CN110494750A - 效应性调节性t细胞的检测方法、效应性调节性t细胞的分析装置、效应性调节性t细胞的分析系统和程序 - Google Patents

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Abstract

一种使用流式细胞术法的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，对包含CD4阳性T细胞群的对照试样进行测定，取得在基于对照试样的测定结果将CD4阳性T细胞群中所含的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准的FOXP3量作为生物试样的测定中使用的基准值，对包含CD4阳性T细胞群的生物试样进行测定，基于生物试样的测定结果，从FOXP3量比基准值多的细胞群中检测效应性调节性T细胞。

Description

效应性调节性T细胞的检测方法、效应性调节性T细胞的分析 装置、效应性调节性T细胞的分析系统和程序
技术领域
本发明涉及效应性调节性T细胞的检测方法、效应性调节性T细胞的分析装置、效应性调节性T细胞的分析系统和程序。
背景技术
CD4阳性的调节性T细胞(Treg)是承担免疫应答抑制的核心作用的T细胞。在CD4阳性T细胞中，表达IL-2受体α链即CD25和调节性T细胞的转录因子FOXP3的T细胞被定义为调节性T细胞。另外，根据CD45RA的表达量和FOXP3的表达量而将调节性T细胞分为初始型、效应型和不具有免疫抑制活性的类型(非活性型)。已知其中的效应性调节性T细胞(eTreg)具有强免疫抑制活性，与抗癌免疫的诱导密切相关。因此，在自身免疫、抗癌免疫等领域中期待对效应性调节性T细胞进行进一步分析。
以下的非专利文献1中记载了：通过使用流式细胞仪的分析能够将调节性T细胞分为初始型、效应型和非活性型。这里，将CD45RA和FOXP3分别进行荧光标记，由利用流式细胞仪得到的检测结果构成图21所示的散点图。在该散点图中，区域401、402、403中所含的调节性T细胞分别属于初始型、效应型和非活性型。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Hiroyoshi Nishikawa、外1名、"RegulatoryT cells in cancerimmunotherapy"、Current Opinion in Immunology、2014年、Volume 27、p.1-7
发明内容
发明要解决的课题
但是，根据试样，存在初始型、效应型和非活性型的区域变得不明确、不能恰当地设定这些区域的边界的情况。因此，对于这种试样，不能精度良好地检测效应性调节性T细胞。
鉴于所述课题，本发明的目的在于，提供能够精度良好地检测效应性调节性T细胞的效应性调节性T细胞的检测方法、效应性调节性T细胞的分析装置、效应性调节性T细胞的分析系统和程序。
用于解决课题的手段
本发明的第一方式涉及一种使用流式细胞术法的效应性调节性T细胞的检测方法。在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，对包含CD4阳性T细胞群的对照试样进行测定，取得在基于对照试样的测定结果将CD4阳性T细胞群中所含的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准的FOXP3量作为生物试样的测定中使用的基准值(S13)，对包含CD4阳性T细胞群的生物试样进行测定(S22)，基于生物试样的测定结果，从FOXP3量比基准值多的细胞群中检测效应性调节性T细胞(S23)。
对照试样是指：为了取得生物试样的测定中使用的基准值而实施测定的试样，例如，包含与健康人同等的外周血单核细胞群。对照试样广泛包含：健康人的外周血本身；包含由健康人的外周血通过密度梯度法纯化而得的外周血单核细胞的试样等。FOXP3量是表示细胞中以何种程度包含FOXP3的值。健康人是指：未罹患特定的慢性疾病、日常生活无障碍的人。
根据本方式的效应性调节性T细胞的检测方法，将对对照试样进行测定而得到的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割而设定基准值，因此可以统一地设定基准值。另外，通过使用对照试样，如以下的实施方式所示即使测定环境改变也可以恰当地设定基准值。进一步地，由于预先对对照试样进行测定而取得基准值，因此可以将对应于测定环境的基准值设定为生物试样的测定时的基准值。从而，根据本方式的检测方法，由于可以统一地且恰当地设定生物试样测定时使用的基准值，因此可以高精度且稳定地检测效应性调节性T细胞。
在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，在一生物试样的每一测定中进行对照试样的测定而取得基准值，将取得的基准值用于一生物试样的测定中的效应性调节性T细胞的检测。由于这样地在生物试样的每一测定中设定基准值，因此可以设定与生物试样测定时的测定环境相适合的基准值。由此，可以提高效应性调节性T细胞的检测精度。
在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，在多个生物试样的每一测定中进行对照试样的测定而取得基准值，将取得的基准值用于多个生物试样的各测定中的效应性调节性T细胞的检测。这样可以减少对照试样的测定频度，因此可以提高生物试样的测定效率。该方法如利用装置自动制备和测定生物试样时那样，可在均一条件下制备和测定多个生物试样时特别有效。需要说明的是，当试剂的批次改变的时刻，试剂的状态也可能改变，因此即使是利用装置自动制备和测定生物试样的情况下，也优选再度利用对照试样设定基准值。
在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，对基于对照试样的测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群的整体应用比而取得基准值(S108)。
这种情况下，按照以下方式来设定比：基于对照试样的测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群的总细胞数中，FOXP3的量多者的细胞的数量的比例为57％以上且72％以下。如以下的实施方式所示，通过这样设定比可以恰当地设定基准值。
另外，可以按照以下方式来设定比：基于对照试样的测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群中，FOXP3的量多者的细胞的数量相对于FOXP3的量少者的细胞的数量的比率为1.35以上且2.48以下。如以下的实施方式所示，通过这样设定比可以恰当地设定基准值。
在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，在将基于对照试样的测定结果得到的CD4阳性T细胞群展开为以FOXP3的量为轴的柱状图(71)时，将具有柱状图(71)中的FOXP3阴性侧的峰波形的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群确定为FOXP3阳性T细胞群(S107)。这样可以恰当地确定FOXP3阳性T细胞群。
这种情况下，在对柱状图(71)中的FOXP3阴性侧的峰波形应用近似曲线时，将近似曲线与轴在FOXP3量的高值侧交叉的点设为结束点。这样可以统一地设定结束点。
在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，对基于对照试样的测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群中CD45RA阴性群应用比，取得基准值(S108)。这样，在取得基准值时成为噪声的细胞被除去，因此可以进一步提高基准值的精度。
这种情况下，按照以下方式设定比：基于对照试样的测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群的总细胞数中，FOXP3的量多者的细胞的数量的比例为62％以上且72％以下。如以下的实施方式所示，通过这样设定比可以恰当地设定基准值。
另外，可以按照以下方式来设定比：基于对照试样的测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群中，FOXP3的量多者的细胞的数量相对于FOXP3的量少者的细胞的数量的比率为1.62以上且2.47以下。如以下的实施方式所示，通过这样设定比可以恰当地设定基准值。
在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，在将基于对照试样的测定结果得到的CD45RA阴性细胞群展开为以FOXP3的量为轴的柱状图(71)时，将具有柱状图(71)中的FOXP3阴性侧的峰波形的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群确定为FOXP3阳性T细胞群(S107)。这样地可以恰当地确定FOXP3阳性T细胞群。
这种情况下，在对柱状图(71)中的FOXP3阴性侧的峰波形应用近似曲线时，将近似曲线与轴在FOXP3量的高值侧交叉的点设为结束点。这样可以统一地设定结束点。
