CN110433281A

CN110433281A - 在卵泡同步化后的单剂重组牛fsh

Info

Publication number: CN110433281A
Application number: CN201910624749.6A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·苏扎; 内奥米·埃萨卡; 奥德·卡里; 多米尼克·蒂博
Original assignee: Sihua Pharmaceutical Factory France
Current assignee: Sihua Pharmaceutical Factory France; Ceva Sante Animale SA
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2019-11-12
Also published as: JP2016502523A; US20150335713A1; JP6823013B2; EP2732824A1; EP2919803A1; CN104918631A; EP3520807A1; RU2015122887A; JP2018168189A; JP6419707B2; AU2013346803A1; EP2919803B1; ES2743763T3; WO2014076231A1; AU2013346803B2; US20190200587A1; RU2679944C2; ZA201503404B; MX2015006141A

Abstract

本发明涉及在卵泡同步化后的单剂重组牛FSH。具体地，本发明涉及使用有生物活性的重组促卵泡激素(rFSH)在非人类哺乳动物中提高生殖性能的方法和组合物。本发明还涉及使用rFSH在非人类哺乳动物中增加排卵或胚胎产生或妊娠的方法。本发明尤其可用于有蹄类动物例如牛或马。

Description

在卵泡同步化后的单剂重组牛FSH

本申请是国际申请日2013年11月15日、国际申请号PCT/EP2013/073928于2015年5月18日进入中国国家阶段、申请号201380060063.X、发明名称“在卵泡同步化后的单剂重组牛FSH”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及使用有生物活性的重组促卵泡激素(rFSH)在非人类哺乳动物中提高生殖性能的方法和组合物。本发明还涉及使用rFSH在非人类哺乳动物中增加排卵、胚胎产生或妊娠的方法。本发明尤其可以在人工授精或体外授精程序中用于有蹄类动物例如牛或马。

背景技术

在非人类哺乳动物例如牛、马或其他有蹄类动物中提高生殖性能的能力，对所有者来说可以具有显著利益。这可以通过在这样的非人类哺乳动物中提高生育力和/或生殖力来实现。目前，已提出了数种方法或方案来提高生殖性能，它们是基于使用雌二醇和其他激素例如GnRH(促性腺激素释放激素)、LH(促黄体激素)、FSH(促卵泡激素)或孕激素(progestagen)(例如孕酮)来模拟在目标物种中存在的激素的天然或接近天然的水平。一些这些方案包括在雌性中使排卵同步化的步骤，以便以同步化方式促进卵泡的刺激、生长和排卵，允许定时人工授精，避免发情期检测的必要性。这些所谓的同步化方案在全世界被广泛用于商业化牛奶场和肉牛牧场。

用于使卵泡波的出现同步的最常用处理方法之一，包括使用不同类型的雌激素。然而，这种甾类激素在世界的许多地方不能使用，并且已开发了可替选的方法来控制卵泡和黄体期，其目的在于例如在雌二醇不可用的国家中改进胚胎供体母牛的超数排卵过程。一种似乎是有希望的选项的方法是在GnRH诱导的排卵之后，在新的卵泡波出现时启动FSH处理。此外，由于目前可用的FSH产品的半衰期一般来说短(约6小时)，因此超数排卵方案包括每日两次FSH处理，总共4至5日，这是相当耗时、紧张的，并容易发生错误。此外，在目前开发的超数排卵计划期间的这些频繁的管理，使其几乎不可能应用于例如放养在牧场中的肉牛。因此，标准的超数排卵方法是基于在通常发生在天然存在的发情期后8至12天的卵泡波出现时多次注射FSH。这种方法被称为“基于发情期的”，并且它尽管在胚胎产生方面高效，但取决于发情周期的阶段，并需要发情期检测。较晚的研究发现，与允许更理想的从授精到排卵的时间间隔的现代同步化方案相比，在“基于发情期”的程序中生育率明显较低。

为了确定延长FSH刺激方案是否能够增加排卵反应，已进行了研究。作者似乎得出结论，将FSH注射时间长度从连续4天延长到连续7天，可以维持卵泡生长并导致更多卵泡获得排卵能力。更多的研究正在进行中，以在不同牛品种中验证这个假说。

在另一个已报道的方案中，将母牛用FSH处理3天而不是4天，并且将第4天的最后两次注射用2eCG(马绒毛膜促性腺激素)注射代替(Barros等，2008)。这种处理似乎增加了胚胎的数目，尽管处理时间仍然长。此外，eCG是相当大的分子，并且已被描述在重复使用时诱导抗体形成，并且可能限制这些类型的方案的广泛/频繁使用。

