KR101847779B1 - 이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 적용하여 말초혈액 면역력을 단계별로 구분하여 평가하고 암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법 및 이를 이용한 진단키트 - Google Patents
이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 적용하여 말초혈액 면역력을 단계별로 구분하여 평가하고 암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법 및 이를 이용한 진단키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에 의하면 이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 적용하여 말초혈액 면역력을 단계별로 구분하여 평가하고 암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, (A) 말초혈액 면역세포의 중 세포 크기 및 주름진 정도를 분석해 림포사이트를 분류하는 단계; (B) 적어도 하나의 항체 조합으로 상기 림포사이트의 표지마커를 염색하여 암환자와 정상인의 말초혈액 내 면역세포의 분포를 분석하는 단계; (C) 암환자와 정상인 사이에서 암 발생 유무를 판별할 수 있도록 암환자와 정상인을 진단하거나 분류할 수 있을 만큼의 민감도와 특이도를 나타낼 수 있는 유의미한 표지마커의 조합을 판별하는 단계; (D) 상기 마커를 이용해 유세포 분석기나 세포 계수기 등을 이용한 자연살해 세포의 계수 없이도 단위 혈액당 면역력을 측정하여 암 발병 유무를 진단할 수 있는 이분형 로지스트 회귀분석 알고리즘을 설계하는 단계; 및 (E) 상기 알고리즘을 통해 계산된 값을 민감도 및 특이도를 기초로 암 발생 확률에 따라 복수의 그룹으로 구분하여 말초혈액의 면역력을 평가하고 암을 진단 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
Description
본 발병은 대장직장암을 포함한 암 환자와 정상인의 말초혈액 면역력을 측정 평가하고 두 그룹간 차이가 나는 항목을 발굴하여 이들 조합에 의한 이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 적용함으로써 암 환자를 진단하고 면역 치료에 관한 기준을 제공하는 것이다.
자면역력(Immunity)은 암의 발병과 진행 및 전이 과정에 이르는 모든 과정에서 매우 밀접한 관계를 가지고 있다. 실제로 지금까지 연구된 많은 문헌에서 정도의 차이는 있지만 대부분 암 환자의 면역력이 현저하게 저하(Low) 또는 손상(Impaired)되어 있다고 보고하고 있는데(Olivera J. Finn, Cancer Immunology, N Engl J Med, 2008:358:2704-15) 이러한 연구 결과는 기존의 전통적인 암 치료 방법 (수술 및 항암요법)에서 탈피하여 새로운 치료 방법을 모색 하는 계기가 되었으며 면역치료법(Immunotherapy)이라는 신 개념 치료 방법의 등장을 이끌어 내게 되었다. 이에 따라 다양한 형태의 면역 치료법이 연구 개발 되어 임상에서 실제 환자에 적용 되고 있으며, 일부 면역 치료법은 가시적인 성과를 보이고 있기도 하다.
면역력이라고 하는 것은 하나의 요소에 의해 결정 되는 것이 아니고 면역 시스템(Immune system)을 이루고 있는 다양한 세포나 단백(Immune cells and proteins) 등과 같은 여러 요소들의 합(Net effect)으로 나타나게 된다. 따라서 개인 면역력(Personal immunity)은 서로 다를 수 밖에 없으며 시시각각 변화하게 된다. 이것은 면역치료에 있어 개인마다 서로 다른 면역력에 근거한 맞춤형 치료(Tailored personal immunotherapy)가 필요 하다는 것을 의미 한다. 일반적으로 치료(Treatment or Therapy)라고 하는 것은 어떠한 질병의 진단(Diagnosis)이 선행된 다음 그에 맞는 치료법이 결정되는 과정을 거치게 된다. 면역치료 역시 면역진단이(Immune diagnosis)선행 되어야만 그에 맞는 치료가 가능한데 대부분의 면역치료는 정확한 면역진단 없이 시행 되고 있는 것이 현실이다. 이것은 앞서 언급한 바와 같이 개인의 면역력이 굉장히 복잡하여 면역력을 평가하고 진단하는 방법론적인 기준이나 근거가 정립되어 있지 않기 때문이다.
암을 진단하고 또한 예방하는 차원에서 가장 보편화된 방법은 영상의학적인 모니터링과 조직학적인 분석에 기초하는 것이다. 암을 예방하기 위한 정밀 검진은 매우 중요 하지만 이는 바쁜 현대인의 일상생활에서 시간과 비용을 요하는 과정으로서 보다 간편하고 정확한 예방법을 찾아내기 위해 다양한 진단법이 연구 되어 오고 있다. 일반적으로 가장 손쉬운 방법으로는 주로 ELISA와 같은 방법을 이용하여 혈액의 종양 표지자(Cancer marker)를 발굴하고 찾아내어 암을 예측하는 것이다. 이는 혈액 샘플의 채취가 간단하고 ELISA 기법이 어렵지 않기 때문에 많이 시도 되고 있는 방법 가운데 하나이다.
마찬가지로 혈액시료(Blood sample) 안에는 단백질 이외에도 거의 대부분의 면역세포군(Immune cells)과 그의 아형 세포들(Immune cell subtypes)이 존재 한다. 이러한 면역세포의 분석은 주로 유세포분석기(Flow cytometeter)를 이용하여 원하는 면역세포의 마커(Marker)를 형광 염색하고 유세포분석기법(FACS; Fluorescence-Activated Cell Sorting)을 이용하여 매우 간단하고 재현성 있게 수행할 수 있다.
본 발명의 목적은 암 면역력 진단을 위해 말초혈액 면역력(Peripheral blood immunity)을 구성하는 면역세포 가운데 암 환자와 정상인에 있어 차이를 보이는 마커를 발굴하는 것이다.
