CN110462404A - 测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法,其特征在于,测定从受试者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)。
Description
技术领域
本发明涉及测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法、鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法、监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法、用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的试剂、用于鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的试剂、用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的试剂、胰腺癌标记物、胰腺癌诊断剂和确定生物样品的方法。
本申请主张基于2017年1月12日在日本申请的特愿2017-003709号的优先权,本文引用其内容。
背景技术
外来体是存在于生物体内的体液中的囊泡状颗粒。已知与通常的细胞表面一样,在外来体的表面上存在各种膜蛋白。另外,据报道,外来体分泌自各种细胞,例如免疫系统的细胞和各种癌细胞,它们作为生物体内细胞间通讯的介质发挥作用而与生理现象有关,或与癌症等疾病有关,这引起了人们的关注。
近年来,已报道通过测定在外来体表面上表达特定抗原(CD9、CD63、CD147)的外来体的量来检测大肠癌的方法(专利文献1),以及在卵巢癌患者中,伴随癌症的发展血液中外来体的量增加(非专利文献1)等。
另外,作为测定外来体所具有的成分的方法,已知有使用与外来体具有的第1抗原特异性结合的第1抗体和与外来体具有的第2抗原特异性结合的第2抗体的免疫测定方法(专利文献2)。
已报道GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)是七次跨膜G蛋白偶联受体,其在肾上腺、甲状腺和胰腺等内分泌系统中高度表达,并且可用于内分泌系统疾病的诊断(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2014/167969号
专利文献2:国际公开第2013/094307号
专利文献3:国际公开第2005/101001号
非专利文献
非专利文献1:Taylor.等人,Gynecologic Oncol,100(2008)pp 13-21
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法和试剂,用于鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法和试剂,用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法和试剂,胰腺癌标记物、胰腺癌诊断剂和确定生物样品的方法。
解决问题的方法
本发明人进行深入研究以解决上述问题,结果发现通过测定从受试者收集的样品中的GPRC5C,特别是外来体所具有的GPRC5C,能够确定受试者患有胰腺癌的可能性;进一步地,通过测定从胰腺癌患者和胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C,能够鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病;进一步地,能够监控受试者患有胰腺癌的可能性;从而完成了本发明。即,本发明涉及以下[1]~[53]。
[1]一种测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法,其特征在于,测定从受试者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C。
[2]根据[1]所记载的方法,其特征在于,其含有以下步骤:
(1)从受试者收集样品的步骤;
(2)测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的步骤;
(3)当步骤(2)中测定的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从健康者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低的步骤。
[3]根据[2]所记载的方法,其中,在所述步骤(2)中,使用从样品分离的外来体进行所述步骤(1)中收集的样品中外来体所具有的GPRC5C的浓度的测定。
[4]根据[2]或[3]所记载的方法,其中所述步骤(2)利用免疫学测定法进行。
[5]根据[4]所记载的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段进行。
[6]根据[4]所记载的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与外来体中特异性表达的抗原(以下称为外来体特异性抗原)结合的抗体或该抗体的片段进行。
[7]根据[6]所记载的方法,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1:细胞间粘附分子-1)、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1(lysosome-associated membrane protein 1:溶酶体相关膜蛋白1)。
[8]根据[1]~[7]中任一项所记载的方法,其中所述样品为血液。
[9]一种鉴别胰腺疾病患者中胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法,其特征在于,测定从胰腺疾病患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C。
[10]根据[9]所记载的方法,其特征在于,其含有以下步骤:
(1)从胰腺疾病患者收集样品的步骤;
(2)测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的步骤;
(3)当步骤(2)中测定的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高的步骤。
[11]根据[10]所记载的方法,其中,在所述步骤(2)中,使用从样品分离的外来体进行所述步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的测定。
[12]根据[10]或[11]所记载的方法,其中所述步骤(2)利用免疫学测定法进行。
[13]根据[12]所记载的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段进行。
[14]根据[12]所记载的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段进行。
[15]根据[14]所记载的方法,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1。
[16]根据[9]~[15]中任一项所记载的方法,其中所述胰腺癌以外的胰腺疾病为胰腺炎。
[17]根据[9]~[16]中任一项所记载的方法,其中所述样品为血液。
[18]一种监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法,其特征在于,测定从受试者随时间收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C。
[19]根据[18]所记载的方法,其特征在于,其含有以下步骤:
(1)从受试者随时间收集样品的步骤;
(2)测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的步骤;
(3)当步骤(2)中测定的GPRC5C浓度维持在较从健康者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当维持在与从健康者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低的步骤。
[20]根据[19]所记载的方法,其中,在所述步骤(2)中,使用从样品分离的外来体进行所述步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的测定。
[21]根据[19]或[20]所记载的方法,其中所述步骤(2)利用免疫学测定法进行。
[22]根据[21]所记载的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段进行。
[23]根据[21]所记载的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段进行。
[24]根据[23]所记载的方法,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD 13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1。
[25]根据[18]~[24]中任一项所记载的方法,其中所述样品为血液。
[26]一种用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的试剂,其特征在于,其含有测定从受试者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的试剂。
[27]根据[26]所记载的试剂,其中所述测定GPRC5C的试剂为免疫学测定试剂。
[28]根据[27]所记载的试剂,其中所述免疫学测定试剂含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
[29]根据[28]所记载的试剂,其中所述免疫学测定试剂进一步含有与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段。
[30]根据[29]所记载的试剂,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1。
[31]根据[26]~[30]中任一项所记载的试剂,其进一步含有外来体分离试剂。
[32]根据[26]~[31]中任一项所记载的试剂,其中所述样品为血液。
[33]一种用于鉴别胰腺癌患者与胰腺癌以外的胰腺疾病患者的试剂,其特征在于,其含有测定从受试者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的试剂。
[34]根据[33]所记载的试剂,其中所述测定GPRC5C的试剂为免疫学测定试剂。
[35]根据[34]所记载的试剂,其中所述免疫学测定试剂含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
[36]根据[35]所记载的试剂,其中所述免疫学测定试剂进一步含有与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段。
[37]根据[36]所记载的试剂,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1。
[38]根据[33]~[37]中任一项所记载的试剂,其进一步含有外来体分离试剂。
[39]根据[33]~[38]中任一项所记载的试剂,其中所述胰腺癌以外的胰腺疾病为胰腺炎。
[40]根据[33]~[39]中任一项所记载的试剂,其中所述样品为血液。
[41]一种用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的试剂,其特征在于,其含有测定从受试者随时间收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的试剂。
[42]根据[41]所记载的试剂,其中所述测定GPRC5C的试剂为免疫学测定试剂。
[43]根据[42]所记载的试剂,其中所述免疫学测定试剂含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
[44]根据[43]所记载的试剂,其中所述免疫学测定试剂进一步含有与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段。
[45]根据[44]所记载的试剂,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1。
