CN110494954A - 脂质和生育酚的综合和定量分析 - Google Patents

脂质和生育酚的综合和定量分析 Download PDF

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Abstract

本文描述了通过质谱法测定样品中来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的存在、不存在或量的方法。一种或多种脂质类选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇酯(CE)、胆固醇(CH)及其组合。该方法包括a)在适合于从一种或多种脂质种类中的每一种产生一种或多种可通过质谱法检测的离子的条件下使样品经受电离源；b)通过质谱法测量来自一种或多种脂质种类中的每一种的一种或多种离子的量；和c)使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种脂质种类中的每一种的存在、不存在或量。

Description

脂质和生育酚的综合和定量分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月31日提交的美国临时专利申请No.62/479,534、2017年5月31日提交的美国临时专利申请No.62/512,776、2017年9月14日提交的美国临时专利申请No.62/558,415、2017年11月30日提交的美国临时专利申请No.62/592,639的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景
提供以下用于描述本发明背景的信息以帮助理解本发明，并且不承认其构成或描述本发明的现有技术。
皮脂是由脂质细胞(皮脂腺的特化细胞)产生的富含脂质的分泌物。在人体中，皮脂覆盖皮肤表面，并有助于抗菌防御、保水、光保护和伤口愈合。皮脂脂质组(lipidome)由脂质的复杂混合物组成。皮脂脂质组合物在物种之间不同，可能是由于各种功能要求。人体皮脂脂质不仅包括游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CH)、胆固醇基/胆固醇酯(CE)和二酰基甘油酯和三酰基甘油(DAG和TAG)，还包括皮脂独有的蜡酯(WE)和角鲨烯(SQ)。除了这些脂质外，皮脂还含有脂溶性分子，如生育酚。皮脂表征已经涉及薄层色谱以分离脂质类别，然后在不鉴定个体脂质种类的情况下测定每个类别中的大部分脂肪酸组成(Stewart等人,J InvestDermatol.1986；87(6):733-6)。最近，结合液相色谱(LC)和质谱(MS)的方法已被用于表征皮脂脂质(Camera等人,J Lipid Res.2010；51(11)；3377-88)，但这些方法仅报告了总和组成并不鉴定脂质种类的脂肪酸组成。此外，这些方法仅提供相对定量，并且皮脂脂质组的脂肪酸组成不能跨脂质类别进行定量。此外，该方法需要预先分离或纯化步骤。在这里，我们提出了同时鉴定皮脂中主要脂质种类的脂肪酸组成和测量这些分子和脂溶性生育酚的绝对浓度的方法。
本文描述了用于检测和定量皮脂样品中的脂质和生育酚的方法和测定。
概述
在本发明的第一方面，一种通过质谱法测定样品中来自选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇酯(CE)、胆固醇(CH)及其组合的一种或多种脂质类别的一种或多种脂质的存在、不存在或量的方法包括多个步骤。这些步骤包括在适于从一种或多种脂质种类中的每一种产生一种或多种可通过质谱法检测的离子的条件下使样品经受电离源；通过质谱法测量来自一种或多种脂质种类中的每一种的一种或多种离子的量；和使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种脂质种类中的每一种的存在、不存在或量。
在本发明的第二方面，通过质谱法测定样品中一种或多种脂质种类和一种或多种生育酚的存在、不存在或量的方法包括多个步骤。所述一种或多种脂质种类来自一种或多种脂质类别，其选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇酯(CE)、胆固醇(CH)、生育酚(TOC)及其组合。一种或多种生育酚选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚及其组合。所述步骤包括在适于从一种或多种脂质种类和一种或多种生育酚中的每一种产生一种或多种可通过质谱法检测的离子的条件下使样品经受电离源；通过质谱法测量来自一种或多种脂质种类和一种或多种生育酚中的每一种的一种或多种离子的量；和使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种脂质种类和一种或多种生育酚中的每一种的存在、不存在或量。
在第一和第二方面的特征中，一种或多种脂质类别包括蜡酯(WE)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、胆固醇酯(CE)或其组合，并且所述方法还包括测定一种或多种脂质种类的一种或多种脂肪酸的碳和双键的数量。
在另一个特征中，样品是皮脂样品或皮脂细胞样品。在又一个特征中，来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的存在、不存在或量是从单次注射确定的。在进一步的特征中，来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类包括蜡酯，并且该方法还包括测定蜡酯的脂肪醇组成。在更进一步的特征中，来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类包括二酰基甘油，并且该方法还包括测定二酰基甘油的两种脂肪酸的碳和双键的数量。
在另外的特征中，测定来自至少两种脂质类别的一种或多种脂质种类的量。关于该特征，至少两种脂质类别包括角鲨烯和蜡酯。进一步关于该特征，至少两种脂质类别包括角鲨烯和二酰基甘油。更进一步关于该特征，至少两种脂质类别包括角鲨烯和三酰基甘油、角鲨烯和游离脂肪酸、角鲨烯和胆固醇酯、角鲨烯和胆固醇、蜡酯和三酰基甘油、蜡酯和二酰基甘油、蜡酯和游离脂肪酸、蜡酯和胆固醇酯、或蜡酯和胆固醇。
在进一步的特征中，测定来自三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种脂质类别的一种或多种脂质种类的量。在另一个特征中，测定来自脂质类别CH、CE、WE、SQ、TAG、DAG和FFA的每一种的一种或多种脂质种类的量。在又一个特征中，测定选自CH、CE、WE、SQ、TAG、DAG和FFA的一种或多种脂质种类的量，和测定选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的一种或多种TOC种类的量。在更进一步的特征中，测定20种或更多种脂质种类的量。
