CN110478472A - Pd-1封闭剂及其应用 - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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- A61P37/04—Immunostimulants
Abstract
本发明提供了PD‑1封闭剂及其应用，属于医学及生物化学技术领域，所述PD‑1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的PD‑1封闭剂可有效结合PBMC细胞上的PD‑1，阻断PD‑1与PDL1的结合，实现对PBMC细胞的封闭，抑制免疫检测点的活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而达到抗肿瘤的作用。
Description
技术领域
本发明属于医学及生物化学技术领域，尤其涉及PD-1封闭剂及其应用。
背景技术
PD-1(programmed cell deathprotein-1，程序性死亡受体)是重要的抑制性信号分子，通过与其两个配体PD-L1(B7-H1/CD274)和PD-L2(B7-DC/CD273)的作用而抑制T细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体的外周耐受上发挥至关重要的作用。
免疫检查点本是人体免疫系统中起保护作用的分子，起类似刹车的作用，防止T细胞过度激活导致的炎症损伤等。而肿瘤细胞利用人体免疫系统这一特性，通过过度表达免疫检查点分子(如PD-L1)，通过与淋巴细胞上的PD-1结合，抑制包括T细胞在内的淋巴细胞发挥抗肿瘤能力，从而抑制人体免疫系统反应，逃脱人体免疫监视与杀伤，最终导致肿瘤细胞的生长和转移不受免疫系统的监控。
在细胞水平研究包括T细胞在内的淋巴细胞的免疫功能时，其抗肿瘤能力也受免疫检查点的抑制，至使无法评价其对肿瘤细胞的真实杀伤效果，因此，快速高效的解决抑制性信号分子的问题，是影响所有淋巴细胞免疫功能的评价的环节。但是现有技术中还未有公开蛋白来阻断PD-1和PDL1的结合。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供PD-1封闭剂及其应用，本发明提供的PD-1封闭剂可有效结合PBMC细胞上的PD-1，阻断PD-1与PDL1的结合，实现对PBMC细胞的封闭，抑制免疫检测点的活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而达到抗肿瘤的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了PD-1封闭剂，所述PD-1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备对PBMC细胞封闭的药物中的应用。
优选的，所述封闭的pH值为5.8～8.0。
优选的，所述封闭的温度为25～37℃。
优选的，所述封闭的时间为1～2h。
优选的，所述PD-1封闭剂在32～500μg/mL的浓度下进行封闭。
本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌或脑胶质瘤。
本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备提高免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用的药物中的应用。
优选的，所述免疫细胞包括T细胞。
本发明提供了PD-1封闭剂及其应用，所述PD-1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的PD-1封闭剂可有效结合PBMC细胞上的PD-1，阻断PD-1与PDL1的结合，实现对PBMC细胞的封闭，抑制免疫检测点的活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而达到抗肿瘤的作用。
附图说明
图1为PD-1和PDL1的三位互作图；
图2为PD-1封闭剂的标记效果检测图；
图3-1为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 0)；
图3-2为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 3)；
图3-3为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 7)；
图3-4为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 10)；
图3-5为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 14)；
图4-1为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD8+细胞上PD-1+的比例(Day 3)
图4-2为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD8+细胞上PD-1+的比例(Day 10)
图4-3为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD8+细胞上PD-1+的比例(Day 14)；
