CN110498809B - 基于酰腙配体类的有机硼化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于酰腙配体类的有机硼化合物及其制备方法和应用。本发明合成的一系列基于酰腙配体类有机硼荧光化合物易于合成，并且显示出良好的热稳定性和AIE特性，作为生物荧光探针与商业化尼罗红探针相比，对细胞器脂滴具有高重叠效率的特异性标记，在生物荧光检测技术领域具有相当重要的意义与价值。

Description

基于酰腙配体类的有机硼化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，具体涉及一种基于酰腙配体类的有机硼化合物及其制备方法和应用。
背景技术
聚集诱导发光(Aggregation-Induced Emission，AIE)型荧光材料，在溶液中几乎不发光，而在聚集状态或固体薄膜下发光增强。其中，AIE发光物质(AIE分子，AIE荧光团，AIEgen)结构的设计策略，主要理论依据为分子内运动受限(Restriction ofintramolecular motion，RIM)机理模型，即分子内振动或转动等运动导致激发态分子的能量以非辐射形式衰减，产生弱的荧光发射；当这些分子聚集在一起时，彼此的牵制作用限制了分子内部的运动，降低因运动而耗散的能量比例，增加光输出形式的能量比例，从而表现出荧光增强的现象。经过17年的发展，具有AIE特性的材料几乎在众多发光材料领域得到应用，如作为对刺激(pH、温度、溶剂、压力等)特异性响应与可逆性传感的智能材料、可调谐折射率的液晶或偏振光材料、高效率的有机发光二极管(OLED)显示和照明材料、光波导材料、选择性生物传感材料、痕迹识别型材料以及在生物体系中的细胞器、病毒、细菌或血管成像等材料。
脂滴(Lipid Droplet)是一种动态储存脂肪(甘油三酯、胆固醇酯和维生素等)的细胞器，主要功能是动态调节细胞的能量平衡，与合成脂类分子的内质网、能量动力车间线粒体等细胞器有着密切的联系，提供细胞和生物有机体能量。最新的研究表明，脂滴并非细胞内一个简单的能量贮存器，而是一个复杂、活动旺盛、动态变化的多功能细胞器。脂滴能够沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器相互作用，可能在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解以及信号传导过程中起着重要的作用。另外，研究还表明，多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病和C型尼曼氏疾病，往往都伴随着脂质贮存的异常。近年来，关于脂滴的生物学研究日益受到人们的重视，主要研究重点在于寻找和确定脂滴标记，或者说特定物种、特定器官和组织脂滴标记的工作，但现有技术中关于脂滴标记探针，如商业化尼罗红探针，存在稳定性不佳、灵敏性差等诸多问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于酰腙配体类的有机硼化合物及其制备方法和应用，解决现有技术中的脂滴标记探针稳定性不佳、灵敏性差等问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种基于酰腙配体类的有机硼化合物，所述有机硼化合物的结构式为式I所示的结构式：
Figure BDA0001663768510000021
其中，Ar1和Ar2分别各自独立地选自下述任一结构式的基团：
Figure BDA0001663768510000022
Ar3为H或者选自下述任一结构式的基团：
Figure BDA0001663768510000031
其中，R1和R2分别各自独立地选自H、CF3、氰基、硝基、卤素、羟基、胺基、任选被取代的烷基、烷氧基、烷硫基、烯基、炔基、环烷基、环烷基氧基、环烷基硫基、酰基、芳基、杂环基、杂芳基、杂环烷基、单烷基胺基或二烷基胺基。
在本发明的有机硼化合物中，所述Ar1、Ar2和Ar3分别各自独立地选自下述任一结构式的基团：
Figure BDA0001663768510000032
在本发明的有机硼化合物中，所述Ar1、Ar2和Ar3分别各自独立地选自：
Figure BDA0001663768510000033
