CN105132352A

CN105132352A - 一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法

Info

Publication number: CN105132352A
Application number: CN201510574719.0A
Authority: CN
Inventors: 王小飞; 龚一富; 王何瑜
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2015-09-10
Filing date: 2015-09-10
Publication date: 2015-12-09

Abstract

本发明公开了一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，特点是步骤如下：将数生长期的三角褐指藻按10%的体积比接种到海水培养液中后，加入2,4-表油菜素内酯使其终浓度为0.05-0.15？mg/L，于培养温度为20℃，光照强度为5000？lx，光照周期为12？h/12？h，每天充分摇瓶3次，共培养10？d即，其中岩藻黄素积累的最适浓度为0.05？mg/L，脂质积累的最适浓度为0.1？mg/L，优点是通过在培养基中添加一定量的2,4-表油菜素内酯，可有效提高三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累速度，显著提高三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质的含量，具有操作简单，成本低，生产周期短。

Description

一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法

技术领域

本发明涉及三角褐指藻，尤其是涉及一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法。

背景技术

岩藻黄素（fucoxanthin）是一类广泛存在于褐藻和硅藻中的类胡萝卜素。这种色素不仅存在于海带、裙带菜等巨藻中，在微藻中也有发现，尤其以硅藻中含量最为丰富。其分子结构中含有不同寻常的共轭双键和5,6-单环氧基，这种结构使其具有抗癌、抗肥胖、抗炎症、抗糖尿病以及抑制血管增生的作用。

人类的生存和发展离不开能源，由于石油、煤炭等传统化石燃料的有限性和不可再生性，导致化石燃料日益枯竭，并造成了严重的环境问题，寻找绿色可再生能源迫在眉睫。在众多生物燃料中，微藻具有生长周期短、光合效率高、生物量高、油脂含量高等优点，被认为是生物柴油的最佳选择之一。限制微藻生物柴油实现商业化生产的根本原因是生产成本高，微藻生物量及油脂含量是影响微藻生物柴油生产成本的关键因素。因此，选择合适的微藻并提高培养微藻的生物量、油脂含量及产量是推动微藻生物柴油生产的有效对策。

三角褐指藻为真核单细胞海洋微藻，属于硅藻门、羽纹纲、褐指藻目、褐指藻科、褐指藻属。生长速度快，适应范围广，富含丰富的蛋白质、脂肪、多糖等生物活性物质，脂质含量尤其丰富。Kim等发现在三角褐指藻中的岩藻黄素的含量要比巨藻中的还要高，因此三角褐指藻被认为是产岩藻黄素的商业藻种。

2,4-表油菜素内酯（2,4-Epibrassinolide，EBR）作为绿色环保型植物生长调节剂，具有高效、广谱、无毒等特点，它最突出的生理作用就是促进植物细胞的伸长与分裂。一些学者认为EBR在植物体内单一或协同其他激素对细胞分裂等过程起作用，它通过调节细胞分裂素、赤霉素、脱落酸等的水平来增加细胞质中Ca²⁺浓度，进而控制细胞分裂。EBR作为一种诱导子能够诱导转录植物中的特定基因，从而提高植物的次生代谢产物。或者在细胞内作为第二信使而直接产于胞内信号的转导，或通过对其它信号通路的调节间接影响细胞生物的活动。目前，国内外还没有公开任何关于利用2,4-表油菜素内酯来促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，该方法通过在培养基中添加一定量的2,4-表油菜素内酯，可有效提高三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累速度，显著提高三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质的含量，具有操作简单，成本低，生产周期短。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，将数生长期的三角褐指藻按10%的体积比接种到海水培养液中后，加入2,4-表油菜素内酯使其终浓度为0.05-0.15mg/L，于培养温度为20℃，光照强度为5000lx，光照周期为12h/12h，每天充分摇瓶3次，共培养10d即可获得岩藻黄素和/或脂质含量较高的三角褐指藻。

所述的海水培养液将灭菌的宁波大学3号母液按1：1000的比例加入到灭菌的海水中摇晃均匀后得到，所述的宁波大学3号母液的配方为：KNO₃10g，KH₂PO₄1g，FeSO₄·7H₂O0.25g，MnSO₄0.025g，EDTANa₂1g，VB₁0.0006，dH₂O100ml。