图4-4为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD4+细胞上PD-1+的比例(Day 3)；
图4-5为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD4+细胞上PD-1+的比例(Day 10)；
图4-6为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD4+细胞上PD-1+的比例(Day 14)；
图5-1为PD-1封闭剂在pH 5.8缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；
图5-2为PD-1封闭剂在pH 5.8缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；
图6-1为PD-1封闭剂在pH 6.6缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；
图6-2为PD-1封闭剂在pH 6.6缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；
图7-1为PD-1封闭剂在pH 6.8缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；
图7-2为PD-1封闭剂在pH 6.8缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；
图8-1为PD-1封闭剂在pH 7.2缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；
图8-2为PD-1封闭剂在pH 7.2缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；
图9-1为PD-1封闭剂在pH 7.4缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；
图9-2为PD-1封闭剂在pH 7.4缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；
图10-1为PD-1封闭剂在pH 8.0缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；
图10-2为PD-1封闭剂在pH 8.0缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；
图11为pH值降低对已结合的PD-1抗体模拟物的影响；
图12-1为pH 6.6结合稳定性分析-室温1h(0、32、64μg/mL)；
图12-2为H 6.6结合稳定性分析-室温1h(125、250、500μg/mL)；
图13-1为pH 6.8结合稳定性分析-室温1h(0、32、64μg/mL)；
图13-2为H 6.8结合稳定性分析-室温1h(125、250、500μg/mL)；
图14为pH 7.2结合稳定性分析(500μg/mL)；
图15为pH 8.0结合稳定性分析(500μg/mL)；
图16为细胞因子刺激对肿瘤细胞PD-L1的表达水平的影响；
图17为台风扫描仪检测的荧光信号；
图18为台风扫描仪检测的荧光信号；
图19为台风扫描仪检测的荧光信号；
图20-1为25℃封闭1h的情况(20.8、41.7μg/mL)；
图20-2为25℃封闭1h的情况(83.3、166.7μg/mL)；
图20-3为25℃封闭1h的情况(333.3μg/mL)；
图21-1为25℃封闭2h的情况(20.8、41.7μg/mL)；
图21-2为25℃封闭2h的情况(83.3、166.7μg/mL)；
图21-3为25℃封闭2h的情况(333.3μg/mL)；
图22-1为37℃封闭1h的情况(20.8、41.7μg/mL)；
图22-2为37℃封闭1h的情况(83.3、166.7μg/mL)；
图22-3为37℃封闭1h的情况(333.3μg/mL)；
图23为杀伤效率检测-流式检测细胞凋亡(肺癌细胞H358)；
图24为杀伤效率检测-LDH(脑胶质瘤细胞-U87)；
图25为杀伤效率检测-LDH(结肠癌细胞-SW480)；
图26为杀伤效率检测-LDH(结直肠癌细胞-DLD-1)；
图27为杀伤效率检测-LDH(乳腺癌癌细胞-SK-BR3)。
具体实施方式
本发明提供了PD-1封闭剂，所述PD-1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，具体如下所示：
ALIVYWEMEDKNIIQFVKFPVEKQLDLAKLQDAGVYRCMISYGGADAAAITVKVNA。
在本发明中，所述KFPVEKQLDLA将ALIVYWEMEDKNIIQFV和KLQDAGVYRCMISYGGADAAAITVKVNA连接。在本发明中，所述PD-1封闭剂由金斯瑞生物技术有限公司多肽合成部进行合成，纯度为98％。
本发明PD-1封闭剂的设计思路为：根据PD-1和PD-L1互作的三位结构，图1，可以确定PD-1和PD-L1的结合区域，SEQ ID No.2～3，SEQ ID No.2：ALIVYWEMEDKNIIQFV，SEQ IDNo.3：KLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNA，将这两个序列，以loop序列相连，SEQ ID No.4：KFPVEKQLDLA，并将SEQ ID No.3中的YKR改成AAA，以避免功能性结合，获得阻断蛋白发生免疫检查点抑制作用，即为PD-1封闭剂。