在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，基于生物试样的测定结果，检测CD45RA阴性且FOXP3量比基准值多的细胞群，来作为效应性调节性T细胞。这样可以高精度地检测效应性调节性T细胞。
这种情况下，基于生物试样的测定结果来提取单一的活淋巴细胞群(S201～S203)，从已提取的淋巴细胞群中提取CD3阳性细胞群(S204)，从提取的CD3阳性细胞群中提取CD4阳性细胞群(S205)，检测已提取的CD4阳性细胞群中CD45RA阴性且FOXP3量比基准值多的细胞群，来作为效应性调节性T细胞(S206)。
在本方式的效应性调节性T细胞的检测方法中，对照试样为健康人的外周血或包含由健康人的外周血中纯化而得的外周血单核细胞的试样。
本发明的第2方式涉及使用流式细胞术法的效应性调节性T细胞的分析装置。本方式的效应性调节性T细胞的分析装置(120)具备：测定部(200)，用于测定包含CD4阳性T细胞群的生物试样(102)；和控制部(310)，取得FOXP3量作为生物试样(102)的测定中使用的基准值，基于测定部(200)对包含CD4阳性T细胞群的生物试样(102)进行测定而得的测定结果从FOXP3量比基准值多的细胞群中检测效应性调节性T细胞，其中，所述FOXP3量在基于测定部(200)对包含CD4阳性T细胞群的对照试样(101)进行测定而得的测定结果将CD4阳性T细胞群中所含的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准。
根据本方式的效应性调节性T细胞的分析装置(120)，发挥与第一方式同样的效果。
在本方式的效应性调节性T细胞的分析装置(120)中，可按照下述方式构成：测定部(200)在一生物试样(102)的每一测定中进行对照试样(101)的测定，控制部(310)将基准值用于一生物试样(102)的分析中的效应性调节性T细胞的检测。
在本方式的效应性调节性T细胞的分析装置(120)中，可按照下述方式构成：测定部(200)在多个生物试样(102)的每一测定中进行对照试样(101)的测定，控制部(310)将基准值用于多个生物试样(102)的各分析中的效应性调节性T细胞的检测。
在本方式的效应性调节性T细胞的分析装置(120)中，可按照下述方式构成：控制部(310)对基于对照试样(101)的测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群的整体应用比，取得基准值。
该情况下，控制部(310)可按照下述方式构成：在将基于对照试样(101)的测定结果得到的CD4阳性T细胞群展开为以FOXP3的量为轴的柱状图(71)时，将具有柱状图(71)中的FOXP3阴性侧的峰波形的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群确定为FOXP3阳性T细胞群。
另外，控制部(310)可按照下述方式构成：在对柱状图(71)中的FOXP3阴性侧的峰波形应用近似曲线时，将近似曲线与轴在FOXP3量的高值侧交叉的点设为结束点。
在本方式的效应性调节性T细胞的分析装置(120)中，可按照下述方式构成：控制部(310)从基于对照试样(101)的测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群中提取CD45RA阴性群，对提取的CD45RA阴性群应用比，取得基准值。
该情况下，控制部(310)可按照下述方式构成：在将基于对照试样(101)的测定结果得到的CD45RA阴性细胞群展开为以FOXP3的量为轴的柱状图(71)时，将具有柱状图(71)中的FOXP3阴性侧的峰波形的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群确定为FOXP3阳性T细胞群。
另外，控制部(310)可按照下述方式构成：在对柱状图(71)中的FOXP3阴性侧的峰波形应用近似曲线时，将近似曲线与轴在FOXP3量的高值侧交叉的点设为结束点。
在本方式的效应性调节性T细胞的分析装置(120)中，可按照下述方式构成：控制部(310)基于生物试样(102)的测定结果检测CD45RA阴性且FOXP3量比基准值多的细胞群，来作为效应性调节性T细胞。
该情况下，控制部(310)可按照下述方式构成：基于生物试样(102)的测定结果提取单一的活淋巴细胞群，从已提取的淋巴细胞群中提取CD3阳性细胞群，从已提取的CD3阳性细胞群中提取CD4阳性细胞群，检测已提取的CD4阳性细胞群中CD45RA阴性且FOXP3量比基准值多的细胞群，来作为效应性调节性T细胞。
本发明的第3方式涉及一种效应性调节性T细胞的分析系统。本方式的效应性调节性T细胞的分析系统(100)具备：第2方式的分析装置(120)；和标记装置(110)，其对对照试样(101)和生物试样(102)的被检物质进行荧光标记。
根据本方式的效应性调节性T细胞的分析系统，发挥与第1和第2方式同样的效果，并且可以自动进行对对照试样和生物试样的被检物质进行荧光标记的处理。从而，可以在均一条件下制备多个试样。
本发明的第4方式涉及程序。本方式的程序(321)对分析效应性调节性T细胞的流式细胞仪的计算机赋予下述功能：取得在基于包含CD4阳性T细胞群的对照试样(101)的测定结果将CD4阳性T细胞群中所含的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准的FOXP3量，来作为生物试样(102)的测定中使用的基准值的功能；基于包含CD4阳性T细胞群的生物试样(102)的测定结果，从FOXP3量比基准值多的细胞群中检测效应性调节性T细胞的功能。
根据本方式的程序，发挥与第1和第2方式同样的效果。
发明的效果
根据本发明，可以高精度且稳定地检测效应性调节性T细胞。
附图说明
图1：图1的(a)是示出实施方式1的对对照试样进行测定而取得基准值的处理的流程图。图1的(b)是示出在实施方式1的取得基准值的处理中展开的柱状图的示意图。图1的(c)是示出实施方式1的检测生物试样中所含的效应性调节性T细胞的处理的流程图。
图2：图2是详细示出实施方式1的取得基准值的处理的流程图。
图3：图3的(a)是实施方式1的包含全部粒子的散点图的例示图。图3的(b)～(f)分别是实施方式1的包含所提取的单一细胞、活细胞、淋巴细胞、CD3阳性T细胞、和CD4阳性T细胞的散点图的例示图。
图4：图4是实施方式1的将提取的CD4阳性T细胞以FOXP3量为轴展开而成的柱状图的例示图。
图5：图5是详细示出实施方式1的检测效应性调节性T细胞的处理的流程图。
图6：图6的(a)是实施方式1的、当生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞时生成的散点图。图6的(b)是实施方式1的将提取的CD4阳性T细胞以CD45RA量为轴展开而成的柱状图的示意图。图6的(c)是实施方式1的、当生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞时将提取的CD4阳性T细胞以FOXP3量为轴展开而成的柱状图。
图7：图7的(a)是示出实施方式1的检验的当生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞时、散点图中通过目视设定的边界值的图。图7的(b)是实施方式1的检验的当生物试样为健康人的外周血单核细胞时、设定了边界值的散点图。图7的(c)是例示实施方式1的检验的当生物试样为健康人的外周血单核细胞时、设定了边界值的柱状图的图。
图8：图8的(a)～(c)是实施方式1的检验的在生物试样为健康人的外周血单核细胞时、设定了边界值的柱状图。
图9：图9的(a)是示出实施方式1的检验的对基于对照试样得到的柱状图应用比率的状态的图。图9的(b)是实施方式1的检验的当生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞时、设定了基准值的散点图。
图10：图10的(a)～(f)是用于说明实施方式1的检验中的、比较例的基于手册进行分级而得的散点图。
图11：图11是详细示出实施方式2的取得基准值的处理的流程图。
图12：图12的(a)是实施方式2的包含基于对照试样提取的CD4阳性T细胞的散点图。图12的(b)是实施方式2的将基于对照试样提取的CD4阳性T细胞以CD45RA量为轴展开而成的柱状图。图12的(c)是在实施方式2的包含基于对照试样提取的CD4阳性T细胞的散点图中示出等高线的图。
图13：图13的(a)是示出实施方式2的当生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞时、在散点图中设定的基准值和分级值的图。图13的(b)是实施方式2的当生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞时、将提取的CD4阳性T细胞以FOXP3量为轴展开而成的柱状图。
图14：图14的(a)～(c)是实施方式2的检验的当生物试样为健康人的外周血单核细胞时、设定了边界值的柱状图。
图15：图15的(a)是示出实施方式2的检验的对基于对照试样得到的柱状图应用比率的状态的图。图15的(b)是实施方式2的检验的当生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞时、设定了基准值的散点图。