또한 이들의 조합을 통한 통계학적인 알고리즘을 정립하고 이를 기반으로 암을 면역 활성 측정을 위한 전 단계로서 세포 계수기를 이용한 자연살해 세포(NK cell)의 세포수 계수 없이도 간편하고 손쉽게 자연살해 세포의 세포활성도를 측정하여 개체의 면역 활성을 진단하고 그에 맞는 면역 치료법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면 이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 적용하여 말초혈액 면역력을 단계별로 구분하여 평가하고 암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, (A) 말초혈액 면역세포의 중 세포 크기 및 주름진 정도를 분석해 림포사이트를 분류하는 단계; (B) 적어도 하나의 항체 조합으로 상기 림포사이트의 표지마커를 염색하여 암환자와 정상인의 말초혈액 내 면역세포의 분포를 분석하는 단계; (C) 암환자와 정상인 사이에서 암 발생 유무를 판별할 수 있도록 암환자와 정상인을 진단하거나 분류할 수 있을 만큼의 민감도와 특이도를 나타낼 수 있는 유의미한 표지마커의 조합을 판별하는 단계; (D) 상기 마커를 이용해 유세포 분석기나 세포 계수기 등을 이용한 자연살해 세포의 계수 없이도 단위 혈액당 면역력을 측정하여 암 발병 유무를 진단할 수 있는 이분형 로지스트 회귀분석 알고리즘을 설계하는 단계; 및 (E) 상기 알고리즘을 통해 계산된 값을 민감도 및 특이도를 기초로 암 발생 확률에 따라 복수의 그룹으로 구분하여 말초혈액의 면역력을 평가하고 암을 진단 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 상기 (A) 단계에서 면역세포를 1) NK cells(NKC), 2) Th1Th2(TH), 3) Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), 4) Regulatory T cells(Tregs), 5) Cytotoxic T cells(CTLs), 6) Exhausted T cells(ETc), 7) Immune checkpoint(ICP), 8) Gamma-delta T cells(GDT), 9) White blood cell subtype(WBCS)와 같이 9가지 군으로 분류하여 분석하는 것을 특징으로 한다.
더욱 바람직하게는, 상기 (B) 단계에서, NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Exhausted T cells(ETc), Immune checkpoint(ICP), 또는 Gamma-delta T cells(GDT) 세포 분석은 유세포 분석기를 이용하여 이루어지고, White blood cell subtype(WBCS)에 포함되는 WBC, Lymphocytes, Neutrophils, Monocytes, Basophils, 또는 Eosinophils 세포 분석은 자동혈구분석기를 통하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (B) 단계에서, NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Exhausted T cells(ETc), Gamma-delta T cells(GDT) 면역세포는 세포막(Cell surface) 표지 마커를 형광 염색하고, Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Immune checkpoint(ICP) 면역세포는 세포 표면(Cell surface) 또는 세포 안(Intracellular) 표지 마커를 형광 염색하여 유세포분석기를 이용하여 분석하는 것을 특징으로 한다.
한편, 상기 (B) 단계에서 면역세포에서 발현되는 표지마커를 토대로 각각의 마커에 대한 면역세포의 표현형을 분포도(%)와 세포수 및 그 비율로 분석하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (D) 단계에서, 암환자와 정상인을 분류할 수 있는 적어도 하나의 유의미한 표지마커의 조합 값을 계수로 하는 선형 방정식을 설계하는 단계; 및 상기 선형 방정식의 값을 이용하여 암환자와 정상인의 값이 각각 1과 0으로 수렴하는 지수함수를 설계하는 단계를 포함하여 이분형 로지스트 회귀분석 알고리즘을 설계하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 유의미한 표지마커의 조합 값은 CD4+ %, CD3+CD8+ %, CD4+CD279+ %, CD4+CD25+ %, CD4+CD152+ %, CD279+ % in CTLs, CD152+ % in CTLs, CD3+CD272+ %, CD3+CD223+, Lymphocytes %, Neutrophils %, NLR, CTLs/Treg, CD314+CD158b- % in NK cells. CD314-CD158b+ % in NK cells, CD4314+ in T cells, Th1 %, Th2 %, TH1/TH2, MDSCs cells/μL, monocytes %, eosinophil %, 내지 basophil % 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (E) 단계는, 민감도 및 특이도를 기준으로 민감도가 소정 설정 값인 지점의 상기 이분형 로지스트 회귀분석 알고리즘을 통하여 계산된 값을 제1 cut value 값으로 특이도가 소정 설정 값인 지점의 상기 알고리즘을 통하여 계산된 값을 제2 cut value 값으로 설정하여 상기 알고리즘을 통하여 계산된 값이 상기 제1 cut value 값 이하인 그룹을 정상, 제1 cut value 값과 제2 cut value 값 사이인 그룹을 암 발생 고위험군, 제2 cut value 값 이상인 그룹을 암환자로 진단하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의하면 상기 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독 가능한 기록 매체가 제공된다.
또한, 본 발명에 의하면 상기 방법에 의해 암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 진단키트가 제공된다.
본 발명에 의하면 혈액시료(Blood sample) 내 함유된 면역세포들 중 유의미한 표지마커를 선정할 수 있고, 이를 유세포분석기를 이용하여 분석하여 회귀분석 알고리즘을 통해 암 면역력을 진단할 수 있다. 이것은 예방적인 차원에서 정밀검사를 받는 것과 비교하여 매우 간단하고 검사 방법도 빠르며 비용을 절감할 수 있으며 충분한 정확성을 제공한다는 장점이 있다. 또한, 기존에 알려진 혈액 내 종양표지자(Cancer biomarker)를 측정하여 진단하는 ELISA에 비해 재현성(Reproducibility)과 안정성(Statibility)을 높여 검사의 신뢰도를 높일 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 NKC분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Th1/Th2 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs) 분석을 위한 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Regulatory T cells(Tregs) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Cytotoxic T cells(CTLs) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Exhausted T cells(ETc) 분석을 위해 CD279+TIGIT+ in CTLs 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Immune checkpoint(ICP) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Gamma-delta T cells(GDT) 분석을 위해 CD3-γδTCR+ 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 9는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 E score를 이용하여 만든 Receiver operating characteristic curve.
