CN103060256B - 一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法，特点是包括以下步骤：（1）将水杨酸或24-表油菜素内酯溶解在乙醇中配成相应的浓度为0.5-2mg/mL的第一母液和第二母液；（2）将小球藻培养直至OD值达到0.1-3.0；（3）将第一母液或者将第二母液或者将第一母液和第二母液按比例混合添加到小球藻培养液中；（4）将添加了第一母液的培养液或第二母液的培养液或者两者混合液的培养液分别在25℃、光强4000lx、光照周期为每天12小时连续光照再12小时连续黑暗的条件下进行培养，将小球藻培养直至藻体颜色由绿变黄色，即获得油脂含量较高的小球藻，优点可有效提高小球藻油脂积累速度，显著提高小球藻油脂含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种小球藻培养方法，尤其是涉及一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法。
背景技术
小球藻（Chlorella）是一种油脂含量较高、具有较大应用前景的能源微藻。它不但具有较高的蛋白质含量，而且具有生长速度快、油脂含量较高等特点，在我国还具有较成熟的规模培养工艺和技术体系，是目前研究得较多的一种经济微藻。利用小球藻等微藻材料快速生长积累油脂，进而生产生物柴油是新型能源研究开发的热点。目前在小球藻培养系统，如生物反应器培养、开放式跑道池培养、培养条件、工艺、培养基等都有较多的文献和专利。但小球藻作为生物能源同样存在生长速度与高油脂含量不可兼得、成本过高等技术瓶颈，还需要进一步研究提高生长速度和油脂含量的方法。
植物激素是高等植物和藻类中存在的一类微量次生代谢产物，对植物体生长、发育等具有调节作用。如生长素能有效提高小球藻的生长速度（王素琴等，不同氮源形态和植物激素对小球藻USTB01生长及叶黄素含量的效应，科技导报，2005年23期12卷；刘世名等，植物激素IBA与6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球藻的生长及化学组成的影响，西北植物学报，2004年第1期）。水杨酸和油菜素内酯是植物体内微量存在的、对增强植物抗逆性有显著效果的两类植物激素，与藻类的抗逆性和次生代谢产物积累密切相关，这两种植物激素均可能提高小球藻的代谢产物的积累，但是目前国内外还没有关于利用水杨酸或油菜素内酯提高小球藻生长和油脂积累的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法，该方法通过在培养基中添加一定量的植物激素，可有效提高小球藻油脂积累速度，显著提高小球藻油脂含量。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法，包括以下步骤：
（1）将水杨酸溶解在乙醇中配成浓度为0.5-2mg/mL的第一母液；或将24-表油菜素内酯溶解在乙醇中配成浓度为0.5-2mg/mL的第二母液；
（2）将小球藻置于培养液中培养直至OD值达到0.1-3.0；
（3）然后将第一母液加入到培养液中使其最终浓度为0.1-1.0μg/mL；或者将第二母液加入到培养液中使其最终浓度为2.5-10μg/mL；或者将所述的第一母液和所述的第二母液按体积比（1-2）:（3-8）的比例混合后，添加到培养液中使水杨酸最终浓度为0.25μg/mL，使24-表油菜素内酯最终浓度为0.375-2.0μg/mL；
（4）将添加了第一母液的培养液或添加了第二母液的培养液或者添加了第一母液和第二母液混合液的培养液分别在25℃、光强4000lx、光照周期为每天12小时连续光照再12小时连续黑暗的条件下进行培养，将小球藻培养1周，直至藻体颜色由绿变黄色，即获得油脂含量较高的小球藻。
所述的第一母液的浓度为1mg/mL。
所述的第二母液的浓度为1mg/mL。
步骤（2）中所述的培养液为f/2改良培养基。
步骤（2）中所述的培养液为宁波大学3号培养基，配方为：1升蒸馏水中加KNO30.1g，KH2PO40.01g，FeSO40.025g，MnSO40.0005g，EDTA-Na20.02g。
