KR101502694B1 - 지질 분석 시스템 및 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지질의 질량 스펙트럼의 이론 정보를 포함하는 라이브러리;
질량분석기를 이용하여 지질 시료로부터 질량 스펙트럼의 실험 정보를 수집 및 저장하는 수집부;
상기 라이브러리의 질량 스펙트럼의 이론 정보 및 상기 수집부의 질량 스펙트럼의 실험 정보로부터 신뢰점수를 계산하는 연산부;
상기 계산된 신뢰점수를 바탕으로 지질 시료의 종류를 선택하는 검색부를 포함하는 지질 분석 시스템에 관한 것이다.

Description

지질 분석 시스템 및 분석 방법{LIPID ANALYSIS SYSTEM AND METHOD FOR ANALYSING THE LIPID}

본 발명은 지질의 질량 스펙트럼으로부터 지질의 종류를 분석하는 지질 분석 시스템 및 지질 분석 방법에 관한 것이다.

지질학(Lipidomics)은 생체 내에서 발생하는 여러 지질체군(lipidome)들의 대사과정에서 생기는 총체적인 현상 및 변화를 정성 및 정량하여 그 생물학적, 생화학적 중요성을 알아내는 것에 초점을 맞춘 학문 분야로써, 최근 많은 각광을 받고 있다. 지질학(Lipidomics)은 또한, 지질이 관여하는 체내 대사과정으로부터 학문적 의의를 찾아내어, 각종 질환관련 표지물질(biomarker)을 찾는 연구에도 그 목적을 두고 있다.

여러 종류의 지질들 중, 인지질(phospholipid, PL)은 세포 내의 신호전달(cell signalling), 세포증식(proliferation) 및 사멸(apoptosis) 등의 생체 내 여러 기능에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 상기 인지질은 생체 세포에서 이중층(double layer)의 형태로 세포막(plasma membrane)을 형성하는데, 그 기본적인 구조는, 두 개의 지방산(fatty acid)이 글리세롤(glycerol)의 sn-1과 sn-2 위치에 결합하고, 한 개의 인산기(phosphate group)가 sn-3 위치에 결합한 형태이다. 상기 인지질은 비극성의 지방산 부분에 여러 종류의 지방산이 결합하는 것이 가능하고, 친수성의 인산 부분에 추가적으로 붙는 헤드기(head group)의 종류에 따라 수십, 수백 가지의 인지질이 생겨난다. 상기 헤드기(head group)는 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC), 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜세린 (phosphatidylserine, PS), 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol, PI), 포스파티딜글리세롤 (phosphatidylglycerol, PG) 및 포스파티딘산 (phosphatidic acid, PA) 등으로 구분할 수 있다. 이런 다양성 때문에, 생체 시료마다 인지질의 분포가 매우 다양하게 된다.

최근 전자분무이온화-탠덤질량 분석법(ESI-MS-MS)의 비약적인 발전으로, 지질 분자들의 구조적 분석이 가능하게 되었고, 샷건 지질학(shotgun lipidomics) 분야가 생물학적 조직의 분석에도 큰 영향을 끼칠 수 있게 되었다. 비록, 전자분무이온화(ESI-MS) 및 전자분무이온화-탠덤질량분석법(ESI-MS-MS) 기법의 발전에도 불구하고, 시료들이 이온화되기 위한 경쟁에 따른 이온화 제약 효과에 의해 분석이 가능한 시료의 수가 줄어들게 되므로, 상기 이온화 제약 효과를 줄이기 위해서는 시료의 사전 분리가 필수적이다.

전자분무이온화(ESI-MS)와 결합된 액체크로마토그래피(HPLC)는 역상 컬럼에서 사슬 길이와 아실 사슬의 불포화 도(degree of unsaturation)를 소팅하는 동안에, 순상 컬럼에서는 다른 극성 헤드를 분리하여 복잡한 인지질 혼합물을 특정화하는 능력이 증가한다. 미세유속 또는 나노유속에서 모세관 액체크로마토그래피(LC)는 직접적으로 전자분무이온화-탠덤질량분석기(ESI-MS-MS)와 결합하고, 2.2 fmol의 낮은 검출 한계를 가지는 인간 조직 및 뇨샘플로부터 인지질(PLs)의 동시 분리 및 특정화를 야기한다. 그러나, 인지질(PL) 분자의 높은 처리량 분석에서 중요한 문제 중 하나는 구조 확인을 위하여 방대한 양의 질량 분석 데이터를 수동적으로 처리할 때 발생한다. 이러한 분석 병목 현상(analysis bottleneck necessitates)은 인지질(PLs)의 확인을 위한 쉽고 정밀한 툴을 필요로 한다.

복잡한 MS 및 MS-MS 스펙트럼으로부터 인지질(PL) 구조의 자동 식별은 LIMSA, Lipidprofiler, Lipid MAPS, LipidQA, LipID 및 LipidXplorer 등의 개발된 여러 프로그램에 의해 수행되었다.

LipidQA는 조각이온들의 질량 대 전하 비에 대한 이론 값뿐만 아니라, 각각의 신호 강도의 이온 값들도 정보로 활용해야 하며, 분해능이 낮은 질량분석기를 사용하거나, 프로그램을 사용하기 위한 최적화된 조건에서 실험데이터를 얻지 못하면 사용하기가 어려워 그 범용성이 낮았다.

LipidXplorer은 최근 크로스 플랫폼 지질학을 위한 유용한 툴(tool)로서 보고되었다. 상기 LipidXplorer은 이론 값 정보들을 활용하지 않고, 분석하고자 하는 지질들의 원소 구성을 입력하는 언어를 바탕으로 프로그래밍하여 가능한 지질의 구조들을 계산한 임시 라이브러리를 만들고, 이를 실험값들과 비교하여 결과를 도출하는 방법을 이용하였다. 상기에서는 사전에 이론 값들의 목록을 제작할 필요가 없어 간단한 사용이 가능할 수도 있으나, 언어의 숙련도에 따라 분석결과의 질이 달라질 수 있으므로 프로그램의 사용이 극대화되지 못할 수 있었다.

이에 더하여, 실험 자들마다 다른 실험 장비 및 플랫폼을 보유하고 있어, 종래 소프트웨어에의 쉬운 접근이 어렵다는 단점이 있었다.

1. P. Haimi, A. Uphoff, M. Hermansson, P. Somerharju. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Anal. Chem. 2006, 78, 8324. 2. C. S. Ejsing, E. Duchoslav, J. Sampaio, K. Simons, R. Bonner, C. Thiele, K. Ekroos, A. Shevchenko. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Anal. Chem. 2006, 78, 6202. 3. M. Sud, E. Fahy, D. Cotter, A. Brown, E. A. Dennis, C. K. Glass, A. H.Merrill Jr, R. C. Murphy, C. R. H. Raetz, D. W. Russell, S. Subramaniam. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Res. 2007, 35, D527. 4. H. Song, F. F. Hsu, J. Ladenson, J. Turk. Algorithm for processing rawmass spectrometric data to identify and quantitate complex lipid molecular species in mixtures by data-dependent scanning and fragment ion database searching. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007, 18, 1848. 5. H. Song, J. Ladenson, J. Turk. Algorithms for automatic processing of data from mass spectrometric analyses of lipids. J. Chromatogr. B 2009, 877, 2847. 6. G. Hubner, C. Crone, B. Lindner. LipID a software tool for automated assignment of lipids inmass spectra. J. Mass Spectrom. 2009, 44, 1676. 7. R. Herzog, D. Schwudke, K. Schuhmann, J. L. Sampaio, S. R. Bornstein, M. Schroeder, A. Shevchenko. A novel informatics concept for highthroughput shotgun lipidomics based on the molecular fragmentation query language. Genome Biol. 2011, 12, R8.

본 발명은 지질의 질량스펙트럼으로부터 분자의 구조적 해석을 위한 시스템 및 이를 이용한 지질 분석 방법에 관한 것이다.

본 발명은 지질의 질량 스펙트럼의 이론 정보를 포함하는 라이브러리;

질량분석기를 이용하여 지질 시료로부터 질량 스펙트럼의 실험 정보를 수집 및 저장하는 수집부;

상기 라이브러리의 질량 스펙트럼의 이론 정보 및 상기 수집부의 질량 스펙트럼의 실험 정보로부터 신뢰점수를 계산하는 연산부;

상기 계산된 신뢰점수를 바탕으로 지질 시료의 종류를 선택하는 검색부를 포함하는 지질 분석 시스템에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 따른 지질 분석 시스템을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 분석하고자 하는 지질의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 인지질 또는 리소인지질일 수 있다.