在试图减少FSH注射的数目的尝试中，已开发了一种可选替方案，其中将FSH包埋在缓释聚合物(透明质酸)中。使用这种缓释制剂，在“基于发情期”的超数排卵计划后进行单次注射。然而，作者得出结论，透明质酸也过于粘稠，并且单次肌内注射产生较低的超数排卵反应(Bo等，2010)。

EP2134165提出了一种使用单链FSH提高生殖的可替选方法，在所述单链FSH中两个亚基由肽连接物共价连接，其在发情期后7至13天在单一药剂中给药。根据这种方法，通过鉴定参考发情期(或发情)日期(最后发情的当天)来准备用于FSH注射的动物，然后在动物周期的第7至8天之间在单次注射中给药FSH。结果似乎令人满意，但是需要动物的个体观察和监测来确定最有效的处理方式。

发明概述

本发明涉及使用有生物活性的重组促卵泡激素(rFSH)在非人类哺乳动物中提高生殖性能的方法和组合物。本发明还提供了用于在非人类哺乳动物中提高生殖、特别是生育力和生殖力的改进的方法。

更具体来说，本发明提供了改进的基于rFSH的组合物和处理方法，其通过最小化给药次数和剂量，在非人类哺乳动物中提供了提高的生殖性能。

本发明的具体目的涉及重组rFSH类似物或包含rFSH类似物的组合物，其用于在经历卵泡同步化方案和/或处理的非人类哺乳动物中提高生殖性能。更优选地，所述rFSH类似物在单次给药中，优选地以约0.01μg至约5mg之间的剂量范围给药。

本发明的具体目的涉及重组rFSH类似物或包含rFSH类似物的组合物的用途，其用于在经历卵泡同步化方案和/或处理的非人类哺乳动物中提高生殖性能。更优选地，所述rFSH类似物在单次给药中，优选地以约0.01μg至约5mg之间的剂量范围给药。

本发明的另一个目的在于一种rFSH类似物(或包含rFSH类似物的组合物)，其用于在一个或数个非人类哺乳动物中提高生殖性能，其中在卵泡同步化后，将所述rFSH类似物在单次给药中，优选地以10μg至1mg之间的剂量范围给药于每个所述一个或数个非人类哺乳动物。

本发明的另一个目的在于一种用于在一个或数个非人类哺乳动物中提高生殖性能的方法，所述方法包括在卵泡同步化后，优选地以10μg至1mg之间的剂量范围向每个所述一个或数个非人类哺乳动物单次给药rFSH类似物。

本发明的另一个目的是一种用于在一个或数个非人类哺乳动物中诱导超数排卵的方法，所述方法包括向每个所述一个或数个非人类哺乳动物给药rFSH类似物，其中所述rFSH类似物在卵泡同步化方案和/或处理后，在单次给药中，优选地以10μg至1mg之间的剂量范围给药于所述非人类哺乳动物。

本发明的另一个目的是一种用于在一个或数个非人类哺乳动物中提高排卵率的方法，所述方法包括向每个所述一个或数个非人类哺乳动物给药rFSH类似物，其中所述rFSH类似物在单次给药中，优选地以10μg至1mg之间的剂量范围给药于所述非人类哺乳动物。给药优选地在卵泡同步化之后进行。

本发明的另一个目的是一种用于在一个或数个非人类哺乳动物中产生或回收卵母细胞的改进方法，所述方法包括向每个所述一个或数个非人类哺乳动物给药rFSH类似物，其中所述rFSH类似物在单次给药中，优选地以10μg至1mg之间的剂量范围给药于所述非人类哺乳动物。

给药优选地在卵泡同步化之后进行。这样的方法对于提高体外授精(IVF)方案或程序的性能来说特别有利。

就此而言，本发明的另一个目的涉及一种体外授精(IVF)方法，所述方法包括从非人类哺乳动物供体获得卵母细胞的步骤和在体外对所述卵母细胞进行授精的步骤，其中通过rFSH类似物的单次给药，优选地以10μg至1mg之间的剂量范围对所述非人类哺乳动物供体进行处理，以增加卵母细胞生产。给药优选地在所述非人类哺乳动物供体的卵泡同步化之后进行。