在另一个特征中，使用一种或多种内标来测定样品中一种或多种脂质种类的量。关于该特征，一种或多种内标选自一种或多种脂质类别，其选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油酯(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇酯(CE)及其组合。进一步关于该特征，一种或多种内标选自脂质类别蜡酯(WE)，并且内标选自WE(FA19:1/OH8:0)和WE(FA17:1/OH8:0)。另外，关于该特征，一种或多种内标中的至少一种是同位素标记的。
在另一个特征中，样品是皮脂样品并使用皮脂带、拭子或滤纸收集。在进一步的特征中，该方法还包括测定胆固醇的量。在另一个特征中，该方法还包括测定样品中一种或多种脂肪酸异构体的存在、不存在或量。在又一个特征中，将样品直接注入质谱仪而无需预先分离或纯化步骤。
在本发明的另一个方面，试剂盒包含针对选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油酯(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CH)、胆固醇酯(CE)及其组合的一种或多种脂质类别中的每一种的一种或多种内标，以及包装材料和使用该试剂盒的说明书。在该方面的特征中，一种或多种内标中的至少一种是同位素标记的。
在本发明的进一步的方面，试剂盒包含针对选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油酯(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CH)、胆固醇酯(CE)及其组合的一种或多种脂质类别中的每一种和针对选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚及其组合的一种或多种生育酚(TOC)中的每一种的一种或多种内标，以及包装材料和使用该试剂盒的说明书。在该方面的特征中，一种或多种内标中的至少一种是同位素标记的。
在本发明的另外的方面，一种通过质谱法测定样品中选自角鲨烯(SQ)、游离脂肪酸(FFA)、复合脂质及其组合的一种或多种脂质种类的存在、不存在或量的方法包括多个步骤。这些步骤包括在适于从一种或多种脂质种类中的每一种产生一种或多种可通过质谱法检测的离子的条件下使样品经受电离源；通过质谱法测量来自一种或多种脂质种类中的每一种的一种或多种离子的量；和使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种脂质种类中的每一种的量。
在该方面的一个特征中，一种或多种复合脂质选自WE、TAG、DAG和CE。在进一步的特征中，该方法还包括测定一种或多种复合脂质类别的一种或多种脂肪酸的碳和双键的数量。在另外的特征中，样品是皮脂样品或皮脂细胞样品。当样品是皮脂样品时，可以使用皮脂带、拭子或滤纸收集。在另一个特征中，来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的量是从单次注射测定的。在更进一步的特征中，该方法还包括测定胆固醇的量。在另一个特征中，样品直接注入质谱仪而无需预先分离或纯化步骤。
在本发明的另外的方面，一种检测样品中一种或多种脂质种类的存在、不存在或量的方法，其中所述脂质种类分类在由SQ、WE、DAG、TAG、FFA、胆固醇和CE组成的脂质类别中，包括在没有预先分离或纯化步骤的情况下将单次注射的样品提取物注入质谱仪中；和使用质谱仪测定样品中一种或多种脂质种类的身份，以及一种或多种脂质种类的浓度。
在本发明进一步的方面，一种检测样品中一种或多种脂质种类和一种或多种TOC的存在、不存在或量的方法，其中所述脂质种类选自由SQ、WE、DAG、TAG、FFA、胆固醇和CE组成的脂质类别，并且一种或多种TOC选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚，包括在没有预先分离或纯化步骤的情况下将单次注射的样品提取物注入质谱仪中，和使用质谱仪测定样品中一种或多种脂质种类的身份、一种或多种TOC的身份、一种或多种脂质种类的浓度以及一种或多种TOC的浓度。
在该方面的一个特征中，使用GC-FAME(气相色谱-脂肪酸甲酯)分析测定样品中一种或多种脂肪酸异构体的存在、不存在或量。
附图简要说明
图1是显示来自所示脂质类别内的脂质种类的线性研究的R2值的图表。
图2是显示与标准分析方法(FAME-GC/MS分析)相比用实施例1中描述的方法分析的皮脂样品的脂肪酸组成百分比(跨所有脂质类别)的图表。
图3是显示使用本文所述方法在皮脂样品中测量的298种WE脂质种类的浓度的图。种类显示在X轴上，浓度(以nmol/带表示)显示在Y轴上。
图4是显示使用本文所述方法在皮脂样品中测量的575种TAG脂质种类的浓度的图。种类显示在X轴上，浓度(以nmol/带表示)显示在Y轴上。
图5是显示使用本文所述方法在皮脂样品中测量的47种DAG脂质种类的浓度矩阵的表。示出了两种脂肪酸的每种理论组合，其中在列中列出一种脂肪酸，在行中列出第二种脂肪酸。在样品中测量的脂质种类的量用相应方框中DAG脂质种类的浓度(以nmol/带表示)表示。
详述
描述了通过质谱法测量样品中来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的存在、不存在或量的方法。在一些实施方案中，脂质种类可选自由角鲨烯(SQ)、蜡酯(WE)、游离脂肪酸(FFA)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、胆固醇酯(CE)、胆固醇(CH)及其组合组成的脂质类别。描述了用于使用单次注射方法定量样品中来自一种或多种脂质类别的脂质种类的质谱方法。另外，所述方法能够用于测定一种或多种脂质种类的一种或多种组成性脂肪酸(即脂肪酸组合物)中的碳和双键的数目。该方法可以在没有预先分离或纯化步骤的情况下进行。在一个实例中，可以在没有色谱步骤的情况下进行所述方法。
在其他实施方案中，描述了用于通过质谱法测量样品中的来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类和一种或多种生育酚(TOC)的存在、不存在或量的方法，所述脂质类别选自由角鲨烯(SQ)、蜡酯(WE)、游离脂肪酸(FFA)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、胆固醇酯(CE)、胆固醇(CH)组成的脂质类别。生育酚可选自α-生育酚、β\γ-生育酚、δ-生育酚及其组合。
