CN110437297B - 法尼醇x受体的抑制剂和在医学中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是法尼醇X受体的抑制剂，例如式(I)的抑制剂，其中R1，R2，R4，X，Y，Z，m，和n如本文中所限定，其可用于在需要其的哺乳动物中治疗或预防肥胖，2型糖尿病/胰岛素抗性和非酒精性脂肪肝病。还公开的是包含药用载体和至少一种本发明的化合物的组合物，抑制哺乳动物中法尼醇X受体的方法，和治疗或预防哺乳动物中的肥胖的方法。

Description

法尼醇X受体的抑制剂和在医学中的用途
本申请是申请日为2014年8月1日、发明名称为“法尼醇X受体的抑制剂和在医学中的用途”的中国专利申请No.201480054322.2的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本专利申请要求2013年8月1日提交的美国临时专利申请号61/861,109和2014年5月29日提交的美国临时专利申请号62/004,436的权益，所述临时申请通过参考结合于此。
发明背景
肥胖已经达到世界范围的流行比例，并且与慢性疾病如2型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝和癌症相关。由于能量摄入超过能量消耗，导致过量的热量在脂肪组织中以脂肪形式净储存，造成肥胖形成。肥胖在代谢上与2型糖尿病(胰岛素抗性)和脂肪肝关联，后者可以导致脂肪肝炎、肝癌发生和肝衰竭。因此，抑制食欲、阻断膳食脂肪吸收、诱导脂肪迁移或增加代谢的药学方法在治疗肥胖和相关代谢病症方面是理想的。
法尼醇X受体(Farnesoid X Receptor,FXR)是孤儿核受体，最初从大鼠肝cDNA文库中鉴定(Forman，等人，Cell 81:687-693,1995)，其与昆虫蜕皮激素受体最密切相关。FXR是包括类固醇，类视黄醇和甲状腺激素的受体的转录因子核受体超家族的成员(Mangelsdorf，等人，Cell 83:841-850,1995)。RNA印迹和原位杂交分析显示，FXR最大量地表达在肝、肠、肾和肾上腺中(B.M.Forman，等人，Cell 81:687-693.1995；Seol，等人，Mol.Endocrinol.9:72-85，1995)。FXR是配体激活的核受体，其作为与由维生素A衍生物9-顺式视黄酸激活的视黄酸受体α(RXRα)的异二聚体结合DNA。FXR/RXRα异二聚体优选结合于由以反向重复编排并且由单个核苷酸分开的共有AG(G/T)TCA(IR-1基序)的两个核受体半位点组成的应答元件(Forman，等人，Cell 81:687-693,1995)。早期的报道显示，大鼠FXR由微摩尔浓度的法尼醇如法呢醇和保幼激素激活，因此导致最初的名称(Forman，等人，Cell81:687-693，1995)。然而，这些化合物是弱的配体并且也未能激活相应的小鼠和人FXR，造成内源FXR配体的性质存在疑问。然而，发现多种天然存在的胆汁酸在生理浓度结合并激活FXR(Makishima，等人，Science 284:1362-1365，1999；Parks，等人，Science 284:1365-1368，1999；Wang等人，Mol.Cell 3:543-553,1999；PCT WO 00/37077，2000年6月29日公开)。充当FXR配体的胆汁酸包括鹅去氧胆酸(CDCA)，脱氧胆酸(DCA)，石胆酸(LCA)，和牛磺酸以及这些胆汁酸的甘氨酸缀合物。
胆汁酸是在肝中形成的并且分泌到肠的十二指肠中的胆固醇代谢物，在那里，它们在溶解和吸收膳食脂肪和维生素方面发挥重要作用。约95％的胆汁酸随后被重新吸收到回肠中并且经由肠肝(enterohepatic)循环体系返回肝。胆固醇在肝中转变为胆汁酸在反馈调节下，并且胆汁酸下调细胞色素P450 7A1(CYP7A1)的转录，细胞色素P450 7A1(CYP7A1)编码催化胆汁酸生物合成中的限速步骤的酶。FXR通过涉及FXR靶基因小异二聚体伙伴(SHP)和肝受体同系物1的间接机制参与胆汁酸对CYP7A1表达的抑制(Goodwin等人，Mol.Cell 6:517-528，2000；在Matsubara等人，Mol.Cell.Endocrinol.368:17-29，2013中综述)。在回肠中，以FXR依赖性的方式，胆汁酸诱导肠胆汁酸结合蛋白(IBABP)的表达，肠胆汁酸结合蛋白(IBABP)是以高亲和力结合胆汁酸并且可以参与它们的细胞摄取和运输的细胞质蛋白。两个小组现在已经证明，胆汁酸通过激活结合在人、大鼠和小鼠IBABP基因启动子中保守的IR-1型应答元件的FXR来介导它们对IBABP表达的影响。因此，FXR涉及到参与胆汁酸和胆固醇稳态的靶基因的刺激(IBABP)和表达(CYP7A1)二者当中。FXR还诱导将未缀合的和缀合的胆汁酸/盐从肝细胞转运到胆汁中的胆盐输出泵(BSEP，ABC11)的表达(在Matsubara等人，Mol.Cell.Endocrinol.368:17-29，2013中综述)。
报道了tempol(4-羟基-2,2,6,6,-四甲基哌啶-1-氧基)，一种抗氧化剂和辐射保护剂，在小鼠中预防肥胖(Mitchell等人，Free Radic.Biol Med.34：93-102，2003)。最近的基于质谱的研究表明，tempol可以影响脂肪酸代谢并且猜测的肠道微生物-产生的代谢物的改变的水平提供tempol可以改变微生物群系(microbiome)的初步线索(Li等人，J.Proteome Res.，12:1369-1376，2013)。之前的研究表明，肠道微生物群系的改变可以影响肝、心脏和肾中胆汁酸的水平(Swann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:4523-4530，2011)。高脂肪膳食可以诱导小肠中受核受体(包括FXR)控制的基因的表达的改变(de Wit等人，BMC Med.Genomics 1:14，2008)。因此，肠中的改变的胆汁酸和可以改变高脂肪膳食诱导的肥胖的FXR信号转导之间可能存在关联。尽管存在已知的天然和合成的FXR激动剂，但还没有公开拮抗FXR的治疗剂。近期的研究表明，次级胆汁酸牛磺-β-鼠胆酸(TβMCA)可以拮抗肠中胆汁酸信号转导(Sayin等人，Cell Metab.225-235，2013；Li等人，Nat.Commun.4:2384，2013)。已经合成三取代的吡唑甲酰胺类似物，其是FXR拮抗剂，但是它们对代谢和生理学的影响未被研究(Yu等人，Bioorg.Med.Chem.2919-2938，2014)。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)特征在于在没有其他肝疾病或显著酒精消费的情况下在肝中的大量的异位甘油三酯(TG)积累(Weiβ等人，Dtsch.Arzteb.l Int.2014；111:447-452，2014)。NAFLD是最常见的肝病症，其影响世界上20-30％的成年群体和多于80％的肥胖的人。NAFLD可以发展为非酒精性脂肪肝炎(NASH)、纤维化、肝硬化和甚至肝细胞癌(Browning等人，J.Clin Invest.114:147-152，2004)。作为代谢综合征的组成部分，NAFLD与肥胖、胰岛素抗性/2型糖尿病和冠心病和动脉粥样硬化密切相关(Bhatia等人，Eur.Heart J.33:1190-1200，2012)。至今，NAFLD发展的潜在分子机制仍然很大程度上未知并且鉴定NAFLD治疗的新的靶点具有高的优先级。
在前所述表明，存在未满足的对于FXR受体的拮抗剂和治疗肥胖患者以诱导重量减轻、胰岛素抗性、和NAFLD的方法的需求。
发明概述
本发明提供治疗或预防哺乳动物，尤其是人中肥胖的核受体法尼醇X受体的抑制剂。体现本发明的各方面的化合物通过法尼醇X受体介导的信号转导抑制法尼醇X受体并且影响高脂肪膳食诱导的肥胖。根据本发明，本发明提供包含这些化合物的组合物和在治疗或预防肥胖中使用这些化合物作为治疗剂的方法。
本发明还提供药物组合物，其包含体现本发明的原理的化合物或盐和药用载体。
本发明还提供抑制哺乳动物中法尼醇X受体的方法，其包括向需要其的哺乳动物施用体现本发明的原理的化合物或其药用盐。
本发明此外提供在哺乳动物中治疗或预防肥胖的方法，其包括向需要其的哺乳动物中施用体现本发明的原理的化合物或其药用盐。
本发明还提供在需要其的哺乳动物中治疗或预防肥胖，胰岛素抗性和NAFLD的方法，其包括向所述哺乳动物施用体现本发明的原理的化合物或其药用盐。理想地是，所述化合物通过仅由肠法尼醇X受体介导的但不由肝法尼醇X受体介导的信号转导抑制肠中法尼醇X受体并且影响肥胖，胰岛素抗性和NAFLD。优选地，所述化合物具有最小的系统性生物利用度，从而所述化合物不抑制肝法尼醇X受体，这最小化任何系统性毒性。
本发明还提供合成本发明的化合物实施方案的方法。
附图说明
图1描述了显示牛磺-β-鼠胆酸(TβMCA)在培养的原代肝细胞中拮抗由FXR激动剂牛磺胆酸(TCA)导致的法尼醇X受体(FXR)激活的荧光素酶测定的结果。
图2描述了显示牛磺-β-鼠胆酸(TβMCA)在Caco2细胞中拮抗由FXR激动剂牛磺胆酸(TCA)导致的FXR激活的荧光素酶测定的结果。
图3说明保持高脂肪膳食达8周的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠的回肠粘膜中的ATP水平。
图4说明由甘氨酸-β-鼠胆酸导致的对利用鹅去氧胆酸的Shp mRNA诱导的阻断。
图5说明由甘氨酸-β-鼠胆酸导致的对利用GW4064的Shp mRNA诱导的阻断。
图6说明由甘氨酸-β-鼠胆酸导致的对利用GW4064的Fgf19 mRNA诱导的阻断。
图7说明由甘氨酸-β-鼠胆酸导致的对由GW4064导致的Atp5g mRNA抑制的倒转。
图8描述了根据本发明的实施方案的化合物的合成。
图9描述了根据本发明的实施方案的化合物的合成。
图10描述了β-鼠胆酸，牛磺-β-鼠胆酸(TβMCA)，甘氨酸-β-鼠胆酸，鹅去氧胆酸，牛磺鹅去氧胆酸(TCA)，和甘氨酸-鹅去氧胆酸的结构。
图11说明在10周的高脂肪膳食后用赋形剂(vehicle)或tempol处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的体重增加。
图12说明在14周的高脂肪膳食后Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的以克计和作为体重的百分数的脂肪量。
图13说明在7周的高脂肪膳食后对于Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的葡萄糖耐量试验(GTT)的结果。
图14说明在13周的高脂肪膳食后对于Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的胰岛素耐量试验(ITT)的结果。
图15说明在15周的高脂肪膳食后对于Fxrfl/fl和FxrΔI小鼠的空腹血糖，空腹血清胰岛素，和HOMA指数。
图16描述了在用tempol处理后喂食正常饮食的小鼠中从硬壁菌门(Firmicutes)向拟杆菌门(Bacteroidetes)的改变。
图17描述了正常饮食的和用赋形剂或tempol处理的小鼠的粪便中的硬壁菌门与拟杆菌门的比例和胆汁盐水解酶酶活性的比较。
图18说明使用合成的激动剂GW4064和各种剂量的TUDCA，TωMCA，TβMCA，TαMCA的人FXR竞争测定。将结果相对于Renilla表达标准化。图19A显示加权的UniFrac距离的主坐标分析图。圆圈表示赋形剂-处理的小鼠中的盲肠群落并且正方形表示tempol-治疗的小鼠中的盲肠群落。两组都喂食高脂肪饮食达10周。
图19B-G显示盲肠内容物的属级(genus level)的16S rRNA基因测序分析。数据表示为平均值±SD。
图20A显示在喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和tempol-治疗的小鼠中的尿离子的主成分分析(PCA)模型的得分散点图。
图20B显示PCA模型中所有检测的尿离子的荷载散点图。p[1]和p[2]值表示各个离子相对主要成分1和2的贡献权重。具有最高荷载值的两种离子的性质标注在图中。在电喷雾电离负的模式(ESI-)中获得所有数据。
图20C显示对甲酚硫酸酯和对甲酚葡萄糖苷酸的尿水平。将值相对于赋形剂-处理的小鼠的那些标准化，并表达为相对丰度。
图20D显示对甲酚硫酸酯(下图)和对甲酚葡萄糖苷酸(上图)的串联MS和化学结构。
图21A显示在14周的高脂肪饮食处理后在赋形剂-和tempol-治疗的小鼠中的尿离子的PCA模型的得分散点图。
图21B显示在14周的HFD后在赋形剂-和抗生素-处理的小鼠中的尿离子的PCA模型的荷载散点图。p[1]和p[2]值表示各个离子相对于主要成分1和2的贡献权重。具有最高荷载值的两种离子的性质注释在图中。所有数据在负的模式中(ESI-)获得。
图21C显示在14周的高脂肪饮食处理后在赋形剂-和抗生素-处理的小鼠中的对甲酚硫酸酯和对甲酚葡萄糖苷酸的尿水平。将值相对于赋形剂-处理的小鼠的那些标准化，并且表达为相对丰度。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。分析方差，然后双尾Student’s t-检验。与赋形剂-处理的小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。
图22A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
图22B显示来自喂食高脂肪饮食达14周的用赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝切片的脂滴的代表性的油红O染色。
图22C显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝重。
图22D显示喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝重与体重比率。
图22E显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠中的肝甘油三酯(TG)含量。
图23A显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
图23B显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝重。
图23C显示喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝重与体重比率。
图23D显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和抗生素-处理的肝TG含量。
图24A显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的回肠PCA模型的得分散点图。
图24B显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠中的回肠离子的PCA模型的荷载散点图。p[1]和p[2]值表示各个离子相对于主要成分1和2的贡献权重。具有最高荷载值的两种离子的性质注释在图中。所有数据在负的模式(ESI-)中获得。
图25A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的回肠中的个体牛磺酸-缀合的胆汁酸与总胆汁酸的比例。
图25B显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的回肠中的个体牛磺酸-缀合的胆汁酸与总胆汁酸的比例。