本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备对PBMC细胞封闭的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中PD-1封闭剂的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可。
在本发明中，所述封闭的pH值优选为5.8～8.0，具体包括5.8、6.6、6.8、7.2、7.4和8.0。
在本发明中，所述封闭的时间优选为1～2h，所述封闭的温度优选为25～37℃，当所述封闭的温度为25℃时，封闭的时间为2h；当所述封闭的温度为37℃时，封闭的时间为1h。
在本发明中，所述PD-1封闭剂优选在32～500μg/mL的浓度下进行封闭，所述浓度具体包括32μg/mL、64μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL。
本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤优选包括肺癌。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中PD-1封闭剂的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备提高免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用的药物中的应用。在本发明中，所述免疫细胞优选包括T细胞。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中PD-1封闭剂的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.PD-1封闭剂
根据PD-1和PD-L1互作的三位结构，图1，可以确定PD-1和PD-L1的结合区域，SEQID No.2～3，SEQ ID No.2：ALIVYWEMEDKNIIQFV，SEQ ID No.3：KLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNA，将这两个序列，以loop序列相连，SEQ ID No.4：KFPVEKQLDLA，并将SEQ ID No.3中的YKR改成AAA，以避免功能性结合，获得阻断蛋白发生免疫检查点抑制作用，即为PD-1封闭剂，SEQ ID No.1：
ALIVYWEMEDKNIIQFVKFPVEKQLDLAKLQDAGVYRCMISYGGADAAAITVKVNA；PD-1封闭剂由金斯瑞生物技术有限公司多肽合成部进行合成，纯度98％。
2.PD-1封闭剂的荧光标记
1)荧光标记试剂盒：Alexa647Protein Labeling Kit(A20173)
2)准备1M NaHCO3：1mL的H2O加入Component B，充分溶解混匀，4℃保存两周内使用；
3)用0.1MNaHCO3将PD-1封闭剂稀释成2mg/mL；
4)室温预热一瓶活性染料，将0.5mL 2mg/mL蛋白溶液加入至活性染料瓶中，瓶中有磁力搅拌子。盖上盖子后，颠倒混匀至完全溶解，不要起泡沫，室温搅拌1h。
5)按说明书安装柱子，垂直放置，柱子顶端安装漏斗，将柱子慢慢穿过X固定夹，再安装到泡沫固定架上，小心移除底部盖子；
6)10*洗脱液储存液(component)室温预热，至完全溶解，稀释10倍备用；
7)用提供的移液器彻底搅拌纯化树脂(component C)，确保均匀悬浮；将树脂移至柱子，使多余的buffer流尽。树脂高度，距顶部3cm。
8)以1×PBS检测溶液流动情况，流干多余液体，确保buffer连贯流出，如果不连贯，或者过慢，重新装柱子。上样前，将漏斗移除，小心将标记的蛋白转移至柱子。使得混合物进入树脂。用约100μL洗脱液漂洗反应瓶，加入柱子上。
9)装回漏斗，缓慢加入洗脱液，不要破坏柱子表面，持续加入洗脱液至蛋白洗出。
10)大约30min，收集所有洗脱液。
11)纯化过程中，会看到两条彩色的线，以区分标记的蛋白和多余的染料，用收集管收集第一条颜色的带，含有标记蛋白。
12)标记的蛋白样品，取20μL加入20μLPBS稀释2倍，分别加入10μL含β-巯基乙醇的Loading buffer和不含β-巯基乙醇的Loading buffer，煮沸5min，12000rpm离心5min，取5μL上样；两块平行胶，一块用于考染，一块用于荧光信号的检测；荧光信号以台风荧光扫描仪进行分析。
3.PBMC上PD-1位点的检测
1)取5×106个PBMC细胞，2000rpm离心5min，细胞用0.5mL PBS洗一次，再以500μLPBS重悬，分100μL/管，分别标记为CK-(阴性对照)、CD8(CD8单染管)、CD4(CD4单染)、PD-1抗体(单染)、test(CD8抗体、CD4抗体和PD-1抗体)；
2)在CD8管和test管中加入10μL PE-CD8抗体，在CD4管和test管和10μLPerCP-CD4抗体，避光孵育30min；
3)再加入800μL PBS，2000rpm离心10min，再以800μL PBS洗一次，最后重悬于500μLPBS中备用。
4)以流式细胞仪检测PBMC中CD8+、CD4+和PD-1+细胞的比例。
4.PBMC上PD-1的体外封闭