所述方法能够同时定量和分辨皮脂的主要脂质类别的分子组成。如下面将更全面地描述的，从健康志愿者收集的皮脂样品经受有机溶剂提取，然后自动流动注射到以多反应监测(MRM)模式操作的质谱仪(在本文中称为流动注射分析-质谱法或FIA-MS)中。从大于2,500种分子种类的广泛组合列表开始，鉴定出约1,000种特定的脂质种类。鉴定的种类可重复地占每种脂质类别中总信号的绝大多数。此外，每个类别包括至少一种内标。验证了测定的分析重现性、回收率和线性度。总之，这些优化的高通量方法为皮脂的脂质组学组成提供了前所未有的洞察力。
使用所述方法，通过单独的质谱分析能够测定皮脂样品中的来自多种脂质类别(包括角鲨烯和蜡酯，以及二酰基甘油、三酰基甘油、胆固醇酯、胆固醇、游离脂肪酸)的超过2,500种脂质种类和一种或多种脂溶性生育酚或总生育酚，而无需使用预先的纯化步骤，例如，无需色谱分离。在单次注射中和在不存在色谱或纯化的情况下测量多种脂质分子和总生育酚或各种组合的一种或多种生育酚的能力减少了获得分析结果所需的时间并且在实验室一次性用品(如有机溶剂、试管、移液器吸头、试剂)、实验室仪器和人力资源方面使用较少的资源。这些改进通过降低测定成本和增加样品分析的仪器和实验室能力来节省成本。
所述方法可以与GC-FAME分析组合使用，GC-FAME分析可以区分脂肪酸的异构种类，例如相同脂肪酸的直链和支链异构体。使用GC-FAME检测的脂肪酸使用校准曲线定量。在GC-FAME分析之前，脂质被分解，因此该测定不测量个体复合脂质种类或显示每种脂肪酸对每种脂质类别的组成有多大贡献。相反，GC-FAME分析报告了皮脂的总脂肪酸组成。当一起使用时，FIA-MS和GC-FAME测定提供了实现对皮脂脂质组进行综合表征的补充信息。
在进一步详细描述本发明之前，定义了以下术语。
定义：
“脂质”或“脂质分子”是指不溶于水或其他极性溶剂但可溶于非极性溶剂(例如醚)的有机小分子。脂质是具有生物功能(包括细胞信号传导、能量储存和提供细胞膜的结构组分)的结构上多样的分子。脂质的非限制性实例包括角鲨烯(SQ)、脂肪酸(FA)、蜡酯(WE)、胆固醇(CH)、胆固醇酯(CE)、三酰基甘油(TAG)和二酰基甘油(DAG)。一些脂质由单一结构组成(即，仅由一种结构组分组成)，并且在本文中称为“简单脂质”。所谓的简单脂质的非限制性实例是SQ和CH。一些脂质由多种结构成分组成(包含一种或多种脂肪酸)，并且在本文中称为“复合脂质”(CL)。DAG、TAG、CE和WE是复合脂质的非限制性实例。如本文所用，“脂质种类”是指个体脂质分子，其被定义为化学式的水平(例如，SQ、CH、FFA(16:0))，或者，对于复合脂质(CL)(其由一种或多种脂肪酸组成或是脂肪酸的组合)，其被定义为识别至少一种组成性脂肪酸中的碳和双键的数目(例如，WE(FA19:1/OH8:0)、DAG(16:0/16:0)、DAG(18:0/18:4)、TAG(39:0-FA12:0)等)。
如本文所用的“脂质类别”是指具有结构相似性并因此归为一个类别的脂质分子。如本文所用，脂质类别的非限制性实例包括角鲨烯(SQ)、蜡酯(WE)、胆固醇(CH)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇/胆固醇酯(CE)，三酰基甘油(TAG)和二酰基甘油(DAG)。一些类别只包含单一脂质种类。例如，角鲨烯(SQ)是SQ类别中的单一脂质种类。其他类别包括多种脂质种类。例如，游离脂肪酸类别(FFA)包括多种脂质种类(例如FFA(14:0)、FFA(16:0)、FFA(16:1)和FFA(18:0))。其他脂质类别包括包含复合脂质的多种脂质种类。对于样品，可以通过将含有该脂肪酸的每种复合脂质的浓度相加来测定复合脂质(CL)的一种或多种类别中的每种脂肪酸的浓度。该值被称为“CL脂肪酸浓度”。另外，可以测定每种脂肪酸在复合脂质的一种或多种类别中的贡献百分比。该值被称为“CL脂肪酸组成”。
“脂质组”是指细胞、组织、生物流体或生物体内的完整脂质谱。脂质谱由多种不同结构的脂质类别的脂质组成。如本文所用，“皮脂脂质组”是指存在于皮脂或皮脂样品中的多种脂质类别的脂质。
术语“色谱法”是指物理分离方法，其中待分离的组分(即化学组分)分布在两相之间，其中一相是固定的(固定相)而另一相(流动相)朝着明确的方向移动。流动相可以是气体(“气相色谱”，“GC”)或液体(“液相色谱”，“LC”；“薄层色谱”，“TLC”)。
术语“质谱法”(MS)是指用于测量和分析分子的技术，其涉及电离或电离并碎片化靶分子，然后基于它们的质/荷比分析离子以产生用作“分子指纹”的质谱。有几种常用的方法来测定离子的质荷比，一些测量离子轨迹与电磁波的相互作用，另一些测量离子行进给定距离所花费的时间，或两者的组合。可以针对数据库搜索来自这些片段质量测量的数据以获得靶分子的鉴定。
术语“以负模式操作”或“以负电离模式操作”是指那些产生和检测负离子的质谱法。术语“以正模式操作”或“以正电离模式操作”是指那些产生和检测正离子的质谱方法。
术语“质量分析器”是指质谱仪中通过质荷比(“m/z”)来分离离子混合物的装置。
术语“m/z”是指通过将离子的质量数除以其电荷数而形成的无量纲量。它一直被称为“质荷”比。
如本文所用，术语“源”或“电离源”是指质谱仪中使待分析的样品电离的装置。电离源的实例包括电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰离子化检测器(FID)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)等。
如本文所用，术语“检测器”是指质谱仪中检测离子的装置。
术语“离子”是指包含电荷的任何物体，其可以例如通过向物体添加电子或从物体移除电子来形成。
术语“质谱”是指由质谱仪产生的数据图，通常包含x轴上的m/z值和y轴上的强度值。
术语“串联MS”是指涉及MS选择的多个阶段的操作，其中在阶段之间发生碎片化。在第一MS阶段，在源中形成离子。选择特定质荷比的离子(各自代表一种(并且可能多于一种)化学成分)，并产生碎片离子。然后分离所得离子并在质谱的第二阶段中检测。第一MS阶段中感兴趣的离子对应于“母”离子或前体离子，而在第二MS阶段期间产生的离子对应于母离子的子成分，并且在本文中称为“子”离子或“产物”离子。
因此，串联MS允许产生表示复杂混合物中化学成分的亲子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此的关系，其中子离子代表母离子的子组分。例如，可以对子离子重复串联MS以测定“孙子”离子。因此，串联MS不限于两级碎片化，而是一般用于指多级MS，也称为“MSn”。术语“MS/MS”是“MS2”的同义词。为简单起见，术语“子离子”在下文中是指由二级或更高级(即，不是第一)MS产生的任何离子。
一种或多种脂质分子的“量”意指样品中测量的脂质分子的化学或质量浓度。例如，量或浓度可表示为摩尔浓度、质量分数、摩尔分数、摩尔浓度、百分比。
“样品”或“生物样品”意指从受试者分离的生物材料。生物样品可含有适合于检测所需生物标志物的任何生物材料，并且可包含来自受试者的细胞和/或非细胞材料。样品可以从任何合适的生物流体或组织(例如皮脂、细胞(例如，皮脂细胞)、血液、血浆(plasma)、血清(serum)、尿液、脑脊髓液(CSF)或组织)中分离。