图26A显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的粪便的BSH酶活性。n＝4-5只小鼠/组。
图26B显示喂食高脂肪饮食达12周的小鼠中的回肠FXR表达的蛋白质印迹分析。各个泳道表示一只小鼠。
图26C显示来自喂食高脂肪饮食达12周的小鼠的回肠中的Fxr mRNA水平和FXR靶基因Shp和Fgf15的mRNA水平。n＝3只小鼠/组。
图26D显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的回肠中的FXR靶基因Shp和Fgf15的mRNA水平。n＝3只小鼠/组。
图26E显示用赋形剂，牛磺胆酸(TCA)，和牛磺酸-β-鼠胆酸(TβMCA)与TCA处理喂食高脂肪饮食达7周的小鼠24小时后回肠中的FXR靶基因Shp和Fgf15的mRNA水平。n＝3只小鼠/组。
图27A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的对照-floxed(Fxrfl/fl)小鼠和肠-特异的敲除小鼠(FxrΔ1E)小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
图27B显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxrfl/fl和FxrΔ1E小鼠的肝切片中的脂滴的代表性的油红O染色。
图27C显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxrfl/fl和FxrΔ1E小鼠的肝重。
图27D显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxrfl/fl和FxrΔ1E小鼠的肝甘油三酯含量。
图28A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxrfl/fl和FxrΔ1E小鼠的回肠粘膜的线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)相关的酶的mRNA水平。
图28B显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的回肠粘膜的线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)-相关基因的mRNA水平。n＝3只小鼠/组。
图28C显示来自喂食高脂肪饮食达12周的Fxrfl/fl和FxrΔ1E小鼠的回肠粘膜的对于复合物-I-和复合物-II-依赖性的呼吸测量的状态III呼吸。
图28D显示喂食高脂肪饮食达7周的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠的回肠粘膜中的ATP水平。
图29A显示无血清脂肪酸。对于各个脂肪酸的柱(bar)，从左到右，来自赋形剂-处理的Fxrfl/fl小鼠，tempol-处理的Fxrfl/fl小鼠，赋形剂-处理的FxrΔIE小鼠和tempol-处理的FxrΔIE小鼠。
图29B显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的血清神经酰胺。n＝3只小鼠/组。
图29C显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的回肠中编码神经酰胺合成-和分解代谢-相关的酶的mRNA的表达。
图29D显示在处理喂食高脂肪饮食达14周的小鼠7周抗生素后回肠中编码神经酰胺合成-和分解代谢-相关的酶的mRNA的水平。
图30A显示源自神经酰胺的MS片段的结构并且
图30B-30G显示各种神经酰胺的串联MS和化学结构。
图31A显示喂食高脂肪饮食达3天的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠中的肝TG含量。
图31B显示喂食高脂肪饮食达14周并且然后用赋形剂或抗生素处理3天的小鼠的回肠中的Fxr，Shp和Fgf15 mRNA水平。
图31C显示来自喂食高脂肪饮食达14周，并且然后用赋形剂或抗生素处理3天的小鼠的回肠的神经酰胺的概况。
图31D显示用赋形剂和2μM，5μM和10μM神经酰胺孵育24小时后的原代肝细胞甘油三酯(TG)含量(n＝4)。
图31E显示用赋形剂和2μM、5μM和10μM神经酰胺孵育16小时后原代肝细胞中的脂肪酸合成、甘油三酯合成、和脂肪酸分解代谢相关基因的mRNA水平(从左至右的柱分别针对各个mRNA，n＝5)。
图31F显示用赋形剂、以及2μM和10μM神经酰胺孵育24小时后原代肝细胞中的核SREBP1-N表达的蛋白质印迹分析(n＝3)。
图31G显示用赋形剂以及2μM和10μM神经酰胺孵育24小时后原代肝细胞中CIDEA表达的蛋白质印迹分析(n＝3)。
图32A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的肝中编码脂肪酸合成和甘油三酯合成相关的酶的mRNA的水平。
图32B显示喂食高脂肪饮食达14周的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的肝中编码参与脂肪酸和甘油三酯合成的酶的mRNA的表达。
图32C显示来自喂食高脂肪饮食达7周的小鼠的肝中脂肪酸氧化-相关的基因的mRNA水平。
图32D显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠的肝中的脂肪酸氧化-相关的基因的mRNA水平。
图32E显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的肝中的SREBP1-N蛋白表达的蛋白质印迹分析。LAMIN A/C用作上样对照(n＝3)。
图32F显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的肝中CIDEA蛋白表达的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作上样对照(n＝3)。
图32G显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的肝中的Cyp7a1mRNA水平(n＝3)。
图32H显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝中的Cyp7a1mRNA水平(n＝3)。
图32I显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的肝中的炎症相关的基因的mRNA水平(n＝3)。
图32J显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝中的炎症相关的基因的mRNA水平(n＝3)。
图33A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
图33B显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的肝切片中的脂滴的油红O染色。
图33C显示喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的肝重。
图33D显示喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的肝重与体重比率。
图33E显示喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂和抗生素-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的肝甘油三酯含量。
图33F显示喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的回肠中神经酰胺的脂类组学概况(从左到右的柱分别针对各个神经酰胺)。
图33G显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的血清神经酰胺水平(从左到右的柱分别针对各个神经酰胺)。
图34A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和tempol-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
图34B显示来自高脂肪饮食达14周的赋形剂和tempol-处理的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠的肝切片中的脂滴的油红O染色。
图34C显示高脂肪饮食达14周的赋形剂和tempol-处理的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠的肝重。
图34D显示来自高脂肪饮食达14周的赋形剂-和tempol-处理的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠的肝重与体重比率。
图34E显示来自高脂肪饮食达14周的赋形剂-和tempol-处理的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠的肝甘油三酯水平。
图34F显示来自高脂肪饮食达14周的赋形剂和tempol-处理的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠的肝中脂肪酸合成、甘油三酯合成和脂肪酸分解代谢相关的基因的mRNA水平。各个mRNA下的柱从左到右是赋形剂-处理的Fxrfl/fl，tempol-处理的Fxrfl/fl，赋形剂-处理的FxrΔIE，tempol-处理的FxrΔIE小鼠。
图34G显示tempol处理高脂肪饮食达16周的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠后肝核SREBP1-N表达的蛋白质印迹分析。各个泳道表示各个小鼠。
图34H显示tempol处理高脂肪饮食达16周的Fxrfl/fl和FxrΔIE，小鼠后肝CIDEA表达的蛋白质印迹分析。各个泳道表示各个小鼠。
图35显示在与含有肠细菌的粪便的蛋白孵育后阳性对照牛磺-β-鼠胆酸(TβMCA)和甘氨酸-β-鼠胆酸(Gly-MCA)向产物β-鼠胆酸(TβMCA)的代谢。
图36显示在口服灌喂0，1，5和50mg/kg的Gly-MCA后小鼠回肠中的Gly-MCA浓度。
图37A显示用Gly-MCA处理24小时后的小鼠中的血清转氨酶(ALT)水平。
图37B显示用Gly-MCA处理24小时后小鼠中的天冬氨酸转氨酶(ALT)水平。
图38显示在存在和不存在Gly-MCA的情况下观察到的在瞬时共转染有嵌和受体构建体的HEK293T成纤维细胞中作为加入的FXR激动剂GW4064的浓度的函数的荧光素酶活性。
图39显示利用100μM CDCA和赋形剂(对照)，或100μM和200μM Gly-MCA与100μMCDCA处理的分化的Caco-2细胞中的Shp mRNA表达(n＝3)。
图40A显示在用100μM和200μM Gly-MCA和用2μM GW4064或5μM GW4064处理后的分化的Caco-2细胞中的Shp mRNA的水平(n＝3)。对于Gly-MCA的各个剂量，从左到右显示进一步不用GW4064处理，用2μM GW4064和5μM GW4064处理。
图40B显示用100μM和200μM Gly-MCA以及用2μM GW4064或5μM GW4064处理后分化的Caco-2细胞中的Fgf19 mRNA水平(n＝3)。对于Gly-MCA的各个剂量，从左到右显示进一步不用GW4064处理，用2μM GW4064和5μM GW4064处理。
图40C显示用100μM和200μM Gly-MCA以及用2μM或5μM GW4064处理后分化的Caco-2细胞中Atp5g mRNA的水平(n＝3)。对于Gly-MCA的各个剂量，从左到右显示进一步不用GW4064处理，用2μM GW4064和5μM GW4064处理。
图41A和41B显示喂食高脂肪饮食的分别赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠，经9周的过程，体重(A)的改变和初始体重(B)的％改变的生长曲线。n＝5只小鼠/组。
图41C和41D显示9周高脂肪饮食后，分别赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠中，如通过NMR测定的身体构成以显示脂肪重量(C)和脂肪重量与瘦肉体重比率(D)。n＝5只小鼠/组。
图42A显示在喂食高脂肪饮食的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠中经1周的时期(从6周至7周)平均的每日的累积的食物摄取。
图42B显示喂食高脂肪饮食的赋形剂-和Gly-MCA-处理小鼠中对于1周的平均时期(从6周至7周)使用间接能量平衡(TEEbal)的24h能量消耗。n＝5只小鼠/组。
图43A显示喂食高脂肪饮食后6至7周后赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠中的葡萄糖耐量试验(GTT)。n＝5只小鼠/组。
图43B显示图45A中描述的葡萄糖耐量试验的曲线下面积(AUC)。
图43C显示喂食高脂肪饮食6至7周后赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠中的胰岛素耐量试验(ITT)。n＝5只小鼠/组。
图44A显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠中的肝切片的代表性的H&E染色。
图44B显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠中的肝重。n＝5只小鼠/组。
图44C显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠中的肝重与体重比率。n＝5只小鼠/组。
图44D显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的肝甘油三酯含量。n＝5只小鼠/组。
图45A和45B分别显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平。n＝5只小鼠/组。
图46A显示来自喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的粪便离子的PCA模型的得分散点图。
图46B显示来自喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠的粪便离子的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)的散点图。各个点表示个体小鼠粪便离子。标记的离子识别为β-MCA，TβMCA，牛磺胆酸(TCA)和Gly-MCA，其受Gly-MCA处理影响。p(corr)[1]P值表示组间差异并且p[1]P值表示离子的相对丰度。以负电离模式(ESI-)获得数据。
图46C显示来自喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的粪便离子的个体胆汁酸组成。
图46D显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的粪便中的Gly-MCA水平。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图47A显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠中的回肠离子的PCA模型的得分散点图。
