CN110484531A - 一种富油微藻的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种富油微藻的筛选方法，属于生物技术领域，该富油微藻油脂的脂肪酸为由16和18个碳原子组成的长链脂肪酸；饱和脂肪酸为C16:0和C18:0，不饱和脂肪酸为C18:1；其中，微藻为原壳小球藻，不饱和脂肪酸的相对含量为60‑69.4％。该方法所得富油微藻遗传稳定性高，脂肪酸为由16和18个碳原子组成的长链脂肪酸，饱和脂肪酸为C16:0和C18:0，不饱和脂肪酸为C18:1且相对含量为60‑69.4％，制得的生物柴油的流动粘度和十六烷值较高、同时具有较低的冷滤点、碘值大小适宜，均达到中国、美国、欧盟、德国的生物柴油标准；增加微藻游离态多糖含量，提高自发性絮凝能力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富油微藻的筛选方法。
背景技术
微藻的脂肪酸能通过简单直接的工业化反应转化成生物柴油(脂肪酸甲酯)。因此，很多研究致力于提高藻株的油脂产量。富油微藻的筛选是一项重要的基础工作，选择具有高的生长速率和高的油脂含量的微藻，并进一步对其培养条件进行优化来增加油脂产率具有非常重要的意义。目前，已有很多研究者对微藻进行了油脂含量的测定，但多为富含EPA和DHA等多不饱和脂肪酸(PUFAs)的微藻。在选育微藻产油脂的第一阶段主要是在自然环境中寻求，然而自然物种的多样性使藻种的选育工作工作量巨大且不易得到显著成效，因此，基因工程、诱变育种、生物合成等方法常用于提离产量和改良产物质量(如：产物类型、易收获、提高抗病性等)。目前的研究中少于20种生产生物燃料的微藻来自菌种保藏，其中70％的藻种在同类研究中没有竞争力，为了得到油脂含量更高的藻种人工操作改变藻株的基因，从而改变生理生化过程是常用手段转基因微藻主要致力于改变生长特性和构建新的高效的表型然而目前用基因操作改良生产油脂的藻种仍然缺乏改造技术。物理诱变、化学诱变、物理化学联合诱变后用高通量筛选的方法选育优良藻株是最简单，最有效的方法之一。
现有技术如授权公告号为CN 102115776 B的中国发明专利，公开了一种微藻筛选方法及系统，该方法包括：将待筛选的微藻藻株分别置于微藻培养装置中的若干光生物反应器中培养；微藻培养装置中气体分配单元上的可控出气管和至少一个恒温水槽，为每个光生物反应器中的微藻藻株提供设定流量的光合反应气体和设定的培养温度；放置在光生物反应器侧面的灯架，为微藻藻株提供设定强度的均匀光照；性能检测设备获取每个光生物反应器中培养的微藻藻株并进行生物性能指标检测，实现筛选出生物性能指标最佳的微藻藻株。能够对不同种类的微藻藻株和相同种类的微藻藻株在不同培养条件下的生物性能指标进行准确的评价、比较和筛选，实现了微藻的高效、快速、批量化筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富油微藻的筛选方法，该方法所得富油微藻遗传稳定性高，脂肪酸为由16和18个碳原子组成的长链脂肪酸，饱和脂肪酸为C16:0和C18:0，不饱和脂肪酸为C18:1且相对含量为60-69.4％，制得的生物柴油的流动粘度和十六烷值较高、同时具有较低的冷滤点、碘值大小适宜，均达到中国、美国、欧盟、德国的生物柴油标准；增加微藻游离态多糖含量，提高自发性絮凝能力。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种富油微藻的筛选方法，富油微藻油脂的脂肪酸为由16和18个碳原子组成的长链脂肪酸；饱和脂肪酸为C16:0和C18:0，不饱和脂肪酸为C18:1；其中，微藻为原壳小球藻，不饱和脂肪酸的相对含量为60-69.4％。本发明筛选所得微藻的油脂的脂肪酸组成为：C16:0、C18:0和C18:1，且C18:1的相对含量为60-69.4％，不含有多不饱和脂肪酸，由此油脂原料制得的生物柴油的流动粘度和十六烷值较高、同时具有较低的冷滤点、碘值大小适宜不会发生固化也不会沉积，均达到中国、美国、欧盟、德国的生物柴油标准，生物柴油的品质较高。
在一些实施方式中，富油微藻的油脂含量提高40-60％。
在一些实施方式中，富油微藻的筛选方法包括诱变育种。诱变育种可以在短时间内获得大量的突变体，形成一个巨大的突变库，一定程度上可以根据对目的性状的需求进行定向育种。
在一些实施方式中，诱变育种采用的诱变剂包括四正丁基氯化铵。利用四正丁基氯化铵对微藻进行化学诱变，改变了油脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的组成和比例，所得藻种油脂中饱和脂肪酸为：C16:0和C18:0，不饱和脂肪酸为：C18:1，不饱和脂肪酸的相对含量为60-69.4％，且可稳定遗传。
