CN101423830A - 富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法，通过射线或化学元素诱变，使海洋微藻发生不定向变异，利用分离培养技术建立不同的诱变品系，进行扩大培养，采用脂肪酸检测方法筛选出高脂肪酸含量的微藻品系。本发明的优点是通过诱变育种技术培育富含脂肪酸的海洋微藻，与利用未进行选育的海洋微藻相比较，利用该方法可提高海洋微藻脂肪酸含量，以其作为制备生物柴油的原料，可进一步提高生物柴油的生产效率，降低生产成本；利用该方法，定向地筛选出含有高比例16和18碳脂肪酸的海洋微藻品系，可有效地提高后期生物柴油制备的效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物育种的方法，具体地说是一种富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法。
背景技术
生物质能是全球未来可持续能源系统中的重要组成部分。
生物柴油(biodiesel)作为生物质能的主要形式，是利用生物质和可再生动植物油与醇类化合物在催化剂存在下进行酯化反应所制备的脂肪酸单脂。与石油柴油相比，生物柴油具有可再生、易生物降解、无毒、不污染环境等特点，可作为一重要新能源取代或者部分替代石油柴油。
目前，由于全球食品安全危机以及原料涨价等问题，大规模生产生物柴油主要面临着生产成本高、原料供给不足等问题。因此，开拓油脂资源，寻找可再生廉价的高含量油脂材料、降低成本成为未来生物柴油产业发展的瓶颈。
海洋微藻具有繁殖速度快、天然脂肪酸含量高、培养成本低等优点，是一类极具有发展前景的生物柴油原料。但相对而言，海洋微藻中脂肪酸组成复杂(多达20余种)，且规模化培养后脂肪酸含量不稳定。如何培育一种可稳定生产目标脂肪酸的海洋微藻新品系，能够解决我国生物柴油开发中的原料不足、成本过高的问题。这正是本发明面临的技术课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法，培育一种可稳定生产目标脂肪酸的海洋微藻新品系，提高海洋微藻中总脂肪酸含量，可减低用其制备生物柴油的成本，提高生物柴油制备的效率。
本发明的构思是放射线和化学诱变剂对海洋微藻进行不定向诱变，使其基因组发生随机变异，当变异发生在脂肪酸合成途径的相关转录区和调控区范围内，基因位点的变异将影响到海洋微藻的脂肪酸合成；通过分离培养各类变异的微藻细胞建立细胞系，然后再通过研究其脂肪酸含量和组成，特定筛选出16碳脂肪酸和18碳脂肪酸含量高的海洋微藻新品系。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法，其特征在于通过射线或化学诱变，使海洋微藻发生不定向变异，利用分离培养技术建立不同的诱变品系，进行扩大培养，采用脂肪酸检测方法筛选出16和18碳不饱和脂肪酸含量高的微藻品系。
对上述技术方案的改进：所述的射线诱变是将海洋微藻混合到富加微量元素和维生素的海水培养液中，使其细胞数量至少达到1×105个/ml，利用紫外线、X射线进行海洋微藻的诱变，辐射剂量为半致死剂量，诱变辐射剂时间为60s-2h。
对上述技术方案的另一改进：所述的化学诱变是将海洋微藻混合到富加微量元素和维生素的海水培养液中，使其细胞数量至少达到1×105个/ml，加入叠氮化钠溶液使之浓度至少达到150mg/L，调节溶液的pH值为8-9。
对上述技术方案的进一步改进：具体培养筛选方法为：
(1)海洋微藻诱变品系的分离培养
取诱变处理后的海洋微藻，利用毛细吸管进行单个微藻细胞的分离培养；光照为90-120μmol·m-2·s-1、12-24h光照培养、温度25-35℃，培养液为富加微量元素和维生素的海水培养液；静置培养45-50h后，用显微镜检查分离的海洋微藻细胞的存活率情况，取存活正常分裂海洋微藻细胞移到50ml培养瓶中，光照为90-120μmol·m-2·s-1、连续光照培养、温度25-35℃；海洋微藻细胞不断增殖分裂形成品系；
(2)海洋微藻诱变品系大规模培养
将海洋微藻诱变品系的藻株分别接种到富加微量元素和维生素的海水培养液中，利用培养瓶进行培养，初始培养密度至少为1.0×105个/ml，光照为90-120μmol·m-2·s-1、连续光照培养、温度25-35℃、冲气培养；培养8-12天，测定脂肪酸含量，过滤收集海洋微藻；
(3)海洋微藻诱变品系脂肪酸含量测定