图47B显示来自喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠的回肠离子的PLS-DA的散点图。各个点表示各个小鼠粪便离子。标记的离子识别为T-α-MCA，TβMCA，牛磺胆酸(TCA)，牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，牛磺脱氧胆酸(TDCA)和牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)以及Gly-MCA，其由Gly-MCA处理诱导。p(corr)[1]P值表示组间差异并且p[1]P值表示离子的相对丰度，所有数据以负的模式(ESI-)获得。
图47C显示来自喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠的回肠中的胆汁酸组成。
图47D显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的回肠中的Gly-MCA水平。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图48显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的血清总甘油三酯水平。n＝5只小鼠/组。
图48显示来自喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的血清甘油三酯种类的概况。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图49显示来自喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的血清神经酰胺的概况。n＝5只小鼠/组。
图49显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的回肠神经酰胺的概况。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图50A显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的回肠中的FXR靶基因Shp和Fgf15的mRNA水平。n＝5只小鼠/组。
图50B显示在来自喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的回肠中编码参与神经酰胺代谢的基因的mRNA的水平。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图51A显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的肝中FXR靶基因Shp的mRNA水平。n＝5只小鼠/组。
图51B显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂-和Gly-MCA-处理的小鼠的肝中Cyp7a1的mRNA水平。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图52显示用赋形剂和Gly-MCA处理6周的遗传上肥胖瘦蛋白受体-缺陷(db/db)的生长曲线。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图53A和53B显示用赋形剂和Gly-MCA处理6周的db/db小鼠中由NMR确定的脂肪重量，和脂肪重量与瘦肉体重比率的身体组成。n＝5只小鼠/组.所有数据表示为平均值±SD。
图54A显示用赋形剂和Gly-MCA处理6周的db/db小鼠中的肝切片的代表性的H&E染色.n＝5只小鼠/组。
图54B和54C显示用赋形剂和Gly-MCA处理6周的db/db小鼠中的肝重，和肝重与体重比率。n＝5只小鼠/组。
图54D显示用赋形剂和Gly-MCA处理6周的db/db小鼠的肝甘油三酯含量n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图55A和55B显示用赋形剂和Gly-MCA处理6周的db/db小鼠中的血清ALT和AST水平。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图56A和56B显示来自赋形剂和Gly-MCA-处理达6周的db/db小鼠的粪便和回肠中的胆汁酸组成。n＝5只小鼠/组。
图56C显示赋形剂和Gly-MCA-处理达6周的db/db小鼠的回肠、粪便、肝和血清中的Gly-MCA的相对水平。n＝5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。
图57A显示用赋形剂和Gly-MCA处理6周的db/db小鼠中的血清甘油三酯种类的概况。n＝5只小鼠/组。
图57B和57C显示喂食高脂肪饮食达9周的赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠的血清和回肠神经酰胺种类的概况。n＝5只小鼠/组.所有数据表示为平均值±SD。
图58显示用赋形剂-和Gly-MCA处理6周的HFD-诱导的肥胖小鼠的体重曲线。n＝5只小鼠/组。
图59显示如通过NMR确定的，用赋形剂-和Gly-MCA处理6周的高脂肪饮食-诱导的肥胖小鼠中的身体组成。n＝5只小鼠/组。
图60A显示用赋形剂-和Gly-MCA处理6周的高脂肪饮食-诱导的肥胖小鼠中的肝切片的代表性的H&E染色。n＝5只小鼠/组。
图60B和60C显示赋形剂-和Gly-MCA处理6周的高脂肪饮食-诱导的肥胖小鼠中的肝重和肝重与体重比率。n＝5只小鼠/组。
图61A和61B显示用赋形剂-和Gly-MCA处理6周的高脂肪饮食-诱导的肥胖小鼠的粪便和回肠中的胆汁酸组成。n＝5只小鼠/组。
图61C显示赋形剂和Gly-MCA-处理6周的高脂肪饮食-诱导的肥胖小鼠的回肠、粪便、肝和血清中的Gly-MCA中的相对水平。n＝5只小鼠/组.所有数据表示为平均值±SD。
发明详述
在一个实施方案中，本发明提供式(I)或(II)的化合物：
Figure BDA0002056000670000151
其中R1和R2独立地选自氢，烷基，和C(＝O)R3,
R4选自氢，烷基，和C(＝O)R3,
X选自C＝O和CH2,
Y选自CH2，NR5，O，S，SO，SO2，和Se,
或X和Y一起形成C＝C,
Z选自COOR6，SO3R7，和P(＝O)(OR8)2,
R3，R5，R6，R7，和R8独立地选自氢，烷基，和芳基,
R4选自氢，烷基，和C(＝O)R3,
m是1至6的整数，并且
n是1至6的整数,
或其药用盐,
条件是，当化合物是式(I)的化合物，m和n是2，X是C＝O，Y是NH，R1和R2二者都是氢，并且R4是氢时，则Z不是SO3H。
根据某些实施方案，当化合物是式(I)的化合物，m是2，X是C＝O，Y是NH，R1和R2二者都是氢，R4是氢，并且n是1时，则Z不是COOH。
根据某些实施方案，化合物是式(I)的化合物。
根据上述实施方案中的任一项，R4是氢。
根据某些实施方案，R1和R2是氢。
根据某些实施方案，X是C＝O。
根据某些实施方案，m是2。
根据某些实施方案，Y是NH。
根据某些实施方案，n是1至6的整数。
根据某些优选的实施方案，所述化合物选自：
Figure BDA0002056000670000161
Figure BDA0002056000670000171
根据某些优选的实施方案，所述化合物选自：
Figure BDA0002056000670000172
根据某些实施方案，X是CH2。
根据某些实施方案，Y选自NH，O，S，和Se。
根据某些实施方案，m是2。
根据某些实施方案，n是2。
根据某些实施方案，Z是SO3H。
根据某些优选的实施方案，所述化合物选自：
Figure BDA0002056000670000181
根据某些实施方案，化合物是式(II)的化合物。
根据某些实施方案，R1和R2是氢。
根据某些实施方案，X是C＝O。
根据某些实施方案，m是2。
根据某些实施方案，Y是NH。
根据某些实施方案，n是1至6的整数。
根据某些优选的实施方案，所述化合物选自：
Figure BDA0002056000670000191
根据某些优选的实施方案，所述化合物选自：
Figure BDA0002056000670000192
Figure BDA0002056000670000201
在某些实施方案中，X是CH2。
根据某些实施方案，Y选自NH，O，S，和Se。
在某些实施方案中，m是2。
在某些实施方案中，n是2。
在某些实施方案中，Z是SO3H。
根据某些优选的实施方案，所述化合物选自：
Figure BDA0002056000670000202
Figure BDA0002056000670000211
根据某些更优选的实施方案，所述化合物选自：
Figure BDA0002056000670000212
Figure BDA0002056000670000221
Figure BDA0002056000670000231
Figure BDA0002056000670000241
本发明还提供式(III)的化合物：
Figure BDA0002056000670000242
其中R1和R2独立地选自氢，烷基，和C(＝O)R3,
R11是氢，卤素，烷基，OR2，和C(＝O)R3,
R12是氢，卤素，烷基，OR4，或C(＝O)R3,
R13是氢，烷基，OR14，或C(＝O)R3,
R4选自氢，烷基，和C(＝O)R3，
R15，R16，R17，和R18独立地选自氢和卤素，并且
R14选自甘氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲基天冬氨酸(methyl aspartate)，天冬氨酸，甲基谷氨酸(methylglutamate)，谷氨酸，甲基脯氨酸，脯氨酸，缬氨酸，2-氟-β-丙氨酸，2-溴丙氨酸，2-氯丙氨酸，2-氟丙氨酸，2-碘丙氨酸，3-溴丙氨酸，3-氯丙氨酸，3-氟丙氨酸，3-碘丙氨酸，4-溴苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，牛磺酸，和4-碘苯丙氨酸,
或其药用盐,
条件是，当R1是氢，R11和R12二者都是β-羟基，R13，R15，R16，R17，和R18全部是氢时，则R14不是甘氨酸或牛磺酸，并且,
当R1是氢，R11是α-羟基，R12，R13，R15，R16，R17，和R18全部是氢时，则R14不是甘氨酸或牛磺酸。
在某些实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0002056000670000251
在某些实施方案中，R11是卤素，R12和R13是羟基，并且R15，R16，R17，和R18全部是氢。
在某些实施方案中，R11和R12二者都是卤素，并且R15，R16，R17和R18全部是氢。
在某些实施方案中，R18是卤素并且R15，R16和R17全部是氢。
现在涉及本文中一般使用的术语，术语“烷基”意为含有例如，1至约6个碳原子，优选地1至约4个碳原子，更优选1至2个碳原子的直链或支链烷基取代基。这样的取代基的实例包括甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，己基，等。
术语“芳基”是指如本领域中通常理解的未取代的或取代的芳族碳环取代基，并且术语“C6-C10芳基”包括苯基和萘基。要理解，根据Hückel’s规则，术语芳基应用于平面的环取代基并且包含4n+2个π电子。
在上述实施方案的任一项中，式(I)或(II)的化合物或盐的C-20碳原子可以具有R构型，S构型，或可以是R和S异构体的混合物。
在上述实施方案的任一项中，当手性碳原子处的立体化学未规定时，所述手性碳原子可以具有R构型，S构型，或可以是R和S异构体的混合物。
术语“药用盐”意在包括由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成的无毒性盐。通常，这样的盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与水或有机溶剂中，或二者的混合物中的化学当量量的适当的碱或酸反应来制备。通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。适当的盐的列表在Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990，p.1445，和Journal of Pharmaceutical Science，66，2-19(1977)中找到。
合适的碱包括无机碱如碱金属和碱土金属碱，例如，含有金属阳离子如钠、钾、镁、钙等的那些。合适的碱的非限制性实例包括氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠和碳酸钾。合适的酸包括无机酸如盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，磷酸，等，和有机酸如对甲苯磺酸，甲磺酸，苯磺酸，草酸，对溴苯基磺酸，碳酸，琥珀酸，柠檬酸，苯甲酸，乙酸，马来酸，酒石酸，脂肪酸，长链脂肪酸，等。优选的具有酸性部分的本发明的化合物的药用盐包括钠盐和钾盐。优选的具有碱性部分(例如，二甲基氨基烷基)的本发明化合物的药用盐包括盐酸盐和氢溴酸盐。含有酸性或碱性部分的本发明的化合物以游离碱或酸的形式或以其药用盐的形式使用。
应该认识到，形成本发明的任意盐的一部分的特定反离子通常不具有决定性的性质，只要所述盐作为整体在药理学上可接受并且只要所述反离子不贡献作为整体的盐不希望的质量。
还要理解，上述化合物和盐可以形成溶剂化物，或以基本上未复合的形式，如无水形式存在。如本文使用的，术语"溶剂化物"是指其中溶剂分子，如结晶溶剂，结合于晶格中的分子复合物。当结合入溶剂化物中的溶剂是水时，所述分子复合物称为水合物。药用溶剂化物包括水合物，醇合物如甲醇合物和乙醇合物，乙腈合物等。这些化合物也可以以多形形式存在。
本发明还涉及药物组合物，其包含药用载体和本文所述的至少一种化合物或盐。
优选，所述药用载体是对于活性化合物化学惰性的载体和在使用条件下不具有有害的副作用或毒性的载体。
载体的选择将部分由选择的本发明的特定化合物，以及由用于施用组合物的特定方法决定。因此，存在多种合适的本发明的药物组合物的制剂。在某些实施方案中，所述制剂适于施用于消化道，并且尤其是施用于小肠。
适于口服施用的制剂可以由(a)液体溶液，如溶解在稀释剂，如水、盐水、或橙汁中的治疗有效量的本发明的化合物，(b)胶囊、香囊、片剂、含片和锭剂，其各自含有预定量的作为固体或颗粒的活性成分，(c)粉末，(d)适当的液体中的悬浮液，和(e)合适的乳状液组成。液体制剂可以包括稀释剂，如水和醇，例如，乙醇、卞醇和聚乙二醇，其中加入或不加入药用表面活性剂、悬浮剂、或乳化剂。胶囊形式可以是含有例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填料，如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉的普通的硬或软壳明胶类型。片剂形式可以包括乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、芳香剂和药理学相容的赋形剂中的一种或多种。含片形式可以包含香料通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中的活性成分，以及包含惰性基础，如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯糖中的活性成分的锭剂，除了活性成分之外含有所述赋形剂的乳状液，凝胶，等是本领域中已知的。