在一些实施方式中，诱变剂还包括碘苯乙二酸。用碘苯乙二酸对微藻进行诱变处理后，微藻游离态多糖含量明显升高，从而自发性絮凝能力明显增强，可采用自沉降方法收集微藻，避免采用其他方法采收微藻造成的较高成本。
在一些实施方式中，碘苯乙二酸的诱变方法为：用无水乙醇配制终浓度为28-35mmol/L的碘苯乙二酸溶液，按照20-34:1的体积比向四正丁基氯化铵诱变后的藻细胞悬浮液中加入碘苯乙二酸溶液，黑暗条件诱变25-30min。本发明将四正丁基氯化铵诱变和碘苯乙二酸诱变结合起来，提供的碘苯乙二酸诱变方法能够将两部分诱变很好的进行组合，属于中高剂量的诱变，最终致死率为72-83％，有利于正向突变的发生，得到多种优良性状集于一身的突变株。
在一些实施方式中，富油微藻游离态多糖含量≧640.98mg/L。
在一些实施方式中，诱变育种后利用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂进行初筛。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是脂肪酸合成过程中一个关键的限速步骤，乙酰辅酶A羧化酶活性的高低将影响生物体内脂肪酸合成效率。脂肪酸是微藻生存的必需物质，用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂进行初筛，则脂肪酸合成能力弱的藻株无法生存，筛选得到的藻株的脂肪酸合成能力较强。
在一些实施方式中，乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂选自芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、肟醚类环己二酮除草剂、芳氧苯基环己二酮类除草剂、三酮类环己二酮除草剂之一。芳氧苯氧丙酸酯类、肟醚类环己二酮、芳氧苯基环己二酮类、三酮类环己二酮均为乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂，都能够很好的抑制微藻的脂肪酸合成。
在一些实施方式中，芳氧苯氧丙酸酯类除草剂为精喹禾灵。精喹禾灵，是一种芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂，在细胞内的靶标酶是位于质体基质中的ACCase，能够抑制脂肪酸的从头合成，初筛效率较高，能够减轻后续复筛的工作量。
本发明的有益效果为：
1)本发明通过利用四正丁基氯化铵对原壳小球藻进行诱变选育，所得富油微藻油脂的脂肪酸为由16和18个碳原子组成的长链脂肪酸；饱和脂肪酸为C16:0和C18:0，不饱和脂肪酸为C18:1，C18:1相对含量为60-69.4％，制得的生物柴油品质较高；
2)本发明通过利用碘苯乙二酸对原壳小球藻进行诱变选育，所得富油微藻游离态多糖含量≧640.98mg/L，自发性絮凝能力明显增强，减少微藻的采收成本；
3)本发明使用精喹禾灵对诱变后的突变菌株进行定向初筛，提高高含油优势藻株的筛选效率，减轻复筛工作量。
附图说明
图1为本发明脂肪酸甲酯的运动粘度、十六烷值、碘值和冷滤点的对比图；
图2为本发明藻液游离态多糖含量和藻细胞沉降比率的对比图；
图3为本发明的原始藻株M和诱变藻株F1的18S rRNA的序列的Blast比对图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种富油微藻的筛选方法，包括：
原壳小球藻经两次分离纯化，将无菌单种藻株M接种至f/2液体培养基中进行扩大培养，培养至对数期生长中期，培养温度25℃，光照强度60-80μmol/(m2·s)，光照周期12h/d，每天早晚各摇瓶一次。
四正丁基氯化铵诱变：用水做溶剂配制终浓度为5.8mmol/L的四正丁基氯化铵溶液，取15mL藻液，加入0.9mL配制好的四正丁基氯化铵溶液，封口，摇床100rpm，23℃诱变70min，5000rpm离心10min，收集藻细胞，用15mL f/2培养基离心洗涤三次，除去残留的四正丁基氯化铵。
碘苯乙二酸诱变：用无水乙醇配制终浓度为30mmol/L的碘苯乙二酸溶液，用15mLf/2培养基悬浮四正丁基氯化铵诱变后的藻细胞，向藻细胞悬浮液中加入0.6mL碘苯乙二酸溶液，黑暗条件诱变28min，5000rpm离心10min，收集藻细胞，用15mL无水乙醇离心洗涤三次，除去残留的碘苯乙二酸。
用f/2液体培养基培养诱变后的藻细胞，置于光照条件下恢复培养5-7d，配制含有6.8μmol/mL精喹禾灵的f/2固体培养基，倒平板，将恢复培养后的藻液稀释100倍，后取200μL藻液涂布在精喹禾灵筛选平板上，光照条件下倒置培养。