본 발명에 따른 지질 분석 시스템은 라이브러리, 수집부, 연산부 및 검색부를 포함한다.

본 발명에 따른 지질 분석 시스템에서 라이브러리는 지질의 이론 정보를 포함하며, 분석 대상(지질 시료)의 지질 종류를 분석하는데 정보를 제공한다. 상기 라이브러리는 지질의 헤드기, 예를 들어, 인지질 및 리소인지질의 헤드기에 따라 이론적으로 계산된 충돌유도분해(CID) 질량 스펙트럼(MS)의 이론 m/z 값을 포함할 수 있으며, 구체적으로 헤드기별로 계산된 전구 이온의 이론 m/z 값, 조각 이온의 이론 m/z 값 및/또는 MS 강도 등을 포함할 수 있다. 상기 라이브러리의 정보는 csv(comma-separated value) 형식으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 분석 시스템에서 수집부는 지질의 실험 정보를 포함하며, 구체적으로 상기 수집부는 질량분석기를 이용하여 지질 시료로부터 질량 스펙트럼(MS)의 실험 정보를 수집 및 저장할 수 있다.

이때, 상기 수집부에 수집 및 저장되는 질량 스펙트럼은 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기(LC-ESI-MS-MS)에 의해 측정된 정보일 수 있다. 상기 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기는 이 분야에서 일반적으로 이용되는 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기를 제한없이 사용할 수 있다. 상기 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기를 이용한 분석 시 지질의 특성에 따라 양이온 모드 또는 음이온 모드를 채택하여 분석을 수행할 수 있으며, 상기 기기에 의해 충돌유도분해(CID)가 일어나 지질은 조각 이온으로 분리되어 조각 이온의 실험 m/z 값 등을 분석함으로써, 지질의 종류를 분류할 수 있다.

상기 수집부의 실험 정보는 측정된 질량 스펙트럼 정보를 포함하며, 구제적으로, 지질의 헤드기에 따른 전구 이온의 실험 m/z 값, 조각 이온의 실험 m/z 값 또는 MS 강도 등을 포함할 수 있다. 이때, 실험 정보는 질량분석기에 의해 측정된 머무름 시간(t_r)에 따른 전구 이온의 실험 m/z 값, 조각 이온의 실험 m/z 값 또는 MS 강도일 수 있다. 상기 수집부의 실험 정보는 연산부에서 사용하기에 용이한 형태로 저장될 수 있는데, 본 발명에서 상기 실험 정보는 텍스트 파일 형태로 저장될 수 있다.

앞에서 설명한 바와 같이, 라이브러리 및 수집부는 각각 이론 정보 및 실험 정보를 포함한다. 구체적으로 이 정보는 지질의 헤드기(head group), 예를 들어, 인지질 및 리소인지질의 헤드기에 따른 충돌유도분해(CID) 질량 스펙트럼(MS)의 정보를 포함할 수 있는데, 이는 지질의 분자들이 헤드기별로 CID 스펙트럼의 패턴, 피크의 개수 등에 차이를 보이므로, 상기 라이브러리의 CID 스펙트럼의 패턴, 피크의 개수 등을 실험에서 측정된 지질의 CID 스펙트럼의 패턴, 피크의 개수 등과 비교함으로써, 상기 실험에서 측정된 지질의 종류를 용이하게 확인하기 위해서이다.

상기 인지질의 헤드기의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol, PI), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG) 및 포스파티딘 산(phosphatidic acid, PA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한, 리소인지질의 헤드기의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine, LPE), 리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine, LPS), 리소포스파티딜이노시톨(lysophosphatidylinositol, LPI), 리소포스파티딜글리세롤(lysophosphatidylglycerol, LPG) 및 리소포스파티딘 산(lysophosphatidic acid, LPA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 지질은 종류에 따라 질량분석기의 음이온 모드 또는 양이온 모드에서 관찰되므로, 상기 라이브러리의 이론 정보 및 수집부의 실험 정보는 양이온 모드 및 음이온 모드로 분리하여 저장되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 지질 분석 시스템은 지질 종류의 선택성을 높이기 위하여 매개변수 설정부를 추가로 포함할 수 있다. 같은 지질에 대해서도 질량분석기에 따라 얻어지는 조각 이온의 패턴이 상이하므로, 본 발명의 시스템에서는 적절한 매개변수를 설정할 수 있다.

상기 매개변수 설정부는 제 1 및 제 2 매개변수 설정부로 구분할 수 있다.

본 발명에서 제 1 매개변수 설정부에서는 질량분석기의 분석 모드, 조각 이온의 설정 피크(set peak) 및 지질의 이성질체를 구분하기 위해 선정된 설정 인자(set factor)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수를 설정할 수 있다. 상기 설정 인자(set factor)는 신뢰점수의 계산시 I_factor로 이용될 수 있다.

또한, 제 2 매개변수 설정부에서는 라이브러리의 m/z 값(이론 m/z 값)과 수집부의 m/z 값(실험 m/z 값)의 차이들의 표준편차(SDD)의 최대값 및 신뢰점수의 최소값으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수를 설정할 수 있다. 상기 제 2 매개변수 설정부는 필요하지 않는 데이터를 제거하기 위한 매개변수를 설정할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 분석 시스템에서 연산부에서는 라이브러리 및 수집부의 이론 정보 및 실험 정보가 불러들여지며, 상기 이론 정보 및 실험 정보로부터 신뢰점수를 계산할 수 있다.

구체적으로, 지질 분석 시스템에서 연산부는 라이브러리의 질량 스펙트럼의 이론 정보 및 상기 수집부의 질량 스펙트럼의 실험 정보로부터 신뢰점수를 계산하는데, 이러한 신뢰점수는 라이브러리 및 수집부의 조각 이온의 m/z 값 및 MS 강도를 이용하여 계산할 수 있으며, 상기 정보에 설정 인자(I_factor)의 MS 강도를 추가로 이용하여 계산할 수 있다. 상기 설정 인자(I_factor)는 이성질체의 구분을 위해 선정된 것으로서, 신뢰점수를 통한 지질 분석 효율을 향상시킬 수 있다.

구체적으로 본 발명에 따른 신뢰점수는 하기 수학식 1에 의해 계산될 수 있다.

<수학식 1>

상기 수학식 1에서, i는 수집부에 수집된 한 개의 질량 스펙트럼에서 관찰된 피크(peak)들 중에서 라이브러리의 이론 m/z 값에 대응되는 피크(peak)의 개수이고, N은 수집부에 수집된 질량 스펙트럼에서 관찰된 총 피크의 개수이며,

는 이론 m/z 값과의 비교과정에서 선택된 실험 m/z 값에 해당하는 피크의 강도(intensity)들의 합이고, I_factor는 위치이성질체의 구분을 위하여 선정된 조각(fragment) 이온의 강도 값이며,

은 이론값과의 비교과정에서 선택되지 않은 나머지 피크들의 강도들의 합이고,

은 이론값과 대응된 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 실험 m/z 값이며,

은 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 이론 m/z 값을 나타낸다.

상기 신뢰점수에서 뒷 부분은 이론 m/z 값과 실험 m/z 값의 차이들의 표준편차(SDD)의 역수값을 나타내는데, 이는 m/z 값의 치이를 고려하여, 이론 m/z 값과 실험 m/z 값의 차이가 적을수록, 원하는 결과에 가까워지도록 추가된 것이다.

본 발명에 따른 지질 분석 시스템에서 검색부는 상기 연산부에서 계산된 신뢰점수를 바탕으로 지질의 종류를 선택할 수 있다. 상기 검색부에서는 계산된 신뢰 점수가 가장 높은 지질을 분석 대상 지질의 지질 종류로 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 지질 분석 시스템을 이용한 지질 분석 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 지질 분석 방법은 지질의 질량 스펙트럼의 이론 정보 및 질량분석기에 의해 측정되는 지질 시료의 실험 정보를 이용하여 신뢰점수를 계산하는 단계; 및

상기 계산된 신뢰점수로 지질의 종류를 선택하는 단계를 포함한다.

이하, 본 발명에 따른 지질 분석 방법을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 지질의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 인지질 또는 리소인지질일 수 있다.

본 발명에 따른 지질 분석 방법에서 이론 정보는 라이브러리에 의해 제공될 수 있다.