图16：图16的(a)是详细示出实施方式3的检测效应性调节性T细胞的处理的流程图。图16的(b)是示出实施方式3的散点图中的效应性调节性T细胞的区域、初始型调节性T细胞的区域、和非活性型调节性T细胞的区域的图。
图17：图17是示出用于进行实施方式1～3的分析的分析系统的构成的框图。
图18：图18是示出用于进行实施方式1～3的分析的分析系统中实行的处理的流程图。
图19：图19是示出用于进行实施方式1～3的分析的分析系统中实行的处理的流程图。
图20：图20是示出用于进行实施方式1～3的分析的分析系统中显示于显示部的画面的构成的图。
图21：图21是用于说明关联技术的示意图。
具体实施方式
在以下的实施方式中，对对照试样进行测定而取得基准值，使用取得的基准值检测生物试样中所含的效应性调节性T细胞。
对照试样是指为取得生物试样的测定中使用的基准值而被测定的试样，例如，包含与健康人同等的外周血单核细胞群。对照试样广泛包含：健康人的外周血本身；包含由健康人的外周血通过密度梯度法等纯化而得的外周血单核细胞的试样等。需要说明的是，外周血单核细胞(PBMC)包含单核细胞和淋巴细胞。健康人是指：未罹患特定的慢性疾病、日常生活无障碍的人。生物试样是包含被检者的外周血单核细胞的试样，例如，包含浸润到被检者的癌组织中的淋巴细胞(TIL)的试样。
另外，在以下的实施方式中，为了方便而以实际生成散点图和柱状图的方式来进行说明，但是，也可以不生成散点图和柱状图。例如，作为基于所生成的散点图和柱状图进行处理的方式的替代，也可以通过数据处理进行同等步骤。
＜实施方式1＞
如图1的(a)所示，对对照试样进行测定而取得基准值的方法包含步骤S11～S13的步骤。在图1的(a)的说明中，适当参照图1的(b)所示的坐标图。如图1的(c)所示，使用通过图1的(a)的方法取得的基准值来检测生物试样中所含的效应性调节性T细胞(eTreg)的方法包含步骤S21～S23的步骤。以下说明操作者使用装置实行图1的(a)、(c)的方法的情况。需要说明的是，图1的(a)、(c)的各步骤也可以通过装置自动实行。对于进行图1的(a)、(c)的各步骤的装置的构成，将参照图17来说明。
参照图1的(a)来说明对对照试样进行测定而取得基准值的处理。
步骤S11中，操作者对对照试样的被检物质进行荧光标记。具体而言，利用与活细胞相比强烈染色死细胞的荧光色素、用于染色表面抗原CD3的荧光色素、用于染色表面抗原CD4的荧光色素、用于染色表面抗原CD8的荧光色素、用于染色表面抗原CD45RA的荧光色素和用于染色调节性T细胞(Treg)的转录因子FOXP3的荧光色素，分别对对照试样中所含的细胞的相应被检物质进行荧光标记。
被检物质的荧光染色通过使分别具有各荧光色素的标记抗体与被检物质结合来进行。例如，作为具有与活细胞相比强烈染色死细胞的荧光色素的标记抗体，使用FixableViability Dye(FVD-eFluor(注册商标)506)(affymetrix eBioscence)。作为具有用于染色表面抗原CD3的荧光色素的标记抗体，使用anti-human CD3Alexa Fluor(注册商标)700(affymetrix eBioscence)。作为具有用于染色表面抗原CD4的荧光色素的标记抗体，使用anti-human CD4APC-eFluor(注册商标)780(affymetrix eBioscence)。作为具有用于染色表面抗原CD8的荧光色素的标记抗体，使用anti-human CD8a PE-Cy7(affymetrixeBioscence)。作为具有用于染色表面抗原CD45RA的荧光色素的标记抗体，使用anti-humanCD45RA FITC(affymetrix eBioscence)。作为具有用于染色FOXP3的荧光色素的标记抗体，使用anti-human FoxP3PE(affymetrix eBioscence)。
步骤S12中，操作者对经荧光标记的对照试样进行测定。步骤S12中，基于流式细胞术法取得基于由对照试样产生的前方散射光、侧方散射光、和荧光的信号。
具体而言，操作者将步骤S11中进行了荧光标记的对照试样供给到分析装置(流式细胞仪)的检测部。检测部使供给的对照试样流入流动池。检测部对流经流动池的对照试样照射光。由此，光照射到对照试样中所含的细胞等粒子上，由粒子产生前方散射光和侧方散射光，由各荧光色素产生彼此波长不同的荧光。检测部输出基于前方散射光、侧方散射光、和荧光的信号。然后，由检测部输出的信号被处理成每一粒子的波形信号，由波形信号取得波形的峰值、面积、宽度等特征参数，所取得的特征参数被作为测定结果储存在分析装置的储存部。
步骤S13中，操作者取得在基于步骤S12的对照试样的测定结果将CD4阳性T细胞群中所含的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准的FOXP3量，来作为生物试样测定时使用的基准值。
具体而言，分析装置基于步骤S12中取得的信号而提取CD4阳性T细胞，将提取的CD4阳性T细胞如图1的(b)所示那样展开为以FOXP3的量为轴的柱状图。该柱状图中，横轴表示FOXP3量，纵轴表示频度。FOXP3量是表示细胞中以何种程度包含FOXP3的值，具体为由染色FOXP3的荧光色素产生的荧光的强度。分析装置将具有柱状图中的FOXP3阴性侧的峰波形的高值侧的结束点以上的FOXP3量的细胞群确定为FOXP3阳性T细胞群。
接下来，分析装置将所确定的FOXP3阳性T细胞群以预先储存在储存部的比分割。即，如图1的(b)所示那样设定分割线，使得在将分割线的左侧和右侧所含的FOXP3阳性T细胞群的数量分别设为A、B时，A：B成为预先储存在储存部的比。然后，分析装置取得在将FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准的FOXP3量，作为基准值并储存在储存部。
需要说明的是，A、B不限于细胞的个数，在图1的(b)所示的表示FOXP3阳性T细胞群的波形部分中，也可以分别为分割线的左侧和右侧的波形部分的下侧面积。这种情况下，按照使分割线的左侧和右侧所含的FOXP3阳性T细胞群的面积比A：B成为规定的比的方式来设定分割线。
这样，对对照试样进行测定而取得基准值。这种取得基准值的处理在从采集自被检者的生物试样中检测效应性调节性T细胞之前进行。对于步骤S13的取得基准值的工序，后文将参照图2来详细说明。
参照图1的(c)，来说明使用取得的基准值检测生物试样中所含的效应性调节性T细胞的处理。
步骤S21中，操作者对生物试样的被检物质进行荧光标记。步骤S21中，利用与图1的(a)的步骤S11同样的荧光色素对生物试样中所含的细胞的被检物质进行荧光标记。步骤S22中，操作者对经荧光标记的生物试样进行测定。步骤S22中，与图1的(a)的步骤S12同样地利用分析装置(流式细胞仪)的检测部取得基于由生物试样产生的前方散射光、侧方散射光、和荧光的信号。然后，由检测部输出的信号被处理成每一粒子的波形信号，由波形信号取得波形的峰值、面积、宽度等特征参数，所取得的特征参数被作为测定结果储存在分析装置的储存部。
步骤S23中，操作者基于步骤S22的生物试样的测定结果，基于FOXP3量比基准值多的细胞群来检测效应性调节性T细胞。
具体而言，分析装置基于步骤S22中取得的信号来提取CD4阳性T细胞。分析装置从储存部读出通过图1的(a)的步骤S13而取得的基准值，从提取的CD4阳性T细胞中提取FOXP3量比基准值多的细胞。分析装置检测所提取的FOXP3量比基准值多的细胞中的CD45RA阴性的细胞，来作为效应性调节性T细胞。对于步骤S23的检测效应性调节性T细胞的工序，后文将参照图5来详细说明。需要说明的是，所提取的FOXP3量比基准值多的细胞中，CD45RA阳性的细胞通常较少，因此也可以不进行基于CD45RA量的提取，而是检测FOXP3量比基准值多的细胞来作为效应性调节性T细胞。
如上所述，将对对照试样进行测定而得到的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割并由此设定基准值，因此可以统一地设定基准值。另外，通过使用包含与健康人同等的外周血单核细胞群的试样作为对照试样，从而即使测定环境改变也可以恰当地设定基准值。即，即使发生了试剂更换、试剂劣化、环境温度改变、试剂或试样的制备量改变之类的测定环境改变，根据实施方式1也可以设定恰当的基准值。进一步地，由于预先对对照试样进行测定而取得基准值，因此可以将对应于测定环境的基准值设定为生物试样的测定时的基准值。从而，可以统一地且恰当地设定生物试样测定时使用的基准值，因此可以高精度且稳定地检测效应性调节性T细胞。
需要说明的是，可以在一生物试样的每一测定中进行图1的(a)所示的取得基准值的处理，可以在多个生物试样的每一测定中进行图1的(a)所示的取得基准值的处理。
即，在一生物试样的每一测定中，可以进行对照试样的测定而取得基准值，将取得的基准值用于一生物试样的测定中的效应性调节性T细胞的检测。这种情况下，在生物试样的每一测定中设定基准值，因此可以设定与生物试样测定时的测定环境相适合的基准值，可以提高效应性调节性T细胞的检测精度。
