SEQ ID NO:2的反义链组成。本发明的siRNA分子可用于制备治疗黑色素瘤等高黑色素相关疾病的药物、并用于制备美白祛斑化妆品。

Description

抑制MITF的siRNA分子及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于抑制MITF基因的siRNA分子及其在制备治疗黑色素瘤等高黑色素相关疾病的药物中的用途。
背景技术
小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)，又称小眼球相关转录因子，在黑色素细胞的发育、分化和功能调节上起着重要作用。MITF具有基本-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helix-leucine zipper，bHLHZip)结构(Hodgkinson CA等，1993，Cell，744：395-404)。人类的MITF基因定位于人类第三条染色体3P14.1-3P12.3。研究证实其在色素细胞的发育、分化和功能调节中发挥关键性作用。MITF基因突变导致色素细胞的发育缺陷与功能障碍，同时MITF与其他信号分子发生复杂的相互作用。
MITF可调控酪氨酸基因家族的表达，从而参与黑素生成的调控(Shibahara，S等，Pigment Cell Res，1998，11：329-336)。酪氨酸酶基因家族的三个成员：酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)，酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)，基因的启动子都含有一个“Mbox”的结构，M box的核心结构为“CATGTG”，MITF可以与该结构结合，从而反式激活相应的基因表达。MITF通过与酪氨酸酶基因家族启动子的作用，一方面指导它们在黑素细胞中特异性表达，另一方面参与外界刺激对黑素细胞黑素生成的调控。MITF本身也具有细胞特异性，MITF在酪氨酸酶的黑素细胞特异性表达中起着关键作用。TRP-1和TRP-2也具有M-box结构，该结构在酪氨酸家族高度保守，MITF可与TRP-1基因M-box结合而活化其表达，并指导其在黑素细胞中特异性表达。
黑色素细胞是皮肤的重要组成细胞之一，起源于胚胎神经嵴，具有树状突起，属于腺细胞，合成的黑素经由树状突起分泌进入角质形成细胞，随角质形成细胞的脱落而排出体外，存在于表皮基底层。黑色素细胞通过合成黑色素形成皮肤颜色，同时可吸收紫外线，使机体免遭紫外线的损害。黑色素细胞的发育、分化与黑色素的合成调节是一个复杂的过程，其中有多种信号分子参与该过程的调控，构成复杂的信号网络，其中MITF在其中扮演重要的角色。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物界中一种既古老且在进化上又高度保守的现象，是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的基因转录后沉默。小干扰RNA(siRNA)是RNAi的效应分子，由两条互补的RNA单链构成，长21～23个核苷酸(nt)。由于RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以技术广泛地应用于功能基因组学研究、传染性疾病以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。近几年，RNA干扰(RNA interfering，RNAi)作为一个新的基因治疗技术，其在抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等医药领域应用前景广阔，得到了迅速发展，部分RNA药物已进入临床试验阶段，为疑难杂症尤其是多因素的疾病如癌症、病毒感染开辟了全新的治疗途径。2016年12月23日，美国食品和药物管理局FDA批准了首个用于治疗脊髓性肌萎缩的RNA药物Spinraza(Nusinersen)的上市申请，标志着RNA药物正式加入药物大军，成为继化学药物、生物蛋白药物之后的第三大新药类型。目前国际上已有数十种siRNA药物进入临床阶段。RNAi药物现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。
发明内容
为了得到能有效治疗黑色素瘤等高黑色素相关疾病的RNA药物，发明人以MITF基因为靶点，设计并筛选出数百种siRNA分子，发现其中一些能够特异性地抑制MITF基因表达，其中一组siRNA分子能有效地抑制MITF基因。因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于抑制MITF基因的siRNA分子，其由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-GAGUCUGAAGCAAGAGCACUGNn-3’(SEQ ID NO:1)，
反义链：5’-CAGUGCUCUUGCUUCAGACUCNn-3’(SEQ ID NO:2)，
其中，正义链和反义链中的N相同或者不同，并且各自独立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0、1或2。
在一种实施方式中，所述n为0，即
正义链：5’-GAGUCUGAAGCAAGAGCACUG-3’(SEQ ID NO:3)，
反义链：5’-CAGUGCUCUUGCUUCAGACUC-3’(SEQ ID NO:4)。
该siRNA分子是该组siRNA分子的主干序列。
在另一种优选的实施方式中，所述N为dT，n为2，即
正义链：5’-GAGUCUGAAGCAAGAGCACUGdTdT-3’(SEQ ID NO:5)，
反义链：5’-CAGUGCUCUUGCUUCAGACUCdTdT-3’(SEQ ID NO:6)。
在一种实施方式中，上述siRNA分子可以呈现为RNA表达框形式。因此，本发明的第二个目的在于提供上述siRNA分子的表达框，这种RNA表达框是一种DNA分子。所述RNA表达框的分子结构为：RNA聚合酶III型启动子(比如U6启动子)-RNA转录模板-RNA聚合酶III型启动子(比如H1启动子)。
本发明的第三个目的在于提供上述siRNA分子、RNA表达框在制备用于抑制MITF表达的药物中的用途、以及在制备美白祛斑化妆品中的用途。
可选地，上述药物是治疗高黑色素相关疾病药物。
优选地，所述药物是治疗黑色素瘤药物。
在一种优选的实施方式中，上述药物是适用于注射的剂型或凝胶剂。
优选地，上述药物还包含必要的佐剂。
体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链SEQ ID NO:2可特异性地与MITF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，下调黑色素相关基因的表达，最终抑制黑色素的生成，无明显毒副作用。