“受试者”意指任何动物，但优选是哺乳动物，例如人、猴、小鼠、兔或大鼠。
I.样品制备和质量控制(QC)
通过将脂质与可能存在于样品中的其他分子(例如，蛋白质、核酸、其他小分子代谢物)分开来制备样品提取物。在一个实例中，样品是皮脂样品，并且使用皮脂带(例如，sebutape)、拭子(例如棉签)或滤纸收集样品。在另一个实例中，样品是皮脂细胞。可以使用本领域普通技术人员已知的方法从样品中提取脂质分子，例如，通过使用甲醇。样品中的一些或所有脂质分子可以与蛋白质结合。在MS分析之前，可以使用各种方法来破坏脂质分子和蛋白质之间的相互作用。例如，可以从样品中提取脂质分子以产生液体提取物，同时可以沉淀存在的蛋白质。可以使用例如甲醇或乙酸乙酯的溶液沉淀蛋白质。在示例性方法中，为了沉淀样品中的蛋白质，向样品中加入甲醇或乙酸乙酯溶液，然后可以将混合物在离心机中旋转或离心过滤以分离含有提取的脂质分子的液体上清液与沉淀的蛋白质。
在其他实施方案中，脂质分子可以从蛋白质释放而不沉淀蛋白质。例如，可以将甲酸溶液添加到样品中以破坏蛋白质和脂质分子之间的相互作用。或者，可以向样品中加入乙酸铵、硫酸铵、甲酸在乙醇中的溶液或甲酸在甲醇中的溶液，以破坏蛋白质和脂质分子之间的离子相互作用而不沉淀蛋白质。
在一些实施方案中，可以将样品提取物直接注射到质谱仪中，而无需事先使用色谱法(例如液相色谱法、气相色谱法或薄层色谱法)来纯化或富集脂质分子的量。
在一些实施方案中，可以将提取的样品分开，使得一部分用于FIA-MS分析，另一部分用于GC-FAME分析。
为了评估例如检测和定量脂质分子的方法的精确度、准确度、校准范围或分析灵敏度，可以使用质量控制(QC)样品。对这些QC样品进行与实验样品相同的提取方法。
II.质谱和定量
可以通过质谱法检测来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类。使用质谱仪进行质谱分析，质谱仪包括用于电离样品并产生带电分子用于进一步分析的离子源。样品的电离可以通过例如电喷雾电离(ESI)进行。其他离子源可包括例如大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰离子化检测器(FID)或基质辅助激光解吸电离(MALDI)。可以基于许多考虑来确定电离方法的选择。示例性考虑因素包括待测量的脂质分子、样品类型、检测器类型和正或负模式的选择。
在样品被电离后，可以分析带正电或带负电的离子以确定质荷比。用于确定质荷比的示例性合适分析仪包括四极分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用例如选择模式或扫描模式来检测离子。示例性扫描模式包括多反应监测(MRM)和选择反应监测(SRM)。
可以将样品提取物直接注入质谱仪的电离源中。可以以约5μl/min至约10μl/min的流速注入样品。运行时间可小于7分钟，样品注射之间的总时间可小于14分钟。
来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类和一种或多种脂溶性生育酚可以以正或负模式电离以产生一种或多种离子。例如，来自角鲨烯、蜡酯、二酰基甘油、三酰基甘油和胆固醇酯的脂质类别的脂质种类和一种或多种生育酚可以以正模式电离。在另一个实例中，来自游离脂肪酸脂质类别的脂质种类可以以负模式电离。可以在单次注射的样品提取物中测量以正模式电离的脂质种类和TOC以及以负模式电离的脂质种类。
在一个实例中，质谱法可以是串联MS，并且可以例如使用AB Sciex QTrap 5500串联质谱仪进行。串联MS允许产生表示复杂混合物中化学成分的亲子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此的关系，其中子离子代表母离子的子成分。
可以针对给定方法和/或针对所使用的特定质谱仪优化质谱仪仪器设置。仪器可以使用各种气体，例如氮气、氦气、氩气或零空气。在一个示例中，质谱仪可以以正电离模式操作。离子喷涂电压设置范围可为约0.5kV至约5.0kV；在一个实施方案中，电压可以设置为4.1kV。源温度可以在约100℃至约600℃的范围内；在一个实施方案中，源温度可以设置在250℃。帘气的范围可为约10至约55psi；在一个实施方案中，帘气设置在17psi。喷雾器和去溶剂化气体流速可以为约0至约90psi。在一个实施方案中，喷雾器气体可以设置在17.0psi，和去溶剂化气体可以设置在25.0psi。碰撞激活解离(CAD)气体设置范围可以从高到低；在一个实施方案中，CAD气体设置在中等。去聚集电位可以在约15V至约170V的范围内。碰撞能量(CE)可以在约10eV至约100eV的范围内。入口电位(EP)设置可以在约5V至约30V的范围内。碰撞室出口电位(CXP)设置可以在约8V至约16V的范围内。
在另一个实例中，仪器可以以负电离模式操作。离子喷涂电压设置可以在约-0.5kV至约-5.5kV的范围内；在一个实施方案中，电压可以设置在-2.5kV。源温度可以在约100℃至约600℃的范围内；在一个实施方案中，源温度可以设置在250℃。帘气的范围可为约10至约55psi；在一个实施方案中，帘气可设置在17.0psi。喷雾器和去溶剂化气体的流速可以为约0至约90psi。在一个实施方案中，喷雾器气体可以设置在17.0psi，去溶剂化气体可以设置在25.0psi。CAD气体的范围可以从低到高。在一个示例中，CAD可以例如设置在介质上。去聚集电位可以在约-30V至约-10V的范围内。碰撞能量(CE)可以在约-30eV至约-5eV的范围内。入口电位(EP)设置可以在约-30V至约-5V的范围内。碰撞室出口电位(CXP)设置可以在约-20V至约-8V的范围内。
在一个实例中，MS可以是准确质量MS。例如，准确质量质谱可以使用四极飞行时间(Q-TOF)分析仪。在示例性实施方案中，准确质量MS可以是准确质量串联MS。