另外，可以在多个生物试样的每一测定中进行对照试样的测定而取得基准值，将取得的基准值用于多个生物试样的各测定中的效应性调节性T细胞的检测。这种情况下，可以减少对照试样的测定频度，因此可以提高生物试样的测定效率。该方法在利用装置自动制备和测定生物试样时之类的、可在均一条件下制备和测定多个生物试样时特别有效。需要说明的是，在试剂的批次改变的时刻，试剂的状态也可能改变，因此即使是利用装置自动制备和测定生物试样的情况下，也优选再度利用对照试样设定基准值。
参照图2来详细说明取得基准值的处理。以下所示的各步骤中，基于图1的(a)的步骤S12中取得的对照试样的测定结果来进行处理。
步骤S101中，分析装置基于测定结果如图3的(a)所示将所有粒子标绘在散点图10中，并提取区域11中所含的粒子作为单一细胞。散点图10中，横轴为基于前方散射光的信号波形的面积，纵轴基于前方散射光的信号波形的宽度。
步骤S102中，分析装置如图3的(b)所示那样将步骤S101中提取的单一细胞标绘在散点图20中，并提取区域21中所含的粒子作为活细胞。散点图20中，横轴为基于前方散射光的信号波形的面积，纵轴为基于由与活细胞相比强烈染色死细胞的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值。
步骤S103中，分析装置如图3的(c)所示那样将步骤S102中提取的活细胞标绘在散点图30中，并提取区域31中所含的粒子作为淋巴细胞。散点图30中，横轴为基于前方散射光的信号波形的面积，纵轴为基于侧方散射光的信号波形的面积。
需要说明的是，实行步骤S101～S103的顺序不限于图2所示的顺序。步骤S101～S103的各步骤可以以任意顺序来实行。
步骤S104中，分析装置如图3的(d)所示那样将步骤S103中提取的淋巴细胞标绘在散点图40中，并提取区域41中所含的粒子作为CD3阳性T细胞。散点图40中，横轴为基于由用于染色表面抗原CD3的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值，纵轴为基于侧方散射光的信号波形的面积。
步骤S105中，分析装置如图3的(e)所示那样将步骤S104中提取的CD3阳性T细胞标绘在散点图50中，并提取区域51中所含的粒子作为CD4阳性T细胞。散点图50中，横轴为基于由用于染色表面抗原CD4的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值，纵轴为基于由用于染色表面抗原CD8的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值。需要说明的是，区域52为包含CD8阳性T细胞的区域。
如果将步骤S105中提取的CD4阳性T细胞标绘在散点图60中，则粒子如图3的(f)那样分布。散点图60中，横轴为基于由用于染色FOXP3的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值，纵轴为基于由用于染色表面抗原CD45RA的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值。
步骤S106中，分析装置如图4所示那样将步骤S105中提取的CD4阳性T细胞展开为柱状图71。柱状图71中，横轴为基于由用于染色FOXP3的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值，纵轴为频度。柱状图71的横轴与图3的(f)的散点图60的横轴相同。
需要说明的是，图4所示的柱状图71中，为了方便而省略了超过约100的频度。以后的图中所示的柱状图71、72中，同样地对于超过规定值的频度进行了适当省略。
步骤S107中，分析装置基于步骤S106中所展开的柱状图71来确定FOXP3阳性T细胞。
具体而言，将具有柱状图71中的FOXP3阴性侧的峰波形的高值侧的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群，确定为FOXP3阳性T细胞。由此，可以恰当地确定FOXP3阳性T细胞群。
关于此时的结束点，在对柱状图71中的FOXP3阴性侧的峰波形、即左侧的山状波形应用近似曲线时，设为近似曲线与FOXP3量的轴在FOXP3量的高值侧交叉的点。更详细而言，通过高斯拟合取得左侧的山状波形相对于正态分布的近似曲线，将近似曲线与FOXP3量的轴在高值侧交叉的点设定为结束点。这样可以统一地设定结束点。图4中，通过粗虚线示出了结束点附近的近似曲线。
步骤S108中，分析装置对步骤S107中确定的FOXP3阳性T细胞群的整体应用规定的比，取得以该比分割时成为分割基准的FOXP3量，作为基准值。规定的比预先储存在储存部中，在生物试样的每一测定中从储存部读出。
在此，与参照图1的(b)进行说明时同样地，将分割线的左侧和右侧所含的FOXP3阳性T细胞群的数量分别设为A、B。A为FOXP3的量少者的细胞的数量，B为FOXP3的量多者的细胞的数量。分析装置按照使A：B达到预先储存在储存部的比的方式来设定分割线，取得分割线与横轴交叉的FOXP3量，作为基准值。
实施方式1中，按照FOXP3的量多者的细胞的数量B相对于FOXP3的量少者的细胞的数量A的比率B/A达到1.35以上且2.48以下的方式来设定比。如后所述，该比为发明人发现的普遍性比。即，发明人发现，基于该比，不论测定环境等如何均可以恰当地设定基准值，可以精度良好地检测效应性调节性T细胞。关于发明人判断该比为普遍值的理由，随后将在实施方式1的检验中说明。实施方式1中，比率B/A设定为1.96。
需要说明的是，也可以按照FOXP3的量多者的细胞的数量B相对于FOXP3阳性T细胞群的总细胞数(A+B)的比例B/(A+B)为57％以上且72％以下的方式来设定比。此时的B/A的范围与将B/A设为1.35以上且2.48以下时几乎相同，因此此时也可以恰当地设定基准值。
参照图5详细地说明检测效应性调节性T细胞的处理。以下所示的各步骤中，基于图1的(c)的步骤S22中取得的生物试样的测定结果来进行处理。
步骤S201中，分析装置基于测定结果与图2的步骤S101同样地将所有粒子标绘在散点图10中，并提取区域11中所含的粒子作为单一细胞。步骤S202中，分析装置将步骤S201中提取的单一细胞与图2的步骤S102同样地标绘在散点图20中，并提取区域21中所含的粒子作为活细胞。步骤S203中，分析装置将步骤S202中提取的活细胞与图2的步骤S103同样地标绘在散点图30中，并提取区域31中所含的粒子作为淋巴细胞。
需要说明的是，实行步骤S201～S203的顺序不限于图5所示的顺序。步骤S201～S203的各步骤可以以任意的顺序实行。
步骤S204中，分析装置将步骤S203中提取的淋巴细胞与图2的步骤S104同样地标绘在散点图40中，并提取区域41中所含的粒子作为CD3阳性T细胞。步骤S205中，分析装置将步骤S204中提取的CD3阳性T细胞与图2的步骤S105同样地标绘在散点图50中，并提取区域51中所含的粒子作为CD4阳性T细胞。
步骤S206中，分析装置检测CD45RA阴性且FOXP3量比基准值大的细胞作为效应性调节性T细胞。
具体而言，分析装置如图6的(a)所示那样将步骤S205中提取的CD4阳性T细胞展开为散点图60。散点图60的轴是与图3的(f)所示的散点图60同样地设定的。即，横轴为基于由用于染色FOXP3的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值，纵轴为基于由用于染色表面抗原CD45RA的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值。需要说明的是，图6的(a)的散点图60是生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞(TIL)时所生成的散点图。
分析装置在散点图60中设定横轴的值为基准值的纵向延伸的直线、和纵轴的值为分级值的横向延伸的直线。这里使用的基准值为图2的步骤S108中取得的基准值。分级值则基于图6的(b)所示的柱状图72而取得。
图6的(b)的柱状图72是将图6的(a)的散点图60的总细胞展开而得的柱状图的示意图。柱状图72中，横轴为基于由用于染色表面抗原CD45RA的荧光色素产生的荧光的信号波形的峰值，纵轴为频度。柱状图72的横轴对应于散点图60的纵轴。分析装置将CD45RA阴性侧的峰波形与CD45RA阳性侧的峰波形之间频度最小时的CD45RA量设定为分级值。CD45RA量比分级值小的细胞为CD45RA阴性的细胞，CD45RA量比分级值大的细胞为CD45RA阳性的细胞。
图6的(a)所示的散点图60中，区域61是比图2的步骤S108中取得的基准值大、比基于图6的(b)的柱状图72而取得的分级值小的区域。步骤S206中，分析装置检测散点图60的区域61中所含的细胞，来作为效应性调节性T细胞。这样地检测区域61的细胞来作为效应性调节性T细胞时，可以高精度地检测效应性调节性T细胞。
图6的(c)的柱状图71是将分布在图6的(a)的散点图60中的全部细胞展开而成的。图6的(c)的柱状图71的轴与图4所示的柱状图71同样地设定。图6的(a)、(c)所示的例子中，FOXP3量比基准值大的细胞在CD4阳性T细胞整体中所占的比例为12.4％。如图6的(a)、(c)所示可知，在生物试样为浸润到胃癌组织中的淋巴细胞(TIL)时，也可以精度良好地检测区域61内的细胞，来作为效应性调节性T细胞。