[46]根据[41]~[45]中任一项所记载的试剂,其进一步含有外来体分离试剂。
[47]根据[41]~[46]中任一项所记载的试剂,其中所述样品为血液。
[48]一种胰腺癌标记物,其特征在于,其由GPRC5C或GPRC5C基因组成。
[49]一种胰腺癌诊断试剂,其特征在于,其具有GPRC5C的特异性结合物质、能够扩增GPRC5C基因的引物组、或与GPRC5C基因的mRNA特异性杂交的探针。
[50]根据[49]所记载的诊断试剂,其中所述GPRC5C的特异性结合物质为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
[51]一种确定生物样品的方法,其特征在于含有测定生物样品中的GPRC5C的存在量的步骤,和当所测定的所述蛋白质的存在量较健康者或胰腺癌以外的胰腺疾病患者的生物样品中的GPRC5C的存在量多时,确定所述生物样品为胰腺癌患者的生物样品的步骤。
[52]一种确定生物样品的方法,其特征在于具有测定生物样品中的GPRC5C基因的表达量的步骤,和当所测定的所述基因的表达量较健康者或胰腺癌以外的胰腺疾病患者的生物样品中的GPRC5C基因的表达量多时,确定所述生物样品为胰腺癌患者的生物样品的步骤。
[53]根据[51]或[52]所记载的方法,其中所述胰腺癌以外的胰腺疾病为胰腺炎。
发明效果
根据本发明能够提供用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法和试剂、鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法和试剂、监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法和试剂、胰腺癌标记物、胰腺癌诊断试剂和确定生物样品的方法。
附图说明
图1为使用从健康者(4个样本)、胰腺炎患者(4个样本)、胰腺癌患者(4个样本)收集的血清中的外来体,通过蛋白免疫印迹检测GPRC5C(48kD)和外来体特异性抗原CD63得到的结果。
图2为使用从健康者(10个样本)、胰腺炎患者(10个样本)、和胰腺癌患者(23个样本)收集的血清中的外来体,比较各个血清中的外来体所具有的GPRC5C浓度的结果。纵轴显示通过蛋白免疫印迹得到的GPRC5C的信号和CD63的信号计算出来的GPRC5C/CD63的信号比。
图3为使用从手术前和手术后的胰腺癌患者(IB期:1个样本,IIB期:2个样本,III期:2个样本)收集的血清中的外来体,通过蛋白免疫印迹检测GPRC5C(48kD)得到的结果。
图4为使用从复发的胰腺癌患者(22个样本)和健康者(2个样本)收集的血清中的外来体,比较各个血清中的外来体所具有的GPRC5C浓度的结果。纵轴显示通过蛋白免疫印迹得到的GPRC5C的信号和CD9的信号计算出来的GPRC5C/CD9的信号比。
具体实施方式
1、测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法
本发明的测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法为特征在于测定从受试者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的方法。
本发明中的外来体为动物细胞分泌的直径30~100nm的脂质双层膜覆盖的膜囊泡。
作为本发明中的样品,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C的样品即可,没有特别的限定,可以举出例如血液、尿液、唾液、乳汁、鼻液、脑脊液等,优选血液。作为所述血液,可以举出例如全血、血清、血浆等,优选血清。
在本发明中,外来体所具有的GPRC5C是指任何形式的GPRC5C,例如包裹在外来体内的GPRC5C、外来体的膜表面上存在的GPRC5C、跨外来体膜的GPRC5C等。
在本发明中,外来体所具有的GPRC5C的浓度不仅包括每单位体积的量或摩尔数,还包括每单位体积的信号强度。
[测定方法1]
在本发明中,测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法可以通过包括以下步骤的方法进行。
(1)从受试者收集样品的步骤;
(2)测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的步骤;
(3)当步骤(2)中测定的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从健康者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低的步骤。
以下,详细说明各步骤。
<步骤(1)>
在步骤(1)中,作为从受试者收集的样品可以列举出上述样品等。
<步骤(2)>
<步骤(2)>为测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的步骤。例如可以通过免疫学测定法测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度。作为免疫学测定法,可以使用任何方法,只要其可以使用抗原抗体反应测定样品中外来体所具有的GPRC5C的浓度,例如,可以例举出使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的方法,以及使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段和与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的方法等。
作为步骤(2)中与GPRC5C结合的抗体,只要是能够测定GPRC5C的抗体,没有特别地限定,例如,可以举出抗-GPRC5C抗体-C末端(ab137482)(アブカム社制)、GPRC5C抗体(N-14)(サンタクルズバイオテクノロジー社制)等。
作为步骤(2)中的外来体特异性抗原,例如,可以举出CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、膜联蛋白V、LAMP1等。
作为与外来体特异性抗原结合的抗体,只要是能够与外来体特异性抗原结合的抗体,没有特别地限定,例如,可以举出纯化的小鼠抗-人CD 63(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:H5C6),纯化的小鼠抗-人CD 9(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:M-L13),纯化的小鼠抗-人CD 81(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:JS-81),纯化的小鼠抗-人CD37(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:M-B371),纯化的小鼠抗-人CD53(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:HI29),抗-CD82抗体[C33](アブカム社制),纯化的小鼠抗-人CD13(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:WM15),纯化的小鼠抗-人CD11a(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:27/CD11a),纯化的小鼠抗-人CD11b/Mac-1(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:ICRF44),纯化的小鼠抗-人CD11c(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:3.9),纯化的小鼠抗-人CD86(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:2331(FUN-1)),抗-ICAM1抗体[HM1](アブカム社制),纯化的小鼠抗-Rab5(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:1/Rab5),抗膜联蛋白V抗体[EPR3979](アブカム社制),纯化的小鼠抗-人Lamp-1(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:25/Lamp-1)等。
作为步骤(2)中的与GPRC5C结合的抗体片段、与外来体特异性抗原结合的抗体片段,只要是分别能够测定GPRC5C、外来体特异性抗原的抗体片段,没有特别地限定,例如,可以举出将通过木瓜蛋白酶处理抗体获得的Fab,通过胃蛋白酶处理抗体获得的F(ab')2,通过胃蛋白酶处理-还原处理抗体获得的Fab'等去除Fc部分得到的抗体片段,通过基因工程方法去除Fc部分得到的抗体片段等。
可以通过夹心ELISA或后面描述的エクソスクリーン法等测定步骤(2)的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度。在夹心ELISA中,用于测定外来体所具有的GPRC5C浓度的上述两种抗体中,可以使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体,使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体。或者,可以使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体,使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体。固相抗体以及标记抗体的制备没有特别地限定,可以根据公知方法进行。
外来体所具有的GPRC5C的测定方法可以使用任何方法进行,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C的方法,例如,可以使用免疫学测定法等方法进行。
具体地,当使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体,使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体时,使固定在固相上的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段与样品中具有GPRC5C的外来体结合,然后,添加经标记的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,在固相上形成与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段、外来体、以及经标记的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的复合物,通过测定形成的该复合物中的该标记物,可以测定该样品中外来体所具有的GPRC5C。
另外,当使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体,使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体时,使固定在固相上的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段与样品中的外来体结合,然后,添加经标记的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,在固相上形成与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段、外来体、以及经标记的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的复合物,通过测定形成的该复合物中的该标记物,可以测定该样品中外来体所具有的GPRC5C。
上述中,作为固相,例如,可以使用微量滴定板,由玻璃或合成树脂制成的颗粒(珠子),由玻璃或合成树脂制成的球状物(球),乳胶,磁性颗粒,各种膜如硝酸纤维素膜等,合成树脂制成的试管等。作为标记物,例如,可以使用酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素、生物素、地高辛、含有标签序列的多肽、金属胶体颗粒、有色乳胶颗粒等。
作为酶,例如,可以举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、荧光素酶等。
作为荧光物质,例如,可以举出荧光素异硫氰酸酯(FITC)、罗丹明B-异硫氰酸酯(RITC)等。作为其它的荧光物质,例如,可以举出量子点(Science,281,2016-2018,1998)、藻胆蛋白如藻红蛋白等、GFP(绿色荧光蛋白)、RFP(红色荧光蛋白、YFP(黄色荧光蛋白)、BFP(蓝色荧光蛋白)等发出荧光的蛋白。