质谱仪通常向用户提供离子扫描(即，在给定的时间点范围内具有特定质量/电荷的每种离子的相对丰度)。质谱数据可以通过许多方法与原始样品中的脂质分子或TOC分子的量相关。在一个实例中，可以使用内标(IS)。可以将内标添加到测试样品和质量控制样品中以定量个体TOC或脂质种类。针对待测量的每种脂质类别可以使用至少一种内标。样品中TOC或脂质分子离子强度与内标离子强度的比率以及内标的已知浓度可用于定量。来自一种或多种TOC和选自TAG、DAG、FFA、SQ、WE、CE和CH的一种或多种脂质类别的一种或多种内标可用于定量。在一些实施方案中，内标可以使用例如氘(2H，表示为“d”)、13C或15N同位素进行同位素标记。内标的任何原子或任何数量的原子可以用同位素标记。在一些实施方案中，所有IS可以是同位素标记的。在一些实施方案中，没有IS是同位素标记的。在其他实施方案中，可以使用同位素标记的IS和未标记的IS的组合。在一个实例中，内标TAG(16:0-d9/16:0/18:1)、TAG(16:0-d9/18:0/18:1)、TAG(16:0-d9/18:1/18:1)、TAG(16:0-d9/18:2/18:1)、TAG(16:0-d9/18:3/18:1)、TAG(16:0-d9/20:3/18:1)、TAG(16:0-d9/20:4/18:1)和/或TAG(16:0-d9/22:6/18:1)可用于定量三酰基甘油脂质种类；内标DAG(16:0-d9/16:0)、DAG(16:0-d9/18:0)、DAG(16:0-d9/18:1)、DAG(16:0-d9/18:2)、DAG(16:0-d9/18:3)、DAG(16:0-d9/20:4)、DAG(16:0-d9/20:5)和/或DAG(16:0-d9/22:6)可用于定量二酰基甘油脂质种类；内标FFA(16:0)-d9、FFA(18:1)-d17和/或FFA(17:1)可用于定量游离脂肪酸；内标SQ-d6可用于定量SQ；内标WE(FA19:1/OH8:0)、WE(FA17:1/OH8:0)、WE(FA16:0-d9/OH16:0d37)和/或WE(FA16:1/OH18:0-d37)可用于定量WE脂质种类；内标CE(16:0)-d7、CE(16:1)-d7、CE(18:1)-d7、CE(18:2)-d7、CE(20:3)-d7、CE(20:4)-d7、CE(20:5)-d7和/或CE(22:6)-d7可用于定量胆固醇酯脂质种类；内标胆固醇-d7可用于定量胆固醇；和/或内标α-生育酚-d6、α-生育酚-13C6、α-生育酚-13C3、α-生育酚-13C9可用于定量生育酚。
校准标准品也可用于定量。校准标准品用于产生标准曲线(校准曲线)，使得给定离子的相对丰度可以转换成分析物(例如TOC或脂质分子)的绝对量。内标可以添加到校准标准品中。在另一个实例中，校准标准品可以是外标，并且可以基于从那些标准品产生的离子产生标准曲线，以计算一种或多种TOC或脂质分子的量。在另一个实例中，外标可以是未标记的TOC或脂质分子。
可以将分析数据发送到计算机并使用计算机软件进行处理。在一个实例中，可以基于靶化合物的信号强度与已知浓度的指定内标的信号强度的比率来定量每种个体TOC或脂质种类。总TOC浓度可以从样品中检测到的每个TOC的总和计算。脂质种类组合物可以通过计算每种脂质类别中个体脂质种类的比例来确定。脂质类别浓度可以从脂质类别中所有脂质种类的总和计算，并且脂质类别组成可以通过计算样品中脂质类别的比例来确定。脂肪酸浓度可以从含有特定脂肪酸的脂质类别中的所有脂质种类的总和计算，并且脂肪酸组成可以通过计算每种脂质类别中个体脂肪酸的比例来确定。
III.试剂盒
本文描述了用于测定一种或多种TOC和/或来自选自WE、SQ、TAG、DAG、FFA、CE、CH及其组合的一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的试剂盒。例如，试剂盒可包含包装材料、一种或多种对照样品、样品收集容器以及经测量的量的一种或多种内标，其量足以进行一次或多次测定。单独包装中的其他试剂盒组分可包括缓冲液和用于检测和/或定量目标样品中的脂质分子其他试剂。试剂盒还可以包括用于使用试剂测量一种或多种脂质种类的以有形形式记录的说明书(例如，在纸上，例如说明书小册子或电子介质)。
在其他实施方案中，本文描述了用于测定来自一种或多种选自WE、SQ、TAG、DAG、FFA、CE、CH及其组合的脂质类别的一种或多种脂质种类和一种或多种选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的TOC的试剂盒。
实施例
试剂
从JT Baker获得HPLC级(99.9％)甲醇；从Honeywell Burdick&Jackson获得HPLC级(99.9％)二氯甲烷；乙酸铵(BioUltra≥99.0％)。TAG(16:0-d9/16:0/18:1)、TAG(16:0-d9/18:0/18:1)、TAG(16:0-d9/18:1/18:1)、TAG(16:0-d9/18:2/18:1)、TAG(16:0-d9/18:3/18:1)、TAG(16:0-d9/20:3/18:1)、TAG(16:0-d9/20:4/18:1)、TAG(16:0-d9/22:6/18:1)、CE(16:0)-d7、CE(16:1)-d7、CE(18:1)-d7、CE(18:2)-d7、CE(20:3)-d7、CE(20:4)-d7、CE(20:5)-d7和CE(22:6)-d7由Avanti Polar Lipids或Echelon Biosciences合成；DAG(16:0-d9/16:0)、DAG(16:0-d9/18:0)、DAG(16:0-d9/18:1)、DAG(16:0-d9/18:2)、DAG(16:0-d9/18:3)、DAG(16:0-d9/20:4)、DAG(16:0-d9/20:5)、DAG(16:0-d9/22:6)由Avanti Polar Lipids合成；FFA(16:0)-d9、FFA(17:1)获自Avanti Polar Lipids；SQ-d6)获自Toronto ResearchChemicals，和α-生育酚-d6获自Santa Cruz Biotechnology。WE(FA19:1/OH8:0)在内部合成。
GC-FAME分析
使用GC-FAME测定表1中所示的32种脂肪酸的甲酯的总脂肪酸含量(以nmol/带计)。提供32种脂肪酸的样品，并将同位素标记的内标加入每种样品中。将样品在氮气流下蒸发至干燥。将干燥的脂质提取物用甲醇/硫酸在90℃下甲基化1小时，从而形成游离脂肪酸的相应甲酯和共轭脂肪酸。将反应混合物用碳酸钾中和并用己烷萃取。取出等份的己烷层并注入到配备有DB-225柱(Agilent Technologies，CA)的7890A/5975C GC/MS系统(Agilent Technologies，CA)上，其中使用氢气作为载气。使用电子电离以单离子监测(SIM)正模式进行质谱分析。使用由强化校准标准品产生的线性或二次回归分析进行定量。
表1.使用GC-FAME测量的脂肪酸浓度
实施例1：用于皮脂脂质和TOC定量测定的质谱法
A.样品制备
使用皮脂带从志愿受试者收集皮脂样品。样品制备在玻璃样品管中进行。用甲醇提取脂质分子。加入3ml甲醇后，将皮脂带样品涡旋，然后在室温下孵育10分钟。涡旋样品后，取出等分试样用于任选的FAME-GC/MS分析，并从每个研究样品中取出另一份等分试样并合并以形成用于质量控制的单个合并样品。向每个样品管中加入75μL含有适当内标的二氯甲烷(DCM)/甲醇(50/50)的工作内标(WIS)溶液。WIS溶液包含针对每种脂质类别的一种或多种内标和针对TOC的一种内标。内标列于表2中。通过添加75μL不含内标的DCM/甲醇(50/50)提取空白样品。将样品涡旋，并从管中取出皮脂带。将样品干燥，然后在300μL DCM/甲醇(90/10)+10mM乙酸铵中重构。将样品涡旋、离心过滤，并转移至小瓶中用于质谱分析。每种脂质类别和TOC的WIS浓度显示在表2中。每种内标的百分比是指重量百分比。所有WIS溶液均在DCM/甲醇(50/50)的溶液中制备。