在一些实施方案中，制剂可以适于延长本发明的化合物与哺乳动物的消化道，并且尤其是与哺乳动物的小肠的接触的时间量。就这一点，可以使用各种制剂如延长释放制剂和设计以延长化合物在释放到小肠之前在胃中保留的时间量的制剂。很多合适的制剂在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro，A.R.，编辑，pp.858-929，Lippincott Williams&Wilkins(2000)中提供。
在一些实施方案中，本发明的化合物或盐可以以食品添加剂的形式施用，即，与食物或饮料的混合物。对于用作食品添加剂，所述化合物或盐可以与食物或饮料本身混合，或可以配制为包含一种或多种合适的赋形剂的组合物，然后与食物或饮料混合。食物或饮料可以是任何合适的食物或饮料。在一些实施方案中，食物或饮料具有相对高的脂肪含量。
本领域普通技术人员将理解，除了前述药物组合物，本发明的化合物或盐可以配制为包合配合物，如环糊精包合配合物，或脂质体。脂质体用于将化合物靶向至特定组织，如淋巴组织或癌性肝细胞。脂质体还可以用于增加本发明的化合物的半衰期。可用于本发明的脂质体包括乳状液、泡沫、微团、不可溶单层、液晶、磷脂分散液、层状层等。在这些制剂中，要递送的活性剂单独或与合适的化疗剂联合，作为脂质体的部分结合。因此，填充有希望的本发明的化合物或其盐的脂质体，可以针对特定组织类型的位点，肝细胞，例如，在那里，脂质体随后递送选择的组合物。用于本发明的脂质体从标准囊泡-形成脂质形成，所述标准囊泡-形成脂质通常包括中性的和带负电的磷脂和固醇，如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑例如，脂质体大小和脂质体在血流中的稳定性来指导。对于制备脂质体，可获得多种方法，如，例如，Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9，467(1980)，和美国专利4,235,871，4,501,728，4,837,028，和5,019,369中所描述的。为了靶向特定组织类型的细胞，要结合入脂质体中的配体可以包括，例如，对所述靶向的组织类型的细胞表面决定簇特异的抗体或其片段。含有本发明的化合物或盐的脂质体悬浮液可以以根据施用模式、递送的药剂和治疗的疾病的阶段而改变的剂量静脉内、局部、外部等施用。
在某些实施方案中，药物组合物可以肠胃外，例如，静脉内、皮下、皮内、或肌肉内施用。因此，本发明提供用于肠胃外施用的组合物，其包含溶解或悬浮于适于肠胃外施用的可接受的载体(包括水性和非水性等渗无菌注射液)中的本发明的化合物或盐的溶液或悬浮液。本领域中已知很多这样的组合物。
根据一个实施方案，本发明提供在需要其的哺乳动物中抑制法尼醇X受体的方法，所述方法包括施用给哺乳动物有效量的本发明的化合物。
优选地，所述动物是哺乳动物。更优选地，所述哺乳动物是人。
术语“哺乳动物”包括，但不限于，啮齿目，如小鼠，和兔形目，如兔。优选的是，哺乳动物来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。更优选的是，哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)或奇蹄动物(Perssodactyla)，包括马科动物(马)。最优选的是，哺乳动物是灵长目，Ceboids，或Simioids(猴)或类人猿目(人和猿)。尤其优选的哺乳动物是人。
在某些实施方案中，FXR-介导的疾病或病况是心血管疾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、高胆固醇血症、或高血脂慢性肝病、肠胃疾病、肾病、心血管疾病、代谢病、癌症(即，结直肠癌)、或神经适应证如卒中。在某些实施方案中，慢性肝病是原发性胆汁性肝硬化(PBC)、脑腱黄瘤病(cerebrotendinous xanthomatosis，CTX)、原发性硬化性胆管炎(primarysclerosing cholangitis，PSC)、药物诱导的胆汁郁积、妊娠肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy)、肠胃外营养相关性胆汁淤积(PNAC)、细菌过度生长或脓毒症相关胆汁淤积、自身免疫性肝炎、慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝移植相关移植物抗宿主病、活体供体移植肝再生、先天性肝纤维化(congenital hepatic fibrosis)、胆总管结石病(choledocholithiasis)、肉芽肿性肝病(granulomatous liver disease)、肝内或肝外恶性肿瘤、斯耶格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)、结节病(Sarcoidosis)、威尔逊病(Wilson's disease)、高歇氏病(Gaucher's disease)、血色素沉着症(hemochromatosis)、或α1-抗胰蛋白酶缺乏。在某些实施方案中，胃肠疾病是炎性肠病(IBD)(包括克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis))、肠易激综合征(irritablebowel syndrome,IBS)、细菌过度生长、吸收障碍(malabsorption)、放射后结肠炎(post-radiation colitis)、或镜下结肠炎(microscopic colitis)。在某些实施方案中，肾病是糖尿病性肾病(diabetic nephropathy)、局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmentalglomerulosclerosis,FSGS)、高血压肾硬化(hypertensive nephrosclerosis)、慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis)、慢性移植性肾病、慢性间质性肾炎(chronicinterstitial nephritis)、或多囊性肾病(polycystic kidney disease)。在某些实施方案中，心血管病是动脉粥样硬化、动脉硬化、血脂异常(dyslipidemia)、高胆固醇血症、或高甘油三酯血症。
根据优选的实施方案，本发明提供在需要其的哺乳动物中治疗或预防肥胖的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的本发明的化合物或盐。
如本文使用的，肥胖可以被认为是其中过量的体脂可以使人处于健康风险中的状况(参见Barlow和Dietz，Pediatrics 102：E29，1998；National Institutes of Health，Obes.Res.6(增刊2):51S-209S，1998)。过量的体脂是能量摄取和能量消耗不平衡的结果。在人中的一个实施方案中，体重指数(BMI)用于评价肥胖。在一个实施方案中，25.0kg/m2至29.9kg/m2的BMI是超重(也成为I级肥胖)，而30kg/m2的BMI真正是肥胖(也称为II级肥胖)。
在人中的另一实施方案中，腰围用于评价肥胖。在该实施方案中，男人102cm以上的腰围被认为肥胖，而女人89cm以上的腰围被认为肥胖。强有力的证据表明，肥胖影响个体的发病率和死亡率。例如，肥胖的个体有增加的心脏病、非胰岛素依赖性(2型)糖尿病、高血压、卒中、癌症(例如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌)、血脂异常、胆囊疾病、睡眠呼吸暂停(sleep apnea)、生育力降低和骨关节炎等的风险(参见Lyznicki等人，Am.Fam.Phys.63:2185，2001)。
根据本发明的施用给哺乳动物，尤其是人的剂量应该足以实现所需响应。这样的响应包括逆转或预防由希望治疗的或对其诱导所希望的益处的肠中表达的法尼醇X受体介导的疾病或病症的不希望的作用。在某些实施方案中，病症是非酒精性脂肪肝病、肥胖和2型糖尿病(胰岛素抗性)。本领域技术人员将了解，剂量将取决于多种因素，包括人的年龄、病况和体重，以及人中非酒精性脂肪肝病的程度。剂量的大小也将由施用的途经、时机和频率以及可能伴随特定化合物的施用的任何有害副作用的存在、性质和程度以及所希望的生理效果决定。本领域技术人员将理解，成功治疗非酒精性脂肪肝病、肥胖、2型糖尿病(胰岛素抗性)或其他疾病或病症可能需要延长的包括多次施用的治疗。
就这一点，通过抑制肠法尼醇X受体治疗NAFLD可以被认为哺乳动物中肝性脂肪变性(hepatic steatosis)的临床表现的减少。而在很多情况下，NAFLD不引起迹象或症状，NAFLD可以引起疲劳、疼痛(尤其是上右侧腹部)、和体重减轻。在一些情况下，NAFLD可以促进非酒精性脂肪肝炎，一种肝中炎症。NAFLD可以促进非酒精性脂肪肝疾病相关的肝硬化其是伴有显著降低的肝功能的肝的瘢痕。瘢痕可以随时间变得严重，从而肝不再恰当地行使功能。
NAFLD可以例如，通过超声、计算机断层扫描、磁共振研究、或通过肝活检评估。在某些实施方案中，哺乳动物消耗高脂肪膳食。高脂肪膳食可以被认为是提供大于30％能量为脂肪的膳食(参见，例如，Churchill Livingstone’s Dictionary of Sport andExercise Science and Medicine，S.Jennett，Elsevier Limited，2008)。在其他实施方案中，本发明提供在哺乳动物中预防非酒精性脂肪肝病的方法。预防非酒精性脂肪肝病可以被认为是在进行从低脂肪或中等脂肪膳食变为高脂肪膳食的膳食改变的哺乳动物中降低肝性脂肪变性的预期表现。
目前，对于NAFLD不存在标准治疗。医生通常处理促进疾病的风险因子。例如，医生在体重减轻计划和健康饮食的选择、糖尿病的控制和胆固醇的降低方面帮助遭受痛苦的患者。
就这一点，通过抑制法尼醇X受体治疗肥胖可以被认为是降低哺乳动物中体重增加率的减少。在某些实施方案中，哺乳动物消耗高脂肪膳食。高脂肪膳食可以被认为是提供大于30％能量为脂肪的膳食(参见，例如，Churchill Livingstone’s Dictionary ofSport and Exercise Science and Medicine，S.Jennett，Elsevier Limited，2008)。在其他实施方案中，本发明提供预防哺乳动物中肥胖的方法。预防肥胖可以被认为是在进行从低脂肪或中等脂肪膳食变为高脂肪膳食的膳食改变的正常重量哺乳动物中减少预期体重增加。
就这一点，通过抑制法尼醇X受体治疗糖尿病可以被认为减少患有胰岛素抗性的患者中的胰岛素抗性。胰岛素抗性可以导致高血糖，并且胰岛素抗性的减少可以导致血液葡萄糖水平的降低。通过抑制法尼醇X受体治疗的症状的非限制性实例包括大脑模糊和无法集中、高血糖、肠胀气、嗜睡、增重、脂肪储存、减肥困难、增加的血液甘油三酯水平、增加血压、增加的促炎性细胞因子相关的心血管疾病、抑郁症、黑棘皮病(acanthosisnigricans)和增加的饥饿感。
根据本发明施用于哺乳动物，尤其是，人的剂量应该足以实现所希望的响应。这种响应包括逆转或预防由希望治疗的或对其诱导所希望的益处的法尼醇X受体介导的疾病或病症的有害影响。在某些实施方案中，病症是肥胖。本领域技术人员将了解，剂量将取决于多种因素，包括人的年龄、病况和体重，以及人中的肥胖程度。剂量的大小也将由施用的途经、时机和频率以及可能伴随特定化合物的施用的任何有害副作用的存在、性质和程度以及所希望的生理效果决定。本领域技术人员将理解，成功治疗肥胖或其他疾病或病症可能需要延长的包括多次施用的治疗。
就这一点，通过抑制法尼醇X受体治疗肥胖可以被认为降低哺乳动物中体重增加率。在某些实施方案中，哺乳动物消耗高脂肪膳食。高脂肪膳食可以被认为是提供大于30％能量为脂肪的膳食(参见，例如，Churchill Livingstone’s Dictionary of Sport andExercise Science and Medicine，S.Jennett，Elsevier Limited(2008))。在其他实施方案中，本发明提供在哺乳动物中预防肥胖的方法。预防肥胖可以被认为是在进行从低脂肪或中等脂肪膳食变为高脂肪膳食的膳食改变的正常重量哺乳动物中减少预期体重增加。
合适的剂量和剂量给药方案可以由本领域技术人员已知的常规测距(range-finding)技术确定。通常，治疗用小于化合物的最适剂量的较小剂量起始。之后，剂量以小的增量增加直到在所述情况下达到最佳效果。本发明的方法通常将包括每kg体重的哺乳动物施用约0.1至约300mg(例如，约0.1至约150mg，约0.1至约100mg，或约0.1至约50mg)的一种或多种上述化合物。
施用的一种化合物或多种化合物的治疗有效量可以根据所需效果和上述因素改变。通常，剂量将在0.01mg/kg至250mg/kg的受试者体重之间，并且更通常在约0.05mg/kg至100mg/kg之间，如约0.2至约80mg/kg，约5至约40mg/kg或约10至约30mg/kg的受试者体重。因此，单位剂型可以根据上述合适的范围和受试者的体重配制。如本文使用的术语“单位剂型”是指适于要治疗的受试者的治疗剂的物理上独立的单位。
备选地，剂量基于体表面积计算，并且每天约1mg/m2至约200mg/m2，如约5mg/m2至约100mg/m2将施用给受试者。在特定实施方案中，施用治疗有效量的一种化合物或多种化合物的包括每日向受试者施用约5mg/m2至约50mg/m2，如约10mg/m2至约40mg/m2。目前认为，单剂量的化合物或化合物是合适的，然而治疗有效剂量可以在一段延长的时期提供或每天多个剂量提供。因此，单位剂型也可以使用受试者的体表面积，基于上述合适的范围和所希望的剂量给药时间表来计算。
如本文中标明的，法尼醇X受体涉及肥胖的发展。因此，预期施用法尼醇X受体的抑制剂治疗或预防肥胖的发展，尤其是在消耗高脂肪膳食的哺乳动物中。
本文中，还表明肠法尼醇X受体在在NAFLD的进展中发挥关键作用。抑制本发明实施方案中的肠法尼醇X受体已经显示改善高脂肪膳食诱导的NAFLD。
通过对分别重建和杀灭肠道细菌的tempol和抗生素的研究，发现新的通路，其中这些药剂改变肠道菌群，导致表达酶胆汁盐水解酶(BSH)的细菌的损失。较低BSH导致肠中增加的缀合的胆汁酸，如T-β-MCA的水平。T-β-MCA相应地是肠FXR的拮抗剂。肠中较低FXR信号转导导致喂食高脂肪饮食的小鼠和遗传肥胖小鼠中肥胖、胰岛素抗性和NAFLD减少。这些研究导致这样的假想：抑制FXR将是用于患有肥胖、胰岛素抗性和NAFLD的患者的有希望的方法。口服施用新的化学实体甘氨酸β-鼠胆酸(Gly-MCA)减少高脂肪饮食-处理的小鼠和遗传肥胖小鼠中的肥胖、胰岛素抗性和NAFLD。建议的是，口服施用并且保留在肠中并且抑制肠FXR以及对肝中表达的FXR不具有影响的任何化合物，会在患有肥胖、胰岛素抗性和NAFLD的患者的治疗中具有功效。
化学
式1的化合物，其中W是OR4，R4是氢，R1和R2是氢，X是C＝O，m是2并且Y是NH，如β-鼠胆酸9和其缀合物，如牛磺-β-鼠胆酸10和甘氨酸-β-鼠胆酸16的代表性的实施方案可以如图8中所述方案中说明的制备。在酸催化下用例如，甲醇酯化二羟基酸1，提供酯2。用氯甲酸乙酯保护A-环羟基，提供碳酸酯3。用例如铬酸钾氧化7-羟基，得到酮4。用例如，HBr中的溴进行溴化，得到溴代酮5。用例如，还原酮，得到溴代醇6。还原性去除溴，使用例如，金属锌，提供烯烃7。用例如，四氧化锇顺-二羟化，得到顺式二醇8。水解两个酯，提供β-鼠胆酸9。可以使用合适的偶联剂将β-鼠胆酸9与牛磺酸缀合，提供牛磺-β-鼠胆酸10。甘氨酸可以被牛磺酸取代，提供β-鼠胆酸的甘氨酸缀合物(16)。2-氨基乙基膦酸可以被牛磺酸取代，提供牛磺-β-鼠胆酸的膦酸类似物。化学如Iida，T.，等人，Lipid，16：863-5(1981)，Iida T.，等人，Journal of Lipid Research，30：1267-1279(1989)，和Tserng K-Y.，等人，J.LipidResearch，18：404-407(1977)中所述。