需要说明的是，如图6的(a)所示，存在于在区域61的正上方的CD45RA阳性细胞的数量少。因此，步骤S206中，分析装置也可以检测CD4阳性T细胞中、FOXP3量比基准值大的细胞，来作为效应性调节性T细胞。该情况下，在生物试样的测定中，可以省略由用于染色表面抗原CD45RA的荧光色素产生的荧光的测定。
步骤S207中，分析装置将步骤S206中检测出的关于效应性调节性T细胞的信息显示在显示部。步骤S207中，例如显示效应性调节性T细胞的数量、效应性调节性T细胞在CD4阳性T细胞整体中所占的比例、效应性调节性T细胞在FOXP3量比基准值大的细胞中所占的比例等。
＜实施方式1的检验＞
接着，对发明人发现不因测定环境等而受影响的普遍性比率B/A的经过进行说明。
以下所示的检验中，发明人按照以下所示的步骤制备了基于浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞(TIL)的试样和基于健康人的外周血单核细胞的试样。
最初，为了除去死细胞，发明人用FVD(Fixable Viability Dye)进行了10～15分钟染色反应。然后，为了在不洗涤条件下将后续加入的抗体的非特异性结合抑制为最小限度，发明人加入Fc block(BD Fc Block(注册商标)Reagent for human)(BD Bioscience)并使之在4℃下反应10～20分钟。然后，为了进行细胞表面的抗原染色，发明人加入抗人CD3、CD4、CD8a、CD45RA抗体，进一步进行30分钟抗体反应。这些抗体分别为anti-humanCD3Alexa Fluor(注册商标)700(affymetrixe Bioscence)、anti-human CD4APC-eFluor(注册商标)780(affymetrix eBioscence)、anti-human CD8a PE-Cy7(affymetrixeBioscence)、anti-human CD45RA FITC(affymetrix eBioscence)。
接下来，发明人用包含2％FBS的PBS(-)洗涤后，为了将细胞内染色而使用FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set(affymetrix eBioscience)进行30～60分钟的细胞固定和膜透明处理。进一步洗涤后，为了将细胞内染色，发明人进行30～60分钟的抗FoxP3抗体反应。然后在洗涤后，发明人用流式细胞仪“CyFlow Space”(希森美康株式会社制)进行多彩色测定。
发明人对基于浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞(TIL)的试样进行了测定，进行与图5的步骤S201～S205同样的步骤而提取CD4阳性T细胞。图7的(a)是示出将由TIL提取的CD4阳性T细胞展开而成的散点图60的图。在图7的(a)所示的散点图60中，发明人通过目视来取得区分效应性调节性T细胞和其以外的细胞的边界值。此时，发明人使用如图7的(a)所例示那样可以容易地区别效应性调节性T细胞和其以外的细胞的TIL来进行边界值的取得。
接下来，发明人在同一批次中对基于健康人的外周血单核细胞的试样进行测定，进行与图5的步骤S201～S205同样的步骤，从而进行CD4阳性T细胞的提取和柱状图71的生成。需要说明的是，当在同一批量中进行多个测定时，各测定中的测定环境是几乎相同的。在同一批量中，例如试剂的批次、试剂的劣化状况、环境温度、试剂和试样的制备量等在各测定中彼此几乎相同。
图7的(b)、(c)是分别示出将由健康人的外周血单核细胞提取的CD4阳性T细胞展开而得的散点图60和柱状图71的图。图7的(b)、(c)中示出应用图7的(a)中取得的边界值的状态。
图7的(c)中，发明人与参照图4而说明的步骤同样地基于FOXP3阴性侧的峰波形设定结束点。然后，发明人将结束点与边界值之间的的细胞的数量设为A、将FOXP3量比边界值大的细胞的数量设为B，取得比率B/A。
发明人将上述那样基于TIL和健康人的外周血单核细胞取得比率B/A的步骤基于不同的TIL和健康人的外周血单核细胞重复了13次。图8的(a)～(c)是示出在这13次的步骤中的、3次的步骤中生成的柱状图71的图。
通过13次的步骤基于13个生物试样(样品1～13)取得的比率B/A、平均值和标准偏差SD如以下的表1所示。需要说明的是，图8的(a)～(c)所示的生物试样分别对应于样品2、3、6。
[表1]
如表1所示，由13个生物试样取得的比率B/A中，最小值为1.35，最大值为2.48。另外，由13个生物试样取得的比率B/A的平均为1.96，标准偏差为0.31，为极小的值。从而，发明人发现：将由浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞(TIL)取得的边界值应用于健康人的外周血单核细胞而取得比率B/A时，所取得的比率B/A的偏差变小，即，得到几乎相同的比率B/A。另外表明：如果按照比率B/A为最小值1.35以上且最大值2.48以下的方式来设定边界值，则可以将FOXP3量比边界值多的细胞判定为效应性调节性T细胞。
然后，发明人将比率B/A设为由表1得到的平均值1.96时，基于包含健康人的外周血单核细胞的生物试样并通过与图2同样的工序取得基准值。
图9的(a)是通过该步骤得到的柱状图71。发明人如图9的(a)所示那样将比率B/A设为1.96而取得基准值。发明人将这样得到的基准值如图9的(b)所示用于基于浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞得到的散点图60中。如图9的(b)所示，根据这样得到的基准值，在生物试样为浸润到胃癌组织中的淋巴细胞时也可以将FOXP3阴性的细胞群和FOXP3阳性的细胞群恰当地分级。即，获知如果基于如上所述而设定的比率B/A来取得基准值、则可以从采自癌症患者的生物试样中恰当地检测效应性调节性T细胞。
由于以上理由，实施方式1中将1.35以上且2.48以下、特别是1.96这一比率B/A预先储存在储存部，并用于基于对照试样来取得基准值的工序。
然后，发明人将比率B/A设为1.96，对包含被检者的外周血单核细胞的8个生物试样基于实施方式1的方法和比较例的方法进行效应性调节性T细胞的检测精度的比较。比较例中，在散点图60中发明人基于手册对效应性调节性T细胞的区域进行分级，从而进行检测。以下参照图10的(a)～(f)来说明比较例中发明人所进行的基于手册的分级。
首先如图10的(a)所示那样，在将CD4阳性T细胞展开而成的散点图60中设定用于省略右上区域的少数细胞的区域81。然后如图10的(b)所示那样，从区域81的左端向下方设定边界线82。然后，如图10的(c)所示那样在分布于右下方的细胞群的左端附近设定边界线83。然后，如图10的(d)所示那样，将边界线83向上延长。然后，如图10的(e)所示那样，为了对CD45RA阴性和CD45RA阳性进行分级，设定沿着横向延伸的边界线84。最后，如图10的(f)所示那样基于边界线82、83、84设定区域60a、60b、60c。区域60a、60b、60c分别为与初始型、效应性和非活性型的调节性T细胞对应的区域。比较例中，检测区域60b中所含的细胞，来作为效应性调节性T细胞。
以下的表2中示出实施方式1和比较例的情况下分别检测到的效应性调节性T细胞相对于CD4阳性T细胞的比例。包含被检者的外周血单核细胞的8个生物试样为样品14～21。另外，表2中示出实施方式1时的平均和标准偏差SD、以及比较例时的平均和标准偏差SD。
[表2]
如表2所示，关于效应性调节性T细胞的比例，在实施方式1和比较例中为几乎相同的值。另一方面，关于标准偏差，实施方式1的值小于比较例的值。由以上结果可知，根据实施方式1，可以与比较例同等程度地检测效应性调节性T细胞，而且与比较例相比，效应性调节性T细胞的检测比例的偏差受到抑制。
＜实施方式2＞
在取得基准值的处理中，实施方式1中将提取的CD4阳性T细胞全部展开为柱状图71，而实施方式2中，将提取的CD4阳性T细胞中的CD45RA阴性细胞展开为柱状图71。
如图11所示，实施方式2在图2所示的取得基准值的工序中，在步骤S106和步骤S107之间追加了步骤S111。实施方式2的其它步骤与实施方式1相同。以下对与实施方式1不同的步骤进行说明。
步骤S111中，分析装置从步骤S105所提取的CD4阳性T细胞中提取CD45RA阴性细胞。
具体而言，如图12的(a)所示，在将CD4阳性T细胞展开而成的柱状图71中，设定用于对CD45RA阴性的细胞和CD45RA阳性的细胞进行分级的分级值。此时的分级值的设定与参照图6的(a)、(b)而说明的分级值的设定相同。即，将图12的(a)的散点图60的全部细胞展开为图12的(b)的柱状图72，在柱状图72中，将CD45RA阴性侧的峰波形和CD45RA阳性侧的峰波形之间频度最小时的CD45RA量设定为分级值。将这样设定的分级值用于散点图60，在散点图60中设定CD45RA量比分级值小的区域62。步骤S111中，提取区域62的细胞作为CD45RA阴性细胞。
需要说明的是，也可以如图12的(c)所示那样，基于表示CD4阳性T细胞的分布密度的等高线而将分级值设定在CD45RA阳性侧的分布密度高的区域和CD45RA阴性侧的分布密度低的区域之间。