1)1000rpm离心5min，收集PBMC
2)以PBS洗一次，1000rpm离心5min，以OKM-200+5％FBS重悬PBMC，并调整至1×107/mL；
3)加入PD-1封闭剂，终浓度为150μg/mL，37℃5％CO2封闭1h(可达到80％以上的封闭效率)；也可以在0.9％的NaCl(生理盐水)中，进行封闭。
5.PD-1封闭剂体外封闭稳定性分析
1)取2×106个细胞，2000rpm离心5min，细胞用1mL PBS洗一次，再以150μLPBS重选，加入50μL 1mg/mL的荧光标记的PD-1封闭剂(封闭体系：25μg/106个细胞，100μL体系)，室温避光孵育2h，再加入800μL PBS，2000rpm离心10min，再以1mL PBS洗一次，最后以265μLPBS重悬计数备用；
2)H358细胞提前48h复苏，复苏24h后，取10mL H358加入终浓度为10ng/mL的INF-γ和25ng/mL的TNF-α，刺激24h后，离心收集细胞，PBS洗一次后，少量PBS重悬计数备用；
3)封闭的淋巴细胞和肿瘤细胞以1:1的比例，进行混合，室温避光2h，再加入800μLPBS，2000rpm离心10min，再以1mL PBS洗一次，最后以20μL 1×Loading buffer重悬，将全部样品进行SDS-PAGE分析，以台风荧光扫描仪检测荧光信号。
6.PD-1封闭剂体外封闭对PBMC的杀伤功能的影响-细胞凋亡法
1)靶细胞处理：提前一天进行靶细胞处理，H358以胰酶消化，加入1640+10％FBS终止反应，1000rpm离心5min；以1640重悬细胞，细胞数<107个/mL，加入5μL 2mM CFSE，避光静止20min；加入1640+10％FBS终止反应，1000rpm离心5min，再加入少量1640+10％FBS静止10min，1000rpm离心5min，以PBS洗一次，1000rpm离心5min；最后以1640+10％FBS(H358)重悬细胞，计数，调整至2×105个/mL，每孔500μL(24空板)，37℃培养，使其贴壁；
2)效应细胞处理：T细胞300g离心5min收集细胞，再以PBS洗一次，以OKM200+5％FBS重悬，<1×107/mL；
3)加入PD-1封闭剂，终浓度为200μg/mL，37℃封闭1h；
4)加入PBS，300g离心5min去除多余抗体，以1640+2％FBS重悬细胞，最后将细胞调整至4×107个/mL，每孔加入100μL(24空板)，最终体积为300μL，37℃5％CO2培养箱继续培养至3.5h；
5)以1.5mL EP管收集细胞，并以胰酶消化贴壁的细胞，2000rpm离心10min，以PBS洗一次；
6)弃上清，以100μLPBS重悬细胞，分别加入5μLAnnexinV或7AAD进行单染，或同时加入5μLAnnexinV和5μL 7AAD，避光30min；
7)以1mLPBS洗2次，最后以500μL PBS重悬细胞，进行流式检测。
7.PD-1封闭剂体外封闭对PBMC的杀伤功能的影响-LDH法
1)取靶细胞，用细胞刮刀轻轻将细胞刮下，10mL PBS洗涤，收集到离心管中，1000rpm，5min离心后弃上清，10mL RPMI-1640+2％FBS重悬，取样计数后按照细胞数量将细胞密度调整到8×104cells/mL。
2)接种靶细胞：将调整密度后的靶细胞分别用排枪接种到96孔细胞培养板中，每孔50μL，同时设不加靶细胞的对照组，每孔加50μL RPMI-1640+2％FBS。
3)取PBMC离心，30mL PBS重悬，取样计数后离心洗涤，弃上清，根据计数结果用RPMI-1640+2％FBS重悬，将细胞密度调整到3.2×106cells/mL，然后依次倍比稀释成1.6×106cells/mL、0.8×106cells/mL、0.4×106cells/mL、0.2×106cells/mL 4个密度。
4)接种PBMC：将稀释好的不同密度的PBMC按照顺序加入含有靶细胞的对应的96孔板中，50μL/孔，使效靶比分别为20:1、10:1、5:1、2.5:1，同时设T高和T低组，各加50μLRPMI-1640+2％FBS。
5)细胞接种完毕后置37℃，CO2培养箱共培养4h。
6)细胞共培养4h后将T高组每孔加10μL细胞裂解液，置37℃，CO2培养箱充分裂解1h。
7)细胞裂解后，取出细胞，每孔加入100μLWorking Solution，室温避光30min。
8)每孔加入50μL Stop Solution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度，根据公式计算细胞杀伤效率。
结果为：
1.PD-1封闭剂的荧光标记效率检测
取标记前和第一次标记后的样品进行SDS-PAGE分析，荧光扫描结果如图2所示，可以检测到荧光信号，说明阻断蛋白标记成功。
2.PBMC培养过程中PD-1表达的变化
多肽冲击PBMC，提呈抗原，再与PBMC共培养，以获得具有特异性杀伤功能的淋巴细胞，在共培养过程中，CD8+细胞、CD4+细胞的PD-1的分布情况如图3-1～图3-5所示：其中Day0的细胞是没有经过任何处理的PBMC，CD8+和CD4+细胞比例在第7天时，发生明显改变，CD8+细胞增多，CD4+细胞比例减少；PD-1+细胞的比例在共培养第3天时，逐渐升高，第10天时，PD-1+的细胞为80％左右；说明，细胞在培养过程中抑制性信号分子PD-1的表达是逐渐升高的，而抑制性信号将影响淋巴细胞抗肿瘤的能。
3.PBMC与肿瘤细胞共培养过程中PD-1+细胞比例的变化