作为发光物质,例如,可以举出吖啶及其衍生物、钌络合物、洛粉(ロフィン)等。作为钌络合物,优选如Clin.Chem.37,9,1534-1539,1991所示的与电子供体一起电化学发光的物质。
作为放射性同位素,例如,可以举出3H、14C、35S、32P、125I、131I等。
作为含有标签序列的多肽,可以举出FLAG肽(FLAG标签,Asp Tyr Lys Asp AspAsp Asp Asp Lys)、多组氨酸(His标签,His His His His His His)、myc表位肽(myc标签,Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu)、血凝素表位肽(HA标签,Tyr Pro Tyr AspVal Pro Asp Tyr Ala)等。
在步骤(2)中,在不破坏样品中的外来体,测定样品中外来体所具有的GPRC5C浓度时,在上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段中,优选使用与存在于外来体表面的GPRC5C表位结合的抗体或抗体片段作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
作为步骤(2)中的免疫学测定法,除上述夹心ELISA之外,可以举出エクソスクリーン法等。エクソスクリーン法为PerkinElmer公司开发的应用AlphaLISA的方法。在该方法中,使用2种具有不同表位的抗体,在其中一种抗体上结合生物素得到生物素化抗体,在另一种抗体上结合AlphaLISA受体珠得到抗体,将其与分析样品反应。然后,通过添加结合链霉亲和素的供体珠,将生物素化抗体与供体珠通过链霉亲和素结合,受体珠和供体珠相邻。当在200nm内相邻时,通过680nm激发从供体珠产生单线态氧,并且当单线态氧到达受体珠时,发射615nm的光,其可以作为信号检测。
具体地,使与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段上结合生物素得到的生物素化抗体、以及结合AlphaLISA受体珠的与外来体特异性抗原结合的抗体或抗体片段,与样品中的外来体所具有的GPRC5C反应,然后,通过添加结合链霉亲和素的供体珠,形成该受体珠、外来体、和该供体珠的复合物。向该复合物的供体珠照射激发光使其产生单线态氧,测定通过产生的单线态氧与该受体珠反应所生成的光。
另外,使与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段上结合生物素得到的生物素化抗体、以及结合AlphaLISA受体珠的与GPRC5C结合的抗体或抗体片段,与样品中的外来体所具有的GPRC5C反应,然后,通过添加结合链霉亲和素的供体珠,形成该受体珠、外来体、和该供体珠的复合物。向该复合物的供体珠照射激发光使其产生单线态氧,测定通过产生的单线态氧与该受体珠反应所生成的光。
<步骤(3)>
步骤(3)为比较步骤(2)中得到的从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤,当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低。
从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度是用于确定该受试者患有胰腺癌的可能性的参考值,可以测定从多个健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,从该统计中可以设定从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
作为从健康者收集的样品,优选与从受试者收集的样品相同类型的样品,例如,当从受试者收集的样品为血液时,优选从健康者收集的样品也是血液。
作为比较从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,没有特别地限定,可以使用公知的方法(Steel法、t检验、威尔科克森检验等)。根据该分析,当显示从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当显示与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低。
另外,也可以使用从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值,来代替从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,作为确定受试者患有胰腺癌的可能性的参考值。这种情况下,比较从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值。例如,可以举出上述外来体特异性抗原等作为外来体特异性抗原。
此外,在上述测定方法1的步骤(2)中,使用从受试者收集的样品中分离的外来体,能够测定样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。具体地,可以举出含有以下步骤的方法。
[测定方法2]
(1A)从受试者收集样品的步骤;
(2A)从步骤(1A)中收集的样品分离外来体的步骤;
(3A)测定步骤(2A)中分离的外来体所具有的GPRC5C的浓度;
(4A)从步骤(3A)中测定的GPRC5C浓度确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤;
(5A)当步骤(4A)中确定的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低的步骤。
以下,详细说明各步骤。
<步骤(1A)>
在步骤(1A)中,作为从受试者收集的样品,可以举出上述样品等。
<步骤(2A)>
在步骤(2A)中,作为分离外来体的方法,只要是能够分离样品中的外来体的方法,没有特别地限定,例如,可以举出超速离心法(Trends in Molecular Medicine.21,533(2015))、使用外来体分离试剂盒EXO-Prep(コスモバイオ社制)的方法等。
<步骤(3A)>
在步骤(3A)中,外来体所具有的GPRC5C浓度的测定方法可以使用任何方法进行,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,例如,可以使用免疫学测定法等的方法进行。作为通过免疫学测定法测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,可以举出以下实施方案。
实施方案1
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的方法。
实施方案2
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的方法。
作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,例如,可以举出上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段等。作为与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,例如,可以举出上述与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段等。
作为实施方案1的方法,例如,可以举出蛋白印迹法等。作为蛋白印迹法,例如,可以举出Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版,Academic Press(1996)中记载的方法等。
作为实施方案2的方法,当不破坏分离的外来体进行测定时,可以举出上述测定方法1中记载的免疫学测定法,例如エクソスクリーン法等,当破坏分离的外来体进行测定时,可以举出夹心ELISA法等。作为エクソスクリーン法,例如,可以举出上述エクソスクリーン法等。
当不破坏分离的外来体进行测定时,与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段是上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段中的、与外来体表面存在的GPRC5C表位结合的抗体或抗体片段。
作为破坏分离的外来体的方法,例如,可以举出使用超声的方法等。作为夹心ELISA法,例如,可以使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体、使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体,也可以使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体、使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体。作为固相和标记物,例如,可以分别举出公知的固相和标记物,例如,可以分别使用上述固相和标记物。作为固相抗体和标记抗体的制备方法,例如,可以举出公知的制备方法。
<步骤(4A)>
步骤(4A)为从步骤(3A)测定的GPRC5C浓度确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤。从该样品的体积,以及步骤(3A)中测定的GPRC5C浓度,能够确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
<步骤(5A)>
步骤(5A)为比较步骤(4A)中确定的从该受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤,当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低。
从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度是用于确定该受试者患有胰腺癌的可能性的参考值,可以测定从多个健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,从统计中可以设定从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
作为健康者的样品,优选与受试者的样品相同类型的样品,例如,当受试者的样品为血液时,优选健康者的样品也是血液。
作为比较从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,可以使用上述方法。根据该分析,当显示从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当显示与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低。
另外,也可以使用从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值,来代替从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,作为确定受试者患有胰腺癌的可能性的参考值。这种情况下,比较从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值。例如,可以举出上述外来体特异性抗原等作为外来体特异性抗原。
2、鉴别患有胰腺疾病的患者中胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法
特征在于测定从胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的本发明方法。
作为本发明鉴别方法中的样品,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C的样品即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述样品等。
在本发明的鉴别方法中,外来体所具有的GPRC5C可以以包裹在外来体内、存在于外来体的膜表面上、跨外来体膜等任何形式存在。
在本发明的鉴别方法中,外来体所具有的GPRC5C的浓度不仅包括每单位体积的质量或摩尔数,还包括每单位体积的信号强度。
[测定方法3]
本发明的鉴别胰腺疾病患者中胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法可以通过包括以下步骤的方法进行。
(1B)从受试者收集样品的步骤;
(2B)测定步骤(1B)中收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤;