过滤干燥后取适量的海洋微藻，充分研磨藻粉；加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂，混合比例为1:2，适当震荡混匀；加入质量百分比为10％的KOH沉淀藻细胞，然后在4000r/min以上转速条件下离心10-15min，取上清液；60℃水浴迅速蒸去多余溶剂至恒重，称重；利用GC/MS进行脂肪酸组成成分和含量的测定，测定其16或18碳脂肪酸的含量；测定总脂肪酸、16和18碳脂肪酸含量最高的海洋微藻品系即为选育出富油海洋微藻品系。
本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
本发明区别于其他技术方法的主要特征是定向培育16碳脂肪酸和18碳脂肪酸含量高的海洋微藻新品系，作为制备生物柴油的原料。16碳和18碳脂肪酸是生物柴油的主要成分，其具有燃点低、黏度低等特点。以富含16碳和18碳脂肪酸的海洋微藻新品系作为制备生物柴油的原料，可降低规模化制备生物柴油的生产成本、油品质优良，大幅度提高生产效率。
具体实施方式
下面以海洋微藻诱变育种培育16碳不饱和脂肪酸为实施例进一步说明本发明。
本实施例实验材料为硅藻。
本实施例是以叠氮化钠作为诱变剂定向提高硅藻的16碳脂肪酸(软脂酸)含量的诱变育种研究。
(1)硅藻藻株脂肪酸含量测定
过滤干燥后取5g硅藻，充分研磨藻粉；加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂(1:2)，适当震荡混匀；加入质量分数10％的KOH沉淀藻细胞，然后在4000r/min条件下离心15min，取上清夜；60℃水浴迅速蒸去多余溶剂至恒重，称量，硅藻藻株测定含量为26.60％。利用GC/MS进行脂肪酸组成成分和含量的测定，测定其16碳脂肪酸(软脂酸)含量为18.7％。
(2)硅藻诱变育种研究
将硅藻混合到f/2培养液中，使其细胞数量达到1×105个/ml，加入叠氮化钠溶液使之浓度达到150mg/L，调节溶液的pH值为8.5，处理时间为1h。
(3)硅藻诱变品系的分离培养
取叠氮化钠处理后的硅藻悬浮液体，利用毛细吸管进行单个硅藻细胞的分离培养；光照为100μmol·m-2·s-1、连续光照培养、温度30℃，培养液为0.05ml f/2培养液；静置培养48h后，用显微镜检查分离的硅藻细胞的存活率情况，取存活正常分裂硅藻细胞移到50ml培养瓶中，光照为100μmol·m-2·s-1、连续光照培养、温度30℃；硅藻细胞不断增殖分裂形成品系。
(4)硅藻藻株大规模培养
将硅藻不同品系的藻株分别接种到1L f/2培养液中，利用培养瓶进行培养，初始培养密度为1.0×105个/ml，光照为100μmol·m-2·s-1、连续光照培养、温度30℃、冲气培养；培养10d，测定脂肪酸含量为31.4％，过滤收集硅藻。
(5)不同诱变品系硅藻脂肪酸含量的测定
按照(1)所述的方法，对不同诱变品系的硅藻进行脂肪酸成分和含量的测定，重点分析总脂肪酸含量和16碳脂肪酸(软脂酸)含量。测定脂肪酸和16碳脂肪酸(软脂酸)含量最高的硅藻品系即为选育出富油海洋微藻品系(脂肪酸含量为31.20％，软脂酸含量为35.7％)。
通过射线诱变为利用紫外线、X射线进行海洋微藻的诱变，辐射剂量为半致死剂量，诱变辐射剂时间为60s-2h。
通过化学元素诱变为利用叠氮化钠化学染色体诱变剂进行海洋微藻的诱变，诱变剂量为半致死剂量，处理时间为1-3h，pH值为7.0-9.0。
本发明的创新点之一在于利用海洋微藻作为制备生物柴油的原料，增加了生物柴油制备的原料；本技术方法的创新点之二在于进行培养的海洋微藻，在前期进行微藻种类的脂肪酸含量和组成的测定，从中筛选出具有高脂肪酸含量的藻株进行培养；本技术方法的创新点之三在于在大规模培养海洋微藻过程中，通过调节培养的物理和化学条件，使海洋微藻自身合成和积累大量的脂肪酸，可以提高最后的生物柴油制备的效率。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1、一种富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法，其特征在于通过射线或化学诱变，使海洋微藻发生不定向变异，利用分离培养技术建立不同的诱变品系，进行扩大培养，采用脂肪酸检测方法筛选出16和18碳不饱和脂肪酸含量高的微藻品系。