所述的2,4-表油菜素内酯在海水培养液中的终浓度为0.05mg/L。该浓度为岩藻黄素积累的最适浓度，可使岩藻黄素含量达到最大。

所述的2,4-表油菜素内酯在海水培养液中的终浓度为0.1mg/L。该浓度为脂质积累的最适浓度，可使脂质含量达到最大。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，通过浓度为0.05-0.15mg/L的2,4-表油菜素内酯对三角褐指藻的诱导处理，使三角褐指藻生物量、岩藻黄素含量、脂质含量及产量增加显著，其原因可能是2,4-表油菜素内酯作为新型植物生长调节物质，可通过促进光合作用从而提高藻类细胞生长，也可影响藻类脂类代谢、糖类代谢和次生代谢调控，从而促进岩藻黄素含量和脂质含量的上升。该发明操作简单，成本低，生产周期短，无有害物质产生，适于批量处理和工厂化生产，为岩藻黄素/微藻产油业的开发利用提供了技术支持。

附图说明

图1为本发明三角褐指藻光密度-细胞密度曲线；

图2为利用不同浓度EBR处理三角褐指藻后生长曲线图；

图3为利用不同浓度EBR处理三角褐指藻后生物量及比生长速率变化；

图4为利用0.1mg/LEBR处理后岩藻黄素粗提液的扫描光谱图；

图5为岩藻黄素标准品的扫描光谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、实验方法

1、三角褐指藻的培养

三角褐指藻由宁波大学海洋生物工程重点实验室微藻室提供。天然海水经沉淀和脱脂棉过滤后，高温灭菌。待冷却至室温后，将灭菌的宁波大学3号母液按1：1000的比例加入到灭菌的海水中摇晃均匀后得到海水培养液，备用。宁波大学3号母液的配方为：KNO₃10g，KH₂PO₄1g，FeSO₄·7H₂O0.25g，MnSO₄0.025g，EDTANa₂1g，VB₁0.0006，dH₂O100ml。将对数生长期的三角褐指藻按10%的体积比接种到海水培养液中，并置于光照培养箱中培养，培养温度为20℃，光照强度为5000lx，光照周期为12h/12h（光/暗），每天充分摇瓶3次，并随机交换位置以减少光照差异，共培养10d。

2、三角褐指藻光密度回归方程和生长曲线测定

取5mL对数生长期的三角褐指藻藻液，倍比稀释，采用分光光度法测定各组稀释液的光吸收值OD₆₈₀，同时用血球计数法计算各组样品中三角褐指藻的细胞密度。根据测定结果以光吸收值OD₆₈₀为X轴，三角褐指藻细胞密度为Y轴，绘制光密度-细胞密度标准曲线，并求得回归方程。培养过程中每天定时从不同质量浓度EBR处理的培养液中取3mL藻液，测定OD₆₈₀值，并根据上述光密度-细胞密度回归方程，计算各样品中三角褐指藻的细胞密度，绘出三角褐指藻生长曲线。

通过测定倍比稀释的三角褐指藻的藻细胞数量和OD₆₈₀，得出光密度-细胞密度回归方程（如图1所示）：y=18.063x+0.0047，R²=0.9964。式中，y为每毫升藻液的细胞数量，x为OD₆₈₀的值，相关系数为0.9964。由相关系数可知，用OD₆₈₀可以反映三角褐指藻的生长情况。

3、生物量及比生长速率的测定

取稳定期的藻液40、80、120、160、200mL，分别加入160、120、80、40、0mL海水培养液，测定其OD₆₈₀的值。然后将这五组样品5000r/min离心10min，收集藻泥，冷冻干燥48h，称重，每个样品设三个平行组。以OD₆₈₀为X轴，生物量（g·L-1）为Y轴，绘制OD₆₈₀-生物量标准曲线。根据不同浓度EBR处理下样品的吸光值，通过该标准曲线，计算稳定期时三角褐指藻细胞的生物量。比生长速率计算公式为μ=（lnNt-lnN₀）/T，N₀是接种后初始的细胞数，Nt是经过T天后的细胞数。

4、岩藻黄素含量及产量的测定

取一定体积的藻液，5000r/min离心10min，用去离子水洗涤2次后收集藻泥，冷冻干燥后研磨得到藻粉。采用有机溶剂法提取岩藻黄素，向藻粉中加入无水乙醇，使其料液比为1:40（g/mL），在60℃的条件下避光静置1h，于5000r/mim离心10min，得到上清液，取沉淀重复浸提离心取上清1次，合并两次所得上清液，稀释后测定样品在445nm处的吸光值，按如下公式计算岩藻黄素含量：