(3B)当步骤(2B)中测定的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高,当与从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高的步骤。
以下,详细说明各步骤。
<步骤(1B)>
在步骤(1B)中,作为从受试者收集的样品,可以举出上述样品等。
<步骤(2B)>
步骤(2B)中外来体所具有的GPRC5C浓度的测定方法可以使用任何方法进行,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,例如,可以使用免疫学测定法等方法进行。作为通过免疫学测定法测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,可以举出以下实施方案。
·实施方案1
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的方法。
·实施方案2
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的方法。
作为步骤(2B)中与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,只要是能够测定GPRC5C的抗体或该抗体的片段即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述抗体或该抗体的片段等。
作为步骤(2B)中的外来体特异性抗原,例如,可以举出上述抗原等。
作为步骤(2B)中与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,只要是能够与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述抗体或该抗体的片段等。
在步骤(2B)中,当使用上述2种抗体或该抗体的片段时,可以使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体,使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体,测定外来体所具有的GPRC5C浓度。或者,可以使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体,使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体,测定外来体所具有的GPRC5C浓度。固相抗体和标记抗体的制备没有特别地限定,可以根据公知的方法进行。
外来体所具有的GPRC5C的测定方法可以使用任何方法进行,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C的方法,例如,可以使用上述夹心ELISA法、エクソスクリーン法等的免疫学测定法等进行。
步骤(2B)中,当不破坏样品中的外来体,测定样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度时,优选使用上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段中的、与外来体表面存在的GPRC5C表位结合的抗体或抗体片段作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
<步骤(3B)>
步骤(3B)为比较步骤(2B)中得到的从胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤,为当从胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中的GPRC5C浓度高时,确定该胰腺疾病患者患有胰腺癌的可能性高,当与从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该胰腺疾病患者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高的步骤。
作为胰腺癌以外的胰腺疾病,可以举出胰腺炎,作为胰腺炎,可以举出急性胰腺炎、慢性胰腺炎。
从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度是用来鉴别该受试者患有胰腺癌还是患有胰腺癌以外的胰腺疾病的参考值,可以测定从多个胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,从统计中设定从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
作为从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品,优选与从受试者收集的样品相同类型的样品,例如,当从受试者收集的样品为血液时,优选从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品也是血液。
作为比较从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,没有特别地限定,例如,可以使用上述方法等。通过该分析,当显示从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高,当显示与从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高。
另外,可以使用从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值,代替从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,作为用于鉴别胰腺疾病患者中胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的参考值。在这种情况下,比较从胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值。例如,可以举出上述外来体特异性抗原等作为外来体特异性抗原。
此外,在上述测定方法3的步骤(2B)中,也可以使用从受试者收集的样品分离的外来体,测定样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。具体地,可以举出包括以下步骤的方法。
[测定方法4]
(1C)从胰腺疾病患者收集样品的步骤;
(2C)从步骤(1C)中收集的样品分离外来体的步骤;
(3C)测定步骤(2C)中分离的外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤;
(4C)从步骤(3C)中测定的GPRC5C浓度确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤;
(5C)当从步骤(4C)中确定的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高,当与从胰腺癌以外的胰腺疾病收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高的步骤。
<步骤(1C)>
步骤(1C)中,作为从受试者收集的样品,可以举出上述样品等。
<步骤(2C)>
步骤(2C)中,作为分离外来体的方法,只要是能够分离样品中外来体的方法即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述方法等。
<步骤(3C)>
步骤(3C)中外来体所具有的GPRC5C浓度的测定方法可以使用任何方法进行,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,例如,可以使用免疫学测定法等方法。作为通过免疫学测定法测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,可以举出以下实施方案。
·实施方案1
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的方法。
·实施方案2
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的方法。
作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,例如,可以举出上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段等。作为与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,例如,可以举出上述与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段等。
作为实施方案1的方法,例如,可以举出蛋白印迹法等。作为蛋白印迹法,例如,可以举出上述方法等。
作为实施方案2的方法,当不破坏分离的外来体进行测定时,可以举出上述测定方法1中记载的免疫学测定法,例如エクソスクリーン法等,当破坏分离的外来体进行测定时,可以举出夹心ELISA法等。作为エクソスクリーン法,例如,可以举出上述エクソスクリーン法等。
当不破坏分离的外来体进行测定时,与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段是上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段中的、与外来体表面存在的GPRC5C表位结合的抗体或抗体片段。
作为破坏分离的外来体的方法,例如,可以举出上述方法等。
作为夹心ELISA法,例如,可以使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体、使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体,也可以使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体、使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体。作为固相和标记物,例如,可以分别举出公知的固相和标记物,例如,可以分别使用上述固相和标记物。作为固相抗体和标记抗体的制备方法,例如,可以举出公知的制备方法。
<步骤(4C)>
步骤(4C)为从步骤(3C)测定的GPRC5C浓度确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤。可以从该样品的体积和步骤(3C)中测定的GPRC5C浓度确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
<步骤(5C)>
步骤(5C)为比较步骤(4C)中确定的从该胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从胰腺癌以外的胰腺疾病收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤,当从胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该胰腺疾病患者患有胰腺癌的可能性高;当与从胰腺癌以外的胰腺疾病收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该胰腺疾病患者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高。
从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度是用来鉴别该胰腺疾病患者患有胰腺癌、还是患有胰腺癌以外的胰腺疾病的参考值,可以测定从多个胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,从该统计中设定从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
这种情况下,在设定参考值时使用的胰腺癌以外的胰腺疾病患者的样品优选是与作为受试者的胰腺疾病患者的样品相同类型的样品,例如,当作为受试者的胰腺疾病患者的样品为血液时,优选胰腺癌以外的胰腺疾病患者的样品也是血液。
作为比较受试者的外来体所具有的GPRC5C浓度与胰腺癌以外的胰腺疾病患者的外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,可以使用上述方法。通过该分析,当显示从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高,当显示与从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高。