在本发明的有机硼化合物中，所述有机硼化合物选自式I’至VI’所示的结构式中的一种：
Figure BDA0001663768510000041
在本发明的有机硼化合物中，所述有机硼化合物选自下述结构式中的一种：
Figure BDA0001663768510000042
Figure BDA0001663768510000051
需要说明的是，优选地，上述涉及到的R1和R2分别各自独立地选自H、CF3、氰基、硝基、卤素、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷硫基、C3-7环烷基、C3-7环烷基氧基、芳基、杂环基、杂芳基、杂环烷基或C1-6二烷基胺基。更优选地，上述涉及到的R1和R2分别各自独立地选自H、CF3、氰基、卤素、C1-4烷氧基、N-甲基哌嗪基、吗啡林基或C1-4二烷基胺基。
本发明还提供了上述的有机硼化合物的制备方法的工艺如下：
Figure BDA0001663768510000052
制备方法包括如下步骤：
S1、酰腙配体的缩合反应(Condensation reaction)：将式II-1所示的结构式的化合物和式III-1所示的酰肼化合物置于乙醇溶剂中，加热回流得到式II-2所示的结构式的中间产物；
Figure BDA0001663768510000053
优选地，步骤S1得到的混合物冷却到室温后，过滤得到的固体，再利用有机溶剂(如乙醇)洗涤，得到中间产物；
进一步地，步骤S1的滤液经由减压浓缩所得到的粗产品，再加入有机溶剂(如乙醇)洗涤后，过滤得到纯的中间产物，进而提高中间产物的产率；
S2、硼化反应：将所述中间产物、烯丙基三甲基硅烷(Allyltrimethylsilane，ATMS)和三氟化硼乙醚(Boron trifluoride etherate，BF3OEt2)置于干燥的二氯乙烷(DCE)溶剂和氮气环境中，回流得到式I所示的结构式的最终产品基于酰腙配体类的有机硼化合物；
优选地，步骤S2反应得到的混合物冷却到室温，经由减压浓缩所得到的粗产品，再加入冷的有机溶剂(如甲醇)洗涤后，过滤得到有机硼化合物；
更优选地，步骤S2的滤液经由减压浓缩得到的粗产品，在填充硅胶的滤板上快速过滤后，得到的粗的有机硼化合物，再进一步通过二氯甲烷–乙醇重结晶，过滤得到高纯度的有机硼化合物。
本发明上述的有机硼化合物在制备用于细胞器脂滴特异性标记的生物荧光探针中的应用。
本发明上述的有机硼化合物在制备用于肿瘤细胞、正常细胞、淡水藻和咸水类海藻的脂滴标记的生物荧光探针、发光二极管、光电放大器、光信息存储器、液晶显示器、光波导材料、生物传感器以及逻辑门、无损读出的生物探针中的应用。
本发明还提供一种体外检测肿瘤细胞(如HeLa细胞)的脂滴特异性标记方法，该方法包含下列步骤：
A、使用上述有机硼化合物处理细胞；
B、通过荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜检测细胞成像。
术语和定义
术语“卤素”代表氟、氯、溴和碘，特别是氟或氯，优选为氟。
术语“烷基”代表一类仅含有碳、氢两种原子的直链或支链烷基团，例如C1-10烷基是指具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链烷基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、2-乙基丁基、2-乙基己基、2-丁基辛基。优选烷基含有1、2、3或4个碳原子(C1-4烷基)，例如甲基、乙基、正丙基或正丁基。
术语“烯基”一般意指直链或支链、含有2-20个碳原子且含有1个或多个双键，例如乙烯基、丙烯基、(E)-2-甲基乙烯基或(Z)-2-甲基乙烯基。
术语“炔基”一般意指直链或支链、含有2-12个碳原子且含有2个或多个双键，例如乙炔基、丙炔基、2-丁炔基或2-戊炔基。
术语“烷氧基”一般意指通过氧原子键合的直链或支链烷基，其中术语“烷基”具有上述定义，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、戊氧基或其异构体。优选烷氧基含有1或2个碳原子(C1-2烷氧基)，例如甲氧基或乙氧基。
术语“烷硫基”一般意指通过硫原子键合的直链或支链烷基，其中术语“烷基”具有如上所述定义。