상기 라이브러리는 지질의 질량 스펙트럼의 이론 정보, 구체적으로 지질의 헤드기별로 계산된 전구 이온의 이론 m/z 값, 조각 이온의 이론 m/z 값 및 MS 강도 등을 포함할 수 있다. 상기 라이브러리는 지질 분자의 이론 정보를 포함함으로써, 분석 대상의 지질 종류를 분석하는데 정보를 제공할 수 있다. 상기 지질의 분자들은 헤드기별로 CID 질량 스펙트럼의 패턴, 피크의 개수 등에 차이를 보이므로, 상기 라이브러리의 CID 스펙트럼의 패턴, 피크의 개수 등을 실험에서 측정된 지질의 CID 스펙트럼의 패턴, 피크의 개수 등과 비교함으로써, 상기 실험에서 측정된 지질의 종류를 용이하게 확인할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 지질 분석 시스템에서 실험 정보는 질량분석기에 의해 측정된 지질 시료의 정보일 수 있으며, 구체적으로, 상기 실험 정보는 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기(LC-ESI-MS-MS)에 의해 측정될 수 있다. 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기는 이 분야에서 일반적으로 이용되는 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기를 제한없이 사용할 수 있다. 상기 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기를 이용한 분석 시 지질의 특성에 따라 양이온 모드 또는 음이온 모드를 채택하여 분석을 수행할 수 있으며, 충돌유도분해(CID)가 일어나 지질은 조각 이온으로 분리되어 조각 이온의 실험 m/z 값을 분석함으로써, 지질의 종류를 분류할 수 있다.

본 발명에서 지질 시료의 실험 정보는 측정된 머무름 시간(t_r)에 따른 전구 이온의 실험 m/z 값, 조각 이온의 실험 m/z 값 또는 MS 강도 등을 포함할 수 있다. 상기 실험 정보를 이용하여 신뢰점수를 계산하기 위하여 상기 정보를 텍스트 파일 형태(.txt)로 변환하는 과정을 수행할 수 있다. 상기 텍스트 형태로의 변환은 예를 들어, Thermo Finnigan 사에서 제공하는 XCalibur 프로그램을 이용할 수 있다. 상기 변환된 텍스트 파일은 스캔의 개수, 분석시간, m/z 범위 둥의 전반적인 정보뿐만 아니라, 머무름 시간마다의 m/z 값과 MS 강도 등를 포함할 수 있다.

상기 이론 정보 및 실험 정보는 구체적으로 지질의 헤드기에 따른 질량 스펙트럼 정보를 포함할 수 있는데, 이때, 지질의 헤드기는 앞에서 전술한 종류를 사용할 수 있다. 또한, 지질은 종류에 따라 질량분석기의 음이온 모드 또는 양이온 모드에서 관찰되므로, 상기 이론 정보 및 실험 정보는 양이온 모드 및 음이온 모드로 구분되어 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 지질 분석 방법에서는 지질의 질량 스펙트럼의 이론 정보 및 실험 정보를 프로그램을 이용하여 처리할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 분석 방법에서 사용되는 프로그램은 분석하고자 하는 지질의 정보 파일을 헤드기별로 한번에 불러들임으로써, 한 개의 파일에서 여러 종류의 지질을 동시에 정성 분석 할 수 있다. 그러나, 파일은 분석에 필수적인 정보 이외에도, 불필요한 데이터들을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 지질 분석 방법에서는 파일의 사이즈를 축소하는 단계를 추가로 수행함으로써, 텍스트 파일의 크기를 줄이고, 프로그램의 구동시간도 단축할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 분석 방법에서는 신뢰점수를 계산하기 전에 조각 이온의 패턴별로 계산 매개변수를 설정하는 단계를 수행할 수 있다.

본 발명에서 계산 매개변수의 설정은 인지질을 찾아내는데 있어서 그 성공확률을 높여주는 역할을 할 수 있다. 같은 지질에 대해서도 질량분석기에 따라 얻어지는 조각 이온의 패턴이 상이하므로, 본 발명에서는 실험 방법에 따라 적절한 매개변수를 설정할 수 있다.

상기 계산 매개변수를 설정하는 단계는 질량분석기의 분석 모드를 선정하는 단계; 조각 이온의 설정 피크(set peak)를 선정하는 단계; 및

지질의 이성질체를 구분하기 위해 설정된 설정 인자(set factor)를 선정하는 단계로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

먼저, 질량분석기의 분석 모드를 선정하는 단계에서 지질의 헤드기에 따라 질량분석기의 분석 모드(양이온 모드 또는 음이온 모드)를 선정하면, 프로그램은 필요한 조각 피크들만으로 구성된 이론 정보를 재구성할 수 있다.

조각 이온의 설정 피크(set peak)를 선정하는 단계에서는 재구성된 이론 정보를 이용하여 설정 피크를 선정하는데, 설정 피크는 신뢰점수의 계산 시 어떤 조각 이온들을 이용할 지를 선택할 수 있다. 설정 피크는 대상 물질의 LC-ESI-MS-MS 실험에서 측정된 조각 이온을 선택하는 것이 바람직하다.

설정 인자(set factor)를 선정하는 단계에서는 설정 인자를 선정하는데, 상기 설정 인자를 선정함으로써 지질의 위치이성질체를 구분하고, 지질의 종류 분석 효율을 향상시킬 수 있다. 상기 설정 인자는 질량분석 시 특정하게 나타나는 조각 이온을 선택할 수 있다. 위치이성질체는 관찰되는 조각 이온들의 종류와 m/z 값이 동일하지만, 조각 이온의 피크의 강도 비율은 상이한 값을 가진다. 따라서, 강도에 큰 차이를 보이는 특정 조각 이온을 인자로 선정할 수 있다. 상기 설정 인자로 선정된 조각 이온은 신뢰점수의 계산 시 I_factor를 선정하는데 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 필요하지 않는 데이터를 제거하기 위한 추가적인 계산 매개변수를 설정할 수 있다. 이 때의 계산 매개변수로는 분석하고자 하는 m/z 범위, 머무름 시간의 범위, 같은 결과를 여러 번 보여주는 것을 막기 위한 동적 제외 기능, 전구 질량 범위 등을 선정할 수 있는데,

본 발명에서는, 특히, 이론 m/z 값 및 실험 m/z 값의 차이들의 표준편차(

, SDD)의 최대값을 선정하는 단계; 및

신뢰점수의 최소값을 선정하는 단계로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 매개변수를 설정하는 단계를 포함할 수 있다.

먼저, SDD의 최대값을 선정하는 단계에서, SDD 값은 실험 m/z값과 이론 m/z값의 비교를 통해 얻어지는 값으로

로 표시된다. 상기 SDD는 후술할 신뢰점수의 계산에서 사용되는데, 의미 있는 결과로의 가능성이 있는 지질을 찾아내기 위한 중요한 역할을 수행한다. 상기 SDD 값은 낮으면 서로 다른 인지질을 검출하기 어려우며, 그 값이 높아지면 원하지 않은 결과물도 출력되므로 분석자의 재검토가 필요하다는 단점이 있다. 또한, 헤드기별로 원하는 지질의 결과를 나타내는 SDD 값이 상이하므로, 헤드기별로 SDD 값을 설정하는 것이 바람직하나, 본 발명에서는, 예를들어, SDD 값을 1 이하로 설정함으로써 헤드기별로 SDD 값을 설정하지 않고, 여러 상이한 지질의 분석을 효과적으로 수행할 수 있다.

신뢰점수의 최소값을 선정하는 단계에서, 후술할 신뢰점수의 계산 시 거짓결과로 도출된 지질의 신뢰점수는 참결과로 도출된 지질의 신뢰점수에 비해 현저히 작은 값을 가진다. 따라서, 신뢰점수의 하한을 헤드기의 종류별로 한정하여 분석의 효율성을 높일 수 있다.

상기 전술한 매개변수를 신뢰점수의 계산 전에 설정함으로써, 지질의 종류 분류 효율성을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따른 지질 분석 방법에서 신뢰점수를 계산하는 단계는 전구 이온 실험 m/z 값과 유사한 전구 이온 이론 m/z 값을 가지는 후보군을 선정한 후, 신뢰점수를 계산할 수 있다.

본 발명의 프로그램에 의한 데이터 분석은 라이브러리 파일로부터 질량분석 데이터를 이용하여 후보 지질 분자(후보군)를 선택하는 것으로부터 시작된다. 구체적으로, 실험 데이터로부터 하나의 조각 이온 스펙트럼을 불러들여 전구 이온의 실험 m/z 값이 선택되면, 프로그램은 라이브러리 파일로부터 초기결과를 선택할 수 있다. 프로그램은 실험값의 전구 이온 m/z 값과 라이브러리의 전구 이온 이론 m/z 값을 비교하여, 유사한 값을 가지는 후보군을 선택할 수 있다. 이 때, 전구 질량 폭(precursor mass width)을 임의로 지정하여 후보군을 선택할 수 있는데, 상기 전구 질량 폭은 실험값 m/z 값을 기준으로 하는 m/z 값의 범위를 의미한다. 예를 들어, 폭 값이 0.5로 지정되고 전구 이온의 실험 m/z 값이 788.5일 경우, 프로그램은 788.0 내지 789.0 사이의 전구 이온 이론 m/z 값을 가지는 지질을 후보군으로 선택하게 된다.