另外,可以使用从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值,代替从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,作为用于鉴别胰腺疾病患者中胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的参考值。在这种情况下,比较从胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值。例如,可以举出上述外来体特异性抗原等作为外来体特异性抗原。
3、监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法
本发明的监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法为特征在于测定从受试者随时间收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的方法。
作为本发明的样品,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C的样品即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述样品等。
在本发明中,外来体所具有的GPRC5C可以以包裹在外来体内、存在于外来体的膜表面上、跨外来体膜等任何形式存在。
在本发明中,外来体所具有的GPRC5C的浓度不仅包括每单位体积的质量或摩尔数,还包括每单位体积的信号强度。
[测定方法5]
本发明中监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法可以通过包括以下步骤的方法进行。
(1D)从受试者随时间收集样品的步骤;
(2D)测定步骤(1D)中收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤;
(3D)当步骤(2D)中测定的GPRC5C浓度维持在较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高,当维持在与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低的步骤。
<步骤(1D)>
步骤(1D)中,作为从受试者收集的样品,可以举出上述样品等。
<步骤(2D)>
步骤(2D)中外来体所具有的GPRC5C浓度的测定方法可以使用任何方法进行,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,例如,可以使用免疫学测定法等方法。作为通过免疫学测定法测定外来体所具有的GPRC5C的方法,可以举出以下实施方案。
·实施方案1
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的方法。
·实施方案2
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的方法。
作为步骤(2D)中与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,只要是能够测定GPRC5C的抗体或该抗体的片段即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述抗体或该抗体的片段等。
作为步骤(2D)中的外来体特异性抗原,例如,可以举出上述抗原等。
作为步骤(2D)中与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,只要是能够与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述抗体或该抗体的片段等。
在步骤(2D)中,当使用上述2种抗体或该抗体的片段时,可以使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体、使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体,测定外来体所具有的GPRC5C浓度。或者,可以使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体、使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体,测定外来体所具有的GPRC5C浓度。固相抗体和标记抗体的制备没有特别地限定,可以根据公知的方法进行。
外来体所具有的GPRC5C的测定方法可以使用任何方法进行,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C的方法,例如,可以使用上述夹心ELISA法、エクソスクリーン法等的免疫学测定法等进行。
步骤(2D)中,当不破坏样品中的外来体,测定样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度时,优选使用上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段中的、与外来体表面存在的GPRC5C表位结合的抗体或抗体片段作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
<步骤(3D)>
步骤(3D)为比较步骤(2D)中得到的从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤,当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低。
从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度是用来确定该受试者患有胰腺癌的可能性的参考值,可以测定从多个健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,从该统计中设定从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
作为从健康者收集的样品,优选是与从受试者收集的样品相同类型的样品,例如,当从受试者收集的样品为血液时,优选从健康者收集的样品也是血液。
作为比较从受试者随时间收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,没有特别地限定,例如,可以使用上述方法等。根据该分析,当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度维持在较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当维持在与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低。
另外,也可以使用从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值,来代替从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,作为监控受试者患有胰腺癌的可能性的参考值。这种情况下,比较从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值。例如,可以举出上述外来体特异性抗原等作为外来体特异性抗原。
此外,在上述测定方法5的步骤(2D)中,可以使用从受试者收集的样品分离的外来体测定样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。具体地,可以举出包括以下步骤的方法。
[测定方法6]
(1E)从受试者随时间收集样品的步骤;
(2E)从步骤(1E)中收集的样品分离外来体的步骤;
(3E)测定步骤(2E)中分离的外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤;
(4E)从步骤(3E)中测定的GPRC5C浓度确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤;
(5E)当从步骤(4E)中确定的GPRC5C浓度维持在较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高,当维持在与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低的步骤。
<步骤(1E)>
步骤(1E)中,作为从受试者收集的样品,可以举出上述样品等。
<步骤(2E)>
步骤(2E)中,作为分离外来体的方法,只要是能够分离样品中外来体的方法即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述方法等。
<步骤(3E)>
步骤(3E)中外来体所具有的GPRC5C浓度的测定方法可以使用任何方法进行,只要是能够测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,例如,可以使用免疫学测定法等方法进行。作为通过免疫学测定法测定外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,可以举出以下实施方案。
·实施方案1
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的方法。
·实施方案2
使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的方法。
作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,例如,可以举出上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段等。作为与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,例如,可以举出上述与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段等。
作为实施方案1的方法,例如,可以举出蛋白印迹法等。作为蛋白印迹法,例如,可以举出上述方法等。
作为实施方案2的方法,当不破坏分离的外来体进行测定时,可以举出上述测定方法1中记载的免疫学测定法,例如エクソスクリーン法等,当破坏分离的外来体进行测定时,可以举出夹心ELISA法等。作为エクソスクリーン法,例如,可以举出上述エクソスクリーン法等。
当不破坏分离的外来体进行测定时,与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段是上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段中的、与外来体表面存在的GPRC5C表位结合的抗体或抗体片段。
作为破坏分离的外来体的方法,例如,可以举出上述方法等。
作为夹心ELISA法,例如,可以使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体、使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体,也可以使用与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段作为固相抗体、使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段作为标记抗体。作为固相和标记物,例如,可以分别举出公知的固相和标记物,例如,可以分别使用上述固相和标记物。作为固相抗体和标记抗体的制备方法,例如,可以举出公知的制备方法。
<步骤(4E)>
步骤(4E)为从步骤(3E)测定的GPRC5C浓度确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤。可以从该样品的体积和步骤(3E)中测定的GPRC5C浓度确定该样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
<步骤(5E)>
步骤(5E)为比较步骤(4E)中确定的从该受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度的步骤,当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度维持在较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当维持在与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低。