表2.工作内标(WIS)溶液
B.MRM和脂质种类选择
在初始步骤中，计算可能存在于皮脂样品中的脂质种类的数量。该计算基于文献中描述的存在于皮脂样品中的脂肪酸和脂质类别，并且产生SQ、WE、TAG、DAG、FFA和CE脂质类别内的所有可能的脂质种类的列表。根据该分析，确定皮脂样品中有超过2,500种可能的脂质种类。
通过质谱法分析来自脂溶性TOC和来自WE、TAG、DAG、FFA和CE脂质类别的化学标准品，以确定可用于监测皮脂样品中TOC和超过2,500种脂质种类的每一种的MRM对。基于该分析，选择用于监测每种TOC和每种脂质种类的MRM对。在脂质类别WE、TAG、DAG、FFA和CE中，每个脂质种类选择一种示例性母离子和子离子对(代表一个MRM对)。还选择一种示例性母离子和子离子对用于生育酚α-生育酚、δ-生育酚以及β-和γ-生育酚的组合(β/γ-生育酚)。一种MRM用于β/γ-生育酚，因为β-生育酚和γ-生育酚的母离子和主要子离子均具有相同的m/z，并且使用所述方法不能彼此区分。选择最丰富的离子用于监测。SQ的质谱分析得到一种母离子和两种子离子；选择具有最低背景的子离子进行监测。
然后使用所选择的MRM来测量使用皮脂样品的脂质种类和TOC的量。需要将样品提取物三次注射到质谱仪中以使用这些MRM测量样品中超过2,500种脂质种类的量。对样品中超过2,500种脂质种类的测量量的数据的分析表明，通过选择样品中最丰富的脂质种类，可以在单次注射中测量皮脂样品中超过90％的脂质分子。因此，选择针对来自WE、TAG和DAG脂质类别的最丰富脂质种类的MRM以包括在单次注射分析方法中以及针对SQ和FFA的MRM。对于CE，选择了针对26种常见脂质种类的MRM。对于TOC，选择了针对α-生育酚、β/γ-生育酚和δ-生育酚的每一种的一种MRM。在此实施例中，选择针对(超过2,500种中的)965种脂质种类和3种TOC的MRM用于包含在单次注射分析方法中。选择针对298种WE种类、47种DAG种类、575种TAG种类、18种FFA、26种CE和SQ以及针对3种TOC的MRM。
C.用于定量检测脂质种类和脂溶性生育酚的质谱法
开发了MS/MS方法以在相同(单次)注射的样品中检测TOC和来自由WE、SQ、TAG、DAG、FFA和CE组成的脂质类别的脂质种类的水平。
使用具有Turbo V源(ESI)的AB SciEx QTrap 5500质谱仪对样品提取物进行质谱分析。将样品提取物直接(即，没有色谱分离)以7μl/min的流速引入到质谱仪的电离源中。该仪器使用16个循环(每个MRM 20.0毫秒)、50毫秒的沉降时间以及5毫秒的质量范围之间的暂停以多反应监测(MRM)模式操作。仪器的每个循环包括正电离模式和负电离模式。仪器以正电离模式操作，离子喷涂电压设置为4.1kV，和以负电离模式操作，离子喷涂电压设置为-2.5kV。源温度设置为250℃，帘气(例如氮气)设置为17.0psi，喷雾器气体(例如氮气)设置为17.0psi，去溶剂化气体(例如氮气)设置为25.0psi，和碰撞活化解离(CAD)气体(例如，氮气)设置为中等。运行时间小于7分钟，并且从一次样品注射到下一次样品注射的总时间为13.25分钟。
从仪器获取原始数据并使用内部软件处理。对于定量，已知浓度的内标为每种脂质种类提供单点校准。如下定量脂质种类(分析物)，并以μM报告数值(IS指内标)：
监测下列脂质种类的MRM：SQ、18种FFA、298种WE、47种DAG、575种TAG、26种CE和3种TOC。
实施例2：方法验证(五种脂质类别)
使用合并的皮脂样品提取物评估用于测量一种或多种脂质类别中的一种或多种脂质种类的方法的精确度。分析四种样品，其中每种样品进行两次技术重复，从而具有总共8个样品。脂质类别浓度的精确度小于5.2％RSD，脂质种类浓度的精确度小于8.0％RSD，脂质种类组合物的精确度小于7.3％RSD。结果列于表3中。还评估了脂肪酸浓度和组成的精确度，结果列于表4中。
表3.皮脂的精确度(根据脂质类别)。
表4.皮脂中脂肪酸浓度和组成的精确度。
为了评估线性度，将合并的皮脂样品稀释0.111x、0.222x、0.333x、0.444x和0.667x。计算每个样品稀释液中每种脂质种类的浓度，以得到每种脂质种类的R2值。每种脂质类别中的脂质种类的结果如图1所示。
将实施例1中描述的方法(FIA-MS)与当前使用的FAME-GC/MS(FAME)分析进行比较。使用皮脂带从20名受试者收集的皮脂样品用于分析。使用两种方法测量样品的总脂肪酸组成。图2显示了17种脂肪酸的脂肪酸组成的比较，以总脂肪酸的百分比表示。使用这两种方法生成的数据的线性回归的R2值为0.936，表明使用每种方法测量的脂肪酸组成是可比较的。不能进行脂质类别中脂肪酸组成的比较，因为FAME分析报告了总脂肪酸组成并且不能确定脂质类别中的脂肪酸组成。
实施例3：脂质分析(五种脂质类别)
使用实施例1中描述的方法分析六种皮脂带皮脂样品。测量来自脂质类别DAG、TAG、WE、SQ和FFA的939种脂质种类的量，并且以每皮脂带的脂质类别的nmol(nmol/带)的报告浓度。在六种皮脂样品中，SQ的浓度分别为201.73185、62.15865、36.4587、227.91105、137.26815和128.3403nmol/带。来自示例性皮脂样品的298种WE脂质种类的浓度绘制在图3中。来自示例性皮脂样品的575种TAG脂质种类的浓度绘制在图4中。显示来自示例性皮脂样品的47种DAG脂质种类的浓度显示在图5中。来自六种皮脂样品的18种FFA脂质种类的浓度显示在表5中。六种样品中的每一种的脂质类别浓度(报告为nmol/带)报告在表6中。脂质类别浓度是所示脂质类别中脂质种类的总和。六种样品中每一种的脂质类别组成(以％表示)报告在表7中。示例性皮脂样品的脂肪酸浓度(报告为nmol/带)显示于表8中。脂肪酸浓度是含有特定脂肪酸的脂质类别中所有脂质种类的总和。
表5.FFA脂质种类的浓度。
表6.脂质类别浓度。
表7.脂质类别组成。
表8.脂肪酸浓度。
实施例4：方法验证(六种脂质类别)
在另一个实例中，该方法在单次注射中对于多达六种脂质类别进行验证。使用合并的皮脂样品提取物评估用于测量一种或多种脂质类别中的一种或多种脂质种类的方法的精确度。分析了五个技术重复样品。结果示于表9中。
表9.皮脂的精确度(根据脂质类别)。
实施例5：脂质分析(六种脂质类别)
使用实施例1中描述的方法分析合并的皮脂样品提取物的五个重复样品。测量来自脂质类别CE、DAG、TAG、WE、SQ和FFA的965种脂质种类的量，并且以每皮脂带的脂质类别的nmol(nmol/带)的报告浓度。来自五种皮脂样品的26种CE脂质种类的浓度显示在表10中。五种样品中的每一种的脂质类浓度(报告为nmol/带)报告在表11中。脂质类别浓度是所示脂质类别中脂质种类的总和。五种样品中每一种的脂质类别组成(以％表示)报告在表12中。示例性皮脂样品的脂肪酸浓度(报告为nmol/带)显示于表13中。脂肪酸浓度是含有特定脂肪酸的脂质类别中所有脂质种类的总和。