诱变后藻株经过精喹禾灵筛选平板的筛选，在第45天左右可以用肉眼观测到明显藻落。挑取颜色浓绿，体积较大藻落于96孔板中进行初步培养。7天后转入100mL小三角瓶中进行扩大培养，空白组做相同处理。分别用紫外可见分光光度计测量扩大培养后的出发藻株及诱变筛选藻株的光密度值，并根据光密度值调整藻细胞以相同的起始密度接种于300mL液体培养基中。
将培养至对数生长后期的藻液8000rpm离心10min，收集藻细胞，40℃供干至质量恒定，采用氯仿-甲醇法提取油脂，对油脂进行甲酯化，采用带有火焰离子检测器(FID)的气相色谱仪对脂肪酸甲酯的成份进一步分析，筛选出不含多不饱和脂肪酸，且脂肪酸组成为C16:0，C18:0和C18:1，不饱和脂肪酸的相对含量不小于60％的优势藻株。
取20mL上述筛选的优势藻株对数生长期的藻液，10500rpm离心15min，取上清液，利用蒽酮比色法对多糖含量进行测定；进一步筛选出多糖含量相对较高的藻株，得到诱变藻株F1。
对比例1：
未用四正丁基氯化铵进行诱变，其余部分和实施例1完全一致。
对比例2：
未用碘苯乙二酸进行诱变，其余部分和实施例1完全一致。
对比例3：
未用四正丁基氯化铵进行诱变，未用碘苯乙二酸进行诱变，其余部分和实施例1完全一致。
试验例1：
脂肪酸分析：
将培养至对数生长后期的藻液8000rpm离心10min，收集藻细胞，40℃供干至质量恒定，采用氯仿-甲醇法提取油脂，对油脂进行甲酯化，采用带有火焰离子检测器(FID)的气相色谱仪对脂肪酸甲酯的成份进一步分析，藻株油脂的脂肪酸成分分析结果见表1。
表1脂肪酸成分分析
生物柴油品质指标的测定：
取上述制得的脂肪酸甲酯，按GB/T265规定测定运动粘度，根GB/T386规定测定十六烷值，按GB/T5532规定测定碘值，按SH/T0248规定测定冷滤点。运动粘度、十六烷值、碘值、冷滤点的测定结果见图1，不同国家生物柴油品质指标标准见表2。
表2不同国家生物柴油品质指标标准
由表1可以看出，实施例1和对比例2的脂肪酸由C16:0，C18:0和C18:1组成，其中实施例1中C18:1相对含量69.4％，对比例2中C18:1相对含量为63.4％，这说明用四正丁基氯化铵诱变对原壳小球藻进行诱变，可以得到脂肪酸组成成分为C16:0，C18:0和C18:1，且C18:1相对含量不小于60％的目的藻株。
由图1和表2可以看出，实施例1和对比例2制得的柴油的运动粘度(4.8mm2/s,5mm2/s)、碘值(79g/100g,72g/100g)、十六烷值(61,59)冷滤点(-6,-4)均达到美国、欧盟、德国、中国的标准，而对比例1和对比例3的运动粘度、冷滤点均较高，均达不到上述四个国家的标准，会造成燃料流动性差，出油困难，燃烧不完全，低温性能差，生物柴油品质较低，这说明用四正丁基氯化铵诱变对原壳小球藻进行诱变，可以得到脂肪酸组成成分为C16:0，C18:0和C18:1，且C18:1相对含量不小于60％的目的藻株，用该藻株的油脂制得的生物柴油品质较高。
试验例2：
游离态多糖含量的测定：
取20mL对数生长期的藻液，10500rpm离心15min，取上清液，利用蒽酮比色法对多糖含量进行测定。
为了解藻体细胞自然沉降率，测定放置12h时样品沉降细胞比率。样品摇匀后室温自然光照置于25mL玻璃比色管中静置分层，到相应的时间点，将10mL刻度线上的藻液取出，测定其分光光度值和浊度，计算藻细胞的沉降比率，沉降比率的计算公式如下：
沉降比率＝(OD0-ODt)/OD0×100％
式中，OD0为放置0h时的分光光度值，ODt为放置12h时的分光光度值。藻液游离态多糖含量和藻细胞沉降比率见图2。
由图2可以看出，实施例1和对比例1中游离态多糖含量和沉降比率明显高于对比例2和对比例3，这说明用碘苯乙二酸进行诱变，筛得的藻株游离态多糖含量较高，沉降比率升高，自发性絮凝能力明显增强，可减少微藻的采收成本。
试验例3：
诱变藻株与原始藻株18S rRNA基因序列比对：
通过裂解法提取藻株的总RNA；逆转录为cDNA，所用引物为随机引物；扩增18SrRNA序列，所用引物为：
正向引物：5’-CTCGATTTCCGCATCGGTG-3’；
反向引物：5’-GTCTATACAACTCGACCTGGC-3’。
回收扩增引物，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对阳性克隆进行测序，用Blast软件对原始藻株M和诱变藻种F1的18S rRNA的序列进行比对和比较。比对结果见图3。