从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度是用来确定该受试者患有胰腺癌的可能性的参考值,可以测定多个从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,从该统计中设定从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度。
作为健康者的样品,优选与受试者的样品相同类型的样品,例如,当受试者的样品为血液时,优选健康者的样品也是血液。
作为比较受试者的外来体所具有的GPRC5C浓度与健康者的外来体所具有的GPRC5C浓度的方法,可以使用上述方法。通过该分析,当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度维持在较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高,当维持在与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低的浓度时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低。
另外,可以使用从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值,代替从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,作为用于监控受试者患有胰腺癌的可能性参考值。在这种情况下,比较从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值。例如,可以举出上述外来体特异性抗原等作为外来体特异性抗原。
如后面实施例中所述,根据本发明,可以通过测定取自手术前、手术后胰腺癌患者的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度,监控实施手术时的治疗效果、癌症部位减少等的胰腺癌患者的状态。
此外,根据本发明,可以通过测定从治疗中的胰腺癌患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度,预测胰腺癌的复发。
此外,根据本发明,可以通过测定从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度,监控受试者患有胰腺癌的可能性。
4、用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的试剂
本发明的用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的试剂为一种试剂,其特征在于含有测定外来体所具有的GPRC5C的试剂,其可以用于本发明的测试受试者患有胰腺癌的可能性方法中。
此外,本发明的用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的试剂中可以进一步含有记载参考标准的参考表,所述参考标准为当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,该受试者患有胰腺癌的可能性高,当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,该受试者患有胰腺癌的可能性低。作为记载于该参考表中的参考标准可以使用以下参考标准:当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值高时,该受试者患有胰腺癌的可能性高,当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值相同或较其低时,该受试者患有胰腺癌的可能性低。作为外来体特异性抗原,例如,可以举出上述外来体特异性抗原等。
在本发明的用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的试剂中,测定外来体所具有的GPRC5C的试剂为用于上述外来体所具有的GPRC5C的测定方法中的试剂。作为测定外来体所具有的GPRC5C的试剂,只要是能够测定样品中外来体所具有的GPRC5C的试剂即可,没有特别地限定,例如,可以举出免疫学测定试剂等。作为免疫学测定试剂,例如,可以举出根据上述免疫学测定法的试剂等。
根据免疫学测定法,测定外来体所具有的GPRC5C的试剂的具体实施方案如下所示。
·测定试剂1
含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂
·测定试剂2
含有与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂3
含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂4
含有固定于固相上的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂5
含有固定于固相上的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂6
含有固定于固相上的与GPRC5C结合的第1抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与GPRC5C结合的第2抗体或该抗体的片段的试剂。
作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,可以分别举出上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段等。
作为与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段中的标记物,例如,可以举出上述标记物等。与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的制备例如可以按照公知的标记抗体的制备方法进行。
作为固定于固相的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及固定于固相的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段中的固相,例如,可以举出上述固相等。将与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段固定于固相上、以及将与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段固定于固相上,例如可以按照公知的方法进行。
在测定试剂6中,与GPRC5C结合的第1抗体或该抗体的片段的结合表位和与GPRC5C结合的第2抗体或该抗体的片段的结合表位可以不同也可以相同,优选不同。
在上述测定试剂1~6中,可以进一步含有外来体分离试剂。作为外来体分离试剂,只要是能够从样品分离外来体的试剂即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述外来体分离试剂盒等。
5、用于在胰腺疾病患者中鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的试剂
本发明的用于在胰腺疾病患者中鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的试剂为一种试剂,其特征在于含有测定外来体所具有的GPRC5C的试剂,其可以用于本发明的鉴别胰腺疾病患者中胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法。
此外,本发明的用于在胰腺疾病患者中鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的试剂中可以进一步含有记载参考标准的参考表,所述参考标准为当从胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病患者的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,该胰腺疾病患者患有胰腺癌的可能性高,当与胰腺癌以外的胰腺疾病患者的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,该胰腺疾病患者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高。作为记载于该参考表中的参考标准也可以使用以下参考标准:当从胰腺疾病患者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值高时,该受试者患有胰腺癌的可能性高,当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值相同或较其低时,该胰腺疾病患者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高。作为外来体特异性抗原,例如,可以举出上述外来体特异性抗原等。
在本发明的用于在胰腺疾病患者中鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的试剂中,测定外来体所具有的GPRC5C的试剂为用于上述测定外来体所具有的GPRC5C的方法中的试剂。作为测定外来体所具有的GPRC5C的试剂,只要是能够测定样品中外来体所具有的GPRC5C的试剂即可,没有特别地限定,例如,可以举出免疫学测定试剂等。作为免疫学测定试剂,例如,可以举出根据上述免疫学测定法的试剂。
根据免疫学测定法,测定外来体所具有的GPRC5C的试剂的具体实施方案如下所示。
·测定试剂7
含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂
·测定试剂8
含有与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂9
含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂10
含有固定于固相上的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂11
含有固定于固相上的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂12
含有固定于固相上的与GPRC5C结合的第1抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与GPRC5C结合的第2抗体或该抗体的片段的试剂。
作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,可以分别举出上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段等。
作为与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段中的标记物,例如,可以举出上述标记物等。与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的制备例如可以按照公知的标记抗体的制备方法进行。
作为固定于固相的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及固定于固相的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段中的固相,例如,可以举出上述固相等。将与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段固定于固相以及将与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段固定于固相,例如可以按照公知的方法进行。
在测定试剂12中,与GPRC5C结合的第1抗体或该抗体的片段的结合表位和与GPRC5C结合的第2抗体或该抗体的片段的结合表位可以不同也可以相同,优选不同。
在上述测定试剂7~12中,可以进一步含有外来体分离试剂。作为外来体分离试剂,只要是能够从样品分离外来体的试剂即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述外来体分离试剂盒等。
6、用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的试剂
本发明的用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的试剂为一种试剂,其特征在于含有测定外来体所具有的GPRC5C的试剂,其可以用于本发明的监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法中。