附图说明
图1是本发明的U6-siRNA转录模板-H1表达框结构示意图。
图2是PCR制备的U6-siRNA转录模板-H1表达框纯化后琼脂糖凝胶电泳检测图(部分)。图中，最右侧条带是DNA分子量Marker(标准参照)。
图3是U6-siRNA转录模板-H1表达框转染黑色素瘤细胞A375后实时定量PCR检测MITF基因的mRNA表达量柱形图，横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示MITF相对于看家基因GAPDH的mRNA表达水平，其中，“MITF siRNA”组为本发明的U6-siRNA转录模板-H1表达框转染组，“阴性对照”组为阴性对照siRNA表达框转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组。
图4是化学合成的siRNA转染黑色素瘤细胞A375后实时定量PCR检测MITF基因的mRNA表达量柱形图，横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示MITF相对于看家基因GAPDH的mRNA表达水平，其中，“正常组”为正常培养细胞未转染组，“阴性对照组”为阴性对照siRNA转染组。
图5是siRNA转染细胞后黑色素瘤细胞生长曲线图。横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示各实验组所测得的OD值(A450值)，其中“MITF siRNA”组为本发明的siRNA转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组，“阴性对照组”为阴性对照siRNA转染组。
图6是siRNA转染细胞后黑色素瘤细胞中黑色素含量相对于正常组的柱形图。横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示黑色素相对于正常组百分含量，其中“MITF siRNA”组为本发明的siRNA转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组，“阴性对照组”为阴性对照siRNA转染组。
具体实施方式
本发明的siRNA分子来源于针对MITF基因开放阅读框的保守区而制备的siRNA分子库，所用siRNA分子库技术是百奥迈科生物技术有限公司的专利技术(中国发明专利号为：200710024217.6)，其优点在于所制备得到的siRNA随机分布于MITF开放阅读框区段，长度可控性分布于19-23bp，可以提高有效靶位点的命中率。
为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的siRNA的抑制黑色素瘤以及抑制黑色素生成的效果，设计了如下实验方案：
(1)构建凋亡抑制MITF基因开放阅读框的siRNA分子库，该分子库中包含靶向至MITF基因的siRNA效应分子，长度分布于19-23bp；
(2)制备具有相应效应的siRNA表达框，其结构为“U6启动子-siRNA转录模板-H1启动子”，使其更易于体外筛选；
(3)运用实时定量PCR检测上述siRNA表达框在细胞中转录出的效应siRNA分子对MITF基因的抑制作用；
(4)化学合成上述方法筛选得到的siRNA，在体外细胞实验中进一步运用实时定量PCR检测方法检测MITF基因的mRNA表达水平；
(5)用CCK8法检测上述筛选到的siRNA对黑素瘤细胞的生长抑制；
(6)检测上述筛选到的siRNA对细胞黑色素生成的影响。
本发明提供的siRNA分子和U6-siRNA转录模板-H1表达框可以特异性地与MITF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，下调黑色素相关基因的表达，最终抑制黑色素的生成。
在本文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”、“siRNA分子”、“双链siRNA”、或“双链siRNA分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。其中，siRNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。
为表述方便起见，在本文中有时将靶向MITF的siRNA分子和U6-siRNA转录模板-H1表达框简称为MITF siRNA。
siRNA分子的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达RNA、PCR合成RNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。
本发明的药物剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持RNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。该药物也可以是凝胶剂。
任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学上可接受的载体及佐剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持RNA分子的活性。
上述美白祛斑化妆品中可以包含常用的化妆品辅料，只要其适合于保持RNA分子的活性。
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
实施例
本文中的siRNA和PCR引物由百奥迈科生物技术有限公司合成。
主要仪器、试剂和材料：
PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad公司)；琼脂糖凝胶电泳系统(北京六一生物科技有限公司)；细胞培养箱(Thermo公司)；核酸合成仪(GE公司)；酶标仪(Bio-Rad公司)。
1kb plus DNA Ladder(Invitrogen公司)；Pfu DNA聚合酶(百奥迈科生物公司)；Agarose(BBI公司)；dNTP(生工生物工程(上海)股份有限公司)；琼脂糖凝胶纯化试剂盒(百奥迈科生物公司)，LipofectaminTM2000(Invitrogen公司)，DMEM培养基(Gibco公司)，TurboCapture mRNA kit(QIAGEN公司)，EzOmicsTM One-Step qPCR kit(百奥迈科生物公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，CCK8试剂盒(同仁化学研究所)。其他生化试剂均购于生工生物工程(上海)股份有限公司，由百奥迈科生物技术有限公司配制成工作溶液。
实施例1靶向MITF基因的siRNA分子库的制备