步骤S111之后的步骤S106～S108与实施方式1同样地进行。即，步骤S106中，分析装置将步骤S111中提取的CD45RA阴性细胞展开为柱状图71。然后，步骤S107中，分析装置与实施方式1同样地基于柱状图71来确定FOXP3阳性T细胞。
在此，实施方式2的步骤S107中确定的FOXP3阳性T细胞是图2的步骤S107中提取的FOXP3阳性T细胞群中提取CD45RA阴性的细胞后的细胞。因此，实施方式2中，先进行FOXP3阳性T细胞的提取和CD45RA阴性细胞的提取中的任一者均可。并且，步骤S108中，分析装置对步骤S107中确定的FOXP3阳性T细胞群应用储存在储存部的规定的比，取得以该比分割时成为分割基准的FOXP3量来作为基准值。
这样地对FOXP3阳性T细胞群中的CD45RA阴性群应用比而取得基准值时，由于成为噪声的CD45RA阳性细胞被除去而可以进一步提高基准值的精度。
需要说明的是，实施方式2中，对生物试样进行测定而检测效应性调节性T细胞的工序与图5所示的实施方式1的工序同样地进行。即，实施方式2中，在图5的步骤S205中进行CD4阳性T细胞的提取，在步骤S206中检测CD45RA阴性且FOXP3量比基准值大的细胞作为效应性调节性T细胞。
实施方式2中，按照FOXP3的量多者的细胞的数量B相对于FOXP3的量少者的细胞的数量A的比率B/A为1.62以上且2.47以下的方式来设定比。该比与实施方式1中同样地为发明人发现的普遍性比。关于发明人判断该比为普遍值的理由，此后将在实施方式2的检验中说明。实施方式2中，比率B/A设为2.01。
需要说明的是，也可以按照FOXP3的量多者的细胞的数B相对于FOXP3阳性T细胞群的总细胞数(A+B)的比例B/(A+B)为62％以上且72％以下的方式来设定比。此时的B/A的范围与将B/A设为1.62以上且2.47以下时几乎相同，因此此时也可以恰当地设定基准值。
实施方式2的检测效应性调节性T细胞的工序也与实施方式1同样，如图13的(a)所示那样在散点图60中应用基准值，来设定对CD45RA阴性细胞和CD45RA阳性细胞进行分级的分级值。然后检测区域61的细胞来作为效应性调节性T细胞。
实施方式2中，如上所述地基于CD4阳性T细胞中的CD45RA阴性细胞来取得基准值，因此可以设定更恰当的基准值、从而从生物试样中检测效应性调节性T细胞。
图13的(a)的散点图60是生物试样为浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞(TIL)时所生成的散点图。由于成为图13的(a)的散点图60的基础的生物试样与成为图6的(a)的散点图60的基础的生物试样相同，因此图13的(a)与图6的(a)的散点图60中的细胞分布相同。图13的(b)的柱状图71是将分布在图13的(a)的散点图60中的全部细胞展开而成的。图13的(a)、(b)所示的例子中，FOXP3量比基准值大的细胞在CD4阳性T细胞整体中所占的比例为12.3％。该值与基于实施方式1的方法时的12.4％几乎相同。因此，实施方式2也可以与实施方式1同样地进行效应性调节性T细胞的检测。
＜实施方式2的检验＞
发明人使用实施方式1的检验中取得的浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞(TIL)的测定结果以及同一批次中健康人的外周血单核细胞的测定结果，来进行与实施方式1同样的检验。
发明人与实施方式1同样地基于浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞(TIL)的测定结果通过目视从散点图60中取得边界值。然后发明人进行与图11的步骤S101～S105、S111、S106同样的步骤来生成柱状图71。其中，实施方式2的检验中，在步骤S111中提取CD45RA阴性细胞，因此柱状图71中所展开的是CD4阳性T细胞中的CD45RA阴性细胞。然后，发明人在柱状图71中应用所取得的边界值，基于包含健康人的外周血单核细胞的13个不同生物试样计算比率B/A。
图14的(a)～(c)是示出对这13个生物试样中的3个生物试样生成的柱状图71的图，分别为与图8的(a)～(c)相同的生物试样。图14的(a)～(c)的柱状图71中，所展开的不是CD4阳性T细胞整体、而是CD4阳性T细胞中的CD45RA阴性细胞，因此图14的(a)～(c)的形状分别与图8的(a)～(c)的形状不同。
基于13个生物试样(样品1～13)取得的比率B/A、平均值、和标准偏差SD如以下的表3所示。需要说明的是，图14的(a)～(c)所示的生物试样分别相当于样品2、3、6。样品1～13分别与实施方式1的检验的样品1～13相同。
[表3]
如表3所示，由13个生物试样取得的比率B/A中，最小值为1.62，最大值为2.47。另外，由13个生物试样取得的比率B/A的平均为2.01，标准偏差为0.28，为极小的值。此时也与实施方式1的检验同样地，可知所取得的比率B/A的偏差变小、即得到几乎相同的比率B/A。另外表明，如果按照比率B/A为最小值1.62以上且最大值2.47以下的方式来设定边界值，则可以将FOXP3量比边界值多的细胞判定为效应性调节性T细胞。
然后，发明人将比率B/A设为由表3得到的平均值2.01时，基于包含健康人的外周血单核细胞的生物试样并通过与图11相同的工序取得基准值。
图15的(a)是通过该步骤得到的柱状图71。发明人如图15的(a)所示那样将比率B/A设为2.01而取得基准值。发明人将这样得到的基准值如图15的(b)所示那样用于基于浸润到胃癌患者的胃癌组织中的淋巴细胞得到的散点图60。如图15的(b)所示，根据这样得到的基准值，在生物试样为浸润到胃癌组织中的淋巴细胞时也可以对FOXP3阴性的细胞群和FOXP3阳性的细胞群进行分级。即，获知如果基于如上所述而设定的比率B/A来取得基准值、则可以从采自癌症患者的生物试样中恰当地检测效应性调节性T细胞。
由于以上理由，实施方式2中将1.62以上且2.47以下、特别是2.01这一比率B/A预先储存在储存部，并用于基于对照试样来取得基准值的工序。
然后，发明人将比率B/A设为2.01，对包含被检者的外周血单核细胞的8个生物试样基于实施方式2的方法和比较例的方法分别进行效应性调节性T细胞的检测精度的比较。比较例中，如实施方式1的检验中所说明那样，在散点图60中发明人基于手册对效应性调节性T细胞的区域进行分级，从而进行检测。
以下的表4中示出实施方式2和比较例的情况下分别检测到的效应性调节性T细胞相对于CD4阳性T细胞的比例。包含被检者的外周血单核细胞的8个生物试样为样品22～29。另外，表4中示出实施方式2时的平均和标准偏差SD、以及比较例时的平均和标准偏差SD。
[表4]
如表4所示，关于效应性调节性T细胞的比例，在实施方式2和比较例中为几乎相同的值。另一方面，关于标准偏差，实施方式2的值小于比较例的值。由以上结果可知，根据实施方式2，可以与比较例同等程度地检测效应性调节性T细胞，而且与比较例相比，效应性调节性T细胞的检测比例的偏差受到抑制。
＜实施方式3＞
如图16的(a)所示，实施方式3的效应性调节性T细胞的检测工序与图5相比在步骤S206和步骤S207之间追加了步骤S211。实施方式3的其它构成与实施方式1或2相同。
步骤S211中，分析装置对初始型调节性T细胞和非活性型调节性T细胞进行检测。
具体而言，分析装置如图16的(b)所示那样在于步骤S206中展开的散点图60中设定区域63、64。区域63是FOXP3量比基准值小且比结束点大、并且CD45RA量比分级值大的区域。区域64是FOXP3量比基准值小且比结束点大、并且CD45RA量比分级值小的区域。在此，基准值与步骤S206中使用的基准值相同。结束点是在将散点图60展开为柱状图71时与用图4所说明的步骤同样地制作的点，是柱状图71中的FOXP3阴性侧的峰波形的高值侧的点。分级值是如图6的(a)中所说明的、将CD45RA阴性细胞和CD45RA阳性细胞分开的CD45RA量。
步骤S211中，分析装置检测散点图60的区域63、64中所含的细胞，分别作为初始型调节性T细胞和非活性型调节性T细胞。接下来，步骤S207中，分析装置将关于步骤S206、S207中检测的效应性调节性T细胞、初始型调节性T细胞、和非活性型调节性T细胞的信息显示在显示部。步骤S207中，显示例如各细胞的数量、各细胞在CD4阳性T细胞整体中所占的比例等。
＜分析系统＞
图17是示出用于进行实施方式1～3中说明的分析的分析系统100的构成的框图。
分析系统100具备标记装置110和作为流式细胞仪的分析装置120。标记装置110对对照试样101和生物试样102的被检物质进行荧光标记。根据标记装置110，可以自动进行对对照试样101和生物试样102的被检物质进行荧光标记的处理。由此，可以在均一条件下制备多个试样。分析装置120对对照试样101和生物试样102进行分析处理。分析装置120中，作为进行测定的测定部而具备测定单元200，作为进行分析的分析部而具备分析单元300。
需要说明的是，标记装置110和分析装置120可以不分开，例如分析装置120和标记装置110可以一体构成。另外，当分析系统100在标记装置110的前段具有用于从外周血的全血中纯化外周血单核细胞的装置时，对照试样101和生物试样102可以是外周血的全血。