PBMC在第三天时与H358共培养，记为共培养第0天，在共培养第3天，检测CD8+、CD4+及PD1+的细胞比例，结果如图4-1～图4-6所示，在没有H358时，PBMC对照组的PD-1+细胞比例与出发时的多肽培养的PBMC的PD-1+细胞比例相似，仅为59.68％，而加入H358共培养时，PD-1+细胞比例上升至79.67％；在共培养第10天，PD-1+细胞比例为85.67％，高于没有H358的对照组的68.14％；第14天时，PD-1+细胞比例仍然高于没有H358的对照组；说明，PBMC与肿瘤细胞H358长期共存时，肿瘤细胞刺激了PBMC上PD-1的表达，抑制了PBMC的抗肿瘤能力，从而达到免疫逃逸目的。
4.PD-1封闭剂在pH 5.8～pH8.0缓冲体系中对PBMC的封闭情况
由于恶性肿瘤微环境是弱酸性环境，pH值为6.5～6.9，低于正常组织周围的pH值，因此，以不同pH值的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲系统，测试PD-1封闭剂对PBMC的封闭能力，结果如图5-1～图5-2、图6-1～图6-2、图7-1～图7-2、图8-1～图8-2、图9-1～图9-2、图10-1～图10-2所示，pH 5.8～pH8.0缓冲体系中，PD-1封闭剂均可以对PBMC进行封闭，但在pH＝5.8的缓冲体系中封闭效率最高，当PD1封闭剂的终浓度为到32μg/mL时，80.3％的细胞均可以检测到结合信号，而且随着浓度的升高，结合很快达到饱和，维持在97％以。
5.pH值降低后，已结合的PD-1封闭剂不会解离
由于恶性肿瘤微环境是弱酸性环境，pH值为6.5～6.9，低于正常组织周围的pH值，因此，为模拟体外结合的抗体药物到达肿瘤附近后，是否会由于pH的降低而发生解离，将体外在pH7.2、pH7.4以及pH8.0环境下，结合的PBMC转移pH6.6的缓冲液中，1h后，检测，已结合的封闭剂是否发生解离，结果如图11所示，在pH 6.6的缓冲液中1h，能检测到荧光信号的细胞比例没有发生明显改变，仍稳定在90％以上，结合相对稳定.
6.PD-1封闭剂的稳定性分析—不同pH条件下
已经封闭的样品，经流式细胞仪检测荧光信号后，将剩余样品置于暗处，室温1h后，再次离心，去除可能已解离的封闭剂，然后再经流式细胞仪检测荧光信号；pH 6.6分析结果分别如图12-1～图12-2所示，能检测到的荧光信号的细胞比例没有发生明显改变，不同浓度下，pH 6.6原由的比例为49.2％、51.0％、61.4％、69.2％和74.9％(已扣除阴性对照的6.2％)；1h后能检测到荧光信号的细胞比例分别为46.5％、49.5％、61.1％、71.4％和72.4％(已扣除阴性对照的1.0％)；说明封闭效果稳定持久。
pH 6.8结合稳定性(室温1h)的分析结果分别如图13-1～图13-2所示，能检测到的荧光信号的细胞比例也没有发生明显改变，原有细胞比例分别为38.5％、42.1％、52.2％、62.9％和78.1％(已扣除阴性对照的1.0％)；室温1h后，能检测到荧光信号的比例为35.5％、38.9％、53.1％、61.8％和74.8％(已扣除阴性对照的1.0％)；说明封闭效果稳定持久。
pH 7.2结合稳定性的分析结果分别如图14所示，封闭剂浓度为500μg/mL时，原有的比例为98.0％，4℃过夜后能检测到的荧光信号的细胞比例为97.0％，再室温1h后比列为92.5％；说明封闭效果稳定持久。
pH 8.0结合稳定性的分析结果分别如图15所示，封闭剂浓度为500μg/mL时，原有的比例为99.6％，4℃过夜后能检测到的荧光信号的细胞比例为98.2％，再室温1h后比列为97.7％；说明封闭效果稳定持久。
7.细胞因子刺激对H358细胞PD-L1表达水平的影响
结果如图16所示，H358细胞在没有细胞因子刺激时，PD-L1的表达水平较高，单独加入IFN-γ刺激和同时加入IFN-γ、TNF-α刺激后，PD-L1表达均明显提高，说明IFN-γ和TNF-α细胞因子可以刺激H358细胞提高PD-L1的表达水平；H358可作为PD-1/PD-L1作用模型中的靶细胞，而且，加入细胞因子刺激时，免疫检查点的抑制作用可能更明显。
8.荧光扫描仪检测PD-1封闭剂的封闭情况
将体外封闭的样品，进行SDS-PAGE分析，并以台风扫描仪检测荧光信号，通过荧光信号强弱以分析封闭的情况，结果如图17所示，随着荧光标记的PD-1抗体药物的浓度增加，检测到的荧光信号增强，说明，PBMC上被封闭的位点越多，而且，浓度为250μg/mL和500μg/mL时的荧光信号强度接近，说明250μg/mL接近封闭的饱和点，可以选此比例进行后续PD-L1竞争封闭的实验。
9.PD-L1低表达肿瘤细胞对PD-1封闭剂效果的影响
取复苏24h后的H358细胞(没有经过细胞因子的刺激)106个，加入已进行体外封闭的PBMC中，分析肿瘤细胞上低表达的PD-L1对体外封闭效果是否有影响。利用台风荧光扫描仪检测到的荧光信号如图18所示，加入H358后的荧光信号与没有加入H358的信号相似，说明，PD-L1低表达的H358对已经封闭的效果没有影响。
10.PD-L1高表达肿瘤细胞对PD-1封闭剂效果的影响
H358经终浓度为10ng/mL的INF-γ和25ng/mL的TNF-α刺激24h后(H358+)，PD-L1的表达水平明显升高，同时以没有刺激的H358为对照分析其是否影响封闭，结果如图19所示，无论H358是否经过细胞因子的刺激，以及PD-L1的表达水平的高低，对PD-1封闭剂的效果没有影响，且以100倍的非标记的PD-1抗体为竞争物，也没有明显降低已有的封闭效果，说明，PD-1封闭剂的结合是不可逆的，一旦结合，十分牢固。