步骤（3）中将所述的第一母液和所述的第二母液按体积比1:5的比例混合后，添加到培养液中使水杨酸最终浓度为0.25μg/mL，使24-表油菜素内酯最终浓度为1.25μg/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种促进小球藻中油脂积累的培养方法，用终浓度为0.1-1.0μg/mL的水杨酸或2.5-10μg/mL的24表油菜素内酯或两者的混合物添加到OD值为0.1-3.0的小球藻培养基中，将高浓度小球藻用植物激素处理后放在光照培养箱中培养，由于这2种植物激素均为抗逆性植物激素，外源施加后引起小球藻的抗逆反应，积累更多的油脂以抵抗逆境，最终可使小球藻迅速积累油脂，在快速生长的同时实现小球藻油脂的积累，与现有的不加植物激素的小球藻培养方法相比，相同的培养时间下，油脂含量增加30%以上。本发明中采用水杨酸或者油菜素内酯或者两者的混合物，均是常用的植物激素，具有相对的生物安全性，价格低廉，在较低浓度下即具有较好的提高小球藻生长和油脂积累的效果，因此本发明是一种具有较大经济效益、使用方便、无生态危害、可大量推广的技术方法。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
本发明一种促进小球藻油脂积累的方法。首先将蛋白核小球藻F-9(C.pyrenoidosa)在较好的生长条件下快速培养至对数生长后期，小球藻达到较高的密度，测定OD460=1.47。用一定量的乙醇将化学纯的水杨酸(SIGMA公司)充分溶解，配成浓度为1.0mg/mL的母液，将母液加入对数生长后期的培养基中，使最终浓度分别为0.1、0.5、1.0μg/mL；将添加了水杨酸的小球藻在25℃、光强4000lx、光照周期每天12小时连续光照再12小时连续黑暗，及不加外源培养基条件下进行连续培养，每天检测小球藻油脂含量（小球藻油脂检测方法采用香草醛比色法，方法参照丛峰等，几种小球藻油脂含量检测方法的比较及优化，宁波大学学报，2012年第1期）和颜色变化，7天后观察到藻体颜色由绿变黄色。这时候小球藻中油脂含量较高。添加了水杨酸的小球藻油脂含量最高可达到33.7%，为对照组的124.3%（所有数据均为3次测定的平均值），如表1所示，
表1对照组小球藻和添加水杨酸后小球藻中油脂含量变化（%）
实施例2
与实施例1基本相同，所不同的只是植物激素采用24-表油菜素内酯(上海源叶生物科技有限公司)，经过试验，最优终浓度分别为2.5、5.0、10.0μg/mL。得到的小球藻油脂含量积累数据如表2，所有数据均为3次测定的平均值。结果添加了24-表油菜素内酯的小球藻油脂含量最高为35.8%，为对照组的132.1%。
表2对照和添加24-表油菜素内酯后小球藻中油脂含量变化（%）
实施例3
与实施例1基本相同，所不同的只是植物激素同时采用水杨酸（在培养基中的终浓度0.25μg/mL）和24-表油菜素内酯（1.25μg/mL），所得到的小球藻油脂含量积累数据如表3，所有数据均为3次测定的平均值。结果添加了水杨酸和24-表油菜素内酯的小球藻油脂含量为37.5%，为对照组的138.3%。
表3对照和添加两种植物激素后小球藻中油脂含量变化（%）
实施例4
与实施例1或2基本相同，所不同的只是小球藻的密度为OD1.08，分别采用水杨酸（0.5μg/mL）和24-表油菜素内酯（2.5μg/mL），所得到的油脂积累数据如表4。结果添加了水杨酸和油菜素内酯的小球藻油脂含量分别为28.7%和29.5%，分别为对照组的127.55%和131.11%。
表4对照组小球藻和添加了植物激素后小球藻中油脂含量变化表（%）
实施例5
与实施例1或2基本相同，所不同的只是小球藻的密度为OD2.16，分别采用水杨酸（0.25μg/mL）和24-表油菜素内酯（1.25μg/mL），所得到的油脂积累数据如表5。结果添加了水杨酸和油菜素内酯的小球藻油脂含量分别为33.4%和36.3%，为对照组的126.04%和136.98%
表5对照组小球藻和添加了植物激素后小球藻中油脂含量变化表（%）
实施例6