상기 후보군을 선택한 후에는 신뢰점수를 계산할 수 있다. 상기 신뢰점수는 이론 m/z 값과 실험 m/z 값의 차이가 적은 후보 분자를 고르기 위한 것으로, 이온의 m/z 값 및 MS 강도를 이용할 수 있으며, 상기 정보 외에 설정 인자(I_factor)의 MS 강도를 추가로 이용하여 계산할 수 있다.

구체적으로, 상기 신뢰점수는 하기 수학식 1에 의해 계산될 수 있다.

<수학식 1>

상기 수학식 1에서, i는 질량분석기에 의해 측정된 한 개의 질량 스펙트럼에서 관찰된 피크(peak)들 중에서 이론 m/z 값에 대응되는 피크(peak)의 개수이고, N은 질량분석기에 의해 측정된 질량 스펙트럼에서 관찰된 총 피크의 개수이며,

는 이론 m/z 값과의 비교과정에서 선택된 실험 m/z 값에 해당하는 피크의 강도(intensity)들의 합이고, I_factor는 위치이성질체의 구분을 위하여 선정된 조각(fragment) 이온의 강도 값이며,

은 이론값과의 비교과정에서 선택되지 않은 나머지 피크들의 강도들의 합이고,

은 이론값과 대응된 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 실험 m/z 값이며,

은 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 이론 m/z 값을 나타낸다.

상기 신뢰점수에서 뒷 부분은 이론 m/z 값과 실험 m/z 값의 차이들의 표준편차(SDD)의 역수값을 나타내는데, 이는 m/z 값의 치이를 고려하여, 이론 m/z 값과 실험 m/z 값의 차이가 적을수록, 원하는 결과에 가까워지도록 추가된 것이다.

상기 전술한 신뢰점수의 결과가 클수록 실험에서 측정된 지질이 후보군 지질과 일치함을 나타내며, 상기 신뢰점수를 계산함으로써, 지질의 종류를 용이하게 분류할 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 지질 분석 방법을 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체에 관한 것이다.

본 발명에서 이러한 매체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 생체 분자의 분석을 위해 사용되는 매체를 이용할 수 있다.

본 발명에서는 nLC-ESI-MS-MS 실험으로부터 얻은 인지질(PL)과 리소인지질(LPL)의 데이터를 분석하는 방법을 제공한다.

수동으로 충돌유도분해(CID) 스펙트럼을 계산하여 인지질을 찾아내는 과정은 매우 번거로우며 비효율적인 반면, 본 발명에 따른 시스템에서는 분석하고자 하는 시료가 매우 많을 때 분석시간을 단축하고, 신뢰점수를 통하여 분석자에게 보다 객관적인 생체 내 지질의 프로필을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 시스템은 사용하는 라이브러리를 유연하게 조작할 수 있어서, 인지질의 헤드기, 리소이성질체 별로 분석할 수 있을 뿐 아니라, 질량분석기를 통한 CDI 스펙트럼의 분석패턴이 알려져 있는 다른 분자들, 예를 들어, 트리아실글레세롤(triacylglycerol), 카르디올리핀(cardiolipin) 및 스핑고미엘린(sphingomyelin) 등에 대해서도 적용할 수 있다.

본 시스템은 또한, 실험데이터 내에서 결과출력에 불필요한 데이터들을 손쉽게 제거하여 원하는 결과들만 도출할 수 있는 쉬운 여과기능을 제공할 수 있다.

도 1은 헤드기의 종류에 따른 라이브러리의 조각 이온의 목록을 나타내는 표이다.
도 2는 본 발명에 따른 분석 방법을 이용한 분석의 전체적인 흐름을 나타내는 흐름도이다.
도 3은 nLC-ESI-MS-MS 실험을 통해 얻은 사람 뇨내의 PI 분자의 충돌유도분해(CID) 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 LiPilot 프로그램에서 매개변수를 설정하는 PC 화면을 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 LiPilot 프로그램에서 PS 분자의 식별을 위한 알고리즘 화면을 나타내는 사진이다.
도 6은 위치이성질체의 식별을 위하여 14:0/16:0-PC와 16:0/14:0-PC가 1:1 비율로 석인 혼합물을 nLC-ESI-MS-MS 실험을 통해 얻은 충돌유도분해(CID) 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 7은 SDD 값의 설정에 따라 도출되는 인지질의 수를 보여주는 그래프이다.
도 8은 상기 도4의 조건들로 nLC-ESI-MS-MS 실험을 통해 얻은 인간의 뇨시료 내의 인지질을 분석한 결과이다.

본 발명은 이들의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법을 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 청구항의 범위에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

1. 실험 조건

1) 분석대상 물질 및 시약 준비

인지질의 정성분석을 위하여 Avanti Polar Lipids(Alabater, AL, USA)로부터 인지질의 표준물질인 6종의 리소인지질(LPL) 16:0-LPC, 18:0-LPE, 18:0-LPS, 18:1-LPI, 18:0-LPG, 18:0-LPA과 16 종의 인지질(PL) 14:0/14:0-PC, 16:0/16:0-PC, 18:0/18:0-PC, 14:0/14:0-PE, 16:0/16:0-PE, 18:0/18:0-PE, 14:0/14:0-PS, 16:0/16:0-PS, 18:0/18:0-PS, 16:0/18:2-PI, 12:0/12:0-PG, 16:0/16:0-PG, 18:0/18:0-PG, 12:0/12:0-PA, 14:0/14:0-PA, 16:0/16:0-PA, 18:0/18:0-PA를 구비하였다.

액체크로마토그래피-질량 분석기(LC-MS)에 사용된 모든 HPLC grade 용매(메탄올(CH₃COOH), 아세토니트릴(CH₃CN), 이소프로필알콜(CH₃CHOHCH₃) 및 물(H₂O)은 Avantor Performance Materials (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다.

클로로포름(CHCl₃), 포름산(HCOOH) 및 수산화암모늄(NH₄OH)은 역시 HPLC grade로 Sigma Aldrich(st. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

2) 분석기기 및 장치

개발된 프로그램에서는 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무 이온화-탬덤질량분석법(nLC-ESI-MS-MS)을 사용하여 얻은 실험 데이터를 기반으로 테스트하였고, 표준물질 인지질(PL)과 정상인의 뇨으로부터 추출한 인지질(PL)이 사용되었다.

1200 시리즈 모세관 펌프 시스템(1200 series capillary pump system)(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)과 나노-전자분무이온화 소스(nano-electrospray ionization source)를 갖춘 LTQ 베로스 이온 포획 질량 분석기(LTQ Velos ion trap mass spectrometer)(Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA)가 로우 질량 스펙트럼 데이터를 발생시키기 위하여 사용되었다.

나노유속 액체크로마토그래피를 위하여 외경(o.d.)이 360 ㎛이고, 내경(i.d.)이 각각 20, 50, 75 ㎛인 실리카 모세관(silica capillary tubes)(Polymicro Technology LLC, Phoenix, AZ, USA)이 사용되었다.

분석컬럼을 직접 제작하기 위해서, 먼저 모세관(capillary tube)의 한쪽 끝을 불꽃으로 달군 후 늘어뜨려 이미터(emitter)를 만든 후, 모세 컬럼(75 ㎛ i.d. X 5 cm 길이)에 Magic C₁₈, 3 ㎛-100Å(Michrom Bioresources Inc., Auburn, CA, USA)를 직접 충진하였다.

컬럼 패킹을 위한 구성 및 기울기 용리(gradient elution)를 위한 시스템 구성은 종래에 사용되는 방법을 이용하였다. 여기서, 기울기 용 리(gradient elution)는 인간의 뇨로부터 인지질(PLs)을 분리하기 위해 이용된다.

3) 인지질의 추출 및 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석법(nLC-ESI-MS-MS)

(1) 인지질의 추출

뇨시료에 존재하는 지질을 추출하기 위해, 용매추출법(solvent extraction)의 한 방법인 폴츠분배법(Folch Method)을 이용하였다. 우선, 1 ml의 사람의 뇨를 액체 N₂를 이용하여 급속 냉각한 후, 12 시간 동안 동결건조하였다. 이 후, 침전물에 클로로포름과 메탄올이 2:1의 비율로 섞인 용매를 900 ㎕ 첨가 후, 20 분 동안 와류교반(vortexing) 하였다. 그 뒤, 180 ㎕ dH₂O 를 첨가하여 다시 5분간 와류교반한 뒤어, 13000 rpm에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 유기용매 층과 수용액 층을 분리하였다. 아래의 유기용매 층을 취한 후에, 원심 건조기(centrifugal dryer)에서 건조하였다. 건조가 종료되면 무게를 측정하여 1:1의 비율로 섞인 클로로포름과 메탄올로 농도에 맞게 녹여서 4℃에서 보관한다.