도 10은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 2개의 E score cut value를 이용하여 암 면역력을 E1 E2 E3의 3단계로 제공하는 모형을 도시한 도면.
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Th1/Th2 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs) 분석을 위한 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Regulatory T cells(Tregs) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Cytotoxic T cells(CTLs) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Exhausted T cells(ETc) 분석을 위해 CD279+TIGIT+ in CTLs 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Immune checkpoint(ICP) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Gamma-delta T cells(GDT) 분석을 위해 CD3-γδTCR+ 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
도 9는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 E score를 이용하여 만든 Receiver operating characteristic curve.
도 10은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 2개의 E score cut value를 이용하여 암 면역력을 E1 E2 E3의 3단계로 제공하는 모형을 도시한 도면.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에서의 세포 분석은 기본적으로 유세포분석기(Flow cytometer)를 이용하여 실시 하며, White blood cell subtype(WBCS)에 포함되는 하기와 같은 6종의 면역세포 WBC, Lymphocytes, Neutrophils, Monocytes, Basophils, Eosinophils의 경우에는 자동혈구분석기(Automatic hematology analyzer)를 이용하여 분석하였다.
본 발명은 대장직장암 수술 전 환자와 정상인의 혈액에서 다음과 같이 9개로 분류되는 면역 세포군에서 발현되는 표지마커를 토대로 각각의 마커에 대한 면역세포의 표현형을 분포도(%)와 세포 수(cells/μL) 및 그 비율(Ratio)로 표현하며, 이것은 면역세포의 기능 및 분석 방법적으로 다음과 같은 카테고리로 분류될 수 있다.
1) NK cells(NKC)
2) Th1Th2(TH)
3) Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs)
4) Regulatory T cells(Tregs)
5) Cytotoxic T cells(CTLs)
6) Exhausted T cells(ETc)
7) Immune checkpoint(ICP)
8) Gamma-delta T cells(GDT)
9) White blood cell subtype(WBCS)
상기 9가지 면역 세포군은 무수히 많은 세포막(Cell surface) 및 세포질(Intracellular) 수용체 또는 신호 전달 물질을 지니고 있는데 이러한 세포 물질을 세포의 마커라 볼 수 있으며 이는 면역세포 고유의 기능을 결정짓는 역할을 하게 된다. 또한 세포의 일부 마커 가운데 일부는 그 기능과 발현 정도가 암의 발병 및 진행 과정과 매우 밀접한 관계를 가지고 있을 수 있다. 실제로도 현재 면역치료의 주가되는 것 가운데 하나는 면역세포의 마커를 통한 신호 전달을 증폭 시키거나 차단함으로써 암세포의 증식을 억제하는 것이다(Katheleen M. Mahoney, Combination cancer immunotherapy and new immunomodulatory targets, 2015, Nat Rev Drug Discov).
본 발명은 이러한 점에 착안하여 주요한 세포 면역 표지 마커를 유의미한 군으로 분류하고 정리하여 선별 하였다. 또한 선별된 마커가 실제로 말초혈액 면역력 단위에서도 암 환자와 정상인 두 그룹 사이에 의미 있는 발현정도의 차이를 나타내며 진단 마커로서 유용성이 있는가를 직접 테스트 하였다. 통계적으로 유의성이 확인된 마커들이 실제로 본 발병자들에 의해 확인 되었지만 이러한 마커들은 단일 항목으로서 암 환자와 정상인을 진단하거나 구분 지을 수 있을 만큼의 충분한 민감도(Sensitivity) 와 특이도(Specificity)를 나타내지는 않았다. 이에 암 환자와 정상인의 두 그룹에 있어 통계적인 유의성을 보이는 마커들이 유의미한 정보를 제공할 수 있도록 이를 조합하고 두 그룹의 차이점을 수식으로 구분 지을 수 있는 알고리즘을 발명하게 되었다. 본 발명에 이용된 수식 모형은 이분형 로지스틱 회귀분석에 기초한 것이다. 본 발명자들은 다양한 조합의 마커를 이용하여 역시 다양한 회귀분석 모형을 얻을 수 있었으며, 암 환자와 정상인을 진단하는데 90% 이상의 민감도와 특이도를 나타내어 말초혈액 면역력을 평가하고 암을 조기에 진단하는 기술이 가능하다는 것을 확인하게 되었다.
이하에서는 다양한 조합의 마커를 이용하여 90% 이상의 민감도와 특이도를 가지도록 암 환자와 정상인을 진단할 수 있는 방법에 대하여 실시예와 이로부터 도출된 데이터를 기반으로 보다 상세히 설명한다.
암세포(K562 세포)에 대한 세포 활성도
측정말초혈액
면역세포의 형광염색을 통한
유세포분석
대장 직장암 환자 98명 및 정상인 132명으로부터 각각 말초혈액 5 cc (5 ㎖)를 채혈하여 혈액 응고를 방지하기 위한 헤파린-EDTA 튜브 (Heparin-EDTA tube)에 담아 실온 상태에서 분석실로 운반해 즉시 분석을 진행하였다.