术语“环烷基”一般意指直链或支链、含有3-8个碳原子的饱和单环烃环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。优选环烷基含有5、6或7个碳原子(C5-7环烷基)，例如环戊基、环己基或环庚基。
术语“环烷基氧基”一般意指通过氧原子键合的直链或支链环烷基，其中术语“环烷基”具有如上所述的定义。
术语“环烷基硫基”一般意指通过硫原子键合的直链或支链环烷基，其中术语“环烷基”具有如上所述的定义。
术语“芳基”一般意指芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，其包含6-14个碳原子，特别是具有6个碳原子的环(例如苯环基或联苯环基)、具有9个碳原子的环(例如茚基)、具有10个碳原子的环(例如二氢化奈基或萘基)、具有13个碳原子的环(例如芴基)或具有14个碳原子的环(例如葱基)。优选芳基为含有1-4个碳原子“烷氧基”取代的苯环基。
术语“杂环基”一般意指含有饱和或部分饱和的单环或双环烃环，其含有5-8个碳原子且含有1-3个选自氧、硫或氮的含杂原子基团。例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、噻二唑基、恶唑基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基或吡喃基。优选杂环基为噻吩基、吡啶基或其含有1-4个碳原子(C1-4烷基)取代杂环基。
术语“杂芳基”一般意指苯环与杂环稠合在一起的化合物基团，例如喹啉基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并恶唑基、吲哚基或嘌呤基。
术语“杂环烷基”一般意指含有3-7个碳原子和1-3个氧、硫或氮杂原子所构成的杂环基团，例如哌啶基、羟基哌啶基、菲诺哌啶基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、四氢化吡咯基、四氢化呋喃基、四氢化噻吩基、吗啡林基或噻嗪基。优选杂环烷基为哌啶基、N-甲基哌嗪基或吗啡林基。
术语“单烷基胺基”一般意指胺基(NH2)的1个氢被“烷基”所取代，其中术语“烷基”具有如上所述的定义。例如甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、丁基胺基或其异构体。
术语“二烷基胺基”一般意指胺基(NH2)的2个氢被“烷基”所取代，其中术语“烷基”具有如上所述的定义。例如二甲基胺基、二乙基胺基、二丙基胺基、二丁基胺基或其异构体。优选二烷基胺基为二甲基胺基或二乙基胺基。
术语“杂原子”一般意指含有1个或多个氧、硫或氮原子。
术语“任选取代的”一般意指结构中的氢被所述取代基取代。除非另有说明，任选取代的基团可以在该基团每一个可取代的位置上具有取代基，或者在结构中的多于一个位置可以被取代。
本文使用的数值范围“C1-10”以及其所包含的亚范围一般意指具有限定数量的1-10个原子，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个原子；其中包含碳原子数量范围的“C1-10”以及其所包含的亚范围一般意指具有限定数量的1-10个碳原子基团，亦即包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子基团。
合适的取代基一般选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、硝基、氰基、羟基、C1-6二烷基胺基、哌啶基、N-甲基哌嗪基或吗啡林基。
实施本发明的基于酰腙配体类的有机硼化合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：本发明合成的一系列基于酰腙(acylhydrazone)配体类有机硼荧光化合物易于合成，并且显示出良好的热稳定性和AIE特性，作为生物荧光探针与商业化尼罗红探针相比，对细胞器脂滴具有高重叠效率的特异性标记，在生物荧光检测技术领域具有相当重要的意义与价值。
附图说明
图1是DMA-POABP在THF溶液中的归一化紫外-可见光吸收光谱和光致发光(PL)光谱(浓度：10μM，激发波长：415nm)；
图2是POABP-DMA在THF溶液中的归一化紫外-可见光吸收光谱和光致发光(PL)光谱(浓度：10μM，激发波长：415nm)；