式I的化合物，其中X是CH2，其中m是2，可以例如通过图9中所述的途径，以说明的β-鼠胆酸9的实施方案开始制备。羧酸通过酸催化的酯化被保护，提供化合物11。化合物11中的羟基可以使用任何合适的保护基团如苄基(Bzl)保护，得到化合物12。使用任何合适的还原剂，例如，氢化锂铝还原羧基，提供醇13。使用任何合适的试剂如三苯基膦和四溴化碳将羟基转变为合适的离去基团，例如，溴，得到化合物14。使用例如，式：HYCH2CH2SO3H(其中Y是NH、O、S、或Se)的亲核试剂置换13中的离去基团，然后脱保护，得到牛磺酸缀合的类似物15。
在一个实施方案中，本发明提供合成式(I)的化合物的方法：
Figure BDA0002056000670000341
其中R1，和R2，和R4是氢,
X是CH2,
Y选自CH2，NR5，O，S，SO，SO2，和Se,
Z选自COOR6，SO3R7，P(＝O)(OR8)2和NR9R10,
R3，R5，R6，R7，R8R9，和R10独立地选自氢，烷基，和芳基,
R4选自氢，烷基，和C(＝O)R3,
m是1至6的整数，并且
n是1至6的整数,
其包含以下步骤：
(i)提供式(IV)的化合物:
Figure BDA0002056000670000351
(ii)用醇处理式(IV)的化合物，提供式(V)的化合物:
Figure BDA0002056000670000352
(iii)保护式(V)的化合物中的羟基，提供式(VI)的化合物:
Figure BDA0002056000670000353
(iv)用还原剂提供式(VI)的化合物，提供式(VII)的化合物:
Figure BDA0002056000670000361
(v)将式(VII)的化合物转化为式(VIII)的化合物，其中LG是离去基团:
Figure BDA0002056000670000362
(vi)用式：HY(CH2)nZ的化合物处理式(VIII)的化合物，其中Y是NH，S，O，或Se，提供式(IX)的化合物:
Figure BDA0002056000670000363
和
(vii)将式(IX)的化合物转变为式(I)的化合物。
在一个实施方案中，本发明提供合成式(II)的化合物的方法:
Figure BDA0002056000670000364
其中R1和R2是氢,
X是CH2,
Y选自CH2，NR5，O，S，SO，SO2，和Se,
Z选自COOR6，SO3R7，P(＝O)(OR8)2和NR9R10,
R3，R5，R6，R7，R8R9，和R10独立地选自氢，烷基，和芳基,
R4选自氢，烷基，和C(＝O)R3,
m是1至6的整数，和
n是1至6的整数,
其包含以下步骤：
(i)提供式(X)的化合物:
Figure BDA0002056000670000371
(ii)用醇处理式(X)的化合物，提供式(XI)的化合物:
Figure BDA0002056000670000372
(iii)保护式(XI)的化合物中的羟基，提供式(XII)的化合物:
Figure BDA0002056000670000373
(iv)用还原剂处理式(XII)的化合物，提供式(XIII)的化合物:
Figure BDA0002056000670000381
(v)将式(XIII)的化合物转化为式(XIV)的化合物，其中LG是离去基团：
Figure BDA0002056000670000382
(vi)用式：HY(CH2)nZ的化合物处理式(XIV)的化合物，其中Y是NH，S，O，或Se，提供式(XV)的化合物:
Figure BDA0002056000670000383
并且
(vii)将式(XV)的化合物转变为式(II)的化合物。
以下实施例进一步说明本发明，但当然不应该被认为以任何方式限制其范围。
荧光素酶测定
PGL4-Shp-TK萤火虫荧光素酶构建体和人Fxr表达质粒由Rutgers University的Grace L.Guo提供。人Asbt表达质粒由Wake Forest University医学院的Paul A.Dawson提供。使用X-TREMEGENETMHP DNA转染试剂(Roche)将质粒转染入细胞。裂解细胞，并且利用DUAL-荧光素酶TM测定试剂盒(Promega)测量荧光素酶活性。将萤火虫荧光素酶活性相对于Remilla荧光素酶活性标准化。
ATP测定
使用以下方案进行ATP检测。对于ATP的提取，10mg的回肠粘膜用1.0mL的冰冷的TE饱和苯酚(Sigma-Aldrich)匀浆。加入200μL的氯仿和150μL的去离子水的混合物并且将匀浆彻底震荡20s并且在4℃在10,000g离心5分钟。将来自上清的等分部分用去离子水稀释100倍，并且将10μL的稀释的提取物通过ATP测定试剂盒(Invitrogen Corp.)测量(Chida等人，Analytica Chimica Acta 727：8-12(2012)。
Tempol，杆菌肽，新霉素和链霉素购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。胆汁酸从Steraloids，Inc.(Newport，RI)和Sigma(St.Louis，MO)订购，并且牛磺胆酸-d5钠盐来自Toronto Research Chemicals Inc.(Toronto，Ontario)。神经酰胺获自Avanti PolarLipids。HFD(60千卡％脂肪)购自Bio-Serv(Frenchtown，NJ)。T-β-MCA和Gly-MCA如根据图41中所示和实施例1所述的方案合成。所有溶剂和有机试剂是可获得的最高等级的。
动物研究
高脂肪饮食(HFD)(60％千卡由脂肪组成)购自Bioserv.Inc。肠-特异的Fxr-失效(FxrΔIE)小鼠和野生型(Fxrfl/fl)小鼠具有C57BL/6N遗传背景。Fxrfl/fl和FxrΔIE(Kim等人，J.Lipid Res.48:2664-2672，2007)小鼠与C57BL/6N小鼠回交超过10代。对于抗生素(杆菌肽，新霉素和链霉素的组合)研究，雄性C57BL/6N小鼠从6周龄开始喂食高脂肪饮食(“HFD)并且施用饮用水中的0.1％(w/v)的各个化合物(杆菌肽，新霉素和链霉素的组合)。对于tempol研究，雄性C57BL/6N小鼠从6周龄开始喂食HFD并施用饮用水中的0.064％(w/v)tempol。对于体内TβMCA，雄性C57BL/6N小鼠从6周龄开始喂食HFD并且用抗生素(0.1％的杆菌肽，新霉素，和链霉素组合的各个化合物)处理3天。将赋形剂(盐水)，TCA(400mg/kg体重，溶解于盐水)或TCA和TβMCA的组合(400mg/kg体重的各个化合物，溶解于盐水)口服施用给小鼠并且在12h后第二次剂量给药。2h后处死小鼠，收集组织。对于Gly-MCA研究，定制合成Gly-MCA。如所述的制备熏肉风味的面团丸(Walker等人，Toxicol.Appl.Pharmacol.260:65-69，2012)，用于口服施用Gly-MCA(0.25mg Gly-MCA/丸，10mg/kg的剂量)。训练小鼠食用面团丸，然后研究。为了预防肥胖、胰岛素抗性和NAFLD，为6-至8-周龄的雄性野生型(WT)C57BL/6N小鼠，从6周龄开始喂食高脂肪饮食(Bio-Serv，Frenchtown，NJ；60千卡％脂肪)，并口服施用赋形剂(对照丸)或Gly-MCA(0.25mg/丸/天，剂量10mg/kg)。给喂食高脂肪饮食达12周的C57BL/6N小鼠施用(0.25mg Gly-MCA/丸，5mg/kg的剂量)。给喂食饲料(chow)的6-至8-周龄的瘦蛋白缺陷的db/db小鼠施用Gly-MCA(0.25mg/丸/日，10mg/kg)。将小鼠分别安置在它们的笼内。在6至7周的HFD的赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠中测量累积的食物摄取和TEEbal达1周。如前所述测量TEEbal(Ravussin等人，Int.J.Obesity 37:399-403，2013)。
所有动物研究根据由NCI动物护理及使用委员会(NCI Animal Care and UseCommittee)批准的实验动物资源研究所(Institute of Laboratory Animal Resources)指导原则进行。
原代肝细胞的制备和培养
来自6-周龄C57BL/6N小鼠的原代肝细胞通过胶原酶1(Invitrogen，Carlsbad，CA)灌注获得。将细胞通过45％Percoll(Sigma，St.Louis，MO)密度离心纯化并且在具有10％胎牛血清和1％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养。肝细胞的存活力使用台盼蓝染料排除确定，并且使用具有高于85％存活力的那些。在培养4小时后将培养基改为具有1％胎牛血清的DMEM。饥饿4小时后，将细胞暴露于神经酰胺。在预定的时间点，收获细胞并且进行qPCR分析和TG含量检测。
RNA分析
轻轻地刮下肠的粘膜并且取肝，并且将二者快速冷冻在液氮中并且储存在-80℃，直到制备RNA。从冷冻的肠和肝，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取RNA。从1μg总RNA使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)合成cDNA。利用qPrimerDepot设计qPCR引物。将测量的mRNA水平相对于18S核糖体RNA的那些标准化，并且表达为相对于对照组的那些的倍数变化。
蛋白质印迹分析
制备肝全细胞或核提取物。将膜与针对FXR的抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，针对SREBP1的抗体(BD Biosciences，San Jose，CA)，和针对CIDEA的抗体(Abcam，Cambridge，MA)孵育。将获得的信号相对于全细胞提取物的β-肌动蛋白(Abcam)和核提取物的LAMIN A/C(Santa Cruz)标准化。
肠微生物群系的16S rRNA基因测序
粪便和盲肠内容物中的细菌使用PowerSoil DNAIsolation试剂盒(Mo Biolaboratory，Inc.，Carlsbad，CA)提取。PCR产物(大约1000bps)，使用Agencourt AMPuretechnology(Beckman Coulter，Brea，CA)，如454Technical Bulletin#2011-002，短片段去除程序(Short Fragment Removal Procedure)中所述的纯化。纯化后，产物通过Qubit(Lifetech，Carlsbad，CA)和qPCR二者，使用KAPABiosystems Library定量试剂盒(KapaBiosystems，Woburn，MA)定量，基于摩尔量汇集，在1％琼脂糖凝胶上运行并提取。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia，CA)纯化后，使用在Agilent2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上的DNA7500LabChip和Qubit定量评价质量和数量。使用四分之一PTP板在454Life Sciences基因组测序仪FLX+(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)上进行测序。16S rRNA基因测序分析如在前所述进行(Lozupone和Knight，Appl.Environ.Microbiol.71:8228-8235，2005)。在Galaxy基于网络的平台上进行加权的UniFrac分析以评价细菌丰度的改变(Blankenberg等人，Bioinformatics 26:1783-1785，2010；Goecks等人，Genome Biol.11：126，2010；Giardine等人，Genome Res.15:1451-1455，2005)。
宏基因组学数据分析
质量过滤和重复数据删除后，各个样品含有平均11,000个读值。Mothur软件包用于预处理测序数据并且RDP多重分类器用来将各个序列分配到分类的层级。预处理由对20的平均质量进行过滤读值，去除重复序列和通过条形码分开样品同时允许条形码中的一个错配组成。为了说明每个样品的总的读值的差异，将分类转变为总读值的百分数。然后将该方法在组内和组间精确比较。
代谢组学分析
脂类组学分析：对于血清脂类组学分析，通过含有作为内标的2μM LPC(17:0)，PC(17:0)，SM(17:0)和CER(17:0)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)的4-倍的冷氯仿：甲醇(2:1)溶液提取25μl血清。将样品涡旋30s并且随后在室温静置5分钟。将混合物在13,000rpm离心5min并且随后收集下层有机相并在室温在真空下蒸发。将残留物溶解于氯仿：甲醇(1:1)，然后用含有2μM PC(17:0)的异丙醇：乙腈：H2O(2:1:1)稀释，之后UPLC-MS分析。对于组织脂类组学分析，将约50mg的精确称量的组织用700μL甲醇：H2O(4:3)溶液匀浆并随后使用800μL含作为内标的2μM LPC(17:0)，SM(17:0)和CER(17:0)的氯仿提取。将匀浆在37℃孵育20分钟，然后在13,000rpm离心20分钟。将下层有机相转移至新的管中并在真空下干燥。将残留物用100μL氯仿：甲醇(1:1)溶液悬浮并随后用含2μM PC(17:0)的异丙醇：乙腈：H2O(2:1:1)溶液稀释，之后注射。对于脂类组学发现，将样品通过UPLC-ESI-QTOF MS，使用Water Acquity CSH 1.7um C18柱(2.1x100mm)，在以下条件分析：UPLC：A-乙腈/水(60/40)，B-异丙醇/乙腈(90/10)。A和B二者都含有10mM乙酸铵和0.1％甲酸。梯度：初始的60％A至2分钟时的57％A，至2.1分钟*时的50％A，至12分钟时的46％A，至12.1分钟*时的30％A，至18分钟时的1％A，之后在18.5分钟时回到初始条件，平衡另外2分钟(*表示激增的梯度)。流速是0.4ml/min。柱温度维持在55℃。MS，与上述相同的条件，除了运行时间为18分钟以外。
整体代谢组学分析：尿样品通过将20μL的尿加入180μL 50％乙腈水溶液(50:50水/乙腈)中来制备。将样品涡旋5分钟并在18000×g在4℃离心20分钟以去除微粒和沉淀的蛋白。将上清转移到自动采样瓶中用于分析。将50mg组织样品在500mL含有5μM氯磺丙脲(内标)的50％乙腈水溶液中匀浆。将样品涡旋并在在13,000rpm在4℃离心20分钟以去除微粒和沉淀蛋白。将上清转移到自动采样瓶中用于分析。对于代谢组学的发现，5μl上清样品等分部分注射入具有Waters Acquity BEH 1.7um C18(2.1x50mm)柱的UPLC-ESI-QTOFMS系统(Waters，Milford，MA)。梯度流动相包含水中的0.1％甲酸(A)和乙腈中0.1％甲酸(B)。将梯度维持在初始95％A达0.5分钟，至在4分钟时的40％A，并且随后至在8分钟时的1％A。将柱冲洗1min，然后在初始条件下平衡1.5min。流速是0.5ml/min。柱温度维持在60℃。WatersSynapt HDMS Q-TOF在正和负模式下进行，扫描50-850amu，以0.3次扫描/秒的速率。使用以下仪器条件：毛细管3kV，来源温度120℃，采样小凹(cove)30V，脱溶剂气流850L/h，在400℃。生物标志物识别和定量：通过分析负载散点图中的离子筛选生物标志物，并且检索代谢组学数据库(METLIN和Madison代谢组学数据库)以找到可能的候选物。为了确认推定的标志物的特性，基于MS/MS片段化模式和保留时间将可信的标准与代谢物相比较。代谢物的浓度通过通过反应监控质谱，基于标准曲线，使用可信标准确定。