分析系统100中，在进行图1的(a)、(c)所示的处理时，由标记装置110来进行图1的(a)的步骤S11和图1的(c)的步骤S21。图1的(a)的步骤S12和图1的(c)的步骤S22由分析装置120的测定单元200来进行。图1的(a)的步骤S13和图1的(c)的步骤S23由分析装置120的分析单元300来进行。
测定单元200具备测定控制部210、检测部220和信号处理电路230。测定控制部210例如由CPU、MPU等构成。测定控制部210接收测定单元200的各部所输出的信号，对测定单元200的各部进行控制。检测部220使在标记装置110中进行了标记处理的对照试样101和生物试样102流入流动池，对流动池照射光，由受光部接收由试样产生的光并输出与光的强度相应的信号。
信号处理电路230对检测部220所输出的信号进行信号处理。具体而言，信号处理电路230基于由检测部220的受光部输出的信号提取每一粒子的波形信号，由每一粒子的波形信号计算峰值、面积、宽度等特征参数。测定控制部210与分析单元300进行通信。测定控制部210将由信号处理电路230计算出的每一粒子的特征参数作为测定结果向分析单元300发送。
分析单元300具备控制部310、储存部320、显示部330和输入部340。控制部310例如由CPU构成。控制部310接收分析单元300的各部输出的信号，对分析单元300的各部进行控制。控制部310与测定单元200进行通信。储存部320例如由ROM、RAM、硬盘等构成。控制部310基于储存于储存部320的程序321实行处理。程序321包含用于实行图1的(a)、(c)所示的处理的程序。
显示部330例如由显示器构成。显示部330显示输出分析结果的画面。图5的步骤S207的显示处理中，控制部310将检测到的关于调节性T细胞的信息示于显示部330。输入部340由例如鼠标、键盘等构成。输入部340接受操作者的输入。显示部330和输入部340也可以由触摸面板等一体地构成。
图18、19是示出分析装置120所进行的处理的流程图。
如图18所示，步骤S301、S302中，控制部310判定操作者是否经由输入部340输入了利用标记装置110进行了标记处理的对照试样101或生物试样102的测定指示。在输入了对照试样101的测定指示的情况下，处理进入步骤S303，在输入生物试样102的测定指示的情况下，处理进入步骤S305。在未输入任一测定指示的情况下结束处理，再度从步骤S301开始处理。
在输入了对照试样101的测定指示的情况下，步骤S303中，测定控制部210与图1的(a)的步骤S12同样地进行对照试样101的测定。测定控制部210将对照试样101的测定结果发送到控制部310。控制部310将从测定控制部210接收到的对照试样101的测定结果储存在储存部320。接下来，步骤S304中，控制部310从储存部320读出对照试样101的测定结果，基于读出的测定结果进行基准值的取得。此时，控制部310将取得的基准值储存在储存部320。关于此时的取得基准值的处理，随后将参照图19进行说明。
在输入了生物试样102的测定指示的情况下，步骤S305中，测定控制部210与图1的(c)的步骤S22同样地进行生物试样102的测定。此时，测定控制部210也将生物试样102的测定结果发送到控制部310。控制部310将从测定控制部210接收到的生物试样102的测定结果储存在储存部320。接下来，步骤S306中，控制部310从储存部320读出生物试样102的测定结果，基于所读出的测定结果与图5或图16的(a)所示的处理同样地进行效应性调节性T细胞的检测处理。此时，控制部310在步骤S304中从储存部320读出所储存的基准值，将读出的基准值应用于生物试样102的分析中的效应性调节性T细胞的检测。步骤S306所进行的显示处理显示图20所示的画面。关于图20所示的画面，将在随后说明。
如图19所示，步骤S401中，控制部310进行确定对照试样101中所含的FOXP3阳性T细胞的处理。步骤S401中，进行与图2的步骤S101～S107同样的处理。由此，在将CD4阳性T细胞展开而成的柱状图71中，确定具有结束点以上的FOXP3量的细胞群来作为FOXP3阳性T细胞。需要说明的是，步骤S401中，可以进行与图11的步骤S101～S105、S111、S106、S107同样的处理。这种情况下，确定CD4阳性且CD45RA阴性的细胞群来作为FOXP3阳性T细胞。
接下来，步骤S402中，控制部310判定对照试样101是否满足规定的条件。规定的条件预先储存在储存部320中。规定的条件例如是FOXP3阳性T细胞的数量在规定范围内的条件。该情况下，当步骤S401中确定的FOXP3阳性T细胞的数量在规定范围内时，控制部310判定为对照试样101满足规定的条件。
需要说明的是，步骤S402的规定的条件不限于上述内容，也可以是下述条件：FOXP3阴性T细胞的数量在规定范围内；CD45RA阳性T细胞和CD45RA阴性T细胞的比率在规定范围内；初始型调节性T细胞的数量在规定范围内。规定的条件也可以是满足这些条件中的多个条件。例如，将具有柱状图71中小于结束点的FOXP3量的细胞群确定为FOXP3阴性T细胞群。例如CD45RA阳性T细胞群被确定为图12的(a)中的区域62内的细胞群，例如CD45RA阴性T细胞群被确定为图12的(a)中的CD45RA量比分级值大的细胞群。例如初始型调节性T细胞群被确定为图16的(b)所示的区域63的细胞群。
在对照试样101满足规定的条件时，步骤S403中，控制部310与图2或图11的步骤S108同样地基于由对照试样101得到的柱状图71取得基准值。然后，控制部310将取得的基准值储存在储存部320。另一方面，当对照试样101不满足规定的条件时，步骤S404中，控制部310在显示部330中显示提醒操作者的画面，使得不测定成为步骤S402的判定基础的对照试样101、而是测定其它对照试样101。由此，操作者可以获知该对照试样101不适合作为用于取得基准值的试样。然后，操作者使用另一对照试样101并再度输入对照试样的测定指示。
图20是图18的步骤S306所示的效应性调节性T细胞的检测处理中显示在显示部330的画面331。需要说明的是，图20的画面331中，除了关于效应性调节性T细胞的信息以外，还显示了关于初始型调节性T细胞和非活性型调节性T细胞的信息。即，图20中例示的画面331是作为图18的步骤S306进行图16的(a)所示的实施方式3的检测处理时的画面。
画面331是示出生物试样102的分析结果的画面，具备示出分析值的列表区域331a和具有与图3的(a)～(f)同样的轴的散点图。列表区域331a显示所提取的细胞的个数和比率。Fr1表示图16的(b)的区域63内的细胞的数量、即初始型调节性T细胞的数量。Fr2表示图16的(b)的区域61内的细胞的数量、即效应性调节性T细胞的数量。Fr3表示图16的(b)的区域64内的细胞数量、即非活性型调节性T细胞数量。Fr1％、Fr2％、Fr3％分别表示初始型调节性T细胞、效应性调节性T细胞、和非活性型调节性T细胞在CD4阳性T细胞中所占的比率。通过在显示部330显示画面331，操作者可以从视觉上把握各细胞的个数和比率以及所生成的散点图。
需要说明的是，控制部310可以在生物试样102的分析中判定癌症治疗药是否有药效，并在画面331中显示癌症治疗药是否有药效。
另外，控制部310可以根据来自操作者的显示指示将在同一批次中测定的关于对照试样101的信息显示在显示部330。作为关于对照试样101的信息，可显示例如由对照试样101得到的柱状图71和由该柱状图71得到的基准值。由此，操作者可以判断基准值是否恰当。
符号说明
71 柱状图
100 分析系统
101 对照试样
102 生物试样
110 标记装置
120 分析装置、流式细胞仪
200 测定单元、测定部
220 流式细胞仪
310 控制部
320 储存部
321 程序

Claims (29)

1.一种效应性调节性T细胞的检测方法，其为使用流式细胞术法的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，
对包含CD4阳性T细胞群的对照试样进行测定，
取得在基于所述对照试样的测定结果将所述CD4阳性T细胞群中所含的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准的FOXP3量作为生物试样的测定中使用的基准值，
对包含CD4阳性T细胞群的生物试样进行测定，
基于所述生物试样的测定结果，从FOXP3量比所述基准值多的细胞群中检测效应性调节性T细胞。
2.根据权利要求1所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，在一所述生物试样的每一测定中进行所述对照试样的测定而取得所述基准值，将取得的所述基准值用于所述一生物试样的测定中的所述效应性调节性T细胞的检测。
3.根据权利要求1所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，在多个所述生物试样的每一测定中进行所述对照试样的测定而取得所述基准值，将取得的所述基准值用于所述多个生物试样的各测定中的所述效应性调节性T细胞的检测。
4.根据权利要求2或3所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，对基于所述对照试样的所述测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群的整体应用所述比，取得所述基准值。