图3是DMA-POABP在不同含水率(fw，vol％，体积％)的THF/水混合物中的PL谱图(浓度：10μM，激发波长：415nm)；
图4是DMA-POABP的PL峰强度(I/I0)与含水混合物的含水率(fw，体积％)之间关系图(浓度：10μM，激发波长：415nm)；
图5是POABP-DMA在不同含水率(fw，vol％，体积％)的THF/水混合物中的PL谱图(浓度：10μM，激发波长：415nm)；
图6是POABP-DMA的PL峰强度(I/I0)与含水混合物的含水率(fw，vol％，体积％)之间关系图(浓度：10μM，激发波长：415nm)；
图7是DMA-POABP晶体的分析中的晶体的晶包结构图；
图8是DMA-POABP晶体的分析中的单分子的晶体结构和原子标记图；
图9是DMA-POABP晶体的分析中的分子间的作用力图；
图10是DMA-POABP晶体的分析中的分子间的排列图；
图11是POABP-DMA晶体的分析中的晶体的晶包结构图；
图12是POABP-DMA晶体的分析中的单分子的晶体结构和原子标记图；
图13是POABP-DMA晶体的分析中的分子间的作用力图；
图14是POABP-DMA晶体的分析中的分子间的排列图；
图15是DMA-POABP在THF-d6溶液中经蓝光LED照射后的Z-E构型转换的核磁共振图；
图16是POABP-DMA在THF-d6溶液中经蓝光LED照射后的Z-E构型转换的核磁共振图；
图17是DMA-POABP和POABP-DMA的E构型相对于时间的生成速率对比图；
图18是共聚焦激光扫描显微镜检测HeLa细胞于DMA-POABP和尼罗红探针共染和的明场和暗场图；激发波长：405nm(DMA-POABP)和515nm(尼罗红)；发射滤光片：448-548nm(DMA-POABP)和570-700nm(尼罗红)；图像使用的比例尺为20μm；
图19是共聚焦激光扫描显微镜检测HeLa细胞于POABP-DMA和尼罗红探针共染和的明场和暗场图；激发波长：405nm(POABP-DMA)和515nm(尼罗红)；发射滤光片：450-530nm(POABP-DMA)和570-700nm(尼罗红)；图像使用的比例尺为20μm；
图20是DMA-POABP和尼罗红的重叠效率图；
图21是POABP-DMA和尼罗红的重叠效率图；
图22是用于计算DMA-POABP和尼罗红探针重叠效率的HeLa细胞标记位置的扫描图；
图23是用于计算POABP-DMA和尼罗红探针重叠效率的HeLa细胞标记位置的扫描图；
图24是使用不同浓度(0-10μM)DMA-POABP探针培育HeLa细胞的细胞活力的方块图；
图25是使用不同浓度(0-10μM)POABP-DMA探针培育HeLa细胞的细胞活力的方块图；
图26是DMA-POABP、POABP-DMA和尼罗红探针标记的HeLa细胞随辐射时间增加的PL变化图；激发波长：405nm(DMA-POABP和POABP-DMA)和515nm(尼罗红)；发射滤光片：448-548nm(DMA-POABP)、450-530nm(POABP-DMA)和570-700nm(尼罗红)；辐射时间：11秒/扫描；激光功率：0.3μW。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的基于酰腙配体类的有机硼化合物及其制备方法和应用作进一步说明：
本发明采用酰腙结构作为有机硼化合物的配体，开发易于合成且具有聚集诱导发光特性的有机硼化合物体系，作为生物荧光探针成功对细胞器脂滴进行特异性的标记技术，对目前市场上的生物荧光检测技术提供一类光稳性佳、特异性标记佳且生物兼容性佳的荧光探针，在生物荧光检测技术等领域具有重要的意义与价值。
下面通过具体实施例进行详细说明。
实施例1：产品的制备
(1)合成DMA-POABP