数据处理和多元数据分析
色谱和光谱数据通过MarkerLynx软件(Waters)解析(deconvoluted)。通过质心算法，去同位素化(deisotoping)，过滤，峰识别和积分产生含有样品特性，离子特性(保留时间和m/z)，和离子丰度的信息的多元数据矩阵。各个离子的强度通过将单个离子相对于整个色谱图中的总离子数标准化来计算。进一步将数据矩阵输出到SIMCA-P软件(Umetrics，Kinnelon，NJ)中并且通过均值中心化(mean-centering)和佩瑞多换算(pareto scaling)转变，其是增加低丰度离子的重要性而不显著扩大噪声的技术。建立包括主成分分析(PCA)，偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)，以及正交投影与潜在结构-判别分析(OPLS-DA)的统计模型以表示数据矩阵中主要的潜在变量。
基于NMR-的代谢组学实验
甲醇，K2HPO4，NaH2PO4(所有都是分析级的)，3-三甲基甲硅烷基[2,2,3,3-d4]丙酸钠(TSP-d4)和D2O(99.9％在D中)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。因为其良好的可溶性和低温稳定性，利用K2HPO和NaH2PO4制备磷酸盐缓冲液(0.1M K2HPO4/NaH2PO4并且PH 7.4)。用0.6mL 600μL预冷的甲醇-水混合物(2/1，v/v)，使用PreCellys组织匀浆器(BertinTechnologies，Rockville，MD)提取肝样品(～50mg)三次。在4℃在11180x g离心10分钟后，将合并的上清干燥。将各个水性提取物分开在600μL含有50％D2O和0.005％TSP-d4(化学位移参照)的磷酸盐缓冲液中恢复。离心后，将550μL的各个提取物转移到5mm NMR管中。使用在前描述的优化的步骤直接提取盲肠内容物样品(Wu等人，2010)。简言之，将样品(～50mg)与600μL预冷的磷酸盐缓冲液混合，涡旋30s并且进行三次连续冻融，然后使用PrecellysTM组织匀浆器进行匀浆。离心(11,180x g，4℃)10min后，将上清(550μL)转移到5mm用于NMR分析的NMR管中。
1H NMR谱学
在298K在装有Bruker反向低温探针(Bruker Biospin，Germany)的Bruker AvanceIII 850MHz分光计(对于1H在850.23MHz操作)上记录水性肝和粪便的提取物的1H NMR谱。对于所有样品中的每一个，使用NOESY脉冲序列(NOESYPR1D)的第一增量获得典型的一维NMR谱。为了抑制水信号，在循环延迟(2s)和混合时间(100ms)期间将弱的连续波辐射应用于水峰。对于各个样品，将90°脉冲宽度调节至大约10μs，并且对于各个谱，将64个瞬时收集在32k数据点中，谱宽为20ppm。为了促进NMR信号分配，获得一系列2D NMR谱，并且对选择的样品如前所述加工(Dai等人，2010；Ding等人，2009)，包括1H-1H关联能谱法(COSY)，1H-1H总关联能谱法(TOCSY)，1H-13C异核单量子关联(HSQC)，和1H-13C异核多键关联谱(HMBC)。
谱数据加工和多元数据分析
所有自由感应衰减(FID)以指数函数，以1Hz线扩张因子增加，之后傅里叶变换。对于相和基线失真，手动校正1H NMR谱，并且使用AMIX软件包(V3.8，Bruker-Biospin，Germany)将谱区域δ0.5-9.5以0.004ppm的等宽(2.4Hz)结合入区域中。区域δ4.45-5.20以不完美的水饱和度抛弃。对于小鼠解剖过程中盲肠内容物中的乙醇污染，也去除区域δ1.15-1.23和δ3.62-3.69。各个桶状(bucketed)区域随后相对于谱积分的总和标准化，以补偿总体浓度差异，之后统计数据分析。
利用SIMCAP+软件(版本13.0，Umetrics，Sweden)进行多元数据分析。主成分分析(PCA)最初在NMR上进行以产生概览和评价数据质量。随后在NMR数据上进行正交投影与潜在结构判别分析(OPLS-DA)。使用7-倍交叉核实方法确认OPLS-DA模型，并且模型的质量通过参数R2X和Q2值描述。为了促进结果的解释，进行由OPLS-DA产生的负载的反转换(Cloarec等人，Anal.Chem.77:517-526，2005)，之后产生负载曲线，使用内部开发的用于MATLAB(The Mathworks Inc.；Natwick，MA)的脚本，将其用变量(或代谢物)的Pearson线性关联系数颜色编码。在该研究中，选择基于判别差异对于相关系数选择|r|>0.811(r>0.755和r<-0.755)的截取值(cutoff value)为显著的(p≤0.05)。
胆汁盐水解酶活性
使用超声从pH 7.4磷酸盐缓冲的盐水(PBS，5.0mL)中的粪便样品(0.5g)制备粪便的蛋白。基于从粪便中的TCDCA的CDCA的产生测量胆汁盐水解酶(BSH)活性。简言之，在200μL的终体积中含有0.1mg/ml粪便的蛋白和50μM TCDCA-d5的3mM乙酸钠缓冲液，pH 5.2中进行孵育。在37℃孵育20分钟后，通过将样品插入干冰中来终止反应。将100μL的乙腈直接加入反应混合物中。在14,000x g离心20min后，将5μL的上清转移到自动采样瓶中，通过偶联有XEVO三重四极杆串联质谱仪的UPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA)进行分析。
线粒体分离和功能研究
对于肠线粒体，轻轻刮下回肠的粘膜，用PBS洗涤2X，在含有0.2％BSA的冰冷的线粒体匀浆缓冲液(225mM甘露醇，75mM蔗糖，5mMMOPS，0.5mM EGTA和2mM牛磺酸(pH 7.25))中搅碎，并且在松配合的匀浆器中匀浆。将匀浆在500xg在4℃离心10分钟。然后将上清在10,000xg在4℃离心10分钟。将最终线粒体沉淀以0.5mg/ml的浓度重悬在含有0.2％BSA的线粒体分离缓冲液，之后进行功能评价。
在25℃在与Clark-型O2电极(Instech)和O2监测仪(Model 5300，YSI Inc)连接的小室中测量分离的线粒体的氧消耗。将线粒体在呼吸缓冲液(120mM KCl，5mM MOPS，0.1mMEGTA，5mM KH2PO4和0.2％BSA)中与用于复合物I(5mM谷氨酸盐和5mM苹果酸盐)，或复合物II(5mM琥珀酸盐和1μM鱼藤酮)的底物孵育。在加入1mM ADP后测量状态3(最大)呼吸活性。加入2μM寡霉素后监测依赖性的呼吸活性(状态4)中的ADP。通过状态3/状态4呼吸比率确定呼吸控制比率。
组织学分析
使用标准方案在福尔马林固定的石蜡切片上进行苏木精和伊红(H&E)染色。使用标准方案在冷冻肝切片上进行油红O染色。对于每只小鼠，评价至少三个不连续肝切片。
甘油三酯含量定量
使用2:1氯仿-甲醇溶液提取肝脂。利用甘油三酯比色测定试剂盒，根据制造商的建议(Bioassay Systems，Hayward，CA)测量肝甘油三酯。
细胞培养
按照之前描述的方法将Caco-2(ATCCTMHTB-37TM)细胞诱导分化(Ferraretto等人，Anticancer Res.27:3919-3925，2007)。将分化的Caco-2细胞用具有1％胎牛血清的DMEM培养基孵育8小时，并随后暴露于Gly-MCA/CDCA/GW4064达24小时。使用TRIzol试剂(Invitrogen)从冷冻的肠提取RNA。从1μg总RNA使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)合成cDNA。
通过肠道细菌Gly-MCA羟基化
从pH 7.4PBS(5.0ml)中的粪便的样品(0.5g)使用超声制备粪便的蛋白。在200ml终体积的中的含有0.1mg/ml粪便的蛋白和50μM Gly-MCA或T-β-MCA的3mM乙酸钠缓冲液，pH5.2中进行孵育。在37℃20-min孵育后，将样品插入干冰中以终止反应。将100μL甲醇直接加入到100ml反应混合物中。在14,000g离心20min后，将5ml的上清转移到自动采样瓶中，通过偶联有XEVO三重四极杆串联质谱仪的UPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA)进行分析。
动物研究
高脂肪膳食(HFD)(60％千卡由脂肪组成)购自Bioserv.Inc。Gly-MCA定制合成。
如所述的(Walker等人，Toxicol.Appl.Pharmacol.260:65-69，2012)制备熏肉风味的面团丸，用于口服施用Gly-MCA(0.25mg Gly-MCA/丸)。训练小鼠食用面团丸，然后研究。
为6-至8-周龄的雄性野生型(WT)C57BL/6N小鼠，从6周龄开始喂食HFD(Bio-Serv，Frenchtown，NJ；60千卡％脂肪)，并口服施用赋形剂(对照丸)或Gly-MCA(0.25mg/丸/天，10mg/kg)。将小鼠分别安置在它们的笼内。在6至7周的HFD的赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠中测量累积的食物摄取和TEEbal达1周。如前所述测量TEEbal(Ravussin等人，Int.J.Obesity37:399-403，2013)。所有动物研究根据由NCI动物护理及使用委员会(NCI Animal Careand Use Committee)批准的实验动物资源研究所(Institute of Laboratory AnimalResources)指导原则进行。
代谢测定
对于葡萄糖耐量试验(GTT)，将小鼠禁食16h，抽血，并且将小鼠用1g/kg葡萄糖腹膜内(i.p.)注射。对于胰岛素耐量试验(ITT)，将小鼠禁食4h，抽血，并且随后用胰岛素(EliLilly，Washington，DC)，通过腹膜内，以1U/kg体重的剂量注射。在注射后15，30，60，和90分钟采集血液样品，并且使用血糖测试仪(Bayer，Pittsburgh，PA)测量葡萄糖。
实施例1
该实施例表明，牛磺-β-鼠胆酸(TβMCA)在原代小鼠肝细胞中拮抗由牛磺胆酸(TCA)导致的FXR激活。
将来自Fxr+/+和Fxr-/-小鼠的原代肝细胞用PGL4-Shp-TK萤火虫荧光素酶构建体和对照质粒phRL-SV40转染。24h后，将细胞用100μM牛磺胆酸(TCA)，TβMCA，或TβMCA与TCA处理。裂解细胞，并且如本文所述测量荧光素酶活性。结果描述在图1中。
如在图1中所述的结果中显而易见的，TβMCA在来自Fxr+/+小鼠的原代肝细胞中拮抗由TCA导致的FXR激活，但在来自Fxr-/-小鼠的原代干细胞中不是如此。
实施例2
该实施例表明，TβMCA在Caco-2细胞中拮抗由TCA导致的FXR激活。
Caco-2细胞用PGL4-Shp-TK萤火虫荧光素酶构建体，对照质粒phRL-SV40，和人FXR以及人ASBT表达质粒转染。24h后，将细胞用100μM TCA，TβMCA，或TβMCA以及100μL 100μMTCA处理。裂解细胞，并且如本文所述测量荧光素酶活性。结果描述在图2中。
如在图2中所述的结果中显而易见的，TβMCA在Caco-2细胞中拮抗由TCA导致的FXR激活。
实施例3
该实施例表明，与Fxrfl/fl小鼠相比，在14周的高脂肪膳食后，在FxrΔIE小鼠中，小鼠回肠粘膜中的ATP水平显著升高。
将两个分开的组的Fxrfl/fl小鼠和FxrΔIE小鼠保持高脂肪膳食达14周。如本文中所述测定两组中的小鼠的回肠粘膜中的ATP水平。结果描述在图3中。
如在图3中所述的结果中显而易见的，与表达肠FXR的对照Fxrfl/fl小鼠的回肠粘膜中的ATP水平相比，在肠中不表达法尼醇X受体(FXR)的FxrΔIE小鼠的回肠粘膜中的ATP水平显著上升。这些结果表明，在不存在核受体FXR的情况下，在小肠中发生增加的能量消耗。
实施例4
该实施例表明，甘氨酸-β-鼠胆酸(Gly-MCA)是FXR拮抗剂。
小鼠在肝中产生TβMCA，而人优先产生Gly-MCA。因此，感兴趣的是确定Gly-MCA是否也是FXR拮抗剂。鹅去氧胆酸(CDCA)，一种FXR激动剂，在100μM的剂量，四倍增加Fxr靶基因Shp mRNA的表达，并且用CDCA诱导Shp mRNA被Gly-MCA以剂量依赖的方式抑制(图4)。Gw4064，一种合成的FXR激动剂，在2μM和5μM浓度诱导FXR靶基因Shp和Fgf19的表达，并且两种基因的诱导由Gly-MCA以剂量依赖的方式阻断(图5和6)。此外，Gw4064处理抑制Atp5gmRNA表达并且Gly-MCA反转这种抑制(图7)。这些数据表明在人中产生的Gly-MCA是与TβMCA类似的FXR拮抗剂。
实施例5
该实施例表明tempol对高脂肪饮食处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的体重的影响。
将赋形剂和tempol-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠维持高脂肪饮食达10周。图11描述了在高脂肪饮食喂食10周后，赋形剂和tempol-处理的Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠的以克计的体重增加。
如在图11中所述的结果中显而易见的，tempol处理Fxrfl/fl小鼠导致增重，其比赋形剂处理的小鼠呈现的增重少大约65％。Tempol处理FxrΔIE小鼠(小肠特异的Fxr-无效小鼠)，导致不显著的增重的差异，由此暗示，肠FXR介导由tempol导致的喂食高脂肪饮食的小鼠的较少增重。
实施例6
该实施例表明肠FXR在脂和葡萄糖代谢中的作用。
给雄性Fxrfl/fl和FxrΔIE小鼠喂食高脂肪膳食，表明FxrΔIE小鼠对高脂肪膳食-诱导的肥胖有抗性。使用Echo 3合1NMR分析仪(Echo Medical Systems，Houston，TX)在未麻醉的小鼠中测量以克计的和作为体重的百分数的脂肪重量，并且结果描述在图12中。结果显示，Fxrfl/fl小鼠的脂肪重量以及脂肪和体重的比率高于FxrΔIE小鼠。葡萄糖耐量试验(GTT)表明，与Fxrfl/fl小鼠相比，FxrΔIE小鼠具有改善的葡萄糖耐受，其描述在图13中，其显示作为时间的函数的血液葡萄糖(以mg/dL计)的曲线下面积。在图14中描述的胰岛素耐量试验(ITT)表明，与Fxrfl/fl小鼠相比，FxrΔIE小鼠中的胰岛素敏感性显著增加。此外，与Fxrfl/fl小鼠相比，FxrΔIE小鼠中的空腹血清胰岛素水平和HOMA显著增加，而空腹血糖在两组小鼠中大约相同，如图15中所描述。
实施例7
该实施例表明，tempol通过抑制乳酸杆菌属影响胆汁酸稳态。
通过以正常饮食填喂(250mg/kg)小鼠，5天的tempol处理后，在小鼠盲肠中观察到肠道微生物群系组成中从硬壁菌门至拟杆菌门的显著的门水平的转变。16S rRNA测序的热图(Heat map)直方图表明，tempol处理显著降低乳杆菌科(Lactobacillacieae)。发现，tempol处理强烈降低乳酸杆菌属。与通过填喂的急性处理的结果类似，获自高脂肪膳食的小鼠的怀疑的粪便微生物的qPCR分析表明，在赋形剂和tempol处理的小鼠之间，总细菌保持不变，而tempol处理引起从硬壁菌门向拟杆菌门的转变，如图16中所描述。这些结果表明，tempol对肠道微生物群系的影响不依赖于膳食和肥胖状况。此外，乳杆菌科的乳酸杆菌属减少，同时粪便中胆汁盐水解酶(BSH)酶活性显著下调，如图17中所描述。胆汁盐水解酶(BSH)将肝中产生的牛磺酸-缀合的胆汁酸去缀合为胆汁酸。