11.温度和时间对PD-1封闭剂的效果影响
25℃封闭1h的结果如图20-1～图20-3所示，浓度为20.8μg/mL、41.7μg/mL和83.3μg/mL时，封闭均达50％以上；根据拟合的结合曲线计算结合常数Kd＝19.7965±8.6037μg/m。
25℃封闭2h的结果如图21-1～图21-3所示，浓度为20.8μg/mL，封闭为50％左右，浓度为333.3μg/mL时，封闭到达90％左右；根据拟合的结合曲线计算结合常数Kd＝15.3360±3.1718μg/mL。
37℃封闭1h的结果如图22-1～图22-3所示，浓度为20.8μg/mL时，封闭达到68.1％，浓度为41.7μg/mL时，封闭已超过80％；根据拟合的结合曲线计算结合常数，Kd＝10.0496±1.9138μg/mL。
如表1所示，在PBS缓冲体系中，25℃时，封闭2h比1h时，结合常数更小，说明2h更适合PD-1封闭剂结合；而同样结合1h，37℃封闭时，结合常数小于25℃的结合常数，说明37℃封闭1h是最优的条件。
表1不同条件下的结合常数
12.PD-1封闭剂对PBMC杀伤肿瘤细胞的效果影响
以无封闭的PBMC和加入PD-1封闭剂的PBMC为效应细胞，检测其对H358(肺癌细胞)、U87(脑胶质瘤细胞)、SW480(结直肠癌细胞)、DLD-1(结直肠癌细胞)、SK-BR3(乳腺癌细胞)的杀伤效果，结果如图23-27所示：对H358的杀伤效率，在40：1的比例时，扣除自发死亡率后，没有加入PD-1封闭剂的PBMC对H358的杀伤效率为3％，而加入PD-1封闭剂后，杀伤效率升高至21.4％，差异显著(P<0.05)；对U87的杀伤效率，由22.9％提高至40.9％；对SW480的杀伤效率，由32.7％提高至52.1％；对DLD-1的杀伤效率，由16.1％提高至27.9％；对SK-BR3的杀伤效率，由26.3％提高至47.8％；说明，PD-1封闭剂可以提高PBMC对多种肿瘤的杀伤能力。
由此可以得出，本发明提供的PD-1封闭剂可有效结合PBMC细胞上的PD-1，阻断PD-1与PDL1的结合，实现对PBMC细胞的封闭，抑制免疫检测点的活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而达到抗肿瘤的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
<120> PD-1封闭剂及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe
1 5 10 15
Val Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala Lys Leu Gln Asp
20 25 30
Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Ala Ala
35 40 45
Ala Ile Thr Val Lys Val Asn Ala
50 55
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe
1 5 10 15
Val
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly
1 5 10 15
Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn Ala
20 25
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala
1 5 10
Claims (10)
1.PD-1封闭剂，其特征在于，所述PD-1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的PD-1封闭剂在制备对PBMC细胞封闭的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述封闭的pH值为5.8～8.0。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述封闭的温度为25～37℃。
5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述封闭的时间为1～2h。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PD-1封闭剂在32～500μg/mL的浓度下进行封闭。
7.权利要求1所述的PD-1封闭剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌或脑胶质瘤。
9.权利要求1所述的PD-1封闭剂在制备提高免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220064259A1 (en) * | 2019-01-04 | 2022-03-03 | George Mason Research Foundation, Inc. | Binding Domain Mapping and Compounds, Compositions, Complexes, Methods, and Kits Related Thereto |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104098651A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-10-15 | 郑州大学 | 具有抗肿瘤活性的PD-L1 IgV亲和肽及其应用 |