岩藻黄素含量（mg/g）=1000A₄₄₅ N*V/(A ^1% _1cm M100×1000)×100%

式中A₄₄₅为岩藻黄素最大吸收峰值；N为稀释倍数；V为粗提液总体积，mL；

A ^1% _1cm为在1cm光程长的比色皿中1g/L岩藻黄素的理论吸收值，即1600；M为样品质量g。岩藻黄素产量（mg/L·d）=岩藻黄素质量/藻液体积*培养天数

5、脂质含量及产量的测定

脂质含量测定步骤如下，取一定体积的藻液，5000r/min离心10min，用去离子水洗涤2次后收集藻泥，冷冻干燥48h后称重。采用Bligh-Dyer法抽提总脂，每组设三个平行。具体步骤如下，取0.1g藻粉置于10mL离心管中，加入3.8mLCHCl₃/CH₃OH/H₂O(1：2：:0.8)，震荡2min，4℃超声提取5min，然后8000rmp离心10min，取上层溶液置于50mL离心管，下层溶液按上述Bligh-Dyer法抽提总脂步骤重复提取三次。

脂质含量（%）=（藻油质量/藻粉干重）×100%

脂质产量（mg/L·d）=藻油质量/藻液体积*培养天数。

二、具体实施例

实施例1

一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，将数生长期的三角褐指藻按10%的体积比接种到海水培养液中后，加入2,4-表油菜素内酯使其终浓度为0.05-0.15mg/L，于培养温度为20℃，光照强度为5000lx，光照周期为12h/12h，每天充分摇瓶3次，共培养10d即可，其中海水培养液将灭菌的宁波大学3号母液按1：1000的比例加入到灭菌的海水中摇晃均匀后得到，所述的宁波大学3号母液的配方为：KNO₃10g，KH₂PO₄1g，FeSO₄·7H₂O0.25g，MnSO₄0.025g，EDTANa₂1g，VB₁0.0006，dH₂O100ml。

实施例2

不同浓度EBR处理与三角褐指藻细胞数量的关系

利用OD₆₈₀的光吸收值来测定单位体积培养液中三角褐指藻细胞数量，每天定时测定三角褐指藻的OD₆₈₀值，并根据回归方程得到经不同浓度的EBR处理的三角褐指藻生长的状况，获得利用不同浓度EBR处理三角褐指藻后生长曲线图，如图2所示，结果表明：三角褐指藻在0~0.2mg/L的EBR浓度范围内均可生长，在1~6d内整体均生长比较快，处于对数生长期，7~8d内藻细胞密度变化不大，处于稳定期，第8d之后，藻细胞密度逐渐降低，处于衰亡期。从各曲线可以看出，在整个培养周期内，0.05mg/L的EBR处理后，细胞密度均高于对照组，即此浓度促进细胞生长。0.1mg/L浓度处理后三角褐指藻的生长状况和对照组相比差异不大，略低于对照组。0.15mg/L和0.2mg/L处理条件下，细胞密度明显低于对照组，且0.2mg/L浓度影响作用最大，即此浓度的EBR抑制三角褐指藻细胞生长，浓度越高，抑制作用越明显。

实施例3

不同浓度EBR处理与三角褐指藻生物量和比生长速率的关系

利用不同浓度EBR处理三角褐指藻，其生物量和比生长速率均有变化。结果如图3所示：当EBR浓度小于0.05mg/L时，三角褐指藻的生物量和比生长速与浓度成正相关，处理浓度大于0.05mg/L时，与EBR浓度呈负相关。0.05mg/L培养条件下的生物量最高，达1.54g/L，是对照组的1.29倍，0.1mg/L培养下的1.18倍，0.15mg/L培养下的1.27倍，0.2mg/L培养下的1.64倍。比生长速率也在0.05mg/L条件下达到最大，是对照组的1.04倍，其他各组比生长速率均小于对照组。

实施例4

不同浓度EBR处理与岩藻黄素含量和产量的关系

（1）利用不同浓度EBR处理三角褐指藻后，得到岩藻黄素粗提液。将岩藻黄素标准品稀释后得到样品溶液。对岩藻黄素粗提液及标准品稀释液分别用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描，获得岩藻黄素粗提液扫描光谱图（此处仅列出了0.1mg/LEBR处理条件下的粗提液扫描光谱如图4所示）及岩藻黄素标准品扫描光谱图（如图5所示）。结果表明，标准品及粗提液（，其他浓度下类似）均在445nm处有最大吸收峰，说明各EBR处理组的粗提液均含有岩藻黄素，此方法可以用来提取三角褐指藻中的岩藻黄素；