由图3可以看出，原始藻株M的18S rRNA基因(SEQ ID NO:3)长度为1642bp，而诱变株F1的18S rRNA基因(SEQ ID NO:4)长度为1641bp，其中11个碱基对发生了变异，验证了诱变株F1发生了遗传变异，且原始藻株M和诱变株F1的18S rRNA基因的同源性百分比为99％。
试验例4：
遗传稳定性验证：
将实施例1所得藻株F1进行摇瓶培养，12d为第一代，以10％接种量接种后摇瓶培养12d即为第二代，以此类推，一共传6代即可。取10mL藻株培养15d的藻液进行油脂含量和游离态多糖含量的测定，分析脂肪酸组成。第1代和第6代的脂肪酸成分、油脂含量、游离态多糖含量见表3。
表3脂肪酸成分、油脂含量和游离态多糖含量的遗传稳定性
由表3可以看出，和第1代相比，第6代的脂肪酸成分、油脂含量和游离态多糖含量仍然保持在较好的水平，这说明诱变株F1具有良好的遗传稳定性。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<120> 一种富油微藻的筛选方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgatttcc gcatcggtg 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtctatacaa ctcgacctgg c 21
<210> 5
<211> 1642
<212> DNA
<213> 原壳小球藻原始藻株（M）(Chlorella protochlorella )
<400> 5
atggctggaa ttcagcaaaa aagaaaaagt acaaaatctt ttaaaaataa aagttgtacg 60
ctccctttga ggagagtagc gaacgggtga gtaacgcgtg agaatctgcc tcttaaactg 120
tggaataact ttactgttag acctgcggtt aatcatggat actatacttt ttttaattca 180
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aaagaatatt attcgttaag agatgagctt gcgtaagatt aggtagttgg taaggtaaag 300
gcttaccaag ccaaagatct ttagctggtt tgagagaatg atcagccaca ttgggactga 360
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tacgaaaggg gcgagcgtta ttcggaatga ttgggcgtaa agttgttagt aaaatttatt 660
agcccgcaag gaaaaatttt atctcgacga gcaattgata gaaaatttat ataaataaaa 720
acttgagtat ttattaggag agtagaattc ctggagtaga ggtaaaattt gttgatctca 780
ggaggaatac ctaaagcgaa agcagctctc tggtaaagca ctaacattga ggcacgaaag 840
cgtgggtagc gaagaggatt agataccctt gtagtccacg ccgtcaacta tgatcttttt 900
ttattttccc ttgaaagggg ggaagtggag tagctaacgc gttaaaagat ccgcctgagg 960
agtacggtcg caagattaaa actcaaagga atagacgggg acccgcacaa gtggtggaac 1020
atcgcggttt aatgcgaaac aacgcgcaaa accttaccag cccttgatat aacacttata 1080
taataaaata ttatagtttt agagtttgtg ttacaggtgt tgcatggctg tcgtcggttc 1140
gtgccgtaag gcgtgcacga atgggtggac tattaccttt tgtaaactat gaaattgctg 1200
gaaagacaaa ttattttgta tttcagaact ttgatactac tgccagtcat aaactggagg 1260
aaggaaggga ttacgtcaag tcctcatgac ccttatgggc tgggctacac gtgtgttaca 1320
atggcgaata caaaaagatg caatgatgag agtcggagca aatctataaa attcgtctta 1380