(2) 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석법(nLC-ESI-MS-MS)

사람의 뇨시료 속의 인지질들을 분리하기 위해서 기울기 용리(gradient elution) 기법을 사용하였는데, 이를 위해 사용한 두 개의 이동상(mobile-phase)은 A: 90/10(v/v) H₂O/CH₃CN(물/아세토니트릴), B: 20/20/60 CH₃CN/CH₃OH/CH₃CHOHCH₃(아세토니트릴/메타놀/이소프로필 알코올)이다.

질량분석기의 양이온 모드에서는 [M+Na]⁺로 표현되는 나트륨 부가체(sodium adduct)의 제거와, 이온화 효율을 높여 [M+H]⁺ 이온만을 검출하기 위해서 두 종류의 이동상 A와 B에 0.1%(v/v) 포름 산(HCOOH)을 넣어주었다. 또한, 음이온 모드에서는 [M-H]^- 이온만을 검출하기 위해서, 0.05%(v/v) 수산화 암모늄(NH₄OH)을 각각 넣어주었다.

유속은 500 nL/min으로 고정하였다. 기울기 용리 조건은 처음에 1분 동안 이동상 B를 0%에서 40%로 높이고, 44분 동안 이동상 B를 40%에서 90%로 서서히 비율을 높인 후, 마지막에 100%의 이동상 B로 10분간 흘려주는 방법을 양이온모드와 음이온모드에서 채택하였다.

전자분무이온화(ESI)를 위해서, 3 kV가 사용되었다. 질량분석 스펙트럼(MS)의 m/z 범위는 양이온 모드에서 450-950이고, 음이온 모드에서 380-950이였다. 충돌유도분해(Collision-induced dissociation, CID)에서, 정상화된 충돌 에너지(normalized collision energy)는 양이온, 음이온 모드에서 모두 40%로 고정하였다. 나노유속 액체크로마토그래피(nLC)에서 인지질들의 위치이성질체가 분리되어 검출되기 때문에, 세 번의 반복측정 이후에는 충돌유도분해(CID)를 하지 않도록 표준 인지질들로부터 얻은 크로마토그램을 참고로 LC조건, peak의 폭 등을 고려하여 30초 정도로 제외시간(exclusion time)을 설정하였다.

4) LiPilot 프로그램 제작

LiPilot 프로그램은 Windows C++언어를 통하여 제작되어 윈도우 기반의 어느 PC에서도 사용할 수 있도록 하였다. LiPilot은 Thermo Scientific 사의 XCalibur 프로그램으로부터 얻은 이온 트랩 질량 분석기(ion trap mass spectrometer)의 실험데이터를 변환한 텍스트 파일(text file)을 불러들일 수 있도록 설계되었다. 또한, 프로그램은 분석하고자 하는 타겟 물질을 csv(comma-separated values) 파일형식을 이용해서 불러들일 수 있도록 하였다.

2. 실험 결과

1) 라이브러리(Library) 제작

라이브러리 파일은 반드시 csv(comma-separated value) 형식으로 생성되는데, 각 인지질(PL)의 헤드기(head group) 별로 제작한다. 각 라이브러리 파일은 아실 사슬(acyl chain)의 다양성에 따른 이론적으로 계산된 충돌유도분해(CID) 스펙트럼의 이론 m/z 값들이 나열되어 있다. 이와 같은 작업은 인지질 분자들이 헤드기(head group) 별로 충돌유도분해(CID) 스펙트럼의 패턴, 피크(peak)의 개수 등에 차이를 보이기 때문에 필요하다.

예를 들어, 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)의 라이브러리 같은 경우는 총 7개의 조각 이온(fragment ion)을 충돌유도분해(CID) 스펙트럼으로부터 관찰할 수 있는데, 생물학적으로 체내에서 합성되는 인지질(PL)을 구성하는 아실 사슬(acyl chain)의 탄소원자의 개수는 대개 14 ~ 22개로 알려져 있는 사실과 이 7개 피크들의 이론 값들을 모든 아실 사슬(acyl chain)의 종류에 따라 계산하여 리스트(list)를 만든 것이다. PS 분자들은 질량분석기의 음이온모드에서 관찰되기 때문에, PS의 라이브러리(library)도 음전하를 띄는 조각 이온(fragment ion)으로 계산하여 제작되었다. 같은 원리가 다른 인지질(PL)의 헤드기(head group)들에 대해서도 적용되어, 도 1에 조각 이온(fragment ion)들의 목록을 헤드기(head group) 별로 정리하였다.

도 1에도 나타난 바와 같이, PS, PG, PI, PA, PC, 및 PE 헤드기(head group)들의 조각 이온(fragment ion) 라이브러리 파일은 질량분석기의 음이온모드로부터 얻은 조각 이온(fragment ion)들을 분석할 수 있도록 제작하였고, PC와 PE는 양이온모드에서 분석할 수 있도록 하였다.

2) 데이터의 도입

프로그램을 이용한 분석의 전체적인 흐름을 도 2에 표현하였다.

초기 질량분석 스펙트럼(raw format (.raw))은 머무름 시간(retention time) 별로 전구체 물질(precursor mass)의 m/z값과 질량 스펙트럼 강도(intensity) 및 조각 이온(fragment ion)과 그에 상응하는 전구 이온(precursor ion)의 정보 등을 담고 있다. 이 로우 파일(raw file)은 프로그램에 불러들이기에 앞서 텍스트 파일의 형태(.txt)로 변환이 되어야 한다. 이 변환은 Thermo Finnigan 사에서 제공하는 XCalibur 프로그램에서 데이터의 수집 이후에 즉시 얻을 수 있다.

상기 텍스트 파일은, 파일이 포함하는 스캔(scan)의 개수, 분석시간, m/z 범위(range) 등의 실험의 전반적인 정보를 제공하는 헤더(header)를 시작으로 각 스캔(scan)의 데이터의 각 머무름 시간마다 m/z 값과 MS 강도(intensity) 값을 포함한다.

LiPilot을 활용한 프로그램분석은 프로그램으로 라이브러리와 텍스트 파일 형태의 데이터 파일을 불러들이는 것으로 시작하는데, nLC-MS-MS 데이터 파일을 로딩하고, 도 2의 플로우 차트(flow chart)에서처럼, 조각(fragment) 패턴 별로 계산매개변수를 설정하는 작업도 같이 수행한다. 라이브러리는 분석하고자 하는 인지질의 헤드기(head group)별 파일을 한 번에 불러들임으로써, 한 개의 파일에서 여러 종류의 인지질을 동시에 정성 분석할 수 있게 된다. 이 단계에서, 텍스트 파일의 사이즈 축소가 필요한데, 이는 갓 변환된 텍스트파일에는 분석에 필수적인 m/z 값, MS 강도(intensity) 등의 데이터 이외에도, 데이터 종속 CID-스펙트럼(data-dependent CID spectra)를 갖지 않는 전구체 물질(precursor mass)들의 데이터 등의 많은 불필요한 데이터들이 포함되어 있기 때문이다. 이 과정을 수행함으로써, 텍스트파일의 크기를 1/10 이하로 줄이고, 프로그램의 구동시간도 단축할 수 있다.

즉, 프로그램의 구동에 필요한 실험데이터 파일에는 머무름 시간, 전구체 물질(precursor mass)의 m/z 값, 충돌유도분해(CID) 스펙트럼 내의 조각 이온(fragment ion)들의 m/z 값과 MS 강도(intensity) 값 등이 반드시 필요하다.

3) 계산 매개변수의 설정

라이브러리와 데이터 파일을 불러들인 후, 개산 매개변수(calculation parameters)를 설정한다. 이 매개변수 (parameters)는 검색알고리즘이 인지질(PL)을 찾아내는데 있어 그 식별 가능성을 높여주는 역할을 한다. 매개변수(parameters) 선택은 같은 인지질(PL)에 대해서도 질량분석기에 따라 얻어지는 조각(fragment)의 패턴이 다르기 때문에 실험방법 별로 그에 맞는 설정을 해야 한다.