（2）利用不同浓度EBR处理三角褐指藻，其对岩藻黄素含量和产量均有显著影响。

设1组为对照组，4组为实验组。对照组不做任何处理，4组实验组分别加入不同浓度的EBR，其浓度分别为0.05mg/L，0.1mg/L，0.15mg/L，0.2mg/L。以上述实验方法中方法1的培养条件同等培养实验组和对照组的三角褐指藻。利用上述实验方法中的方法2提取三角褐指藻中的岩藻黄素，并测定实验组和对照组中三角褐指藻细胞岩藻黄素含量及产量，结果如表1所示。

表1不同浓度的EBR处理三角褐指藻后岩藻黄素含量及产量

从表中能够明显的看出，随着EBR浓度的升高，三角褐指藻细胞岩藻黄素含量及产量呈现先增加后降低的趋势。当EBR浓度在0.01~0.15mg/L时，藻体细胞岩藻黄素含量及产量均高于对照组，即在此浓度范围内促进三角褐指藻岩藻黄素的增加。最大值出现在0.05mg/L时，岩藻黄素含量达0.065%，为对照组（0.053%）的1.23倍；岩藻黄素产量最大值为0.029mg/L·d，为对照组的1.38倍。在EBR浓度为0.2mg/L时，岩藻黄素含量略微下降，即抑制三角褐指藻中岩藻黄素的增加，比对照组下降了3.77%，岩藻黄素产量比对照组降低了2.37%。

实施例5

不同浓度EBR处理与脂质含量和产量的关系

设1组为对照组，4组为实验组。对照组不做任何处理，4组实验组分别加入不同浓度的EBR，其浓度分别为0.05mg/L，0.1mg/L，0.15mg/L，0.2mg/L。以上述的培养条件同等培养实验组和对照组的三角褐指藻。利用上述的方法提取三角褐指藻中的脂质，并测定实验组和对照组中三角褐指藻细胞脂质含量及产量，结果如表2所示。

表2不同浓度的EBR处理三角褐指藻后脂质含量及产量

EBR浓度（mg·L^-1）	0	0.05	0.1	0.15	0.2
						脂质含量(%)	15.48	26.55	33.33	18.74	11.75
脂质产量（mg·L^-1·d^-1）	24.44	42.22	52.70	29.84	18.73

从表中能够明显的看出，随着EBR浓度的升高，三角褐指藻细胞脂质含量及产量呈现先增加后降低的趋势。当EBR浓度在0.01~0.15mg/L时，藻体细胞脂质含量及产量均高于对照组，即在此浓度范围内促进三角褐指藻脂质的增加。最大值出现在在0.1mg/L时，脂质含量达33.32%，为对照组（15.48%）的2.15倍，在0.05mg/L和0.15mg/L时脂质含量虽然低于最大值，但仍然起到促进作用；0.2mg/L时表现为抑制作用，仅为11.75%，比对照组下降了24.10%。

脂质的产量随EBR浓度增加变化非常明显，在0.1mg/L时达到最大值，为52.69mg/L·d，对照组仅为24.44mg/L·d。浓度大于0.2mg/L时，表现为抑制作用，总脂产量比对照组下降了23.36%。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，其特征在于：将数生长期的三角褐指藻按10%的体积比接种到海水培养液中后，加入2,4-表油菜素内酯使其终浓度为0.05-0.15mg/L，于培养温度为20℃，光照强度为5000lx，光照周期为12h/12h，每天充分摇瓶3次，共培养10d即可获得岩藻黄素和/或脂质含量较高的三角褐指藻。

2.根据权利要求1所述的一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，其特征在于：所述的海水培养液将灭菌的宁波大学3号母液按1：1000的比例加入到灭菌的海水中摇晃均匀后得到，所述的宁波大学3号母液的配方为：KNO₃10g，KH₂PO₄1g，FeSO₄·7H₂O0.25g，MnSO₄0.025g，EDTANa₂1g，VB₁0.0006，dH₂O100ml。

3.根据权利要求2所述的一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，其特征在于：所述的2,4-表油菜素内酯在海水培养液中的终浓度为0.05mg/L。

4.根据权利要求2所述的一种促进三角褐指藻中岩藻黄素和/或脂质积累的方法，其特征在于：所述的2,4-表油菜素内酯在海水培养液中的终浓度为0.1mg/L。