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tcgagtggat tgtaagtcta tgtctcccta tttttttatg ggatgggtct gatggcctat 1560
acatatatag aaatttagaa gatataccca gaatttattt ggtaactgga gtgaagtcgt 1620
aacaaggtaa gtgtcctaca ct 1642
<210> 4
<211> 1641
<212> DNA
<213> 原壳小球藻诱变株（F1）(Mutant strain of chlorella protochlorella)
<400> 4
atggctggaa ttcagcaaaa aagaaaaagt acaaaatctt ttaaaaataa aagttgtacg 60
ctccctttga ggagagttgc gaacgggtga gtaacgcgtg agaatctgcc tcttaaactg 120
tggaataact ttactgttag acctgcggtt aatcatggat actatacttt ttttaattca 180
attgtaaaat ggattatcta aaataaaatt attagaaaat ttgaattaaa aaagttatat 240
aaagaatatt attcgttaag agatgagctt gcgtaagatt aggtagttgg taaggtaaag 300
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tcgagtggat tgtaagtcta tgtctcccta ttttttttgg gatgggtctg atggcctata 1560
catatataga aatttagaag atatacccag aatttatttg gtaactggag tgaagtcgta 1620
acaaggtaag tgtcctacac t 1641
Claims (10)
1.一种富油微藻的筛选方法，其特征在于：所述富油微藻油脂的脂肪酸为由16和18个碳原子组成的长链脂肪酸；
饱和脂肪酸为C16:0和C18:0，不饱和脂肪酸为C18:1；
其中，所述微藻为原壳小球藻，不饱和脂肪酸的相对含量为60-69.4％。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述富油微藻的油脂含量为67-82％。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述富油微藻的筛选方法包括诱变育种。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述诱变育种采用的诱变剂包括四正丁基氯化铵。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述诱变剂还包括碘苯乙二酸。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：所述碘苯乙二酸的诱变方法为：用无水乙醇配制终浓度为28-35mmol/L的碘苯乙二酸溶液，按照20-34:1的体积比向四正丁基氯化铵诱变后的藻细胞悬浮液中加入碘苯乙二酸溶液，黑暗条件诱变25-30min。
7.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：所述富油微藻游离态多糖含量≧640.98mg/L。
8.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述诱变育种后利用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂进行初筛。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于：所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂选自芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、肟醚类环己二酮除草剂、芳氧苯基环己二酮类除草剂、三酮类环己二酮除草剂之一。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于：所述芳氧苯氧丙酸酯类除草剂为精喹禾灵。
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