本发明的另一个目的是一种用于在非人类哺乳动物中提高黄体的质量和数量的方法，所述方法包括向所述非人类哺乳动物给药rFSH类似物，其中所述rFSH类似物在单次给药中，优选地以10μg至1mg之间的剂量范围给药于所述非人类哺乳动物。

在特定实施方式中，本发明涉及一种方法，其包括：

(a)提供经过处理以使卵泡同步化的非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)或一组非人类哺乳动物(例如一组有蹄类动物)；或者对非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)或一组非人类哺乳动物(例如一组有蹄类动物)进行处理，以使卵泡同步化；

(b)以约0.01μg至约5mg之间的剂量范围，优选地通过注射、更优选地通过肌内注射，向所述非人类哺乳动物或一组哺乳动物给药单剂rFSH类似物；以及

(c)优选地在排卵时间附近，更优选地在给药步骤(b)后2至7天、甚至更优选地4至6天，对所述非人类哺乳动物或一组非人类哺乳动物进行授精，优选地通过人工授精来进行。

这种方法避免了对检测或监测发情期的需要，并且特别是对于成组非人类哺乳动物更加有效。

在另一种特定实施方式中，本发明涉及一种方法，其包括：

(a)提供经过处理以使卵泡同步化的有蹄类动物或一组有蹄类动物；或者对有蹄类动物或一组有蹄类动物进行处理，以使卵泡同步化；

(b)以约10μg至约1mg之间的剂量范围，优选地通过注射、更优选地通过肌内注射，向所述有蹄类动物或一组有蹄类动物给药单剂rFSH类似物；

(c)优选地通过卵泡抽吸从所述有蹄类动物回收卵母细胞；

(d)任选地，在体外对所述回收的卵母细胞进行授精；以及

(e)任选地将所述受精的卵母细胞植入到受体动物中，优选地植入到以前通过以约10μg至约1mg之间的剂量范围给药单剂rFSH类似物进行处理的受体动物中。

在本发明中使用的rFSH类似物优选为单链rFSH。此外，所述rFSH类似物优选地以基本上纯的形式，任选地与一种或数种可药用赋形剂或载体联合使用。

本发明可用于非人类哺乳动物，并且优选地用于任何有蹄类动物例如牛、绵羊、马、羊或山羊。本发明的组合物和方法对于在牛中提高生育力和/或生殖力以及特别是超数排卵、排卵率、卵母细胞生产或黄体(CL)质量和数量，特别有效。

附图说明

图1：用于使用rFSH类似物提高生殖性能的方案。

图2：在本发明中使用的牛rFSH类似物的核苷酸和氨基酸序列。连接β和α亚基的CTP连接物序列被下划线。被下划线且加粗的核苷酸编码信号肽。

发明详述

本发明提供了在非人类哺乳动物、优选为有蹄类动物、甚至更优选为牛中提高生殖性能的方法。具体来说，使用重组单链FSH在雌性非人类哺乳动物中刺激生育力和/或生殖力，正如由超数排卵、胚胎产生的增加和/或妊娠的增加所说明的。所述重组单链FSH也有效地刺激卵泡生长和成熟，导致卵母细胞回收、超数排卵和排卵率提高，并导致黄体(CL)的质量和数量提高。

所述重组单链FSH可用于授精方案和/或处理，包括用于胚胎移植和体外授精。本发明可用于任何有蹄类动物，优选为牛。

定义

在本发明的上下文中，术语“提高生殖性能”或“提高的生殖性能”是指提高非人类哺乳动物或多个非人类哺乳动物成为可生育和生殖的可能性。

提高生殖性能包括刺激卵泡生长和/或成熟，或提高黄体的质量和数量。

提高的生殖性能还包括已被授精的非人类哺乳动物或多个非人类哺乳动物变得妊娠、产生活的后代或发育出活的胚胎的提高的可能性。

提高生殖性能还包括增加非人类哺乳动物或多个非人类哺乳动物在子宫内和/或在体外产生的活胚胎的数目。提高的生殖性能包括提高生育力、生殖力、超数排卵、卵母细胞比率、排卵率、胚胎产生和/或妊娠。当与未处理的非人类哺乳动物相比时，提高优选为至少约1％，更优选为至少2％、3％、4％、5％、10％或更高。