2、根据权利要求1所述的富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法，其特征在于所述的射线诱变是将海洋微藻混合到富加微量元素和维生素的海水培养液中，使其细胞数量至少达到1×105个/ml，利用紫外线、X射线进行海洋微藻的诱变，辐射剂量为半致死剂量，诱变辐射剂时间为60s-2h。
3、根据权利要求1所述的富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法，其特征在于所述的化学诱变的是将海洋微藻混合到富加微量元素和维生素的海水培养液中，使其细胞数量至少达到1×105个/ml，加入叠氮化钠溶液使之浓度至少达到150mg/L，调节溶液的pH值为8-9。
4、根据权利要求1所述的富含脂肪酸的海洋微藻诱变育种方法，其特征在于：具体培养筛选方法为：
(1)海洋微藻诱变品系的分离培养
取诱变处理后的海洋微藻，利用毛细吸管进行单个微藻细胞的分离培养；光照为90-120μmol·m-2·s-1、12-24h光照培养、温度25-35℃，培养液为富加微量元素和维生素的海水培养液；静置培养45-50h后，用显微镜检查分离的海洋微藻细胞的存活率情况，取存活正常分裂海洋微藻细胞移到50ml培养瓶中，光照为90-120μmol·m-2·s-1、连续光照培养、温度25-35℃；海洋微藻细胞不断增殖分裂形成品系；
(2)海洋微藻诱变品系大规模培养
将海洋微藻诱变品系的藻株分别接种到富加微量元素和维生素的海水培养液中，利用培养瓶进行培养，初始培养密度至少为1.0×105个/ml，光照为90-120μmol·m-2·s-1、连续光照培养、温度25-35℃、冲气培养；培养8-12天，测定脂肪酸含量，过滤收集海洋微藻；
(3)海洋微藻诱变品系脂肪酸含量测定
过滤干燥后取适量的海洋微藻，充分研磨藻粉；加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂，混合比例为1:2，适当震荡混匀；加入质量百分比为10％的KOH沉淀藻细胞，然后在4000r/min以上转速条件下离心10-15min，取上清液；60℃水浴迅速蒸去多余溶剂至恒重，称重；利用GC/MS进行脂肪酸组成成分和含量的测定，测定其16或18碳脂肪酸的含量；测定总脂肪酸、16和18碳脂肪酸含量最高的海洋微藻品系即为选育出富油海洋微藻品系。
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|---|---|
| CN (1) | CN101423830A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102604928A (zh) * | 2011-01-21 | 2012-07-25 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 叠氮钠处理微藻细胞改良微藻油脂含量品性的方法 |
| CN110484531A (zh) * | 2019-09-02 | 2019-11-22 | 浙江海洋大学 | 一种富油微藻的筛选方法 |
| EP2601297B1 (en) * | 2010-08-02 | 2020-09-16 | Cellectis | Method for targeted genomic events in algae |
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2008
- 2008-11-16 CN CNA2008101604910A patent/CN101423830A/zh active Pending
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| EP2601297B1 (en) * | 2010-08-02 | 2020-09-16 | Cellectis | Method for targeted genomic events in algae |
| CN102604928A (zh) * | 2011-01-21 | 2012-07-25 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 叠氮钠处理微藻细胞改良微藻油脂含量品性的方法 |
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