此外,本发明的用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的试剂中可以进一步含有记载参考标准的参考表,所述参考标准为当从受试者随时间收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度维持在较从健康者的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高的浓度时,该受试者患有胰腺癌的可能性高,当维持在与健康者的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,该受试者患有胰腺癌的可能性低。作为记载于该参考表中的参考标准可以使用以下参考标准:当从受试者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值高时,该受试者患有胰腺癌的可能性高,当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度与外来体特异性抗原浓度的比值相同或较其低时,该受试者患有胰腺癌的可能性低。作为外来体特异性抗原,例如,可以举出上述外来体特异性抗原等。
在本发明的用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的试剂中,测定外来体所具有的GPRC5C的试剂为用于上述测定外来体所具有的GPRC5C的方法中的试剂。作为测定外来体所具有的GPRC5C的试剂,只要是能够测定样品中外来体所具有的GPRC5C的试剂即可,没有特别地限定,例如,可以举出免疫学测定试剂等。作为免疫学测定试剂,例如,可以举出根据上述免疫学测定法的试剂等。
根据免疫学测定法,测定外来体所具有的GPRC5C的试剂的具体实施方案如下所示。
·测定试剂13
含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂
·测定试剂14
含有与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂15
含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂16
含有固定于固相上的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂17
含有固定于固相上的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段的试剂。
·测定试剂18
含有固定于固相上的与GPRC5C结合的第1抗体或该抗体的片段,以及与标记物结合的与GPRC5C结合的第2抗体或该抗体的片段的试剂。
作为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段,可以分别举出上述与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段等。
作为与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段中的标记物,例如,可以举出上述标记物等。与标记物结合的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及与标记物结合的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段的制备例如可以按照公知的标记抗体的制备方法进行。
作为固定于固相的与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段以及固定于固相的与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段中的固相,例如,可以举出上述固相等。将与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段固定于固相以及将与外来体特异性抗原结合的抗体或该抗体的片段固定于固相,例如可以按照公知的方法进行。
在测定试剂18中,与GPRC5C结合的第1抗体或该抗体的片段的结合表位和与GPRC5C结合的第2抗体或该抗体的片段的结合表位可以不同也可以相同,优选不同。
在上述测定试剂13~18中,可以进一步含有外来体分离试剂。作为外来体分离试剂,只要是能够从样品分离外来体的试剂即可,没有特别地限定,例如,可以举出上述外来体分离试剂盒等。
7、胰腺癌标记物
本发明的胰腺癌标记物的特征在于其由GPRC5C或GPRC5C基因组成。人GPRC5CGenBank的登录号为NP_071319.2;NP_061123.3。此外,人GPRC5C mRNA的GenBank登录号为NM_022036.2;NM_018653.3。
8、胰腺癌诊断试剂
本发明的胰腺癌诊断试剂的特征在于其具有GPRC5C的特异性结合物质,能够扩增GPRC5C基因的引物组,或与GPRC5C基因的mRNA特异性杂交的探针。
(特异性结合物质)
作为特异性结合物质,可以举出与GPRC5C结合的抗体、该抗体的片段、与GPRC5C结合的适配体等。作为抗体或该抗体的片段,可以举出上述抗体或抗体片段。
适配体为对靶物质具有特异性结合能力的物质。作为适配体,可以举出核酸适配体、肽适配体等。具有靶肽特异性结合能力的核酸适配体,例如可以利用通过指数富集的配体系统演化(SELEX)法进行筛选。此外,具有靶肽特异性结合能力的肽适配体,例如可以通过使用酵母的双杂交法等进行筛选。
(引物组)
能够扩增GPRC5C基因的引物组,只要是能够通过RT-PCR等扩增这些基因的mRNA的引物即可,没有特别地限定。
这些基因的mRNA具有上述登录号指定的GenBank数据库条目中记载的碱基序列。另外,由于mRNA中可能存在剪接变体等,因此这些基因的mRNA不限于上述登录号所指定的mRNA。
例如,使用受试者的组织等作为样品,通过使用本发明的引物组进行RT-PCR等,可以检测样品中GPRC5C基因的mRNA。
(探针)
作为探针,只要是与GPRC5C基因的mRNA特异性杂交的探针即可,没有特别地限定。探针可以固定在载体上以构成DNA微阵列等。例如,通过将从受试者组织提取的mRNA与上述DNA微阵列接触并检测与探针杂交的GPRC5C基因的mRNA,能够确定受试者是否患有胰腺癌。作为载体,例如,可以举出上述载体等。
9、生物样品的确定方法
本发明的生物样品的确定方法含有测定生物样品中的GPRC5C的存在量的步骤,和当所测定的GPRC5C的存在量较对照多时,确定所述生物样品为从胰腺癌患者收集的生物样品的步骤。
通过本发明的确定方法能够确定生物样品是否是从胰腺癌患者收集的生物样品。根据本发明的确定方法,能够特异性检测出胰腺癌。
在本发明的确定方法中,生物样品如前所述,可以为血清、血浆或从血清或血浆纯化得到的外来体。测定生物样品中GPRC5C的步骤可以通过使用上述特异性结合物质的夹心ELISA、蛋白印迹法、使用反相蛋白质阵列的检测、免疫组织化学染色等进行。
本文中,基于使用梯度稀释的已知浓度的GPRC5C作为标准品制成的校准曲线,可以将测定的GPRC5C换算成定量值。
在本发明的确定方法中,当生物样品中的GPRC5C较对照样品中GPRC5C的存在量多时,确定所述生物样品为从胰腺癌患者收集的生物样品。作为对照,例如,可以举出从健康者或胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的生物样品。或者,基于预先存在于从健康者收集的生物样品中的GPRC5C的量来设定参考值,并且当与参考值相比GPRC5C的量多时,可以确定生物样品是从胰腺癌患者收集的样品。
本发明的确定方法还可以含有测定生物样品中的GPRC5C基因的表达量的步骤,和与对照相比所测定的所述基因的表达量较多时,确定所述生物样品为从胰腺癌患者收集的生物样品的步骤。
在本发明的确定方法中,生物样品可以为受试者的组织等。测定生物样品中的GPRC5C基因的表达量的步骤可以通过使用上述引物组的RT-PCR、定量RT-PCR等进行。或者,可以通过上述使用探针的DNA微阵列分析、Northern blotting等测定CPRC5C基因的表达量。本文中,基于使用梯度稀释的已知浓度的各基因片段等作为标准品制成的校准曲线,可以将测定的GPRC5C基因的表达量换算成定量值。
此外,在本发明的确定方法中,当生物样品中GPRC5C基因的表达量较对照样品中上述基因的表达量多时,确定所述生物样品是从胰腺癌患者收集的生物样品。作为对照,例如,可以举出从健康者或胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的生物样品。或者,基于预先存在于从健康者收集的生物样品中的GPRC5C基因的表达量来设定参考值,并且当上述基因的表达量与参考值相比多时,可以确定生物样品是从胰腺癌患者收集的样品。
实施例
以下,通过实施例说明本发明,但是本发明并不限于该实施例。
[实施例1]
检测各血清中的外来体所具有的GPRC5C
将从健康者收集的血清(4个样本)、从胰腺炎患者收集的血清(4个样本)、以及从胰腺癌患者收集的血清(4个样本:IIA期2种,IIB期1种,III期1种)用水平转子在100,000×g以上(4℃)超速离心70分钟,然后弃去上清液,加入PBS[含有0.15mol/L氯化钠的10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)]使其沉淀,将该沉淀级分用作外来体级分。将该外来体级分溶解在PBS中(总体积100μL)。向每孔中相当于100μL血清的外来体级分溶液的量中加入上述溶液和1/3量的4×样品缓冲液(含有4%十二烷基硫酸钠、10%蔗糖、0.01%溴酚蓝、10%2-巯基乙醇的0.125mol/L Tris缓冲液[pH6.8])并混合,于95℃保温5分钟,然后冰冷却。将该处理液加入4-15%ミニプロティアンTGX凝胶(バイオラッド社制)的孔中并进行SDS-PAGE。在将SDS-PAGE后的凝胶转移至PVDF膜后,使用Nacalai Blocking One溶液[ナカライテスク社制]于室温(25℃)将该膜封闭1小时。然后,于室温(25℃)进行一抗反应1小时(抗-GPRC5C抗体C-末端兔多克隆[アブカム社制]1:500)。然后,于室温(25℃)进行二抗反应1小时(兔IgGHRP[GEヘルスケア社制]1:5000)。最后,使用ImmunoStar LD(和光纯药工业社制)进行显色反应(室温[25℃]5分钟),并且拍摄蛋白印迹图像以检测各个血清中外来体所具有的GPRC5C的信号。蛋白印迹图像结果如图1所示。
此外,根据上述方法,使用纯化的小鼠抗-人CD63(日本ベクトン·ディッキンソン社制,克隆:H5C6),通过蛋白印迹法评价各血清中的外来体所具有的CD63的表达量。其结果如图1所示。
如图1所表明的,比较健康者与胰腺癌患者,可知在胰腺癌患者中外来体所具有的GPRC5C具有显著高的表达。
[实施例2]
为了使用从健康者收集的血清(10个样本)、从胰腺炎患者收集的血清(10个样本)、从胰腺癌患者收集的血清(23个样本)比较各个血清中外来体所具有的GPRC5C浓度,根据实施例1的方法,检测各个血清中的外来体所具有的GPRC5C信号和CD63的信号作为外来体所具有的GPRC5C浓度和CD63的浓度。图2显示GPRC5C/CD63的信号比。
如图2所表明的,可知与从健康人收集的血清中外来体所具有的GPRC5C浓度相比,从胰腺癌患者收集的血清中外来体所具有的GPRC5C浓度的值更高。此外,可知与从胰腺炎患者收集的血清中外来体所具有的GPRC5C浓度相比,从胰腺癌患者收集的血清中外来体所具有的GPRC5C浓度的值更高。
[实施例3]
对于胰腺癌患者(5例),根据实施例1的方法,使用蛋白印迹法比较手术前后各个血清中外来体所具有的GPRC5C浓度。蛋白印迹图像的结果如图3所示。
如图3所表明的,可知与手术前相比,手术后的外来体所具有的GPRC5C浓度显著降低。
[实施例4]
根据使用蛋白印迹法的实施例1的方法,测定从复发性胰腺癌患者收集的血清中外来体所具有的GPRC5C浓度,以及从健康者收集的血清中外来体所具有的GPRC5C浓度,并比较两个CPRC5C浓度。此外,与此同时,通过使用生物素化抗CD9抗体(8A12)(コスモバイオ社製)的生物素化抗CD9抗体(1000倍稀释)和HRP结合的链霉亲和素(CST社制)(2000倍稀释)的蛋白印迹法测定各血清中外来体所具有的CD9浓度。由所测定的GPRC5C浓度和CD9浓度计算出GPRC5C浓度与CD9浓度的比值,作为GPRC5C/CD9的信号比。图4显示该GPRC5C/CD9的信号比。
如图4所表明的,可知与从健康者收集的血清中外来体所具有的GPRC5C浓度相比,从复发性胰腺癌患者收集的血清中外来体所具有的GPRC5C浓度的值更高。
[产业上利用的可能]