예를 들어, 도 3은 LTQ 베로스 이온 포획 질량 분석기(LTQ Velos linear ion trap mass spectrometer)를 사용한 nLC-ESI-MS-MS 실험을 통해 얻은 사람 뇨 샘플로부터 PI 분자의 데이터 종속 충돌유도분해(CID) 스펙트럼을 보여주는데, 이는 18:0/22:6-PI로 표기한다. 초기 텍스트 파일로부터 축소, 집약된 임시 텍스트 파일은 909.6 m/z 값을 가지는 [M-H]^- 전구 이온(precursor ion)이 가지는 특정한 패턴의 충돌유도분해(CID) 스펙트럼을 보여주는데, 이 충돌유도분해(CID) 스펙트럼은 인지질의 헤드기(head group)에 대한 정보와, 두 개의 아실 사슬(acyl chain)의 위치 및 길이, 불포화도(degree of unsaturation)에 대한 정보도 함께 제공한다.

조각 이온(Fragment ion)의 m/z 643.3과 599.3은 각각 전구 이온(precursor ion)으로부터 얻어지는 케톤(ketone)형태에서 지방산이 손실된 [M-H-R₁‘CH=C=O]^- 와 [M-H-R₂’CH=C=O]^- 을 나타낸다. 유사하게 카로본산 형태에서 아실 사슬(acyl chain)이 떨어지는 m/z 값 625.3 ([M-H-R₁COOH]^-)과 581.2 ([M-H-R₂COOH]^-)도 관찰된다. PI 분자의 조각 이온(Fragment ion) 중에서 이노시톨 헤드기(head group)가 떨어지는 [M-H-162]- 의 피크(peak)는 관찰되지 않았다. PC와 PE의 경우 헤드기(head group)가 떨어져 나오는 피크(peak)들이 관찰된다. 그러나, PI에서는 헤드기(head group) 없이 어미 이온(parent ion)으로부터 분리되는 피크(peak)(m/z 481.4의 [M-H-162-R₁‘CH=C=O]^-와, 437.2의 [M-H-162-R₂‘CH=C=O]^-)가 관찰된다. 이와 비슷하게 헤드기(head group) 없이 어미 이온(parent ion)으로부터 카르복실 산이 떨어지는 463.2([M-H-162-R₁COOH]^-)와 419.2([M-H-162-R₂COOH]^-)도 관찰된다. 더 나아가, 아실 사슬(acyl chain)의 프리 카르본산염 음이온이 m/z값 283.3([R₁COOH]^-)과 327.3([R₂COOH]^-)으로 관찰된다.

PI의 충돌유도분해(CID) 스펙트럼에서는 [M-H-R₂COOH]^- 피크(peak)가 [M-H-R₁COOH]^- 보다 강도(intensity)가 큰 반면, [R₁COO]^- 가 [R₂COO]^- 보다 강도(intensity)가 크다. 이러한 결과는 기존의 연구결과에서도 찾아볼 수 있듯이, 아실 사슬(acyl chain)의 위치를 결정하는 데에 이용될 수 있다.

LiPilot 프로그램에서 계산 매개변수(parameter)들을 설정하는 첫 단계에서, 분석하고자 하는 인지질의 헤드기(head group)를 질량분석기의 분석모드(양이온모드, 음이온모드)별로 선정해주어야 한다. 다음으로, 도 4a에서 보이는 바와 같이, 우측에 기존에 만들어 놓은 라이브러리 파일들을 불러들인다. 예를 들어, PI_LTQ_Velos_N은 PI 분자들의 라이브러리로, LTQ Velos 질량분석기를 사용하였고, 음이온 모드에서 분석하였을 때 사용하는 라이브러리 파일이라는 것을 말한다. 각 파일마다 프로그램 내에서 필요한 조각 피크(fragment peak)들만으로 임시 라이브러리를 다시 구성하는데, 이는 ‘Set Peak’ 패널(도 4a)에서 어떤 조각(fragment) 들로 구성할 것인지 선택할 수 있다. 인지질의 위치이성질체를 구분하기 위해서, 프로그램의 ‘Set Factor’ 기능을 통해서 수행할 수 있는데, LTQ Velos 이온 트랩 질량분석기에서 특정하게 보이는 조각 이온(fragment ion)들을 선택하여야 한다.

예를 들어, 18:0/22:6-PI와 22:6/18:0-PI는 위치이성질체로써, 관찰되는 조각 이온(fragment ion)들의 종류와 m/z값들은 모두 같지만, [M-H-R₁COOH]^-/[M-H-R₂COOH]^-와 같은 피크(peak)들의 강도(intensity)비율은 다르다. 따라서 도 4a에서처럼 [M-H-R₂COOH]^-를 팩터로 설정하거나, [R₁COO]^-를 팩터로 설정하고, 식(1)에 연결되어 신뢰점수(confidence score)를 계산할 때 사용된다. 리소인지질(LPLs)을 포함하는 인지질(PLs)의 위치이성질체는 C18 고정상에서 nLC-ESI-MS-MS 분석에서 머무름 시간의 차이에 의해 특정될 수도 있으나, 본 프로그램에서는 받아들여지지 않는다.

도 4b는 불필요한 데이터를 제거하기 위해 사용되는 추가적인 매개변수(parameter)들을 설정하는 프로그램의 한 패널을 보여준다. 이 매개변수들은 분석하고자 하는 m/z의 범위, 머무름 시간의 범위, 같은 결과를 여러 번 보여주는 것을 막기 위한 동적제외(dynamic exclusion)기능, precursor mass 범위, fragment mass 범위 등의 설정이 있다.

4) 신뢰점수

nLC-ESI-MS-MS로부터 얻은 인지질(PL) 분자들의 데이터 분석은 LiPilot이 라이브러리 파일로부터 MS-MS 데이터를 이용하여 후보 인지질 분자들을 선택하는 것으로 시작하여 다음과 같은 과정으로 진행된다.

도 5a에 나타나듯이, 실험데이터로부터 하나의 조각 이온(fragment ion) 스펙트럼을 불러들여 전구 이온(precursor ion)의 m/z값이 선택되면, LiPilot은 라이브러리 파일로부터 초기결과를 선택한다. LiPilot은 실험값의 전구 이온(precursor ion) m/z값과, 라이브러리의 이론적으로 계산된 인지질들의 전구 이온(precursor ion) m/z 값들을 비교하여, 도 4b에 있는 ‘precursor mass width’가 적용된 초기결과들을 도출하게 된다. 전구 이온 질량 폭(Precursor ion mass width)은 실험자가 임의로 지정할 수 있는 값으로, 전구 이온(precursor ion) m/z 값을 통하여, 초기결과를 도출할 때 사용되는 간격을 말한다.

예를 들어, 폭(width) 값이 0.5로 지정되고, 전구 이온(precursor ion)의 실험값이 788.5 일 때, LiPilot은 라이브러리로부터 788.0 내지 789.0 사이의 이론 전구 이온(precursor ion) m/z값을 가지는 모든 인지질의 후보군을 초기결과로 임시 저장한다(도 5b 및 5c). 도 5c는 실험데이터의 아실 사슬을 가지는 전구 이온(precursor ion) ([M-H]^-) m/z 788.06을 가질 수 있는 4개의 PS 후보 결과들을 보여주고 있다. 그 다음, LiPilot은 각 후보군의 이론 조각 이온(fragment ion) m/z 값들에 가장 가까운 실험값을 대응시킨다. 4개의 후보군 중, 제일 위에 있는 후보의 충돌유도분해(CID) 스펙트럼에서, [R₁COO]^-와 [R₂COO]^-의 실험데이터 m/z 값 283.3과 281.3에 가장 가까운 이론 m/z값은 각각 283.48과 281.46 이다(도 5b). 이런 방식으로, 각 후보군들은 라이브러리(library)의 이론 조각 이온(fragment ion)의 m/z 값에 상응하는 가장 가까운 실험 m/z 값을 대응시킨다. 도. 5d의 첫 번째 줄에 있는 PS 후보의 경우, 각 이론 조각(fragment) m/z 값에 대응하는 가장 가까운 실험 m/z값을 바로 아래에 나타내었다. 이론 m/z 값과 실험 m/z 값의 차이가 적은 후보분자를 고르기 위하여, 본 연구의 핵심인 ‘신뢰점수(Confidence Score)’를 개발하였다.

<식 1>

상기 수학식 1에서, i는 수집부에 수집된 한 개의 질량 스펙트럼에서 관찰된 피크(peak)들 중에서 라이브러리의 이론 m/z 값에 대응되는 피크(peak)의 개수이고,

N은 수집부에 수집된 질량 스펙트럼에서 관찰된 총 피크의 개수이며,

는 이론 m/z 값과의 비교과정에서 선택된 실험 m/z 값에 해당하는 피크의 강도(intensity)들의 합이고,

I_factor는 위치이성질체의 구분을 위하여 선정된 조각(fragment) 이온의 강도 값이며,

은 이론값과의 비교과정에서 선택되지 않은 나머지 피크들의 강도들의 합이고,

은 이론값과 대응된 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 실험 m/z 값이며,

은 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 이론 m/z 값을 나타낸다.