각각의 면역세포 마커를 분석하기 위해 다음과 같은 8가지 면역세포 카테고리로 분류하였으며, 8개의 폴리스티렌 튜브(12x75mm Polystyrene tube)를 준비하였다. 각각의 8개 튜브에서는 다음과 같은 항체조합이 사용 되었고 각 항체의 볼륨은 아래 표 1 내지 8과 같다. 표 1 내지 표 8은 각각 NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Exhausted T cells(ETc), Immune checkpoint(ICP), Gamma-delta T cells(GDT)의 마커를 분석하기 위한 항체로서 모든 항체는 항-인간 마우스 이뮤노글로불린(mouse anti-human IgGs)에 형광 물질(fluorescence dye)이 부착되어 있는 형태이며 본 발명에서 사용된 형광의 종류로는 FITC, Alexa Fluor 488, PE, PE-Cy5, PE-Cy7, PerCP, 및 APC의 7종이다. 각 표의 상단 항목에서 Channel은 유세포 분석기의 디텍터 채널 종류를, Tandem-dye는 항체에 부착된 형광의 종류를, Marker는 표지마커의 종류를, Marker location은 각 마커의 위치를 의미하여 각 마커의 위치에 따라 하기 실험방법을 통해 설명하는 바와 같이 실험방법에 차이가 있을 수 있다.
| Channel | Tandem-dye | Marker | Marker location | Distributor | Catalog# | Lot# | Volume/test |
| FL1 | FITC | CD3 | surface | BD | 555339 | 6125658 | 0.5 |
| FL2 | PE | CD56 | surface | BD | 555516 | 6054620 | 2.5 |
| FL3 | PE-Cy7 | CD314 | surface | BD | 562365 | 6140911 | 2.5 |
| FL4 | APC | CD158b | surface | BioLegend | 312612 | B210467 | 0.5 |
| Channel | Tandem-dye | Target | Marker location | Distributor | Catalog# | Lot# | Volume/test |
| FL1 | Alexa Fluor488 | CD183 | surface | BD | 558047 | 6155849 | 0.5 |
| FL2 | PE | CD194 | surface | BD | 551120 | 5107877 | 0.5 |
| FL3 | PE-Cy5 | CD4 | surface | BD | 555348 | 5037589 | 0.5 |
| FL4 | APC | CD196 | surface | BD | 560619 | 5135834 | 0.15 |
| Channel | Tandem-dye | Target | Marker location | Distributor | Catalog# | Lot# | Volume/test |
| FL1 | FITC | CD3 | surface | BD | 555339 | 6125658 | 0.5 |
| CD19 | surface | BD | 555412 | 5097663 | 0.5 | ||
| CD56 | surface | BD | 340410 | 6141554 | 2.5 | ||
| FL2 | PE | CD11b | surface | BD | 555388 | 4314750 | 0.1 |
| FL3 | PE-Cy5 | HLA-DR | surface | BD | 555813 | 6132725 | 2.5 |
| FL4 | APC | CD33 | surface | BD | 551378 | 4288542 | 0.1 |
| Channel | Tandem-dye | Target | Marker location | Distributor | Catalog# | Lot# | Volume/test |
| FL1 | FITC | CD4 | surface | BD | 555346 | 5097644 | 0.5 |
| FL2 | PE | CD25 | surface | BD | 555432 | 6040885 | 2.5 |
| FL3 | PE-Cy7 | CD152 | intra | BD | 555854 | 5142830 | 2.5 |
| FL4 | APC | CD279 | surface | BD | 558694 | 6154800 | 2.5 |
| Channel | Tandem-dye | Target | Marker location | Distributor | Catalog# | Lot# | Volume/test |
| FL1 | FITC | CD3 | surface | BD | 555339 | 6125658 | 0.5 |
| FL2 | PE | CD25 | surface | BD | 555432 | 6040885 | 2.5 |
| FL3 | PE-Cy7 | CD152 | intra | BD | 555854 | 5142830 | 2.5 |
| FL4 | APC | CD279 | surface | BD | 558694 | 6154800 | 2.5 |
| Channel | Tandem-dye | Target | Marker location | Distributor | Catalog# | Lot# | Volume/test |
| FL1 | FITC | CD3 | surface | BD | 555339 | 6125658 | 0.5 |
| FL2 | PE | TIGIT | Surface | eBioseience | 12-9500-42 | 4310012 | 2.5 |
| FL3 | PerCP | CD8 | Surface | eBioseience | 46-0087-41 | E10832-1634 | 2.5 |
| FL4 | APC | CD279 | Surface | BD | 558694 | 6154800 | 2.5 |
| Channel | Tandem-dye | marker | Marker location | Distributor | Catalog# | Lot# | Volume/test |
| FL1 | FITC | CD3 | Surface | BD | 555339 | 6125658 | 0.5 |
| FL2 | PE | CD366 | Intra | BD | 563422 | 5082811 | 1 |
| FL3 | PerCP | CD272 | Intra | R&D systems | FAB3354C | ABCC212071 | 1 |
| FL4 | APC | CD223 | intra | R&D systems | FAB23193A | ADXM0116041 | 2.5 |
| Channel | Tandem-dye | marker | Marker location | Distributor | Catalog# | Lot# | Volume/test |
| FL1 | FITC | CD3 | Surface | BD | 555339 | 6125658 | 0.5 |
| FL2 | PE | γδTCR | surface | BD | 555717 | 5267944 | 1 |
기본적인 염색 방법은 다음과 같은 과정으로 진행 되었다.
① 염색하고자 하는 각 항체의 테스트당 볼륨(volume/test)을 마이크로피펫(micro pipette)으로 1.8mL 볼륨의 미세원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 분주한다. 각 항체의 조합 볼륨은 테스트당 10μL가 되도록 준비 한다. 또한 항체 조합은 염색하고자 하는 마커의 부위(marker location)가 모두 세포막(surface)인지 또는 세포막(surface)과 세포질(intra)의 조합인지에 따라 준비가 달라지는데 기본적인 염색은 먼저 세포막(surface) 마커만 염색하기 위한 항체를 조합하여 세포를 염색하고 세포를 고정한 다음(Fixation) 세포질(intra) 마커를 준비하여 염색하는 방식으로 세포를 염색한다.