这些结果表明tempol通过抑制乳酸杆菌属影响胆汁酸稳态。
实施例8
该实施例表明使用合成的激动剂Gw4064和改变剂量的TUDCA，TωMCA，TβMCA，TαMCA的人FXR竞争测定的结果。将结果相对于Renilla表达标准化。
将HEK293T细胞用以下各项共转染：1)嵌合受体构建体，其中将人FXR(含有天然配体-结合结构域和AF2转录激活结构域)的羧基末端部分融合于在组成型活性SV40启动子的调节控制下的GAL4DNA-结合结构域的氨基末端；2)萤火虫荧光素酶报告质粒，其由UASGAL4DNA应答元件驱动；和，3)Renilla荧光素酶报告基因(pRL-荧光素酶；Promega；Madison，WI)，作为转染效率对照。使用Dual荧光素酶报告子测定试剂盒(Promega Corp.，Madison，WI)和Tecan GeniosPro发光板读数器(Research Triangle Park，NC)进行荧光素酶检测。结果在图18中说明。
如在图18中所说明的结果中显而易见的，所有的胆汁酸缀合物TUDCA，TωMCA，TβMCA，和TαMCA在合成的激动剂Gw4064的存在下抑制FXR。
实施例9
该实施例表明，tempol带来的肠道微生物群的改变与NAFLD相关。
高脂肪饮食(HFD)广泛地用作用于NAFLD的小鼠模型。在正常膳食条件下，抗氧化剂tempol选择性地调节肠道微生物群组成和代谢(Li等人，Nat.Commun.4：2384，2013)。在确定在HFD-诱导的NAFLD模型中tempol是否改变肠道微生物群系的尝试中，进行16S rRNA基因测序分析。加权的UniFracTM分析显示分离自HFD达12周的赋形剂和tempol-处理的组的盲肠群落的不同聚类。主坐标1(PC1)说明56.08％的变化，表明在HFD达12周的小鼠中，tempol比赋形剂对微生物群组成具有更强的影响(图19A)。主成分分析曲线中样品的分离反映出显著减少的硬壁菌门和显著增加的变形菌门的丰度差异。脱硫弧菌属(genusDesulfovibrio)被认为是增加的变形菌门的主要成因(图19B)，发现其在肥胖受试者中显著较低(Karlsson等人，Obisity 20:2257-2261，2012)。观察到罗斯氏菌(Roseburia)属的显著增加(图19C)，其与狗的体重负相关(Handi等人，FEMS Microbiol.Ecol.84332-343，2013)。在tempol-处理的小鼠中，狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)和乳酸杆菌属水平也显著减少，而拟杆菌属和链球菌属水平仍然相似(图19D-G)。
为了鉴定尿中肠道微生物群相关标志物，使用基于超高效液相色谱加上电喷雾电离四极杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-QTOFMS)的代谢组学分析。来自小鼠尿的UPLC-ESI-QTOFMS负模式数据的PCA建模表明tempol和对照组之间的明确区别(图20A)。荷载散点图分析表明，两种化合物，对甲酚硫酸酯(m/s 187.0060，保留时间2.61min)和对甲酚葡萄糖苷酸(m/s283.0812，保留时间3.04min)在tempol-处理组的尿中显著降低(图20B和C)。这些化合物的身份通过MS/MS分析确认(图20D)。这些结果表明，tempol在HFD达14周的小鼠中重建肠道微生物群组成并且改变肠道微生物群-相关的代谢标志物。与tempol处理模型具体调节肠道菌群的结果类似，代谢组学分析表明，对甲酚硫酸酯和对甲酚葡萄糖苷酸的尿水平在抗生素-处理的HFD达14周的小鼠中几乎没有(图21A-C)。在肠道微生物群组成和相关代谢物改变后，肝组织学显示出在tempol-处理的HFD达16周的小鼠和抗生素-处理的HFD达7周的小鼠中肝脂滴的显著降低(图22A和B，和图23A)。Tempol处理和抗生素处理(其还改变肠道微生物群组成)，分别降低肝重和肝/体重比率(图22C和D，图23A和B)。在用抗生素和tempol处理的小鼠中，肝甘油三酯(TG)含量分别降低至大约50％和35％(图22E和图23D)。
实施例10
该实施例表明，肠道微生物群改变胆汁酸代谢并且影响FXR信号转导。
肠道微生物群与胆汁酸代谢密切相关。采用基于UPLC-ESI-QTOFMS的代谢组学分析确定肠中胆汁酸组成和胆汁酸代谢物水平。来自小鼠回肠的UPLC-ESI-QTOFMS负模型数据的PCA模型的得分散点图显示赋形剂和抗生素组织间的差异代谢分布(图24A)。上部富集的代谢物，TβMCA(m/z514.2871，保留时间＝6.64min)，在抗生素-处理的HFD达7周的小鼠中增加，如根据前述方法在负载散点图(图24B)中显示的；该增加与用tempol处理所观察到的类似(Li等人，J.Proteome Res.，12:1369-1376，2013)。回肠胆汁酸组成分析表明，在抗生素处理后，牛磺酸-缀合的胆汁酸TβMCA的水平显著增加(图25A)。从tempol-处理的HFD达16周的小鼠获得类似结果(图25B)。肠道微生物群可以通过微生物酶活性改变胆汁酸组成。胆汁盐水解酶(BSH)(一种水解牛磺酸-缀合的胆汁酸为游离胆汁酸的细菌酶)的活性，在抗生素-处理的HFD达7周的小鼠中大大降低(图26A)。这可能在抗生素-和tempol-处理的HFD(其是TβMCA，一种FXR拮抗剂)的小鼠的回肠中引起最显著富集的胆汁酸(Li等人，J.ProteomeRes.，12:1369-1376，2013；Sayin等人，Cell Metab.225-235，2013)。蛋白质印迹和qPCR分析表明，12周的HFD处理显著诱导回肠中FXR蛋白水平(图26B)和FXR信号转导，如通过FXR靶基因，小的异二聚体伙伴(Shp)和成纤维细胞生长因子15(Fgf15)mRNA的mRNA的增加所表明的(图26C)。相反，抗生素处理降低Shp和Fgf15 mRNA，表明FXR信号转导在回肠中被抑制(图26D)。关于TβMCA是否抑制HFD处理的小鼠中的体内FXR信号转导，产生疑问。在用抗生素处理的HFD达三天的小鼠的回肠中，TβMCA处理显著钝化通过FXR激动剂TCA导致的Shp和Fgf15诱导(图26E)。这些结果表明，作为较低的细菌BSH活性(其在HFD-喂食的小鼠的回肠中抑制FXR信号转导)的结果，抗生素和tempol二者的处理，主要通过增加TβMCA调节胆汁酸组成。
实施例11
该实施例表明，肠-特异的Fxr破坏在高脂肪饮食喂食的小鼠中降低肝脂积累。
为了进一步明确肠FXR在NAFLD的发展中的作用，将肠-特异的Fxr-无效(FxrΔIE)小鼠用HFD处理14周。肝切片的H&E染色和油红O染色显示与野生型(Fxrfl/fl)小鼠相比，在FxrΔIE小鼠的肝中脂积累的显著减少(图27A和B)。FxrΔIE小鼠显示显著降低的肝重和肝重比率(图27C)。该肝重变化主要由于与Fxrfl/fl小鼠相比，在HFD达14周，在FxrΔIE小鼠中肝的甘油三酯(TG)水平低50％(图27D)。机制研究表明，线粒体电子传递链(ETC)复合物II相关的基因如琥珀酸酯脱氢酶复合物，亚单位D，完整膜蛋白(Sdhd)，复合物III相关的基因如细胞色素c1(Cyc1)，复合物IV相关的基因如线粒体编码的细胞色素c氧化酶II(mt-Co2)，细胞色素c氧化酶亚单位IV同种型1(Cox4i1)，细胞色素c氧化酶亚单位Va(Cox5a)，ATP合酶，H+转运，线粒体l F0复合物，亚单位C1(亚单位9)(Atp5g)和ATP合酶，H+转运，线粒体l F0复合物，亚单位D(Atp5h)的表达，在FxrΔIE小鼠的回肠上皮中升高(图28A)。从抗生素-处理的小鼠获得类似结果(图28B)。随后，与Fxrfl/fl小鼠相比，在FxrΔIE小鼠的回肠线粒体中，复合物II的活性增加大约70％并且复合物I的活性无显著升高(图28C)。FxrΔIE小鼠中的回肠ATP水平也显著高于Fxrfl/fl小鼠(图28D)。游离脂肪酸与肝性脂肪变性的发展密切相关(Donnelly等人，J.Clin.Invest.115:1343-1351，20052005)。然而，血清脂类组学表明，一小组种类的游离脂肪酸在赋形剂-和tempol-处理的FxrΔIE小鼠和Fxrfl/fl小鼠中水平相似(图29A)。LC-MS/MS定量确认，回肠C16:0，C18:0，C20:0，C22:0，C24:0和C24:1神经酰胺水平在抗生素-处理的HFD达7周的小鼠中显著降低(图29B)。因此，抗生素-处理的小鼠中的血清C16:0，C18:0，C20:0，C24:0和C24:1神经酰胺水平也显著低于赋形剂-处理的小鼠的(图29C)。各个神经酰胺的身份通过LC-MS碎片谱法确认(图30A-G)。此外，编码重新神经酰胺合成-相关的基因，如丝氨酸棕榈酰转移酶，长链碱基亚单位3(Sptlc3)，神经酰胺合酶4(Cers4)，变性精母细胞同系物1(Degs1)，和神经鞘磷脂磷酸二脂酶3(Smpd3)的肠mRNA在FxrΔIE小鼠和抗生素-处理的小鼠中显著衰减(图29C和D)。神经酰胺合酶2(Cers2)mRNA水平在抗生素-处理的小鼠中显著降低，并且在FxrΔIE小鼠中具有降低的趋势(P＝0.06)。参与神经酰胺分解代谢的基因如神经鞘磷脂合酶1和2(Sgms1和Sgms2)，和碱性神经酰胺酶1和3(Acer1和Acer3)的表达在FxrΔIE小鼠和抗生素-处理的小鼠中仍然类似(图29C和D)。
实施例12
该实施例表明，神经酰胺调节肝中SREBP1c-CIDEA通路。
为了在神经酰胺水平的降低和NAFLD的改善之间建立因果关联，将HFD的小鼠用抗生素处理短的时期。三天的抗生素处理不降低肝中甘油三酯含量(图31A)。随后，FXR信号转导通路被抑制，如通过降低的FXR靶基因Shp和Fgf15 mRNA的表达所表明的(图31B)。早至抗生素处理后3天，抗生素-处理的小鼠的回肠中的神经酰胺水平显著降低(图31C)。这些结果表明，神经酰胺可能是NAFLD的发展的原因，而不是其结果，并且是监测NAFLD的生物标志物。在培养的原代小鼠肝细胞中进一步评价神经酰胺对NAFLD的促进。神经酰胺处理在原代肝细胞中以剂量依赖的方式诱导显著增加的甘油三酯含量(图31D)。为了阐明神经酰胺导致肝性脂肪变性的机制，测量参与肝的脂肪生成和脂肪酸氧化的基因的表达。脂肪酸合成-相关的基因如固醇应答元件结合蛋白1c(Srebp1c)，DNA片段化因子-α-样效应子a(Cidea)，极长链脂肪酸延伸蛋白6(Elovl6)和TG制剂相关的基因如二酰甘油O-酰基转移酶2(Dgat2)在原代肝细胞中由神经酰胺显著上调(图31E)。相比之下，参与脂肪酸β-氧化的基因如肉碱棕榈酰基转移酶1(Cpt1)，酰基-辅酶A氧化酶1(Acox1)，烯酰-辅酶A，水合酶/3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(Ehhadh)，和乙酰-辅酶A酰基转移酶1A(Acaa1a)的表达不受神经酰胺处理影响(图31E)。与mRNA结果一致，在2μM和10μM的神经酰胺暴露显著诱导SREBP1-N和SREBP1-N靶基因蛋白CIDEA成熟核形式的蛋白水平(图31F和G)。在体内，由肝的脂肪酸合成相关的基因Srebp1c，Cidea，脂肪酸合酶(Fasn)，和Elovl6编码的mRNA在抗生素-处理的小鼠中比赋形剂-处理的小鼠减少，并且在FxrΔIE比在Fxrfl/fl小鼠中减少(图32A和B)。涉及脂肪酸的基因的表达，与赋形剂-处理的小鼠相比，在抗生素-处理的小鼠中保持相似水平，并且与Fxrfl/fl小鼠相比，FxrΔIE小鼠中保持相似水平(图32C和D)。蛋白质印迹分析还表明，SREBP1-N和CIDEA的成熟核形式的蛋白水平在抗生素-处理的的HFD达7周小鼠的肝中显著下调(图32E和F)。速率限制酶胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)引发用于胆汁酸合成的经典通路并且在调节脂代谢中发挥重要作用。在抗生素-处理的小鼠中少量诱导Cyp7a1mRNA水平，但在tempol-处理的小鼠中不诱导(图32G和H)。此外，炎症-相关的基因如toll-样受体2(Tlr2)，toll-样受体4(Tlr4)，toll-样受体9(Tlr9)和肿瘤坏死因子α(Tnfα)，在抗生素-和tempol-小鼠中相当(图32I和J)。本研究结果表明，抑制神经酰胺代谢可能是改善抗生素-处理的小鼠中HFD-诱导的NAFLD发展的主要促进因子。
实施例13
该实施例表明，对于肠道微生物群系-介导的NAFLD进展需要抑制肠FXR。
使用FxrΔIE小鼠确定肠FXR在NAFLD进展中的作用。肝组织学表明，抗生素和tempol处理分别降低HFD达14和16周的Fxrfl/fl小鼠中的肝脂滴；在FxrΔIE小鼠中，利用这些处理未观察到肝脂的改变(图33A和B以及图34A和B)。抗生素-和tempol-处理的Fxrfl/fl小鼠的肝重和肝/体重比率显著降低，而在FxrΔIE和Fxrfl/fl小鼠中肝重和肝/体重比率类似(图33C和D，图34C和D)。肝的甘油三酯含量分析证实，抗生素和tempol处理不减轻FxrΔIE小鼠中的肝性脂肪变性(图33E和图34E)。在FxrΔIE小鼠和tempol-处理的Fxrfl/fl小鼠中，回肠和血清C16:0，C18:0，C20:0，C22:0，C24:0以及C24:1神经酰胺水平显著降低，但在FxrΔIE小鼠中不降低(图33F和G)。在FxrΔIE小鼠中，肝的脂肪酸合成相关的基因如Srebp1c，Cidea，Fasn，和Elovl6在赋形剂-处理的和抗生素-处理的小鼠之间保持不变(图34F)。此外，在tempol-处理的小鼠的肝中，SREBP1和CIDEA蛋白的成熟核形式的蛋白水平显著降低，而在用tempol处理的FxrΔIE小鼠中未注意到降低(图34G和H)。本研究结果表明，抑制肠FXR介导由抗生素和tempol处理引起的NAFLD的改善。
实施例14
该实施例表明高脂肪饮食的小鼠对tempol和抗生素处理的系统性响应。
参与氨基酸、碳水化合物和核苷酸的代谢的总共53种代谢物通过1H NMR鉴别。盲肠内容物的1D 1H NMR谱由短链脂肪酸(SCFAs)、核苷酸、寡糖和一些氨基酸控制。糖原、葡萄糖、氨基酸和核苷酸是在肝的1H NMR谱中观察到的主要的代谢物。
为了获得与不同生物样品组相关的代谢变化，在tempol或抗生素处理后，在从小鼠的盲肠内容物或肝获得的数据之间进行成对的OPLS-DA。这些模型的质量进一步通过利用针对OPLS-DA和PLS-DA模型的CV-ANOVA(p<0.05)和置换检验(200次检验)的评价来验证。与赋形剂-处理的野生型小鼠相比，tempol处理显著降低SCFA(乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯)的水平，但显著升高盲肠内容物中寡糖和葡萄糖的水平。与来自各自的对照的那些相比，从抗生素-处理的野生型小鼠的盲肠内容物中也观察到SCFA和寡糖的类似改变。然而，在tempol-处理的和赋形剂-处理的FxrΔIE小鼠之间，在盲肠内容物中未观察到SCFA和寡糖水平的显著差异。