与实施例3基本相同，所不同的只是小球藻的培养体积不同，分别在扩大体积培养体系：光生物反应器（20L）和大池培养系统(10米×20米×0.5米)中培养，检测水杨酸（0.25μg/mL）和24-表油菜素内酯（1.25μg/mL）对小球藻油脂积累的影响，所得到的油脂积累数据如表6。结果表明，在扩大的培养体系中，添加植物激素仍然对小球藻油脂积累有促进作用。最终小球藻油脂含量最高为34.1%，为对照组的135.3%。各项指标均略低于三角瓶培养。
表6对照和添加了植物激素后小球藻中油脂含量变化表（%）(光生物反应器和大池培养)
综上所述，水杨酸最适宜浓度为0.1-1.0μg/mL，24-表油菜素内酯最适合浓度为2.5-10.0μg/mL，在该浓度下，小球藻的油脂积累效果最佳；细胞吸光度OD值在0.1-3.0的范围内，小球藻的油脂都能得到一定的积累，随着OD值的增加，油脂积累效果更加显著，培养液中水杨酸最终浓度为0.25μg/mL，24-表油菜素内酯最终浓度为1.25μg/mL，两者按上述浓度联合作用，小球藻油脂积累效果达到最佳；该技术在20升简易生物反应器和室外大池培养同样具有较好的效果。
除上述实施例外，第一母液的水杨酸的浓度可取0.5-2mg/mL范围内的任一值，取1mg/mL时，油脂积累效果较好；第二母液的24-表油菜素内酯的浓度可取0.5-2mg/mL范围内的任一值，取1mg/mL时，油脂积累效果较好；小球藻的OD值可取0.1-3.0范围内的任一值，如1.0、2.0、3.0；第一母液和第二母液的体积比可取（1-2）:（3-8）范围内的任一值，两者按1:5的比例混合，水杨酸最终浓度为0.25μg/mL，24表油菜素内酯最终浓度为1.25μg/mL时，油脂积累效果较好。
上述实施例中用于培养小球藻的培养液在实验室里为f/2改良培养基（Guillard etal,Canadian Journal of Microbiology,1962,8:(2)）、较大规模培养采用宁波大学3号培养基，配方为：1升蒸馏水中加KNO30.1g，KH2PO40.01g，FeSO40.025g，MnSO40.0005g，EDTA-Na20.02g。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将水杨酸溶解在乙醇中配成浓度为0.5-2mg/mL的第一母液；或将24-表油菜素内酯溶解在乙醇中配成浓度为0.5-2mg/mL的第二母液；
（2）将小球藻置于培养液中培养直至OD值达到0.1-3.0；其中所述的培养液为f/2改良培养基或者所述的培养液为宁波大学3号培养基，配方为：1升蒸馏水中加KNO30.1g，KH2PO40.01g，FeSO40.025g，MnSO40.0005g，EDTA-Na20.02g；
（3）然后将第一母液加入到培养液中使其最终浓度为0.1-1.0μg/mL；或者将第二母液加入到培养液中使其最终浓度为2.5-10μg/mL；或者将所述的第一母液和所述的第二母液按体积比（1-2）:（3-8）的比例混合后，添加到培养液中使水杨酸最终浓度为0.25μg/mL，使24-表油菜素内酯最终浓度为0.375-2.0μg/mL；
（4）将添加了第一母液的培养液或添加了第二母液的培养液或者添加了第一母液和第二母液混合液的培养液分别在25℃、光强4000lx、光照周期为每天12小时连续光照再12小时连续黑暗的条件下进行培养，将小球藻培养1周，直至藻体颜色由绿变黄色，即获得油脂含量较高的小球藻。
2.根据权利要求1所述的一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法，其特征在于：所述的第一母液的浓度为1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法，其特征在于：所述的第二母液的浓度为1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法，其特征在于：所述的OD值为1.0-3.0。
5.根据权利要求1所述的一种可促进小球藻中油脂积累的培养方法，其特征在于：步骤（3）中将所述的第一母液和所述的第二母液按体积比1:5的比例混合后，添加到培养液中使水杨酸最终浓度为0.25μg/mL，使24-表油菜素内酯最终浓度为1.25μg/mL。
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