예를 들어 마커의 부위가 세포막(surface)의 조합으로만 구성된 NK cell(NKC)을 10 tests(10명)로 분석 하고자 할 경우에는, FITC mouse anti-human CD3 IgGs의 5μL(0.5μL x 10 tests), PE mouse anti-human CD56 IgGs의 25μL(2.5μL x 10 tests), PE-Cy7 mouse anti-human CD314 IgGs의 25μL(2.5μL x 10 tests), APC mouse anti-human CD158b IgG의 5μL(0.5 μL x 10 tests)을 각각 미세원심분리 튜브에 넣어 60μL를 준비한다. 그런 다음 40μL의 PBS(Phosphate-buffered saline)를 튜브에 넣어 최종적으로 100μL의 항체조합 볼륨을 만든다.
다른 예로 마커의 부위가 세포막(surface)과 세포질(intra) 조합으로 구성된 Tregs을 10 tests(10명)로 분석하고자 할 경우에는, 항체 조합 튜브를 두개 준비 한다.
먼저 첫 번째 튜브에 세포막(surface) 염색 항체인 FITC mouse anti-human CD4 IgGs의 5μL(0.5μL x 10 tests), PE mouse anti-human CD25 IgGs의 25μL(2.5μL x 10 tests), APC mouse anti-human CD279 IgG의 5μL(0.5μL x 10 tests)을 각각 미세원심분리 튜브에 넣어 35μL를 준비한다. 그런 다음 65μL의 PBS(Phosphate-buffered saline)를 튜브에 넣어 최종적으로 100μL의 항체조합 볼륨을 만든다.
그런 다음 두번째 튜브에 세포질(intra) 염색 항체인 PE-Cy5 mouse anti-human CD152 IgGs의 25μL(2.5μL x 10 tests)을 준비하고 75μL의 PBS(Phosphate-buffered saline)를 튜브에 넣어 최종적으로 100μL의 항체조합 볼륨을 만든다.
이와 같은 방법으로 마커의 부위가 세포막의 조합으로 구성된 NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Exhausted T cells(ETc), Gamma-delta T cells(GDT)의 염색 항체를 준비하고, 마커의 부위가 세포막과 세포질의 조합으로 구성된 Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Immune checkpoint(ICP)의 염색 항체를 세포막과 세포질 염색용으로 각각 준비한다. 각 항체의 구성 부피비는 표 1 내지 표 8의 volume/test비를 통해 적시한 바와 같으므로 위 예시와 같은 방법으로 항체조합 볼륨을 준비할 수 있다.
② 염색을 위한 모든 항체조합 튜브가 준비 되면 각각의 8개 폴리스티렌 튜브에 50μL의 전혈(whole blood)를 분주한다.
③ 미리 준비된 항체 조합이 담겨 있는 튜브(세포막(surface)용 항체조합)에서 혈액에 들어 있는 테스트 튜브로 항체 조합을 10μL씩을 분주하고 마이크로피펫으로 잘 섞어준다. 그런 다음 빛을 차단한 상태의 실온에서 20분간 염색 한다.
④ 세포 염색이 끝나면 혈액의 적혈구(RBC)를 제거 하기 위해 450μL의 lysing solution(BD FACS Lysing solution, DB Biosciences)을 각각의 8개 폴리스티렌 튜브에 분주하고 vortex로 잘 섞어서 20분간 빛을 차단한 실온에서 반응시킨다.
⑤ 2mL의 PBS를 각각 튜브에 분주하고 원심분리기에 넣어 5분간 250 중력가속도(g force)로 돌린다. 그런 다음 상층액을 버리고 한번 더 2mL의 PBS로 동일하게 원심분리기로 세포를 세척한다.
⑥ 세포막(surface)만의 조합 항체로 염색이 된 경우에는 200μL의 PBS를 튜브에 넣고 잘 섞어준 다음 유세포 분석기를 이용해 분석을 진행한다.
⑦ 세포막(surface) 및 세포질(intra) 염색 조합의 항체인 경우에는 상기 ⑤ 과정이 끝난 이후 0.05% saponine 함유 Distilled water 40μL을 미리 준비된 세포질(intra) 염색용 항체 10μL와 동시에 튜브에 넣어주고 잘 섞어준 다음 실온에서 빛을 차단한 상태에서 20분간 2차 염색을 진행한다. 그런 다음 ⑤ 과정을 거쳐 200μL의 PBS를 튜브에 넣고 유세포 분석기로 분석을 진행한다.
유세포 분석을 통해 얻게 되는 결과 값은 모두 분포도(%)로 얻어지게 되는데 각 분포도에 따른 세포 수(cells/μL)를 얻기 위해, 자동혈구 분석기를 이용해 얻은 백혈구 세포의 차등(differential)을 이용하여 분포도에 곱하는 방식으로 세포 수를 계산할 수 있다.
예를 들어, CD3-CD56+ NK cells = 15% 일 경우, 그 세포 수는 림프구 세포 3000 cells/μL을 이용하여 3000 x 0.15 = 450cells/μL로 계산된다.
위와 같은 실험 과정을 통해 유세포 분석기를 이용한 면역세포의 각 마커 분석 결과를 도 1 내지 8에 나타내었으며, 암 환자와 정상인을 분석한 통계 처리 결과 값을 표 9 내지 18에 표시하였다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 NKC분석을 위해 ① CD3-CD56+, ② CD3+CD56+, ③ CD314+CD158b- in CD3-CD56+ cells (NK cells), ④ CD314-CD158b+ in NK cells, ⑤ CD314-CD158b+ in NK cells, ⑥ CD158b+ in CD3+CD56- (T cells)와 같이 6가지 세포 표현형을 제공한다.