在本发明的上下文中，术语“生育力”或“生育”是指产生可受精的卵母细胞的能力。

在本发明的上下文中，术语“生殖”或“生殖力”是指完成妊娠的能力。

在本发明的上下文中，术语“超数排卵”是指排卵的卵泡数目和/或可生育的卵细胞的产生的增加。

术语“妊娠的”是指非人类哺乳动物或一组非人类哺乳动物，其中某些目前正处于妊娠中或已被授精并可能妊娠。

当在本文中使用时，术语“发情期”是指非人类哺乳动物最可能变得妊娠的时间段。发情期可以通过非人类哺乳动物处于发情、包括显示出旺盛发情的行为表现来检测或监测。

“授精”是指通过本领域任何已知的方法引入精液，包括但不限于自然和人工授精(AI)和体外授精(IVF)。

一“组”动物是指任何至少2个非人类哺乳动物的组，例如牧群或兽群。

“有蹄类动物”是指具有蹄的任何动物，尤其是奇蹄目和偶蹄目两个分类学目的动物。

术语“给药”是指所有给药途径，例如口服、肠粘膜、肠胃外或经皮给药。优选地，给药途径为注射。

在本发明的上下文中，术语“卵泡同步化”是指卵泡波出现的同步化。

重组FSH类似物

促卵泡激素属于生育激素类。FSH由被称为α和β的两条链(或亚基)构成。在生理条件下，两个亚基通过非共价相互作用相连。来自于不同物种的FSH的核苷酸和氨基酸序列已被公开并且可以在公共数据库中获得，例如牛FSH(Kim KE等，1988，“牛的促卵泡激素β亚基基因的核苷酸序列”(nucleotide sequence of the bovine gene for follicle-stimulating hormone beta-subunit)，DNA 1988,7(4):227-233)或人FSH：基因库号：CAA43996.1。

本发明利用FSH类似物。术语“类似物”一般是指模拟天然化合物的生理效应的化合物。类似物在结构上与天然化合物相似，并且作为例如生产方法的结果或由于结构差异赋予类似物以有益的活性而可能存在结构差异。

在优选实施方式中，本发明的FSH类似物是具有共价连接的α和β两个亚基的FSH。这样的优选FSH类似物也可以被称为“单链”FSH。

在优选实施方式中，本发明使用一种重组FSH，其中α亚基通过肽连接物共价连接到β亚基。本发明显示，FSH的这种重组单链类似物在有蹄类动物中提供了提高生殖性能的改进的性质。所述肽连接物可以是不影响FSH的构象或活性的任何肽连接物。在优选实施方式中，所述连接物是CTP连接物，例如包含US6,242,580和US2008/0312151中所描述的人绒毛膜促性腺激素的羧基端肽序列的连接物。在另一种实施方式中，所述连接物是包含(G₄S)序列的肽，所述序列可以重复数次。

在本发明中使用的重组牛FSH类似物的cDNA和氨基酸序列提供在图2中(SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4)。第一部分(1-129位氨基酸)对应于牛FSHβ亚基序列(SEQ ID NO 2)，中央部分对应于羧基端肽连接物(130-157位氨基酸)，第三部分(158-253位氨基酸)对应于牛FSHα亚基序列(SEQ ID NO 1，也参见EP2134165)。

本发明的一种实施方式使用具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列或与SEQ ID NO 3的氨基酸序列具有90％或更高、优选地95％或更高同源性的氨基酸序列的单链重组牛FSH。

当所述方法用于处理牛时，优选地使用如上所公开的牛FSH类似物，即其中α和β结构域源自于牛FSH并且通过肽连接物相连的重组FSH。

当所述方法用于处理另一种有蹄类动物时，优选地使用源自于所述有蹄类动物的FSH类似物。

所述蛋白优选为基本上纯的，即具有至少95％、更优选地至少97、98或99％的纯度水平。

在优选实施方式中，将FSH在包含适合的制药配方的组合物中给药。所述制药配方可以包含一种或数种赋形剂或载体。

在一种优选实施方式中，所述牛FSH具有高于10 000IU/mg，更优选地高于13000IU/mg，例如约16 000IU/mg的活性。根据由ASRM执业委员会发表的转换系数(Fertilityand Sterility,vol90,supl3,November 2008-美国生殖医学学会(American Society forReproductive Medecine))，10 000IU的牛FSH对应于600μg。

处理

正如上面指出的，本发明涉及使用重组FSH类似物在非人类哺乳动物中提高生殖性能的新方法。本发明可用于授精计划，特别是有蹄类动物的人工授精，以例如在被处理的动物中提高排卵率和/或超数排卵和/或黄体的质量和数量，并且可用于体外授精计划，以例如提高卵母细胞从供体动物的回收和/或受体动物中的妊娠率。