PS 분자의 경우, [M-H-head-R₂COOH]^- 의 강도(intensity)는 [M-H-head-R₁COOH]^-의 강도(intensity)보다 실험적으로 더 크다. 이를 이용하여, PS의 정성분석 시에는, [M-H-head-R₂COOH]^- 를 Ifactor로 설정하여, sn-1과 sn-2의 아실 사슬(acyl chain)의 구성의 차이에 따른 위치이성질체를 구분하였다. PS를 포함한 다른 인지질 분자들의 종류에 대해서는 도 1에 채워진 원으로 표기하였다. PS같은 경우, [M-H-head]^- 가 추가적인 Ifactor로 설정되었는데, 이는 [M-H-head]^-가 충돌유도분해(CID) 스펙트럼에서 매우 강도(intensity)가 커서, 점수(score)의 최적화하고, PS 분자들을 찾아내는 데에 큰 효과를 나타내기 때문이다. 신뢰 점수(Confidence Score)의 뒤에 부분은 이론 m/z값과 실험 m/z값의 차이들의 표준편차의 역수 값이다. 이 값은, m/z값들의 차이를 고려하여, 이론 m/z 값과 실험 m/z 값의 차이가 적을수록, 원하는 결과에 가까워지도록 하기 위해서 추가되었다.

도 5e에 각 후보분자들마다 신뢰 점수(confidence Score)의 각 항목별 계산결과 및 신뢰 점수(confidence Score) 값도 나타내었다.

예를 들어, 위에 두 개의 PS 후보결과들은 다른 후보들에 비해 더 큰 신뢰 점수(confidence score)를 가진다. 하지만, I_factor의 적용으로 18:0/18:1-PS가 131.45의 신뢰 점수(confidence score) 값으로 18:1/18:0보다 더 크다.

위치이성질체의 선택적인 식별을 보다 분명히 하기 위하여, 14:0/16:0-PC와 16:0/14:0-PC가 1:1 비율로 섞인 표준물질의 혼합물을 nLC-ESI-MS-MS를 이용하여 분석한 결과를 사용하였다.

도 6는 두 위치이성질체(regioisomer)의 m/z 706.7의 37.35분과 37.61분에서 얻은 데어터 종속(data-dependent) 충돌유도분해(CID) 스펙트럼과 함께, BPC를 보여주고 있다. 비록, 두 분자가 구조상 매우 비슷한 모양과 구성을 가지고 있는 이유로 완벽하게 분리가 되지는 않았지만, 충돌유도분해(CID)의 패턴은 [M+H-R₂‘CH=C=O]⁺ 이온과 [M+H-R1‘CH=C=O]⁺ 중, 앞의 조각(fragment)이 생성되는 것이 보다 쉽다는 점을 참고하여, 상대적인 강도(intensity)의 차이를 통해서 두 개의 다른 분자가 존재함을 분명하게 보여주고 있다. LiPilot을 통한 분석결과는 다른 후보결과들의 신뢰 점수(confidence score)와 확연하게 차이나는 신뢰 점수(confidence score) 값을 가지는 두 분자(14:0/16:0-PC는 660.0, 16:0/14:0-PC는 391.6)만을 선택적으로 도출하였다.

이와 함께, 기존에 연구된 LPC분자의 위치이성질체들 중, sn-1에 아실 사슬(acyl chain)이 위치하는 분자가 sn-2에 위치한 분자보다 더 긴 머무름 시간을 보이며 분리되는 것과 마찬가지로, 두 아실 사슬(acyl chain)의 구성이 다른 PC의 위치이성질체도 머무름 시간의 차이로도 두 분자가 구분되는 것을 볼 수 있다.

이와 같은 방법으로, 다른 인지질(PC, PE, PS, PI, PG, PA) 및 리소인지질(LPC, LPE, LPS, LPI, LPG, LPA)도 성공적으로 식별할 수 있다. 하지만, 각 지질 라이브러리의 종류별로 다른 조각(fragment) 들이 선택되기 때문에, 신뢰 점수(confidence score)의 값 자체가 서로 다른 인지질의 종류끼리의 비교에는 사용될 수 없다. 하지만, 한 가지 지질의 종류 내에서의 신뢰 점수(confidence score)의 비교는 다소 유의미한 결과를 도출할 수 있다.

5) 인지질 표준 물질을 이용한 LiPilot의 성능 검증

신뢰 점수(Confidence score)가 계산된 뒤, 필요 없는 결과들을 제거하기 위한 기본적인 여러 여과기능이 필요하다. 전구 질량 폭(Precursor mass width)은 신뢰 점수(confidence score)의 계산에 직접적으로 포함되어있지 않지만, 실험 m/z값과 이론 m/z값의 비교를 통해 얻어지는 SDD값,

, 은 의미 있는 결과로의 가능성이 있는 인지질을 찾아내기 위한 중요한 역할을 한다. 만약 SDD 값이 인지질의 종류별로 매우 다르게 필요하다면, 각 라이브러리 별로 SDD값을 설정해줄 수 있도록 프로그램을 설계할 수 있다. 도 7은 전구 이온(Precursor ion)와 조각 이온(fragment ion)들의 m/z값들에 대해서 모두 1.0을 적용하여, 여러 가지의 인지질 표준물질을 사용하여 얻은 데이터를 사용한 결과를 LiPilot을 통해 분석한 결과를 보여주고 있다. 도 7에 나타나듯이 출력된 각각의 인지질 구조마다 SDD값과, 신뢰 점수(confidence score)값을 보여주고 있다. 사용된 인지질 표준물질의 SDD값들을 보면, 모두 1.0 미만으로 나타났다. 도 7는 SDD값의 설정에 따라 도출되는 결과의 인지질 수를 보여준다. PS의 경우, SDD값을 3으로 설정하였을 때, 3개의 PS 표준물질(흑색 막대)을 포함하는 32개의 분자(백색 막대)가 결과로 도출되었다. 하지만, SDD값을 0.3으로 설정하면, 사용된 3개의 PS 표준물질 중에서, 2개만 결과로 도출된다. 이와 같이, 프로그램을 사용한 성공적인 인지질의 정성분석을 위해서는 SDD 값은 각 인지질의 헤드기(head group)별로 다르게 설정되어야 한다는 것을 확인할 수 있다. 도 7의 왼쪽 아래의 그림을 보면, 4개의 서로 다른 인지질을 성공적으로 검출하기 위해서는 SDD값이 최소한 1.0보다는 커야한다는 것을 보여 준다. 하지만, 이 SDD 값에서의 결과물은 우리가 원하지 않는 결과물도 출력하기 때문에, 분석자의 재검토가 필요하다. 프로그램을 사용한 식별 성공률을 높이기 위해서, 라이브러리의 이론 m/z값과 대응된 실험 m/z값들에 해당하는 강도(intensity)들을 제외한 나머지 강도(intensity)들의 합인 수식의 값을 비교하면 도움이 되는데, 이는 신뢰 점수(confidence score) 값 자체와 큰 연관성이 있기 때문이다. 예를 들어, 거짓결과로 도출된 20:0/12:0-PA(도 7의 표 5번째 줄)같은 경우, 신뢰 점수(confidence score)가 올바른 결과로 도출된 다른 PA들에 비해서 현격하게 작다(~100 대 2-19 × 10⁶). 다른 종류의 인지질의 결과에서도 마찬가지로, 사용된 인지질의 표준물질들의 신뢰 점수(confidence score)가 거짓 양성결과들의 그것보다 4만 배 이상 차이나는 것을 확인할 수 있다. 따라서 신뢰 점수(confidence score)는 표준물질을 이용하여 미리 여러 설정들을 확인하고, 매개변수 조건들을 최적화한 후에 사용되어야 한다.

LiPilot 프로그램에서, 도 4b에서와 같이, 분석결과의 여과 및 최적화를 위한 SDD의 최대값과, 신뢰 점수(confidence score)의 최소값은 분석하고자 하는 인지질의 종류별로 각각 설정하여 줄 수 있다.

5) LiPilot을 이용한 노시료로부터 추출한 인지질의 식별

도 4의 조건들로 nLC-ESI-MS-MS로부터 얻은 사람의 뇨시료 내의 인지질을 분석하였다. 분석 결과, 도 8에 나타나듯이, 인지질의 이성질체(isomer)나 동중원소(isobar)를 구분할 때 사용할 수 있도록, LC의 실험조건에 따라 신뢰점수 값이 매우 다양하게 나타났다.