보다 상세히, 도 1의 왼쪽 상단 그래프의 경우 유세포 분석기로 혈액을 분석하면 X축을 FSC-H(세포의 상대적 크기)로 Y축을 SSC-H(세포의 주름진 정도)로 세포들을 분류할 수 있는데 이중 중심부근의 림포사이트(Lymphocytes)를 중심으로 분석을 진행하였으며, 이 부분을 각 마커에 부착되는 항체를 이용해 염색을 진행한 결과이다. 오른쪽 상단 그래프의 경우 X축은 CD3의 염색 유무를 Y축은 CD56의 염색 유무를 나타내는데 그래프 내부의 십자 모양의 실선을 중심으로 왼쪽은 CD3- 오른쪽은 CD3+, 아래쪽은 CD56- 위쪽은 CD56+로 볼 수 있다. 이 경우 CD3-CD56+ 부분을 Q1, CD3+CD56+ 부분을 Q2, CD3+CD56- 부분을 Q3, CD3-CD56- 부분을 Q4로 지정하였다. 왼쪽 하단의 그래프의 경우 Q1 지역의 세포들을 다시 항체를 이용해 CD314, CD158 마커의 염색 유무에 따라 분류한 것으로서 그래프의 표현방법은 앞서 설명한 바와 같다. 오른쪽 하단 그래프의 경우 오른쪽 상단 그래프의 Q3 지역의 세포들을 다시 항체를 이용해 CD314, CD158 마커의 염색 유무에 따라 분류한 것으로서 그래프의 표현방법은 앞서 설명한 바와 같다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Th1/Th2 분석을 위해 ① Th1, ② Th2, ③ Th17, ④Th1/Th2와 같이 4가지 세포 표현형을 제공한다.
보다 상세히, 도 2 역시 도 1의 림포사이트 부분의 세포를 이용해 분석한 결과로서 항체를 순차적으로 또는 동시에 넣어 각 마커 CD4, CD183, CD194, CD196의 염색 유무를 분류하여 분석한 결과를 도시하였으며, 그래프의 X축과 Y축에 넣은 항체와의 반응 유무를 수치로 표현하였으며, 그래프 내에 실선을 통해 각 구역을 세분화하였다. 상세한 방법은 도 1을 통하여 설명한 바와 같다. 한편, Th1, Th2, Th17의 분포도는 아래와 같은 수학식 1에 의해 구해진다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs) 분석을 위한 세포 표현형을 제공한다.
보다 상세히, 그래프의 표현 방법은 도 1을 통하여 설명한 바와 같고, 도면에서와 같이 HLA-DR 및 Lineage 계열(CD3CD19CD56) 모두 음성(negative)인 세포 집단(Q4)안에서 CD33+과 CD11b+를 발현하는 세포를 표현형으로 하며 MDSCs는 다음 수학식 2와 같이 구해질 수 있다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Regulatory T cells(Tregs) 분석을 위해 ① CD4+CD279+, ② CD4+CD25+, ③ CD4+CD152+와 같이 3가지 세포 표현형을 제공한다. 도 4 내지 도 8을 통하여 나타낸 그래프의 표현은 도 1을 통하여 설명한 바와 같으므로 자세한 설명은 생략한다.
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Cytotoxic T cells(CTLs) 분석을 위해 ① CD152+ in CTLs, ② CD279+ in CTLs와 같이 2가지 세포 표현형을 제공한다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Exhausted T cells(ETc) 분석을 위해 CD279+TIGIT+ in CTLs 세포 표현형을 제공한다.
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Immune checkpoint(ICP) 분석을 위해 ① CD3+CD366+, ② CD3-CD366+, ③ CD366+ in lymphocytes, ④ CD3+CD272+, ⑤ CD3-CD272+, ⑥ CD272+ in lymphocytes, ⑦ CD3+CD223+, ⑧ CD3-CD223+, ⑨ CD223+ in lymphocytes와 같이 9가지 세포 표현형을 제공한다.
도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Gamma-delta T cells(GDT) 분석을 위해 CD3-γδTCR+ 세포 표현형을 제공한다.
한편, 표 9는 암 환자 및 정상인의 말초혈액 NKC의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 10은 암 환자 및 정상인의 말초혈액 TH의 평균 분포도 및 세포수를 나타낸 표이다. 표 11은 암 환자 및 정상인의 말초혈액 MDSCs의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 12는 암 환자 및 정상인의 말초혈액 Tregs의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 13은 암 환자 및 정상인의 말초혈액 CTLs의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 14는 암 환자 및 정상인의 말초혈액 ETc의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 15는 암 환자 및 정상인의 말초혈액 ICP의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 16은 암 환자 및 정상인의 말초혈액 GDT의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 17은 암 환자 및 정상인의 말초혈액 WBCS의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 18은 암 환자 및 정상인의 말초혈액 면역세포의 비(Ratio)를 나타낸 표이다.
상기 각 표의 상단 항목에서 N은 실험군의 숫자, Mean은 평균값, S.D.는 표준편차, S.E.는 표준에러, 95% Mean은 오차율을 줄이기 위해 집단의 양 말단의 결과치 2.5%씩을 버리고 95%만을 이용해 계산한 평균값, Median은 중앙값을 의미한다.
이분형 로지스틱 회귀분석 모형을 통한 대장직장암 진단 방법
상기 표 9 내지 18 에서 표시 한 바와 같이 전체 정상인 132명 및 환자 98명의 말초혈액 면역세포를 분석한 결과, 유의수준 P value < 0.05 에서 두 그룹간 차이를 보이는 면역세포의 마커가 존재함을 확인할 수 있었으며 표에서 빨간색으로 표시한 부분이 유의미한 면역세포의 마커라 할 수 있다. 두 그룹간 평균값의 차이는 통계프로그램 SPSS를 이용하여 분석하였다. 모집단이 정규분포를 따르고 등 분산 조건을 만족함으로 평균값의 통계적 차이는 T 검정 student's t-test를 사용하였다.