| CN105566496A (zh) * | 2015-11-26 | 2016-05-11 | 大庆东竺明生物技术有限公司 | 阻断人程序性死亡因子1(pd-1)功能的单克隆抗体及其编码基因和应用 |
| CN107226842A (zh) * | 2016-03-24 | 2017-10-03 | 华东理工大学 | 靶向pd-1的多肽及其应用 |
| CN107383174A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-11-24 | 苏州立豪生物科技有限公司 | 一种能与pd‑1特异性结合的肿瘤抑制肽及其用途 |
| CN107987153A (zh) * | 2016-10-27 | 2018-05-04 | 广东香雪精准医疗技术有限公司 | 高亲和力的可溶性pd-1分子 |
| CN108752476A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-11-06 | 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 | 一种pdl-1抗体、其药物组合物及其用途 |
| CN109608544A (zh) * | 2015-11-17 | 2019-04-12 | 苏州盛迪亚生物医药有限公司 | Pd-l1抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
| CN110050000A (zh) * | 2017-05-12 | 2019-07-23 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途 |
-
2019
- 2019-09-29 CN CN201910932776.XA patent/CN110478472B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104098651A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-10-15 | 郑州大学 | 具有抗肿瘤活性的PD-L1 IgV亲和肽及其应用 |
| CN109608544A (zh) * | 2015-11-17 | 2019-04-12 | 苏州盛迪亚生物医药有限公司 | Pd-l1抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
| CN105566496A (zh) * | 2015-11-26 | 2016-05-11 | 大庆东竺明生物技术有限公司 | 阻断人程序性死亡因子1(pd-1)功能的单克隆抗体及其编码基因和应用 |
| CN108752476A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-11-06 | 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 | 一种pdl-1抗体、其药物组合物及其用途 |
| CN107226842A (zh) * | 2016-03-24 | 2017-10-03 | 华东理工大学 | 靶向pd-1的多肽及其应用 |
| CN107987153A (zh) * | 2016-10-27 | 2018-05-04 | 广东香雪精准医疗技术有限公司 | 高亲和力的可溶性pd-1分子 |
| CN110050000A (zh) * | 2017-05-12 | 2019-07-23 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途 |
| CN107383174A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-11-24 | 苏州立豪生物科技有限公司 | 一种能与pd‑1特异性结合的肿瘤抑制肽及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| EVAN PERRY等: "Fragment-based screening of programmed death ligand 1 (PD-L1)", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》 * |
| 李文斌: "《中国肿瘤内科进展 中国肿瘤医师教育（2015年）》", 31 July 2015 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220064259A1 (en) * | 2019-01-04 | 2022-03-03 | George Mason Research Foundation, Inc. | Binding Domain Mapping and Compounds, Compositions, Complexes, Methods, and Kits Related Thereto |
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