与赋形剂-处理的野生型小鼠相比，tempol处理显著降低肝中脂和不饱和脂肪酸(UFA)的水平，而tempol处理显著升高葡萄糖，糖原，胆汁酸和一系列核苷酸代谢物(例如，尿苷，次黄嘌呤和5’-IMP)，nicotinurate，和胆碱的水平。这些观察结果与由于tempol处理导致的减少的肝中脂肪生成一致。然而，在tempol-处理后在FxrΔIE小鼠的肝中未观察到脂和葡萄糖代谢的显著改变。此外，抗生素处理显著升高肝中胆汁酸，三甲基胺氧化物(TMAO，胆碱，富马酸酯，甲酸酯，氨基酸(包括支链氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)，丙氨酸，甘氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸)，和一些核酸如次黄嘌呤，尿苷和5’-IMP的水平。与赋形剂-处理的Fxrfl/fl小鼠相比，FxrΔIE小鼠在肝中呈现较低的脂和UFA水平，但较高的牛磺酸和糖原水平。
实施例15
该实施例表明根据本发明的实施方案合成β-鼠胆酸9，甘氨酸-β-鼠胆酸(Gly-MCA)10，和牛磺-β-鼠胆酸(T-β-MCA)11。
β-鼠胆酸(β-MCA)9如图41中所示通过按照文献步骤制备(Iida T，Momose T，等人，Journal of Lipid Research，30：1267-1279(1989))。通常，在酸催化下用甲醇酯化二羟基酸1，提供定量产量的酯2。用氯酸乙酯保护位置3的羟基，提供碳酸酯3。用铬酸钾氧化6-羟基，得到定量产量的酮4。用47％HBr溶液溴化得到溴化酮5，其用NaBH4还原，得到中等产量的溴化醇6。用金属锌还原型脱溴化氢，以约80％产率提供烯烃7。用四氧化锇顺式二羟基化得到顺式二醇8，然后水解，提供定量产量的s-鼠胆酸9。将r-鼠胆酸9与甘氨酸缀合，提供甘氨酸-β-鼠胆酸(Gly-MCA)10。通过回流将甘氨酸乙酯的悬浮液与β-MCA9和EEDQ反应过夜。将准备后获得的残留物溶解于沸腾的乙醇并且用10％K2CO3水解。将水溶液酸化，得到Gly-MCA10，为白色粉末，68％产率。1H NMR(CDCl3)0.75(s，3H，18-Me)，1.01(d，3H，J＝6.5Hz，21-Me)，1.14(s，3H，19-Me)，3.44-3.56(m，2H)，3.58-3.61(m，1H)，3.91(s，2H)。
TβMCA11类似地通过与牛磺酸而不是甘氨酸缀合来从9制备。
实施例16
该实施例表明，Gly-MCA在肠中稳定。
如上所述制备粪便的提取物。将Gly-MCA(50μM)与粪便的提取物(0.1mg/mL)孵育。阴性对照是单独粪便的提取物。阳性对照是粪便的提取物(0.1mg/mL)和TβMCA酸(50μM)。将样品用UPLC分析以确定ββ-MCA(水解产物)的量并且结果显示在图35中。
通过口服灌喂以0，1，5，和50mg/kg的Gly-MCA的剂量，利用在玉米油中剂量给药的Gly-MCA，将Gly-MCA施用给小鼠。使用超高效液色谱-电喷雾串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-QTOFMS)检测Gly-MCA。结果显示在图36中。
如从图35和36中所示的结果显而易见的，Gly-MCA在肠中稳定。
实施例17
该实施例表明，用Gly-MCA处理的小鼠不发展显著的肝毒性。
对小鼠用赋形剂或Gly-MCA以1mg/kg，5mg/kg，和50mg/kg剂量给药。24h后，测定血清转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平并且结果显示在图37中。
如从图37中所示的结果显而易见的，与赋形剂相比，Gly-MCA在各个剂量不呈现显著的肝毒性。
实施例18
该实施例表明，Gly-MCA显著抑制由合成的FXR激动剂GW4064诱导的FXR活性。
将HEK293T成纤维细胞用以下各项瞬时共转染：(1)嵌合受体构建体，其中将人FXR(含有天然配体-结合结构域和AF2转录激活结构域)的羧基末端部分融合于在组成型活性SV40启动子的调节控制下的GAL4 DNA-结合结构域的氨基末端，2)萤火虫荧光素酶报告质粒，其由UAS GAL4 DNA应答元件驱动，和，3)Renilla荧光素酶报告基因(pRL-荧光素酶；Promega；Madison，WI)，作为转染效率对照。将GW4064或GW4064和Gly-MCA加入至培养基中达24h，收获细胞并且制备细胞提取物。使用Dual荧光素酶报告测定试剂盒(Promega；Madison，WI)和TecanGeniosProTM发光板读数器(Research Triangle Park，NC)进行荧光素酶检测。结果显示在图38中。
如从图38中所示结果显而易见的，Gly-MCA显著抑制GW4064诱导的FXR活性。
实施例19
该实施例表明，Gly-MCA是有效的FXR拮抗剂。
将分化的Caco-2细胞用100μM的FXR激动剂鹅去氧胆酸(CDCA)和用0，100μM，或200μM Gly-MCA处理，并且测量FXR靶基因Shp mRNA的表达。如从图39中所示结果显而易见的，CDCA引起Shp mRNA表达的4倍的增加。Gly-MCA以剂量依赖的方式抑制利用CDCA对Shp mRNA的诱导。
将分化的Caco-2细胞用0.2μM或5μM GW4064和用100μM或200μM Gly-MCA处理。将对照细胞未用任一种药剂处理。确定FXR靶基因mRNAs，Shp mRNA，Fgf19 mRNA，和Atp5gmRNA的相对表达并且结果分别显示在图40A-C中。GW4064诱导的Shp mRNA和Fgf19 mRNA的表达由Gly-MCA以剂量依赖的方式阻断(图40A和B)。GW4064处理抑制FXR靶基因Atp5g mRNA的表达并且Gly-MCA逆转所述抑制(图40C)。
实施例20
该实施例表明，由Gly-MCA抑制FXR信号转导是用于治疗肥胖、胰岛素抗性和NAFLD的有效治疗策略。
为了确定抑制肠FXR是否可以是用于高脂肪饮食(HFD)-诱导的肥胖，胰岛素抗性和NAFLD的治疗靶点，并且确认该转录因子是合适药物靶点，将HFD-处理的小鼠口服施用Gly-MCA。用HFD处理一周后，Gly-MCA处理降低体重增加(图41A和B)。与赋形剂-处理的小鼠相比，通过NMR测量的绝对脂肪重量和脂肪/瘦肉体重比，在7周的处理后，在Gly-MCA-处理的小鼠中显著降低(图41C和D)。为了探索在Gly-MCA-处理的小鼠中减少肥胖症的机制，使用能量平衡技术(TEEbal：食物能量摄取和身体组成变化)测量累积的食物摄取、能量消耗(EE)。在两组中，食物摄取相当(图44A)。与赋形剂-处理的小鼠相比，Gly-MCA处理显著增加能量消耗，其可促进减少HFD的小鼠的体重增加(图42B)。为了明确Gly-MCA在肥胖-相关的葡萄糖稳态中的作用，进行葡萄糖和胰岛素耐量测试(分别为GTT和ITT)。GTT表明，HFD激发(challenge)6周后，与赋形剂-处理的小鼠相比，在葡萄糖加载后，Gly-MCA-处理的小鼠显示显著降低的血液葡萄糖水平(图43A和B)。ITT表明，Gly-MCA处理后，胰岛素敏感度显著增加(图43C)。这些结果表明，Gly-MCA改善HFD-诱导的肥胖和胰岛素抗性。肝组织学表明，在Gly-MCA处理喂食HFD 7周后的小鼠肝脂滴的显著减少(图44A)。Gly-MCA处理降低肝重和肝/体重比率(图44B)。肝的甘油三酯含量在用Gly-MCA处理的小鼠中降低至大约51％(图44D)。这些结果表明，Gly-MCA处理保护小鼠免受HFD-诱导的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。为了排除Gly-MCA对体重和NAFLD的影响是由于非特异性毒物学效应的可能性，确定肝毒性的血清转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)生物标志物。HFD小鼠ALT和AST显著更高并且GlyMCA处理显著降低血清ALT和AST水平(图45A和B)，因此表明使用的Gly-MCA的剂量是无毒的，但实际上降低了HFD-诱导的肝毒性。NAFLD与胆汁酸代谢密切相关。采用基于UPLC-ESI-QTOFMS的代谢组学分析来确定粪便和肠中胆汁酸组成和胆汁酸代谢物的水平。来自小鼠粪便和回肠的UPLC-ESI-QTOFMS负模式数据的PCA模型的得分散点图表明赋形剂-和Gly-MCA-处理组之间不同的代谢特性(图46A和B)。顶部富集的代谢物，TβMCA(m/z 514.2871，保留时间＝6.64min)，在Gly-MCA-处理的HFD达9周的小鼠中增加，如负载散点图中所示的(图46B和47B)。在Gly-MCA处理后，粪便中T-β-MCA的水平显著增加，而TCA水平显著降低(图46C)。在Gly-MCA-处理的小鼠的回肠中，牛磺酸-缀合的胆汁酸的水平显著增加，TβMCA的水平显著增加(图46C)。在Gly-MCA处理达9周后，在粪便和回肠中，Gly-MCA水平显著增加(分别为图46D和47D)。HFD达9周的两组之间血清甘油三酯水平保持类似(图48A和B)。在Gly-MCA处理的HFD达9周的小鼠中，血清C16:0，C20:0，C22:0，和C24:1神经酰胺水平，和回肠C16:0，C18:1，和C24:0神经酰胺水平降低(图49A和B)。Gly-MCA处理降低Shp和Fgf15 mRNA，表明在回肠中FXR信号转导被抑制(图50A)。编码神经酰胺重新合成-相关的基因，如丝氨酸Sptlc3，Cers4，Degs1，和Smpd3的肠mRNA在Gly-MCA处理的小鼠中显著更低(图50B)。ShpmRNA的表达在两组之间相似，表明FXR信号转导在肝中不受影响(图51A)。在Gly-MCA-处理的小鼠中诱导Cyp7a1 mRNA水平(图51B)。因为Fgf15 mRNA水平较低，这可能促进Gly-MCA-处理的小鼠中Cyp7a1 mRNA水平的增加。在遗传诱导的肥胖的模型中，与赋形剂-处理的小鼠相比，用Gly-MCA处理6周的瘦蛋白受体-缺陷(db/db)小鼠具有降低的体重；仅一周的处理后，重量减轻显著(图52)。与赋形剂-处理的小鼠相比，如通过NMR测量的，绝对脂肪重量和脂肪/瘦肉体重比，在6周的Gly-MCA处理后，在Gly-MCA-处理的db/db小鼠中显著降低(图53A和B)。肝组织学表明Gly-MCA处理后肝脂滴的显著降低(图54A)。Gly-MCA处理降低肝重和肝/体重比率(图54B和C)。在用Gly-MCA处理的小鼠中肝TG含量大大改善(图54D)。Gly-MCA处理显著降低血清ALT和AST水平(图55A和55B)，因此表明，使用的Gly-MCA的剂量是对db/db小鼠无毒的并且在该小鼠模型中降低肝毒性。在Gly-MCA处理后，在粪便和回肠中T-α-MCA和TβMCA的水平显著增加(图56A和56B)。回肠中Gly-MCA的积累远大于肝、粪便、和血清中(图56C)。在6周的Gly-MCA处理后，血清甘油三酯水平仍然类似(图57A)。与赋形剂处理相比，在Gly-MCA处理的小鼠中，血清C16:0，C20:0，C22:0，和C24:1神经酰胺水平，以及回肠C16:0，C18:0，C18:1，C20:0，C22:0，C24:0和C24:1神经酰胺水平降低(图57B和C)。在另一HFD-诱导的肥胖模型中，将通过喂食高脂肪饮食12周造成肥胖的C57BL/6N小鼠用Gly-MCA处理。由于有限量的Gly-MCA，这些小鼠仅用5mg/kg GMCA处理。尽管是较低剂量给药，与赋形剂-处理的小鼠相比，从处理两周开始，它们也降低体重增加(图58)。与赋形剂-处理的小鼠相比，如通过NMR测量的绝对脂肪重量，在6周的处理后，在Gly-MCA-处理的肥胖小鼠中显著降低(图59)。肝组织学表明Gly-MCA处理后肝脂滴的显著改善(图60A)。Gly-MCA处理降低肝重和肝/体重比率(图60B和C)。在Gly-MCA处理后，在粪便和回肠中TαMCA和TβMCA的水平显著增加(图61A和61B)。回肠中Gly-MCA的积累远大于在肝、粪便、和血清中(图61C)。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通过引用至与好像指出各个参考文献分别和具体通过参考结合并且在本文中以其整体陈述的相同的程度来结合。
在描述本发明的范围内(特别是在以下权利要求的范围内)，术语“一个(a)”和“一个(an)”和“那个(the)”和“至少一种”以及类似的指示的使用要被理解为包括单数和复数，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一种”，接着一列一个或多个项目(例如，“A和B中的至少一种”)的使用要被理解为意为选自所列的项目(A或B)中的一个项目或所列项目(A和B)中的两种或多种的任意组合，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。术语“包含(comprising)”,“具有(having)”,“包括(including)”和“含有”被认为是开放式的术语(即，意为“包括，但不限于”)，除非另有说明。本文中值的范围的陈述仅以在用作分别涉及落在该范围内的各个分开的值的速记方法，除非本文中另有说明，并且各个分开的值结合于说明书，就像其在本文中分别陈述。本文中所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。本文中提供的任何和所有实施例，或示例性术语(例如，“如”)的使用，仅意在更好地说明本发明并且不构成对本发明的范围的限制，除非另外要求。说明书中的术语不应该被理解为表明对于本发明的实践至关重要的任何未要求的要素。
本发明的优选的实施方案在本文中描述，包括进行本发明的发明人已知的最佳方式。在阅读上述说明书后，这些优选的实施方案的变化形式对于本领域技术人员可以变得显而易见。本发明人预期技术人员酌情使用这种变化形式，并且本发明人预期本发明以除了如本文中具体描述的之外的其他方式实践。因此，本发明包括适用法律允许的，附于此的权利要求中所述的主题的所有改进和对等物。此外，本发明包括以其所有可以的变化形式的上述要素的任意组合，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。

Claims (14)

1.化合物，所述化合物选自：
Figure FDA0002392167060000011
其中
R14选自甘氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲基天冬氨酸，天冬氨酸，甲基谷氨酸，谷氨酸，甲基脯氨酸，脯氨酸，缬氨酸，2-氟-β-丙氨酸，2-溴丙氨酸，2-氯丙氨酸，2-氟丙氨酸，2-碘丙氨酸，3-溴丙氨酸，3-氯丙氨酸，32-氟丙氨酸，3-碘丙氨酸，4-溴苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，和4-碘苯丙氨酸，
或其药用盐。
2.权利要求1所述的化合物或盐，其中所述化合物是
Figure FDA0002392167060000012
或其药用盐。
3.权利要求1所述的化合物或盐，其中所述化合物是
Figure FDA0002392167060000021
4.权利要求2或3所述的化合物或盐，其中R14是甘氨酸。
5.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0002392167060000022
或其药用盐。
6.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0002392167060000023
7.权利要求5或6所述的化合物或盐，其中R14是甘氨酸。
8.一种药物组合物，其包含药用载体和权利要求1所述的化合物或盐。
9.一种药物组合物，其包含药用载体和权利要求2所述的化合物或盐。
10.一种药物组合物，其包含药用载体和权利要求3所述的化合物。
11.一种药物组合物，其包含药用载体和权利要求4所述的化合物或盐。
12.一种药物组合物，其包含药用载体和权利要求5所述的化合物或盐。
13.一种药物组合物，其包含药用载体和权利要求6所述的化合物。
14.一种药物组合物，其包含药用载体和权利要求7所述的化合物或盐。
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