于装有冷凝管的100mL单口圆底瓶中，加入4-二甲胺基苯甲醛(4-dimethylaminobenzaldehyde，DMA-P-CHO；1.5g，10mmol)、苯甲酰肼(benzohydrazide，BHA；1.36g，10mmol)和乙醇(EtOH；20mL)溶剂，加热回流24小时。反应混合物冷却回到室温后，过滤并以冷的乙醇溶剂冲洗3次，得到白色的DMA-PAHP中间固态产物，经由真空干燥后，无需进一步纯化直接进行下一步反应。于装有冷凝管的100mL双口圆底瓶中，加入DMA-PAHP烯丙基三甲基硅烷(ATMS；2.05mL，12.9mmol)、三氟化硼乙醚(BF3OEt2；1.87mL，14.87mmol)和干燥的二氯乙烷(DCE；50mL)溶剂，加热回流超过两小时后，以硅胶板(TLC)片对反应进行监测；确认反应完全后，抽干溶剂，并通过柱层析法纯化得到黄色的DMA-POABP产品(2.4g)，收率为77％。1H NMR(400MHz,THF-d8),δ(ppm):8.45-8.43(m,2H),8.16(d,2H,J＝7.2Hz),7.86(s,1H),7.59-7.55(m,1H),7.51-7.49(m,2H),6.89-6.87(m,2H),3.16(s,6H).13C NMR(100MHz,THF-d8),δ(ppm):170.65,155.63,151.25,138.14,133.58,129.66,129.41,129.27,128.47,117.98,112.88,112.53,40.54,40.22.MS(MALDI-TOF):calculated forC16H16BF2N3O[M+H]+316.1354；found 316.1354.
Figure BDA0001663768510000121
(2)合成DMA-POAB-p-Py
于装有冷凝管的100mL单口圆底瓶中，加入4-二甲胺基苯甲醛(4-dimethylaminobenzaldehyde，DMA-P-CHO；1.5g，10mmol)、异烟肼(isoniazide，PyHA；1.38g，10mmol)和乙醇(EtOH；20mL)溶剂，加热回流24小时。反应混合物冷却回到室温后，过滤并以冷的乙醇溶剂冲洗3次，得到白色的DMA-PAHP中间固态产物，经由真空干燥后，无需进一步纯化直接进行下一步反应。于装有冷凝管的100mL双口圆底瓶中，加入DMA-PAHP烯丙基三甲基硅烷(ATMS；2.05mL，12.9mmol)、三氟化硼、乙醚(BF3OEt2；1.87mL，14.87mmol)和干燥的二氯乙烷(DCE；50mL)溶剂，加热回流超过两小时后，以TLC片对反应进行监测；确认反应完全后，抽干溶剂，并通过柱层析法纯化得到橘色的DMA-POAB-p-Py产品(0.7g)，收率为22％。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.80(m,2H),8.28(b,2H),8.00-7.99(m,2H),7.67(s,1H),6.78-6.76(m,2H),3.09(s,6H).
Figure BDA0001663768510000131
(3)合成POABP-DMA
于装有冷凝管的100mL单口圆底瓶中，加入苯甲醛(benzaldehyde，P-CHO；1.03mL，10mmol)、4-二甲胺基苯甲酰肼(4-dimethylaminobenzohydrazide，BHA-DMA；1.80g，10mmol)和乙醇(EtOH；20mL)溶剂，加热回流24小时。反应混合物冷却回到室温后，过滤并以冷的乙醇溶剂冲洗3次，得到白色的DMA-PAHP中间固态产物，经由真空干燥后，无需进一步纯化直接进行下一步反应。于装有冷凝管的100mL双口圆底瓶中，加入DMA-PAHP烯丙基三甲基硅烷(ATMS；2.05mL，12.9mmol)、三氟化硼乙醚(BF3OEt2；1.87mL，14.87mmol)和干燥的二氯乙烷(DCE；50mL)溶剂，加热回流超过两小时后，以TLC片对反应进行监测；确认反应完全后，抽干溶剂，并通过柱层析法纯化得到橘色的POABP-DMA产品(1.9g)，收率为62％。1H NMR(400MHz,THF-d8),δ(ppm):8.06(d,2H,J＝7.6Hz),8.05-8.02(m,3H),7.64-7.58(m,3H),6.80-6.78(m,2H),3.09(s,6H).13C NMR(100MHz,THF-d8),δ(ppm):174.34,155.35,148.68,135.04,134.68,131.76,131.43,130.05,114.29,112.20,40.27.MS(MALDI-TOF):calculated for C16H16BF2N3O[M]+315.1354；found 315.1364.