表10.CE脂质种类的浓度
表11.脂质类别浓度。
表12.脂质类别组成。
表13.脂肪酸浓度。
实施例6：皮脂分析(六种脂质类别和TOC)
在另一个实例中，该方法在单次注射中对于脂溶性TOC和多达六种脂质类别进行验证。使用合并的皮脂样品提取物评估用于测量一种或多种TOC和/或一种或多种脂质类别中的一种或多种脂质种类的方法的准确度。分析了三个技术重复样品。表14中显示了TOC和六种脂质类别的精确结果。还评估了每种生育酚的精确度。α-生育酚、β/γ-生育酚和δ-生育酚的精确度分别为17.08％、15.37％和14.57％RSD。
表14.皮脂的精确度。
脂质类别/TOC ％RSD
CE 3.99
TAG 4.95
DAG 2.85
FFA 11.99
WE 1.93
SQ 5.13
TOC 15.97
使用实施例1中描述的方法分析合并的皮脂样品提取物的三个重复样品。测量三种脂溶性TOC和来自脂质类别CE、DAG、TAG、WE、SQ和FFA的965种脂质种类的量，并且以每皮脂带的脂质类别的nmol(nmol/带)的报告浓度。在每个样品中测量的生育酚包括α-生育酚、δ-生育酚和β-与γ-生育酚的组合。来自三种皮脂样品的生育酚浓度显示在表15中。表16中报告了三个重复样品中的每一个的TOC和脂质类别浓度(报告为nmol/带)。脂质类别浓度是所示脂质类别中脂质种类的总和。表17中报告了三种样品中每一种的TOC和脂质类别组成(以％表示)。脂肪酸浓度是含有特定脂肪酸的脂质类别中所有脂质种类的总和。
表15.TOC的浓度。
表16.脂质类别和TOC浓度。
表17.脂质类别和TOC组成。

Claims (48)

1.一种通过质谱法测定样品中来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的存在、不存在或量的方法，其中所述一种或多种脂质类别选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇酯(CE)、胆固醇(CH)及其组合，所述方法包括：
a)在适于从一种或多种脂质种类中的每一种产生一种或多种可通过质谱法检测的离子的条件下使样品经受电离源；
b)通过质谱法测量来自一种或多种脂质种类中的每一种的一种或多种离子的量；和
c)使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种脂质种类中的每一种的存在、不存在或量。
2.一种通过质谱法测定样品中的以下物质的存在、不存在或量的方法：
来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类，其中所述一种或多种脂质类别选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇酯(CE)、胆固醇(CH)及其组合；和
选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚及其组合的一种或多种生育酚，
所述方法包括：
a)在适于从一种或多种脂质种类和一种或多种生育酚中的每一种产生一种或多种可通过质谱法检测的离子的条件下使样品经受电离源；
b)通过质谱法测量来自一种或多种脂质种类和一种或多种生育酚中的每一种的一种或多种离子的量；和
c)使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种脂质种类和一种或多种生育酚中的每一种的存在、不存在或量。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种脂质类别包括蜡酯(WE)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、胆固醇酯(CE)或其组合，并且所述方法还包括测定一种或多种脂质种类的一种或多种脂肪酸的碳和双键的数量。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是皮脂样品或皮脂细胞样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其中来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的存在、不存在或量是从单次注射测定的。
6.根据权利要求2所述的方法，其中来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的存在、不存在或量以及一种或多种生育酚的存在、不存在或量是从单次注射测定的。
7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类包括蜡酯，并且所述方法还包括测定蜡酯的脂肪醇组成。
8.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类包括二酰基甘油，并且所述方法还包括测定二酰基甘油的两种脂肪酸的碳和双键的数量。
9.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中测定来自至少两种脂质类别的一种或多种脂质种类的量。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括角鲨烯和蜡酯。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括角鲨烯和二酰基甘油。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括角鲨烯和三酰基甘油。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括角鲨烯和游离脂肪酸。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括角鲨烯和胆固醇酯。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括角鲨烯和胆固醇。
16.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括蜡酯和三酰基甘油。
17.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括蜡酯和二酰基甘油。
18.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括蜡酯和游离脂肪酸。
19.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括蜡酯和胆固醇酯。