LiPilot은 93종의 인지질(26개의 PC, 15개의 PE, 19개의 PS, 11개의 PG, 20개의 PI, 2개의 PA)과 22종의 리소인지질(4개의 LPC, 7개의 LPE, 2개의 LPS, 1개의 LPG, 1개의 LPI, 7개의 LPA)를 검출하였다. LiPilot이 찾은 대부분의 종들은 매우 큰 신뢰점수를 나타냈지만, 몇몇 종들은 상대적으로 낮은 신뢰점수 값(<100)을 보였는데, 이는 CID 스펙트럼을 실험자가 직접 확인하여 결과로 확정하였다. 같은 m/z 값을 가지는 18:1/18:1-PS와 18:0/18:2-PS같은 isobar 종들도 본 연구에서 개발한 프로그램으로 분명하게 구분할 수 있었다.

LiPilot의 또다른 장점 중 하나는 분석하고자하는 여러 실험 데이터를 한 번에 불러들여서, 한 종류의 물질이 어떤 실험 파일들에서 동시에 검출되었는지 판단할 수 있다는 점이다.

Claims (22)

1. 지질의 질량 스펙트럼의 이론 정보를 포함하는 라이브러리;
   질량분석기를 이용하여 지질 시료로부터 질량 스펙트럼의 실험 정보를 수집 및 저장하는 수집부;
   상기 라이브러리의 질량 스펙트럼의 이론 정보 및 상기 수집부의 질량 스펙트럼의 실험 정보로부터 신뢰점수를 계산하는 연산부;
   상기 계산된 신뢰점수를 바탕으로 지질 시료의 종류를 선택하는 검색부를 포함하고,
   상기 라이브러리의 이론 정보 및 수집부의 실험 정보는 지질의 헤드기에 따른 전구 이온의 m/z 값, 조각 이온의 m/z 값 또는 MS 강도를 포함하며,
   상기 신뢰점수의 계산은 라이브러리 및 수집부의 조각 이온의 m/z 값 및 MS 강도를 이용하여 계산하고,
   상기 신뢰점수는 하기 수학식 1에 의해 계산되는 지질 분석 시스템:
   <수학식 1>
   

   

   
   
   상기 수학식 1에서, i는 수집부에 수집된 한 개의 질량 스펙트럼에서 관찰된 피크(pea k)들 중에서 라이브러리의 이론 m/z 값에 대응되는 피크(peak)의 개수이고,
   N은 수집부에 수집된 질량 스펙트럼에서 관찰된 총 피크의 개수이며,
   

   

   는 이론 m/z 값과의 비교과정에서 선택된 실험 m/z 값에 해당하는 피크의 강도(intensity)들의 합이고,
   Ifactor는 위치이성질체의 구분을 위하여 선정된 조각(fragment) 이온의 강도 값이며,
   

   

   은 이론값과의 비교과정에서 선택되지 않은 나머지 피크들의 강도들의 합이고,
   

   

   은 이론값과 대응된 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 실험 m/z 값이며,
   

   

   은 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 이론 m/z 값을 나타낸다.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   지질은 인지질 또는 리소인지질인 지질 분석 시스템.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   수집부는 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기에 의해 측정된 지질의 질량 스펙트럼 정보를 수집 및 저장하는 지질 분석 시스템.
   
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서,
   지질의 헤드기는 포스파티딜콜린(PC), 리소포스파티딜콜린(LPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 리소포스파티딜에탄올아민(LPE), 포스파티딜세린(PS), 리소포스파티딜세린(LPS), 포스파티딜이노시톨(PI), 리소포스파티딜이노시톨(LPI), 포스파티딜글리세롤(PG), 리소포스파티딜글리세롤(LPG), 포스파티딘 산(PA) 및 리소포스파티딘 산(LPA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 지질 분석 시스템.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   질량분석기의 분석 모드, 조각 이온의 설정 피크(set peak) 및 지질의 이성질체를 구분하기 위해 선정된 설정 인자(set factor)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수를 설정하는 제 1 매개변수 설정부를 추가로 포함하는 지질 분석 시스템.
   
7. 제 1 항에 있어서,
   라이브러리의 m/z 값(이론 m/z 값)과 수집부의 m/z 값(실험 m/z 값)의 차이들의 표준편차(SDD)의 최대값 및 신뢰점수의 최소값으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수를 설정하는 제 2 매개변수 설정부를 추가로 포함하는 지질 분석 시스템.
   
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서,
   신뢰점수는 이성질체의 구분을 위해 선정된 설정 인자(I_factor)의 MS 강도를 추가로 이용하여 계산하는 지질 분석 시스템.
   
10. 삭제
11. 지질의 질량 스펙트럼의 이론 정보 및 질량분석기에 의해 측정되는 지질 시료의 실험 정보를 이용하여 신뢰점수를 계산하는 단계; 및
    상기 계산된 신뢰점수로 지질의 종류를 선택하는 단계를 포함하고,
    상기 이론 정보는 지질의 헤드기별로 계산된 전구 이온의 이론 m/z 값, 조각 이온의 이론 m/z 값 또는 MS 강도이며,
    상기 실험 정보는 질량분석기에 의해 측정된 머무름 시간(t_r)에 따른 전구 이온의 실험 m/z 값, 조각 이온의 실험 m/z 값 또는 MS 강도이고,
    상기 신뢰점수의 계산은 조각 이온의 m/z 값 및 MS 강도를 이용하며,
    상기 신뢰점수는 하기 수학식 1에 의해 계산되는 지질 분석 방법:
    <수학식 1>
    

    

    
    
    상기 수학식 1에서, i는 수집부에 수집된 한 개의 질량 스펙트럼에서 관찰된 피크(pea k)들 중에서 라이브러리의 이론 m/z 값에 대응되는 피크(peak)의 개수이고,
    N은 수집부에 수집된 질량 스펙트럼에서 관찰된 총 피크의 개수이며,
    

    

    는 이론 m/z 값과의 비교과정에서 선택된 실험 m/z 값에 해당하는 피크의 강도(intensity)들의 합이고,
    Ifactor는 위치이성질체의 구 분을 위하여 선정된 조각(fragment) 이온의 강도 값이며,
    

    

    은 이론값과의 비교과정에서 선택되지 않은 나머지 피크들의 강도들의 합이고,
    

    

    은 이론값과 대응된 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 실험 m/z 값이며,
    

    

    은 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 이론 m/z 값을 나타낸다.
    
12. 제 11 항에 있어서,
    지질은 인지질 또는 리소인지질인 지질 분석 방법.
    
13. 삭제
14. 제 11 항에 있어서,
    지질 시료의 실험 정보는 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석기에 의해 측정되는 지질 분석 방법.
    
15. 삭제
16. 제 11 항에 있어서,
    신뢰점수를 계산하는 단계 전에 질량분석기의 분석 모드를 선정하는 단계; 조각 이온의 설정 피크(set peak)를 선정하는 단계; 및
    지질의 이성질체를 구분하기 위해 설정된 설정 인자(set factor)를 선정하는 단계로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 매개변수를 설정하는 단계를 추가로 포함하는 지질 분석 방법.
    
17. 제 11 항에 있어서,
    신뢰점수를 계산하는 단계 전에 이론 m/z 값 및 실험 m/z 값의 차이들의 표준편차(

    

    , SDD)의 최대값을 선정하는 단계; 및
    신뢰점수의 최소값을 선정하는 단계로 이루어진 그룹으로부터 선 택된 하나 이상을 포함하는 매개변수를 설정하는 단계를 추가로 포함하는 지질 분석 방법:
    상기 표준편차에서, i는 수집부에 수집된 한 개의 질량 스펙트럼에서 관찰된 피크(pea k)들 중에서 라이브러리의 이론 m/z 값에 대응되는 피크(peak)의 개수이고,
    N은 수집부에 수집된 질량 스펙트럼에서 관찰된 총 피크의 개수이며,
    

    

    은 이론값과 대응된 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 실 험 m/z 값이고,
    

    

    은 실험 조각 피크(fragment peak)들 중, k번째 피크(peak)의 이론 m/z 값을 나타낸다.
    
18. 제 11 항에 있어서,
    신뢰점수를 계산하는 단계는 전구 이온 실험 m/z 값과 유사한 전구 이온 이론 m/z 값을 가지는 후보군을 선정한 후, 상기 후보군의 신뢰점수를 계산하는 지질 분석 방법.
    
19. 삭제
20. 제 11 항에 있어서,
    신뢰점수를 계산하는 단계는 이성질체의 구분을 위해 선정된 설정 인자(I_factor)의 MS 강도를 추가로 이용하는 지질 분석 방법.
    
21. 삭제
22. 컴퓨터에 제11항에 따른 지질 분석 방법을 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체.

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