Figure BDA0001663768510000141
(4)合成DMAP2-OABP
于装有冷凝管的100mL单口圆底瓶中，加入米氏酮(Michler's ketone，DMAP2-CHO；2.7g，10mmol)、苯甲酰肼(benzohydrazide，BHA；1.36g，10mmol)和乙醇(EtOH；20mL)溶剂，加热回流24小时。反应混合物冷却回到室温后，过滤并以冷的乙醇溶剂冲洗3次，得到白色的DMA-PAHP中间固态产物，经由真空干燥后，无需进一步纯化直接进行下一步反应。于装有冷凝管的100mL双口圆底瓶中，加入DMA-PAHP烯丙基三甲基硅烷(ATMS；2.05mL，12.9mmol)、三氟化硼乙醚(BF3OEt2；1.87mL，14.87mmol)和干燥的二氯乙烷(DCE；50mL)溶剂，加热回流超过两小时后，以TLC片对反应进行监测；确认反应完全后，抽干溶剂，并通过柱层析法纯化得到深黃色的DMAP2-OABP产品(2.6g)，收率为60％。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.08(d,2H,J＝7.2Hz),7.67-7.64(m,2H),7.54-7.48(m,2H),7.44-7.40(t,1H,J＝7.4Hz),6.74-6.67(m,4H),3.11(s,6H),3.08(s,6H).MS(MALDI-TOF):calculated forC24H25BF2N4O[M]+434.2089；found 434.2082.
Figure BDA0001663768510000142
(5)其他实施例产品，例如POABP、MeO-POABP、DMA-POABP-F、DMA-POABP-CF3、POABP-OMe、F-POABP-DMA、CF3-POABP-DMA或MeOP2-OABP，合成步骤和条件同上述(1)～(4)。
实施例2：产品的光学和聚集诱导发光特性研究
以2个有机硼荧光产品(DMA-POABP和POABP-DMA)作为实施例进行说明，研究其光学性质和聚集诱导发光特性。其它产品同理，不再进行详细赘述。
(1)光学特性的研究
DMA-POABP和POABP-DMA在四氢呋喃(THF)溶液中的紫外-可见(UV-vis)吸收光谱和光致发光(PL)光谱分别如图1和2所示。两个产品在THF溶液的最大吸收波长皆位于415nm，但发射波长分别位于473和555nm，斯托克(Stokes)位移分别为58和140nm，主要原因是POABP-DMA拥有较大的基态和激发态间偶极矩(dipole moment)差，以及较佳的分子内电荷转移(ICT)效应所导致。两个产品的吸收波段与生物成像通常使用的405nm激发光源相当吻合，相当有利于作为生物荧光技术所需的荧光探针。
(2)聚集诱导发光特性的研究
利用不同体积比的水和THF溶液环境对两个产品进行聚集诱导发光(AIE)特性的研究，如图3-6所示，DMA-POABP分子在纯THF溶液中发光较弱，随着水的比率(fw)达到体积的90％，分子因聚集导致荧光强度大大增强，其相较于纯THF溶液的荧光强度增强将近28倍。相较下，POABP-DMA分子在纯THF溶液中发出黄色荧光，随着水的比率(fw)增加，荧光强度一开始先减弱，主要由于其较强的ICT效应所致；但当fw高于体积的80％后，荧光强度因AIE效应而增强。研究结果表示，两个产品皆展现了良好的AIE特性，对应用于生物成像的水环境而言，能展现良好的荧光成像效果。
(3)固态发光的研究
将两个产品通过THF和正己烷进行晶体培养，晶体结构如图7-14和表1所示，从晶体数据中观察到，(a)两个产品结构上的C和N双键皆以Z式构成，且分子构型极为共平面；(b)中心硼五元环的N→B键长分别为1.566和
Figure BDA0001663768510000161
属于一种特殊共价键形式的配位键，主要由硼原子提供空轨道，氮原子提供两个电子所构成的共价键，键长因此比一般共价键长还长一些；(c)五元环内的O-B键长分别为1.473和