이를 통해 말초혈액 내의 각 면역세포의 분포도와 세포 수를 측정하고 암 면역력 특이적 면역세포 마커를 이용하여 대장직장암 환자와 정상인을 정확하게 분류할 수 있으며, 면역력 검사를 통한 암 진단 역시 가능할 수 있다. 이와 같이 신뢰성 있는 암 진단을 위해 암 환자와 정상인의 말초혈액 면역력 차이를 보다 극명하게 나타낼 수 있도록 수식화된 이분형 로지스틱 회귀분석 모형을 암 진단에 적용하게 되었다.
알고리즘을 완성하기 위해 암 환자와 정상인을 종속 변수로 하여 각각 1과 0으로 변환하였으며 독립 변수로는 상기 표 9 내지 18에서 보는 바와 같이 면역세포 마커 결과 값을 사용 하였다. 그러면서 정상인 132명과 암 환자 98명의 두 그룹을 가장 잘 구분 지을 수 있는 항목을 선별하였다.
위 표 19는 23가지 면역세포 마커를 이용한 회귀분석 모형에서의 계수(B)와 상수(Constant)를 표시한 것이며, 표 상단의 항목에서 B는 B 추정값으로 회귀수식 모형에서 계수 값에 해당하고, S.E는 B 추정값에 대한 표준 오차 값, Wald는 (B 추정값/B 추정값의 표준 오차 값)의 제곱 값이다. 즉 (B/S.E.)2 를 의미하는 것으로 각 독립 변수의 유의성 검정을 위한 통계량을 의미한다. Df는 자유도, Sig.는 significance 유의확률을 의미하며 각 항목이 모형에서 차지하는 유의성을 의미하고, Exp(B)는 B값에 자연로그를 취한 eB를 의미하며, 각 독립변수가 1만큼 증가하면 내부값이 0인 집단에 속할 확률보다 내부 값이 1인 집단에 속할 확률이 몇 배인가를 나타내는 통계량이다.
위 상수(Constant)와 계수(B)를 이용한 로지스틱 회귀분석 수식은 다음 수학식 3과 같다.
상기 수식에서와 같이 면역세포를 유세포분석하여 결과 값을 얻게 되면 각각의 결과 값과 계수 값을 곱하여 상수 값과 함께 합산하고 Logit(P) 값을 구하게 된다. 이때 암 환자와 정상인을 1과 0으로 치환한 바와 같이 회귀분석 수식을 이용하여 암을 진단하는 것이 목적이므로 어떠한 임의의 신규 테스트 결과 값을 알고리즘에 입력하여 1과 0사이 어떠한 값이 관측되는지를 파악하고 암 환자인지 정상인인지 예측하는 것이 필요하다. 따라서 선형 방정식 모델 값인 Logit(P)를 지수함수를 이용하여 1과 0의 값에 수렴하도록 변환할 수 있다. 이때 지수 함수를 이용하여 암 환자(1의 값을 나타냄)와 정상인(0의 값을 나타냄)으로 분류 되는 예측 수식은 다음 수학식 4와 같다.
수식에서와 같이 암 환자와 정상인의 에측 Y 값은 eP 를 분자로 1-eP를 분모로 하여 구하는데 확률 Y 값을 본 발명에서 E score라고 명명한다.
도 9는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 E score를 이용하여 만든 Receiver operating characteristic curve이다.
도 9에서 보는 바와 같이 E socre에 대한 Receiver operating characterisc (ROC) curve를 그리게 되면 AUC 값이 0.98이 되는 것을 알 수 있고, 이는 말초혈액 면역력을 바탕으로 한 대장직장암 진단이 가능하다는 것을 의미 한다고 볼 수 있다.
표 20은 상기 E score 결과 값에 따른 민감도, 특이도 및 유덴 인덱스 값을 나타낸 것으로, 상기 표 20에서 보는 바와 같이 E score 결과 값의 민감도와 특이도에 대한 cut value를 임의 조정할 수 있는데 cut value를 0.098로 잡게 되면 민감도는 100% 이면서 특이도는 78.4%가 되고, cut value를 0.684로 잡게 되면 민감도는 83.1% 이면서 특이도는 100%인 것을 알 수 있다. 이것은 E score < 0.098 에서는 모두 정상인이라 할 수 있으며 마찬가지로 0.684 < E score 에서는 모두 암 환자라고 진단 할 수 있음을 보여 주는 것이다.
도 10은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 2개의 E score cut value를 이용하여 암 면역력을 E1 E2 E3의 3단계로 제공하는 모형을 도시한 도면이다.
도 10을 참조하면, 말초혈액 면역력을 이용한 로지스틱 회귀분석 진단에 있어 반드시 cut value를 하나로 규정지을 필요는 없다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따르면 E score의 cut value를 0.098과 0.684를 기준으로 세구간으로 구분하고 E score 결과에 따른 암 면역력을 3단계로 구분하여 진단할 수 있다. E socre ≤ 0.098 구간은 정상인이면서 E1으로 명명하고 0.098 < E score ≤ 0.684 구간은 암 고위험군으로서 E2라 명명하며 0.684 < E score 구간은 암 환자로 E3라고 명명하고 진단할 수 있다.