更具体来说，本发明的目的涉及用于在非人类哺乳动物中提高生殖性能的重组FSH类似物，其中所述重组FSH包含由肽连接物共价连接的α亚基和β亚基，并且其中所述重组FSH在卵泡同步化后，优选地以10μg至1mg之间的剂量在单次给药中给药于所述非人类哺乳动物。

本发明的另一个目的在于一种用于在非人类哺乳动物中提高生殖性能或胚胎产生的方法，所述方法包括在卵泡同步化后，以10μg至1mg之间的剂量向所述非人类哺乳动物单次给药重组FSH类似物，所述重组FSH类似物包含由肽连接物共价连接的α亚基和β亚基。

本发明的另一个目的在于一种在非人类哺乳动物中提高卵母细胞回收的方法，所述方法包括在卵泡同步化后，以10μg至1mg之间的剂量向所述非人类哺乳动物单次给药重组FSH类似物，所述重组FSH类似物包含由肽连接物共价连接的α亚基和β亚基。

本发明的另一个目的在于一种用于在非人类哺乳动物中提高妊娠率的方法，所述方法包括在卵泡同步化后，以10μg至1mg之间的剂量向所述非人类哺乳动物单次给药重组FSH类似物，所述重组FSH类似物包含由肽连接物共价连接的α亚基和β亚基。

本发明的另一个目的在于一种用于在非人类哺乳动物中提高排卵率的方法，所述方法包括在卵泡同步化后，以10μg至1mg之间的剂量向所述非人类哺乳动物单次给药重组FSH类似物，所述重组FSH类似物包含由肽连接物共价连接的α亚基和β亚基。

本发明的另一个目的是一种在非人类哺乳动物中诱导超数排卵的方法，所述方法包括向非人类哺乳动物给药重组FSH类似物，其中所述重组FSH类似物包含由肽连接物共价连接的α亚基和β亚基，并且其中所述重组FSH类似物在卵泡同步化后，优选地以10μg至1mg之间的剂量在单次给药中给药于所述哺乳动物。

在优选实施方式中，所述方法包括：

(a)对非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)或一组非人类哺乳动物(例如一组有蹄类动物)进行处理，以使卵泡同步化，或者提供经过处理以使卵泡同步化的非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)或一组非人类哺乳动物(例如一组有蹄类动物)；

(b)向所述处理过的非人类哺乳动物单剂给药10μg至1mg之间的重组FSH类似物；以及

(c)优选地在排卵时间附近，更优选地在给药步骤(b)后2至7天、甚至更优选地4至6天，任选地对所述非人类哺乳动物进行授精和/或收集卵母细胞。

在第一处理步骤中，新卵泡波的出现被同步化。本发明显示，与本发明的重组FSH相组合，这样的处理允许增加胚胎产生，即使在较低的激素剂量下并使用较少的注射。

在非人类哺乳动物例如牛中，卵泡生长不是连续的，而是以波出现(每个周期2至4个波)。每个波大致在前一个波中的优势卵泡获得最大尺寸时开始，此时大量小卵泡开始一个快速生长的时期。从这组卵泡中，允许一个卵泡生长至远大于其他卵泡的尺寸。这个大卵泡被称为优势卵泡，因为它具有调节和限制被称为从属卵泡的较小卵泡的生长的能力。在达到最大尺寸后数天，优势卵泡开始退化并死亡。当优势卵泡退化时，其限制其他卵泡的能力降低；因此，新的卵泡波启动。这种动态过程的结果是在发情周期的每一天存在所有尺寸的卵泡，包括至少一个大卵泡。

卵泡波同步化为在有限的时间段中处理所有非人类哺乳动物以及因此捕捉授精的经济利益，提供了机会。在发情周期同步化后，高百分率的处理过的雌性动物显示出可生育的接近同步的发情期和排卵。

排卵的同步化或定时AI方案是指人工刺激卵泡生长和定时排卵，以便不需监测发情期行为而在预定时间启动排卵的方法和/或方案。在牛中使用的常用方法和方案的综述，描述在Bo等在2012年9月7日至8日的AETE第28届年会(Saint Malo,France)上的文章中(牛中卵泡发育的控制和超数排卵方案的最新进展(Recent advances in the control offollicular development and superovulation protocols in cattle))。