Figure BDA0001663768510000162
属于一般正常的共价键长；(d)晶体单元分别以单斜晶系(monoclinic)和三斜晶系(triclinic)构成；(e)分子主要受分子间π…H、O…H或F…H的氢键限制了分子运动，减弱激发态分子的无辐射能量损失，利于增强固态或聚集态的发光特性；(f)分子间无明显的π-π堆积，以至于激发态分子不易因聚集而导致荧光猝灭(ACQ)。此数据说明了，两个有机硼产品虽然构型极为平面，但在固体或聚集型态展现独特发光特性的原因所在，此研究更证实此类产品适用于生物成像。
表1：DMA-POABP和POABP-DMA的晶体数据汇总
Figure BDA0001663768510000163
Figure BDA0001663768510000171
(4)Z和E构型转换的研究
利用核磁共振(NMR)分析两个产品在蓝光发光二极管(LED)照射下的Z、E构型转换，如图15和图16所示，纯Z构型的两个产品分别在3.14和3.07ppm出现氢原子的单峰，经由蓝光LED照射后，分别在3.16和3.09ppm出现E构型的氢原子单峰。将E构型氢原子峰的积分强度对时间作图，如图17所示，DMA-POABP分子的Z-E构型转换速率比POABP-DMA分子快了一倍，说明在THF溶剂下，DMA-POABP的双键转动较为容易，根据RIM机理，其激发态分子的能量易以无辐射方式释放能量，导致荧光强度减弱。针对此现象，本发明提出限制了激发态双键重整(ESDBR)效应为平面分子展现AIE特性的机理，激发态的平面分子于溶剂环境下，容易透过自由的双键转动来释放能量(即无辐射能量损失)，但在高黏度、固态或聚集态环境下，双键的转动被抑制，减弱了无辐射能量损失，使得分子以辐射方式释放能量(即荧光或磷光发射)，展现出较佳的固态或聚集态发光。该体系产品是一类特殊的RIM发光分子。
实施例3：产品在脂滴特异性标记的应用
(1)细胞培养
人类宫颈癌细胞(HeLa)由美国Type Culture Collection提供。HeLa细胞在含有10％热灭活的胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Thermo Scientific)的改性型培养基(MEM)培养基中培养，并且在37℃含有5％CO2的湿化孵化器中保持。在实验前，细胞预先培养至达到融合。HeLa细胞在增补10％FBS、青霉素和链霉素的MEM培养基中的盖玻片上生长。
(2)荧光探针染色和细胞成像
使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗细胞一次，细胞在1-20μM有机硼荧光探针的MEM培养基中再培养30分钟，接着，将荧光标记的细胞安装在标准的安装介质上，通过共聚焦激光扫描显微镜进行细胞成像。两个产品所选择的激发波长皆为405nm，发射长波通滤波器波长分别为448–548(DMA-POABP)和450–530(POABP-DMA)nm；商业化尼罗红的条件为515nm激发波长，570–700nm发射长波通滤波器波长。如图18和19所示，两个有机硼产品不仅能作为生物探针对脂滴细胞器进行特异性标记，而且相较于商业化尼罗红的脂滴标记，分别达到81％和91％的重叠覆盖率(图20-23)。
(3)细胞毒性研究
使用噻唑蓝(MTT)试验两个有机硼探针对HeLa细胞的细胞毒性。将HeLa细胞接种在96孔板、强度为5000细胞/mL和0-10μM有机硼荧光探针中，于37℃培育24小时后，将MTT溶液(5mg/mL于PBS溶液)加入每一个孔中。培育4小时后，加入二甲基亚砜(DMSO)溶液溶解紫色晶体,振荡15分钟后，使用Perkin-Elmer Victor酶标仪监测MTT在595nm处的吸亮度。通过经由有机硼探针培养的细胞与仅使用培养基培养的细胞的吸亮度来表达细胞活力。每个实验至少进行3次。如图24和25所示，细胞在高浓度(10μM)的DMA-POABP和POABP-DMA两个有机硼产品溶液中，依然有90％以上的高生物兼容性。