5.根据权利要求4所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，按照以下方式来设定所述比：基于所述对照试样的所述测定结果得到的所述FOXP3阳性T细胞群的总细胞数中，FOXP3的量多者的细胞的数量的比例为57％以上且72％以下。
6.根据权利要求4所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，按照以下方式来设定所述比：基于所述对照试样的所述测定结果得到的所述FOXP3阳性T细胞群中，FOXP3的量多者的细胞的数量相对于FOXP3的量少者的细胞的数量的比率为1.35以上且2.48以下。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，在将基于所述对照试样的所述测定结果得到的所述CD4阳性T细胞群展开为以FOXP3的量为轴的柱状图时，将具有所述柱状图中的FOXP3阴性侧的峰波形的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群确定为所述FOXP3阳性T细胞群。
8.根据权利要求7所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，在对所述柱状图中的所述FOXP3阴性侧的峰波形应用近似曲线时，将所述近似曲线与所述轴在FOXP3量的高值侧交叉的点设为所述结束点。
9.根据权利要求2或3所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，对基于所述对照试样的所述测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群中的CD45RA阴性群应用所述比，取得所述基准值。
10.根据权利要求9所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，按照以下方式设定所述比：基于所述对照试样的所述测定结果得到的所述FOXP3阳性T细胞群的总细胞数中，FOXP3的量多者的细胞的数量的比例为62％以上且72％以下。
11.根据权利要求9所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，按照以下方式来设定所述比：基于所述对照试样的所述测定结果得到的所述FOXP3阳性T细胞群中，FOXP3的量多者的细胞的数量相对于FOXP3的量少者的细胞的数量的比率为1.62以上且2.47以下。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，在将基于所述对照试样的所述测定结果得到的所述CD45RA阴性细胞群展开为以FOXP3的量为轴的柱状图时，将具有所述柱状图中的FOXP3阴性侧的峰波形的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群确定为所述FOXP3阳性T细胞群。
13.根据权利要求12所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，在对所述柱状图中的所述FOXP3阴性侧的峰波形应用近似曲线时，将所述近似曲线与所述轴在FOXP3量的高值侧交叉的点设为所述结束点。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，基于所述生物试样的所述测定结果，检测CD45RA阴性且FOXP3量比所述基准值多的细胞群作为效应性调节性T细胞。
15.根据权利要求14所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，
基于所述生物试样的所述测定结果提取单一的活淋巴细胞群，
从已提取的所述淋巴细胞群中提取CD3阳性细胞群，
从已提取的所述CD3阳性细胞群中提取CD4阳性细胞群，
检测已提取的所述CD4阳性细胞群中的CD45RA阴性且FOXP3量比所述基准值多的细胞群作为效应性调节性T细胞。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的效应性调节性T细胞的检测方法，其中，所述对照试样为健康人的外周血或包含由健康人的外周血纯化而得的外周血单核细胞的试样。
17.一种效应性调节性T细胞的分析装置，其为使用流式细胞术法的效应性调节性T细胞的分析装置，具备：
测定部，用于测定包含CD4阳性T细胞群的生物试样；和
控制部，取得FOXP3量作为生物试样的测定中使用的基准值，基于所述测定部对所述包含CD4阳性T细胞群的生物试样进行测定而得的测定结果从FOXP3量比所述基准值多的细胞群中检测效应性调节性T细胞，其中，所述FOXP3量在基于所述测定部对包含CD4阳性T细胞群的对照试样进行测定而得的测定结果将CD4阳性T细胞群中所含的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准。
18.根据权利要求17所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述测定部在一所述生物试样的每一测定中进行所述对照试样的测定，
所述控制部将所述基准值用于所述一生物试样的分析中的所述效应性调节性T细胞的检测。
19.根据权利要求17所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述测定部在多个所述生物试样的每一测定中进行所述对照试样的测定，
所述控制部将所述基准值用于所述多个生物试样的各分析中的所述效应性调节性T细胞的检测。
20.根据权利要求18或19所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述控制部对基于所述对照试样的所述测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群的整体应用所述比，取得所述基准值。
21.根据权利要求20所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述控制部在将基于所述对照试样的所述测定结果得到的所述CD4阳性T细胞群展开为以FOXP3的量为轴的柱状图时、将具有所述柱状图中的FOXP3阴性侧的峰波形的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群确定为所述FOXP3阳性T细胞群。
22.根据权利要求21所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述控制部在对所述柱状图中的所述FOXP3阴性侧的峰波形应用近似曲线时、将所述近似曲线与所述轴在FOXP3量的高值侧交叉的点设为所述结束点。
23.根据权利要求18或19所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述控制部从基于所述对照试样的所述测定结果得到的FOXP3阳性T细胞群中提取CD45RA阴性群、对已提取的所述CD45RA阴性群应用所述比而取得所述基准值。
24.根据权利要求23所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述控制部在将基于所述对照试样的所述测定结果得到的所述CD45RA阴性细胞群展开为以FOXP3的量为轴的柱状图时、将具有所述柱状图中的FOXP3阴性侧的峰波形的结束点的FOXP3量以上的FOXP3量的细胞群确定为所述FOXP3阳性T细胞群。
25.根据权利要求24所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述控制部在对所述柱状图中的所述FOXP3阴性侧的峰波形应用近似曲线时、将所述近似曲线与所述轴在FOXP3量的高值侧交叉的点设为所述结束点。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述控制部基于所述生物试样的所述测定结果检测CD45RA阴性且FOXP3量比所述基准值多的细胞群作为效应性调节性T细胞。
27.根据权利要求26所述的效应性调节性T细胞的分析装置，其中，所述控制部基于所述生物试样的所述测定结果提取单一的活淋巴细胞群，
从已提取的所述淋巴细胞群中提取CD3阳性细胞群，
从已提取的所述CD3阳性细胞群中提取CD4阳性细胞群，
检测已提取的所述CD4阳性细胞群中的CD45RA阴性且FOXP3量比所述基准值多的细胞群作为效应性调节性T细胞。
28.一种效应性调节性T细胞的分析系统，其具备：权利要求17至27中任一项所述的分析装置、和
对所述对照试样和所述生物试样的被检物质进行荧光标记的标记装置。
29.一种程序，其对分析效应性调节性T细胞的流式细胞仪的计算机赋予以下功能：
取得在基于包含CD4阳性T细胞群的对照试样的测定结果将所述CD4阳性T细胞群中所含的FOXP3阳性T细胞群以规定的比分割时成为分割基准的FOXP3量，作为生物试样的测定中使用的基准值；和
基于包含CD4阳性T细胞群的生物试样的测定结果，从FOXP3量比所述基准值多的细胞群中检测效应性调节性T细胞。
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