新卵泡波的出现可以通过激素或物理处理来进行。激素处理包括适合的激素例如前列腺素、孕激素或GnRH的给药。物理处理包括卵泡消融。

在优选实施方式中，卵泡同步化通过对非人类哺乳动物进行激素处理，优选地使用孕激素、孕激素-前列腺素组合、单独的前列腺素、孕激素-雌激素组合以及带有或不带有孕激素的促性腺激素-前列腺素组合进行激素处理来获得。

在优选实施方式中，卵泡同步化通过下列处理之一来获得：

-PGF2α或其类似物；

-GnRH+PGF2α

-孕激素(作为孕酮…)，任选地与雌激素或PGF2α或GnRH相组合。

具体的剂量和/或方案在本领域中已有公开，例如在Thatcher等，2001(AmericanAssociation of Bovine Practitioner,AABP,Vancouver,95-105)；Diskin等，2001(occasional publication n°26,p175,British society of Animal Science)；或Pursley等，1995(Theriogenology 44 p915)中。此外，孕激素可以使用特定装置例如植入物(例如Ceva Santé Animale的PRID)来给药。

在另一种实施方式中，卵泡同步化通过卵泡消融来获得。卵泡的消融是指至少一个卵泡的消除、移除或破坏。卵泡消融是指卵泡消融的物理方法，例如在发情周期的随机阶段处烧灼或超声引导的经阴道卵泡抽吸(Bergfelt，1997)。消融可以被导向所有卵泡，或仅导向一个或两个最大的卵泡(Baracaldo等，2000)，以至少确保优势卵泡被抑制。

在优选实施方式中，本发明涉及一种方法，其包括：

(a)用孕激素、孕激素-前列腺素组合、前列腺素、孕激素-雌激素组合或带有或不带有孕激素的促性腺激素-前列腺素组合处理非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)或一组非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)，以使卵泡同步化；或者提供已用孕激素、孕激素-前列腺素组合、前列腺素、孕激素-雌激素组合或带有或不带有孕激素的促性腺激素-前列腺素组合处理过以使卵泡同步化的非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)或一组非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)；

(b)向所述处理过的非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)单剂给药10μg至1mg之间的重组FSH类似物；以及

(c)优选地在排卵时间附近，更优选地在给药步骤(b)后2至7天、甚至更优选地4至6天，任选地对(b)的处理过的非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)进行授精和/或从(b)的处理过的非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)收集卵母细胞。

在步骤(b)中，重组FSH类似物可以使用本身在本领域中已知的任何手段或技术来给药，包括但不限于全身性给药例如肌内、静脉内、皮下等。优选的给药途径是肌内注射。

在优选实施方式中，本发明的组合物或方法使用50μg的单剂rFSH类似物。

在另一种优选实施方式中，本发明的组合物或方法使用100μg的单剂rFSH类似物。

实验部分中提呈的结果显示，在同步化的非人类哺乳动物例如有蹄类动物上，这样的单次给药导致有繁殖力的胚胎的产生并显著增加了生殖活动。

在优选实施方式中，所述方法还包括在排卵时间附近，更优选地在rFSH类似物给药后2至7天、甚至更优选地4至6天，对所述有蹄类动物进行授精的步骤(c)。

其他激素例如促黄体激素、绒毛膜促性腺激素和前列腺素，任选地与rFSH一起给药。在一种实施方式中，除了rFSH类似物的给药之外，将前列腺素给药于非人类哺乳动物。前列腺素任选地作为单一药剂，通常通过注射给药，或者作为多个药剂相隔数小时给药。在一种实施方式中，第一剂前列腺素在rFSH类似物给药后提供给非人类哺乳动物，然后是第二剂前列腺素，其在第一剂前列腺素后约6小时至1天提供给所述非人类哺乳动物。

或者，所述方法包括优选地在排卵时间附近，更优选地在rFSH类似物给药后2至7天、甚至更优选地4至6天，从(b)的处理过的非人类哺乳动物回收或收集卵母细胞的步骤(c)。卵母细胞可以通过本身在本领域中已知的技术来回收，例如但不限于卵泡抽吸。收集到的卵母细胞表现出改善的生殖力特性。收集到的卵母细胞可以被体外授精，并随后转移到受体非人类哺乳动物例如有蹄类动物。