(4)光稳定性研究
荧光标记的细胞使用共聚焦激光扫描显微镜成像，所选定的条件同上述(2)荧光探针染色和细胞成像。如图26所示，相对于商业化尼罗红探针，本发明的DMA-POABP和POABP-DMA两个有机硼产品皆展现高的光稳定性，原因来自于本发明的有机硼荧光探针在高含水量环境能呈现良好的AIE特性所致。此外，本发明在材料制备上具有简易的优点，更能突显本发明的有机硼荧光探针具有相当大的竞争力。
本发明仅以HeLa细胞为实施例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围内。其中，包含对其他肿瘤细胞(如MCF-7细胞或MDA-MB-231细胞)或正常细胞(如COS-7细胞或MDCK-II细胞)的脂滴进行标记成像、对淡水或咸水类海藻的脂滴进行标记成像，或是采用酰腙配体类有机硼化合物包覆成纳米探针在生物学上的应用。此外，考虑到该类化合物良好的固态发光性质，可作为发光层，有望用于有机发光二极管装置。
本发明所包含的信息，在未脱离下述权利要求的精神和保护范围下，本发明各种偏离精确的描述，对于与本发明相关的本领域技术人员来说是显而易见的。本发明并不认为限制在所定义的程序、性质或组成的范围内，因为优选的实施例和其他描述只用于说明目前提供发明的特定方面。对于在化学、生物化学或相关领域的技术人员来说，实现本发明于各种修改的描述模式，都应属于本发明所附权利要求的保护范围内。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于酰腙配体类的有机硼化合物，其特征在于，所述有机硼化合物的结构式为式I所示的结构式：
Figure FDA0003460489360000011
其中，Ar1和Ar2分别各自独立地选自下述任一结构式的基团：
Figure FDA0003460489360000012
Ar3为H或者具有下述结构式的基团：
Figure FDA0003460489360000013
R1独立地选自H、CF3、氰基、卤素、C1-4烷氧基、N-甲基哌嗪基、吗啡林基或C1-4二烷基胺基；
所述式I不包括具有如下结构的有机硼化合物：
Figure FDA0003460489360000021
2.一种权利要求1所述的有机硼化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、酰腙配体的缩合反应：将式II-1所示的结构式的化合物和式III-1所示的酰肼化合物置于乙醇溶剂中，加热回流得到式II-2所示的结构式的中间产物；
Figure FDA0003460489360000022
S2、硼化反应：将所述中间产物、烯丙基三甲基硅烷和三氟化硼乙醚置于干燥的二氯乙烷溶剂和氮气环境中，回流得到式I所示的结构式的最终产品基于酰腙配体类的有机硼化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1反应得到的混合物冷却至室温后，过滤得到的固体，再利用有机溶剂洗涤，得到中间产物。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2反应得到的混合物冷却到室温，经由减压浓缩得到粗产品，再加入冷的有机溶剂洗涤后，过滤得到有机硼化合物。
5.权利要求1所述的有机硼化合物在制备用于细胞器脂滴特异性标记的生物荧光探针中的应用。
6.权利要求1所述的有机硼化合物在制备用于肿瘤细胞、正常细胞、淡水藻和咸水类海藻的脂滴标记的生物荧光探针、发光二极管、光电放大器、光信息存储器、液晶显示器、光波导材料、生物传感器以及逻辑门、无损读出的生物探针中的应用。
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