1.MITF基因靶序列的获得：美国NCBI数据库中MITF基因共有八种转录变异体(transcript variant)序列，选择有代表性的转录变异体1(NCBI数据库号：NM_198159)开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)进行合成，由百奥迈科生物技术(百奥迈科生物公司)有限公司全基因合成长度为1563bp的MITF的ORF序列。
2.用百奥迈科生物技术有限公司的专利技术构建siRNA分子库(专利号为：200710024217.6)，构建siRNA分子库。成功构建MITF保守区的siRNA分子库，随机挑取克隆进行测序，其序列长度可控性分布在19-23bp之间，显示出位点及长度的多样性。
筛选出200个siRNA序列，用CCK8法检测上述筛选到的siRNA对黑素瘤细胞的生长抑制。其中一种siRNA分子可有效地抑制黑素瘤细胞的生长，正义链序列为SEQ ID NO:3，反义链序列为SEQ ID NO:4。在下述实施例中将该分子命名为MITF siRNA。
实施例2 siRNA表达框的制备与靶点筛选
1.合成PCR引物，序列如下：
5’U6启动子引物：5’-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3’(SEQIDNO:7)；
3’H1启动子引物：5’-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3’(SEQIDNO:8)；
MITF基因正向引物：5’-CATCACCTTCAACAACAAC-3’(SEQIDNO:9)；
MITF基因反向引物：5’-ATGCTCATACTGCTCCTC-3’(SEQIDNO:10)；
GAPDH基因正向引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQIDNO:11)；
GAPDH基因反向引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO:12)。
2.siRNA表达框的制备
2.1PCR扩增制备siRNA表达框“U6-siRNA转录模板-H1”：以正义链序列为SEQ IDNO:3、反义链序列为SEQ ID NO:4的MITF siRNA阳性克隆质粒为模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通过PCR的方法扩增制备。表达框示意图如图1所示。
各PCR反应体系为(50μl反应体系)：0.5μl模板DNA(10-50ng)，1μl 5’U6启动子引物(10μM)，1μl 3’H1启动子引物(10μM)，1μl dNTP(10mM)，0.5μl Pfu DNA聚合酶，用ddH2O补足到50μl，反应条件为：95℃预变性1min，95℃变性15sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，20个循环。1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增得到的表达框，并用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物条带单一，片段大小约为380～384bp，符合设计要求。琼脂糖凝胶电泳检测图如图2所示。
2.2阴性对照siRNA表达框的制备
参照2.1的步骤，PCR扩增制备阴性siRNA表达框“U6-阴性对照siRNA转录模板-H1”。其中阴性对照siRNA的正义链序列为SEQ ID NO:13、反义链序列为SEQ ID NO:14：
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO:13)，
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO:14)。
3.靶点筛选
3.1细胞培养：黑色素瘤细胞A375在含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养。
3.2细胞铺板并转染：将细胞按1×105/孔接种到96孔细胞培养板中，用无抗含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。转染按照LipofectaminTM2000的说明书操作，U6-siRNA转录模板-H1表达框DNA量按0.2μg/孔加入。
3.3实时定量PCR检测MITF基因mRNA水平：用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapturemRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，按80μl无RNase水/孔溶解RNA，取4μl RNA为模板进行实时定量PCR反应。
用基因特异性引物检测样本中MITF基因的mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下25μl反应体系：4μl模板RNA，12.5μl 2×Master Mix，1μl正向引物(6μM)，1μl反向引物(6μM)，0.5μl 50×SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25μl。反应条件：40℃反转录30min，95℃预变性7min，95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环45次，并测定溶解曲线。
3.4结果分析：用2-ΔΔct法分析实验结果，并作出柱状图，如图3所示，结果显示MITFsiRNA呈现较好的沉默效果，相对于作为“正常组”的未转染组，其沉默效果达到89％。
该表达框的靶向位置是MITF基因保守区的片段GAGTCTGAAGCAAGAGCACTG。
实施例3化学合成siRNA验证沉默效果
1.化学合成制备正义链序列为SEQ ID NO:5、反义链序列为SEQ ID NO:6的MITFsiRNA
利用核酸合成仪(AKTA Oligo Pilot)分别合成MITF siRNA的正义链SEQ ID NO:3和反义链SEQ ID NO:4，进行纯化，将正义链和反义链退火成siRNA双链(duplex)，分装1OD/管，最后冷冻干燥，转染前用无RNase水溶解至20μM。
2.合成作为阴性对照的siRNA分子
阴性对照的siRNA序列为：
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:15)，
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO:16)。
3.沉默效率验证
3.1细胞培养：黑色素瘤细胞A375在含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养。
3.2细胞铺板并转染：将细胞按1×105/孔接种到96孔细胞培养板中，用无抗含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。