본 발명에서는 대장직장암 수술 전 환자를 예를 들어 말초혈액 면역력을 이용하여 정상인(E1)과 암 고위험군(E2) 및 암 환자(E3)로 진단을 하였지만 방법론적으로 대장직장암에만 한정되지 않고 다른 암 종에 있어서도 적용될 수 있음은 물론이다. 또한 23가지 면역세포 마커를 이용하여 만든 회귀모형은 향후 새롭게 발굴되는 마커를 이용하여 민감도와 특이도를 높여 암 진단의 유용성을 극대화 할 수 있으며, 본 발명에서 제시한 23가지 항목이 아닌 새로운 조합에 의해서도 회귀 모형이 만들어 지고 암 진단에 사용 될 수 있을 것이다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
Claims (10)
- 이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 적용하여 말초혈액 면역력을 단계별로 구분하여 평가하고 대장직장암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서,
(A) 말초혈액 면역세포의 중 세포 크기 및 주름진 정도를 분석해 림포사이트를 분류하는 단계;
(B) 적어도 하나의 항체 조합으로 상기 림포사이트의 표지마커를 염색하여 암환자와 정상인의 말초혈액 내 면역세포의 분포를 분석하는 단계;
(C) 암환자와 정상인 사이에서 암 발생 유무를 판별할 수 있도록 암환자와 정상인을 진단하거나 분류할 수 있을 만큼의 민감도와 특이도를 나타낼 수 있는 유의미한 표지마커의 조합을 판별하는 단계;
(D) 상기 마커를 이용해 유세포 분석기나 세포 계수기 등을 이용한 자연살해 세포의 계수 없이도 단위 혈액당 면역력을 측정하여 암 발병 유무를 진단할 수 있는 이분형 로지스트 회귀분석 알고리즘을 설계하는 단계; 및
(E) 민감도 및 특이도를 기준으로 민감도가 소정 설정 값인 지점의 상기 이분형 로지스트 회귀분석 알고리즘을 통하여 계산된 값을 제1 cut value 값으로 특이도가 소정 설정 값인 지점의 상기 알고리즘을 통하여 계산된 값을 제2 cut value 값으로 설정하여 상기 알고리즘을 통하여 계산된 값이 상기 제1 cut value 값 이하인 그룹을 정상, 제1 cut value 값과 제2 cut value 값 사이인 그룹을 암 발생 고위험군, 제2 cut value 값 이상인 그룹을 암환자로 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (A) 단계에서 면역세포를
1) NK cells(NKC)
2) Th1Th2(TH)
3) Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs)
4) Regulatory T cells(Tregs)
5) Cytotoxic T cells(CTLs)
6) Exhausted T cells(ETc)
7) Immune checkpoint(ICP)
8) Gamma-delta T cells(GDT)
9) White blood cell subtype(WBCS)
와 같이 9가지 군으로 분류하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서,
상기 (B) 단계에서, NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Exhausted T cells(ETc), Immune checkpoint(ICP), 또는 Gamma-delta T cells(GDT) 세포 분석은 유세포 분석기를 이용하여 이루어지고, White blood cell subtype(WBCS)에 포함되는 WBC, Lymphocytes, Neutrophils, Monocytes, Basophils, 또는 Eosinophils 세포 분석은 자동혈구분석기를 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서,
상기 (B) 단계에서,
NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Exhausted T cells(ETc), Gamma-delta T cells(GDT) 면역세포는 세포막(Cell surface) 표지 마커를 형광 염색하고,
Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Immune checkpoint(ICP) 면역세포는 세포 표면(Cell surface) 또는 세포 안(Intracellular) 표지 마커를 형광 염색하여 유세포분석기를 이용하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (B) 단계에서 면역세포에서 발현되는 표지마커를 토대로 각각의 마커에 대한 면역세포의 표현형을 분포도(%)와 세포수 및 그 비율로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (D) 단계에서,
암환자와 정상인을 분류할 수 있는 적어도 하나의 유의미한 표지마커의 조합 값을 계수로 하는 선형 방정식을 설계하는 단계; 및
상기 선형 방정식의 값을 이용하여 암환자와 정상인의 값이 각각 1과 0으로 수렴하는 지수함수를 설계하는 단계를 포함하여 이분형 로지스트 회귀분석 알고리즘을 설계하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서,
상기 유의미한 표지마커의 조합 값은 CD4+ %, CD3+CD8+ %, CD4+CD279+ %, CD4+CD25+ %, CD4+CD152+ %, CD279+ % in CTLs, CD152+ % in CTLs, CD3+CD272+ %, CD3+CD223+, Lymphocytes %, Neutrophils %, NLR, CTLs/Treg, CD314+CD158b- % in NK cells. CD314-CD158b+ % in NK cells, CD4314+ in T cells, Th1 %, Th2 %, TH1/TH2, MDSCs cells/μL, monocytes %, eosinophil %, 내지 basophil % 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독 가능한 기록 매체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 대장직장암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 진단키트.
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010145205A (ja) | 2008-12-18 | 2010-07-01 | Tokyo Medical & Dental Univ | 免疫力評価方法、装置、及びプログラム |
| JP4608704B2 (ja) | 2006-06-15 | 2011-01-12 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 免疫力評価方法、免疫力評価装置、及び免疫力評価プログラム |
| KR101483883B1 (ko) * | 2013-10-30 | 2015-01-19 | 이종균 | 세포 계수가 필요 없는 신규한 면역활성 측정방법 |
| WO2016014530A1 (en) * | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars |
-
2017
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4608704B2 (ja) | 2006-06-15 | 2011-01-12 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 免疫力評価方法、免疫力評価装置、及び免疫力評価プログラム |
| JP2010145205A (ja) | 2008-12-18 | 2010-07-01 | Tokyo Medical & Dental Univ | 免疫力評価方法、装置、及びプログラム |
| KR101483883B1 (ko) * | 2013-10-30 | 2015-01-19 | 이종균 | 세포 계수가 필요 없는 신규한 면역활성 측정방법 |
| WO2016014530A1 (en) * | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Tumor-Infiltrating Monocytic Myeloid-Derived Suppressor Cells Mediate CCR5-Dependent Recruitment of Regulatory T cells Favoring Tumor Growth (The Journal of Immunology, (2012), 189, pp 5602-5611.) |
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