本发明可用于任何有蹄类动物，例如牛、羊、山羊、鹿、牦牛、水牛、野牛、羚羊、瞪羚、麋鹿、驯鹿、驼鹿、大角羊、长颈鹿、骆驼、猪、马、羊驼和小羊驼。它特别适合于处理母肉牛和乳牛，包括小母牛。

本发明的其他情况和优点将在下面的实验部分中公开，所述实验部分说明了所要求保护的发明。

实施例

实施例1–在同步化的非人类哺乳动物中单次50μg rFSH类似物给药对生殖性能的影响

我们用牛rFSH类似物的单一肌内注射处理了14只乳用小母牛(50μg/小母牛)。注射在卵泡消融后30小时(在24至48小时的时间窗内)进行。所使用的牛rFSH类似物如图2中所示。处理方案显示在图1中。

所有组在第一次FSH注射(F0)后2天和3天时接受两次前列腺素PGF2α注射。在F0后5天时进行hCG(人绒毛膜促性腺激素)注射，并在hCG处理后12小时和24小时进行人工授精(AI)。在AI后7天通过非手术程序进行胚胎收集。

使用(Bioniche Animal Health Product,Canada)进行参比处理。是从猪垂体腺获得的纯化的冷冻干燥的促卵泡激素提取物。(50mg)在4天内以减小的剂量每日两次肌内给药(在处理结束时累计FSH为400mg/小母牛)。将14只乳用小母牛用处理。

测量了不同参数：

-超数排卵：如果在冲洗的当天>2CL(黄体)，则超数排卵被认为是成功的；

-排卵率：基于每只奶牛的排卵反应的全组LSM(最小二乘法)；

-胚胎质量：基于每只奶牛的活胚胎数目的全组LSM(最小二乘法)；

结果在下表中给出。

结果显示，本发明的处理可以明显地在牛中诱导超数排卵反应。作为比较，在用参比方案(8次天然FSH例如的注射，400mg)处理的小母牛中，本发明的处理(单次注射rFSH类似物，50μg)产生较高的排卵率(81％相比于76％)和较高的活胚胎数目(7.9相比于5.9)。因此，即使一只小母牛在使用本发明的处理时没有超数排卵(尽管使用参比处理时都超数排卵)，但使用本发明时胚胎的质量似乎更好。因此，卵泡同步化处理与单次rFSH类似物注射的组合允许始终如一地产生超数排卵的胚胎。

实施例2–在同步化的非人类哺乳动物中单次100μg rFSH类似物给药对生殖性能的影响

我们用牛rFSH类似物的单一肌内注射处理了14只乳用小母牛(100μg/小母牛)。注射在卵泡消融后30小时(在24至48小时的时间窗内)进行。所使用的牛rFSH类似物如图2中所示。处理方案显示在图1中。

测量了不同参数：

-排卵率：基于每只奶牛的排卵反应的全组LSM(最小二乘法)；

结果在下表中给出。

结果显示，本发明的处理可以明显地在牛中诱导超数排卵反应。作为比较，在用参比方案(8次天然FSH例如的注射，400mg)处理的小母牛中，本发明的处理(单次注射rFSH类似物，100μg)产生较高的排卵率(88％相比于76％)。因此，即使两只小母牛在使用本发明的处理时没有超数排卵(尽管使用参比处理时都超数排卵)，但在两种产品之间胚胎的质量似乎是等同的。所述处理获得了超过70％的超数排卵反应，并且在胚胎质量方面也满足标准。因此，卵泡同步化处理与单次rFSH类似物注射的组合允许始终如一地产生超数排卵的胚胎。

序列表

<110> 法国诗华大药厂

<120> 在卵泡同步化后的单剂重组牛FSH

<130> SPI193313-91

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 109

<212> PRT

<213> 牛FSH α亚基

<400> 1

Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu Cys Gly

1 5 10 15

Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr

20 25 30

Arg Asp Leu Val Tyr Arg Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys Thr

35 40 45

Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro Gly Cys

50 55 60

Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu Cys

65 70 75 80

His Cys Ser Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly

85 90 95

Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Arg Glu Ile Lys Glu

100 105

<210> 2

<211> 96

<212> PRT

<213> 牛FSH β亚基

<400> 2

Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu

1 5 10 15

Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys

20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys

35 40 45

Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys

50 55 60

Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val

65 70 75 80

Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser

85 90 95

<210> 3

<211> 253

<212> PRT

<213> 牛rFSH类似物

<400> 3

Met Lys Ser Val Gln Phe Cys Phe Leu Phe Cys Cys Trp Arg Ala Ile

1 5 10 15

Cys Cys Arg Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys

20 25 30

Glu Glu Cys Gly Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly

35 40 45

Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Arg Asp Pro Ala Arg Pro Asn

50 55 60

Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys

65 70 75 80

Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val

85 90 95

Ala Thr Glu Cys His Cys Ser Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys

100 105 110

Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Arg Glu Ile Lys

115 120 125

Glu Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser

130 135 140

Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Asp

145 150 155 160

Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu Lys Glu Asn

165 170 175

Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys Met Gly Cys

180 185 190

Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys Lys Thr Met

195 200 205

Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val Ala Lys

210 215 220

Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val Glu Asn His

225 230 235 240

Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser

245 250

<210> 4

<211> 762

<212> DNA

<213> 牛rFSH类似物

<400> 4

atgaagtctg tccagttctg tttccttttc tgttgctgga gagcaatctg ctgcagaagc 60

tgcgagctga ccaacatcac catcacggtg gagaaagagg aatgtggctt ctgcataagc 120

atcaacacca cgtggtgtgc aggctactgc tacacccggg acttggtgta cagggaccca 180

gcaaggccca atatccagaa aacgtgtacc ttcaaggagc tggtctacga gacggtgaaa 240

gtgcctggct gtgctcacca tgcagactcc ctgtacacgt acccagtagc cactgaatgt 300

cactgcagca agtgcgacag cgacagcact gactgcaccg tgagaggcct ggggcccagc 360

tactgctcct tcagggaaat caaagaatcc tcttcctcaa aggcccctcc cccgagcctt 420

ccaagtccat cccgactccc ggggccctcg gacaccccga tcctcccaca atttcctgat 480

ggagagttta caatgcaggg ctgtcctgaa tgcaagctaa aagaaaacaa atacttctcc 540

aagccagatg ctccaatcta tcagtgcatg gggtgctgct tctccagggc ataccccact 600

ccagcgaggt ctaagaagac aatgttggtc cccaagaaca tcacctcgga agctacatgc 660

tgtgtggcca aagcatttac caaggccaca gtgatgggaa atgtcagagt ggagaaccac 720

accgagtgcc actgcagcac ttgttattat cacaaatcct aa 762

Claims

1.牛重组FSH(rFSH)类似物或包含牛重组rFSH类似物的组合物用于在牛中提高生殖性能的用途，其中所述牛重组rFSH类似物包含由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列，并且所述rFSH类似物在卵泡同步后以50μg的剂量在单次给药中给药于所述牛。

2.权利要求1的用途，其中所述rFSH通过全身性给药、优选地通过肌内给药、更优选地通过注射进行给药。

3.权利要求1或2任一项的用途，其中所述rFSH具有由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列。

4.权利要求1至3任一项的用途，其还包括在排卵时间附近，优选为rFSH给药后2至7天、更优选地4至6天，对所述牛进行授精。

5.根利要求1至4任一项的用途，其还包括优选地在排卵时间附近，更优选为rFSH类似物给药后2至7天、甚至更优选地4至6天，从所述牛收集卵母细胞。

6.权利要求1-5任一项的用途，其包括：

(a)提供经过处理以使卵泡同步化的牛或一组牛；

(b)以50μg的剂量，优选地通过注射、更优选地通过肌内注射，向所述牛或一组牛给药单剂所述rFSH类似物；以及

(c)优选地在排卵时间附近，更优选地在给药步骤(b)后2至7天、甚至更优选地4至6天，任选地对所述牛或一组牛进行授精，优选地通过人工授精来进行，或者从所述牛或一组牛收集卵母细胞。

7.权利要求1-5任一项的用途，其包括：

(a)对牛或一组牛进行处理，以使卵泡同步化；

8.权利要求1-7任一项的用途，其中卵泡同步化通过对所述牛进行激素处理，优选地使用PGF2α或其类似物，GnRH和PGF2α，或孕激素，任选地与雌激素或PGF2α或GnRH相组合进行激素处理来获得，或者通过卵泡消融来获得。

9.权利要求1至8任一项的用途，其中所述生殖性能通过在所述牛中诱导超数排卵来提高。

10.权利要求1至8任一项的用途，其中所述生殖性能通过在所述牛中增加妊娠来提高。

11.权利要求1至8任一项的用途，其中所述生殖性能通过在所述牛中增加排卵率来提高。

12.权利要求1-11任一项的用途，其中所述牛是母肉牛或乳牛，包括小母牛。