本发明的用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法和试剂,用于鉴别胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法和试剂,用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法和试剂,胰腺癌标记物,胰腺癌诊断试剂,以及用于确定生物样品的方法可用于临床诊断。
Claims (53)
1.一种测试受试者患有胰腺癌的可能性的方法,其特征在于,测定从受试者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,其含有以下步骤:
(1)从受试者收集样品的步骤;
(2)测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的步骤;
(3)当步骤(2)中测定的GPRC5C浓度较从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从健康者收集的样品中外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,在所述步骤(2)中,使用从样品分离的外来体进行所述步骤(1)中收集的样品中外来体所具有的GPRC5C的浓度的测定。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其中所述步骤(2)利用免疫学测定法进行。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段进行。
6.根据权利要求4所述的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与外来体中特异性表达的抗原(以下称为外来体特异性抗原)结合的抗体或该抗体的片段进行。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1:细胞间粘附分子-1)、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1(lysosome-associated membrane protein1:溶酶体相关膜蛋白1)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述样品为血液。
9.一种鉴别胰腺疾病患者中胰腺癌与胰腺癌以外的胰腺疾病的方法,其特征在于,测定从胰腺疾病患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,其含有以下步骤:
(1)从胰腺疾病患者收集样品的步骤;
(2)测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的步骤;
(3)当步骤(2)中测定的GPRC5C浓度较从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当与从胰腺癌以外的胰腺疾病患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌以外的胰腺疾病的可能性高的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,在所述步骤(2)中,使用从样品分离的外来体进行所述步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的测定。
12.根据权利要求10或11所述的方法,其中所述步骤(2)利用免疫学测定法进行。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段进行。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与外来体中特异性表达的抗原(以下称为外来体特异性抗原)结合的抗体或该抗体的片段进行。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1:细胞间粘附分子-1)、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1(lysosome-associated membrane protein1:溶酶体相关膜蛋白1)。
16.根据权利要求9至15中任一项所述的方法,其中所述胰腺癌以外的胰腺疾病为胰腺炎。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法,其中所述样品为血液。
18.一种监控受试者患有胰腺癌的可能性的方法,其特征在于,测定从受试者随时间收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)。
19.根据权利要求18所述的方法,其特征在于,其含有以下步骤:
(1)从受试者随时间收集样品的步骤;
(2)测定步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的步骤;
(3)当步骤(2)中测定的GPRC5C浓度维持在较从健康者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度高时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性高;当维持在与从健康者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C浓度相同或较其低时,确定该受试者患有胰腺癌的可能性低的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,在所述步骤(2)中,使用从样品分离的外来体进行所述步骤(1)中收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C的浓度的测定。
21.根据权利要求19或20所述的方法,其中所述步骤(2)利用免疫学测定法进行。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段进行。
23.根据权利要求21所述的方法,其中所述免疫学测定法使用与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段,以及与外来体中特异性表达的抗原(以下称为外来体特异性抗原)结合的抗体或该抗体的片段进行。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1:细胞间粘附分子-1)、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1(lysosome-associated membrane protein1:溶酶体相关膜蛋白1)。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法,其中所述样品为血液。
26.一种用于测试受试者患有胰腺癌的可能性的试剂,其特征在于,其含有测定从受试者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)的试剂。
27.根据权利要求26所述的试剂,其中所述测定GPRC5C的试剂为免疫学测定试剂。
28.根据权利要求27所述的试剂,其中所述免疫学测定试剂含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
29.根据权利要求28所述的试剂,其中所述免疫学测定试剂进一步含有与外来体中特异性表达的抗原(以下称为外来体特异性抗原)结合的抗体或该抗体的片段。
30.根据权利要求29所述的试剂,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1:细胞间粘附分子-1)、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1(lysosome-associated membrane protein1:溶酶体相关膜蛋白1)。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的试剂,其进一步含有外来体分离试剂。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的试剂,其中所述样品为血液。
33.一种用于鉴别胰腺癌患者与胰腺癌以外的胰腺疾病患者的试剂,其特征在于,其含有测定从胰腺疾病患者收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)的试剂。
34.根据权利要求33所述的试剂,其中所述测定GPRC5C的试剂为免疫学测定试剂。
35.根据权利要求34所述的试剂,其中所述免疫学测定试剂含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
36.根据权利要求35所述的试剂,其中所述免疫学测定试剂进一步含有与外来体中特异性表达的抗原(以下称为外来体特异性抗原)结合的抗体或该抗体的片段。
37.根据权利要求36所述的试剂,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1:细胞间粘附分子-1)、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1(lysosome-associated membrane protein1:溶酶体相关膜蛋白1)。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的试剂,其进一步含有外来体分离试剂。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的试剂,其中所述胰腺癌以外的胰腺疾病为胰腺炎。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的试剂,其中所述样品为血液。
41.一种用于监控受试者患有胰腺癌的可能性的试剂,其特征在于,其含有测定从受试者随时间收集的样品中的外来体所具有的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)的试剂。
42.根据权利要求41所述的试剂,其中所述测定GPRC5C的试剂为免疫学测定试剂。
43.根据权利要求42所述的试剂,其中所述免疫学测定试剂含有与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
44.根据权利要求43所述的试剂,其中所述免疫学测定试剂进一步含有与外来体中特异性表达的抗原(以下称为外来体特异性抗原)结合的抗体或该抗体的片段。
45.根据权利要求44所述的试剂,其中所述外来体特异性抗原为CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1:细胞间粘附分子-1)、Rab5、膜联蛋白V、或LAMP1(lysosome-associated membrane protein1:溶酶体相关膜蛋白1)。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的试剂,其进一步含有外来体分离试剂。
47.根据权利要求41至46中任一项所述的试剂,其中所述样品为血液。
48.一种胰腺癌标记物,其特征在于,其由GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)或GPRC5C基因组成。
49.一种胰腺癌诊断试剂,其特征在于,其含有GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)的特异性结合物质、能够扩增GPRC5C基因的引物组、或与GPRC5C基因的mRNA特异性杂交的探针。
50.根据权利要求49所述的诊断试剂,其中所述GPRC5C的特异性结合物质为与GPRC5C结合的抗体或该抗体的片段。
51.一种确定生物样品的方法,其特征在于含有测定生物样品中的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)的存在量的步骤,和当所测定的GPRC5C的存在量较健康者或胰腺癌以外的胰腺疾病患者的生物样品中的GPRC5C蛋白质的存在量多时,确定所述生物样品为胰腺癌患者的生物样品的步骤。
52.一种确定生物样品的方法,其特征在于含有测定生物样品中的GPRC5C(G蛋白偶联受体家族C组5成员C:G蛋白偶联受体,C家族,第5组,成员C)基因的表达量的步骤,和当所测定的所述基因的表达量较健康者或胰腺癌以外的胰腺疾病患者的生物样品中的GPRC5C基因的表达量多时,确定所述生物样品为胰腺癌患者的生物样品的步骤。
53.根据权利要求51或52所述的方法,其中所述胰腺癌以外的胰腺疾病为胰腺炎。
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