20.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种脂质类别包括蜡酯和胆固醇。
21.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中测定来自三种或更多种脂质类别的一种或多种脂质种类的量。
22.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中测定来自四种或更多种脂质类别的一种或多种脂质种类的量。
23.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中测定来自五种或更多种脂质类别的一种或多种脂质种类的量。
24.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中测定来自六种或更多种脂质类别的一种或多种脂质种类的量。
25.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中测定来自脂质类别CH、CE、WE、SQ、TAG、DAG和FFA的每一种的一种或多种脂质种类的量。
26.根据权利要求2、3、7或8中任一项所述的方法，其中测定选自CH、CE、WE、SQ、TAG、DAG和FFA的一种或多种脂质种类的量，和测定选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的一种或多种TOC种类的量。
27.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中测定二十种或更多种脂质种类的量。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用一种或多种内标来测定样品中一种或多种脂质种类的量。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种内标选自一种或多种脂质类别，其选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油酯(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇酯(CE)及其组合。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种内标选自脂质类别蜡酯(WE)，并且所述内标选自WE(FA19:1/OH8:0)和WE(FA17:1/OH8:0)。
31.一种试剂盒，其包含针对选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油酯(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CH)、胆固醇酯(CE)及其组合的一种或多种脂质类别中的每一种的一种或多种内标，以及包装材料和使用该试剂盒的说明书。
32.一种试剂盒，其包含针对选自蜡酯(WE)、角鲨烯(SQ)、三酰基甘油酯(TAG)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CH)、胆固醇酯(CE)及其组合的一种或多种脂质类别中的每一种和针对选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚及其组合的一种或多种生育酚(TOC)中的每一种的一种或多种内标，以及包装材料和使用该试剂盒的说明书。
33.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中所述样品是皮脂样品并使用皮脂带、拭子或滤纸收集。
34.根据权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，还包括测定胆固醇的量。
35.一种通过质谱法测定样品中选自角鲨烯(SQ)、游离脂肪酸(FFA)、复合脂质及其组合的一种或多种脂质种类的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：
a)在适于从一种或多种脂质种类中的每一种产生一种或多种可通过质谱法检测的离子的条件下使样品经受电离源；
b)通过质谱法测量来自一种或多种脂质种类中的每一种的一种或多种离子的量；和
c)使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种脂质种类中的每一种的量。
36.根据权利要求35所述的方法，其中一种或多种复合脂质选自WE、TAG、DAG和CE。
37.根据权利要求36所述的方法，还包括测定一种或多种复合脂质类别的一种或多种脂肪酸的碳和双键的数目。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述样品是皮脂样品或皮脂细胞样品。
39.根据权利要求35所述的方法，其中来自一种或多种脂质类别的一种或多种脂质种类的量是从单次注射测定的。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述样品是皮脂样品并且使用皮脂带、拭子或滤纸收集。
41.根据权利要求35所述的方法，还包括测定胆固醇的量。
42.一种检测样品中一种或多种脂质种类的存在、不存在或量的方法，其中所述脂质种类选自由SQ、WE、DAG、TAG、FFA、胆固醇和CE组成的脂质类别，所述方法包括：
在没有预先分离或纯化步骤的情况下将单次注射的样品提取物注入质谱仪中；和
使用质谱仪测定样品中一种或多种脂质种类的身份，以及一种或多种脂质种类的浓度。
43.一种检测样品中一种或多种脂质种类和一种或多种TOC的存在、不存在或量的方法，其中所述脂质种类选自由SQ、WE、DAG、TAG、FFA、胆固醇和CE组成的脂质类别，并且一种或多种TOC选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚，所述方法包括：
在没有预先分离或纯化步骤的情况下将单次注射的样品提取物注入质谱仪中；和
使用质谱仪测定样品中一种或多种脂质种类的身份、一种或多种TOC的身份、一种或多种脂质种类的浓度以及一种或多种TOC的浓度。
44.根据权利要求1所述的方法，还包括测定样品中一种或多种脂肪酸异构体的存在、不存在或量。
45.根据权利要求44所述的方法，其中使用GC-FAME(气相色谱-脂肪酸甲酯)分析测定样品中一种或多种脂肪酸异构体的存在、不存在或量。
46.根据权利要求1、2或35中任一项所述的方法，其中在没有预先分离或纯化步骤的情况下将所述样品直接注射到质谱仪中。
47.根据权利要求28所述的方法，其中一种或多种内标中的至少一种是同位素标记的。
48.根据权利要求31或32中任一项所述的试剂盒，其中一种或多种内标中的至少一种是同位素标记的。
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