转染按照LipofectaminTM2000的说明书转染，RNA按10nM/孔加入。
3.3实时定量PCR检测MITF基因mRNA水平：用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapturemRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，按80μl无RNase水/孔溶解RNA，取4μl RNA为模板进行实时定量PCR反应。
用基因特异性引物检测样本中MITF mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25μl反应体系：4μl模板RNA，12.5μl 2×MasterMix，1μl正向引物(6μM)，1μl反向引物(6μM)，0.5μl 50×SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25μl。反应条件：40℃反转录30min，95℃预变性7min，95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环45次。
3.4结果分析：用2-ΔΔct法分析实验结果，并作柱状图，如图4所示，结果显示，相对于作为“正常组”的未转染组，靶向至MITF基因的MITF siRNA沉默效果达到80％。
实施例4黑色素瘤细胞生长抑制检测
1.细胞毒性检测
细胞培养：黑色素瘤细胞A375在含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养。
细胞铺板并转染：将细胞按1×105/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。转染按LipofectaminTM2000(Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10nM/孔加入。
2.CCK-8测定：在不同时间点测定。在细胞板每孔加入1/10培养基体积的CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育0.5～4h。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度。
结果分析：根据所测得的A450值(OD值)，作生长曲线图，如图5所示，与正常组相比，MITF siRNA对黑色素瘤细胞有一定的生长抑制用，且无明显的毒性作用。
实施例5黑色素含量的测定
1.细胞毒性检测
细胞培养：黑色素瘤细胞A375在含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养。
细胞铺板并转染：将细胞按1×105/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。转染按LipofectaminTM2000(Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10nM/孔加入。
2.黑色素含量测定：参照Jones K等人(Jones K et a1.Pigment Cell Res 2002；15:335-40)的方法，经改进后进行黑色素含量测定。A375细胞转染72h后，用PBS洗涤两次，用0.25％胰蛋白酶消化，并用完全培养基终止消化，1,000rpm离心5min，弃上清液，每孔加1ml PBS重悬细胞，用血球计数板计数，然后1,000rpm离心5min，弃上清液，细胞沉淀在超净工作台中干燥，每106个细胞溶于500μl的1N含1％DMSO的NaOH溶液。经80℃加热1h后冷却。用酶标仪在475nm波长处测定吸光度。
结果分析：根据所测得的A475值(OD值)，作柱状图，如图6所示，与正常组相比，MITFsiRNA处理组的细胞中黑色素含量下降了约45％，明显抑制了黑色素的生成。
由上述实验可见，靶向MITF的MITF siRNA以及U6-siRNA转录模板-H1表达框DNA都表现出显著抑制MITF表达的活性，且无明显的毒性作用，因而具有应用于黑色素瘤等高黑色素相关疾病治疗的潜力。
序列表
<110> 百奥迈科生物技术有限公司
<120> 抑制MITF的siRNA分子及其应用
<130> SHPI1810418
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gagucugaag caagagcacu gn 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 2
cagugcucuu gcuucagacu cn 22
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gagucugaag caagagcacu g 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cagugcucuu gcuucagacu c 21
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gagucugaag caagagcacu gdd 23
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cagugcucuu gcuucagacu cdd 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aaggtcgggc aggaagaggg c 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tatttgcatg tcgctatgtg ttct 24
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
catcaccttc aacaacaac 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
atgctcatac tgctcctc 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 13
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 14
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 15
uucuccgaac gugucacgud d 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 16
acgugacacg uucggagaad d 21

Claims (4)

1.一种用于抑制MITF基因的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-GAGUCUGAAGCAAGAGCACUGdTdT-3’，
反义链：5’-CAGUGCUCUUGCUUCAGACUCdTdT-3’。
2.如权利要求1所述的siRNA分子在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。
3.权利要求2所述的用途，其特征在于，所述治疗黑色素瘤药物是注射剂型。
4.权利要求2所述的用途，其特征在于，所述治疗黑色素瘤药物是凝胶剂。
CN201810466264.4A 2018-05-16 2018-05-16 抑制MITF的siRNA分子及其应用 Active CN110499313B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810466264.4A CN110499313B (zh) 2018-05-16 2018-05-16 抑制MITF的siRNA分子及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810466264.4A CN110499313B (zh) 2018-05-16 2018-05-16 抑制MITF的siRNA分子及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110499313A CN110499313A (zh) 2019-11-26
CN110499313B true CN110499313B (zh) 2022-08-12

Family

ID=68583579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810466264.4A Active CN110499313B (zh) 2018-05-16 2018-05-16 抑制MITF的siRNA分子及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110499313B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112773730B (zh) * 2021-01-28 2023-01-03 南昌大学 微小rna在美白护肤产品中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088020A (zh) * 2011-10-27 2013-05-08 江苏吉康生物技术有限公司 抑制黑色素生成的siRNA分子及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3178925B1 (en) * 2014-08-08 2021-10-06 National Center For Child Health And Development Method for producing retinal ganglion cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088020A (zh) * 2011-10-27 2013-05-08 江苏吉康生物技术有限公司 抑制黑色素生成的siRNA分子及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MITF-siRNA Formulation Is a Safe and Effective Therapy for Human Melasma;Xiang Yi等;《Molecular Therapy》;20110228;第19卷(第2期);第362-371页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110499313A (zh) 2019-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107454843B (zh) 包含微小核糖核酸作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物
EP2390330B1 (en) MicroRNA molecules
Kang et al. Hydrogen sulfide protects cardiomyocytes against apoptosis in ischemia/reperfusion through MiR-1-regulated histone deacetylase 4 pathway
EP3088524A1 (en) Artificial mimic mirna for controlling gene expression, and use of same
EP2781598B1 (en) Nucleic acid molecule for inhibiting activity of rnai molecule
US9045753B2 (en) siRNA molecule for inhibiting growth of melanin and application thereof
CN113201591A (zh) 一种长链非编码rna及其抑制剂在预防、治疗乳腺癌中的应用
CN110499313B (zh) 抑制MITF的siRNA分子及其应用
Zhou et al. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells
CN107858351B (zh) 一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用
CN107828787B (zh) 抑制人srsf3基因表达的反义寡核苷酸序列及其应用
CN109337907B (zh) 一种用于抑制TCF12基因的siRNA分子
CN113265466A (zh) 一种长链非编码rna及其在诊断、治疗肝细胞癌中的应用
CN110540990A (zh) 沉默小眼畸形转录因子mRNA表达的siRNA分子
CN114085832B (zh) 用于抑制PRR14基因的siRNA分子
EP3919618A1 (en) Oligonucleotide molecule and application thereof in tumor therapy
JP6687948B2 (ja) 遺伝子発現制御のための発現抑制核酸分子およびその用途
KR20220166516A (ko) 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법
KR20180092378A (ko) miR-130a를 유효성분으로 함유하는 방사선 민감성 증진용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant