CN110430866B - 含有胸腺素β-4作为有效成分的稳定外用剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有胸腺素β‑4作为有效成分的稳定的外用剂，更具体地，本发明涉及具有改善生物活性和稳定性的具有治疗效果的Tβ4的外用剂。通过改进，根据本发明的外用剂可以维持Tβ4的生物活性并使由于氧化反应产生的Tβ4亚砜和由于聚集产生的多聚体最小化，从而使Tβ4处于稳定状态。

Description

含有胸腺素β-4作为有效成分的稳定外用剂
技术领域
本发明涉及包含胸腺素β4(Tβ4)作为活性成分的稳定外用剂。更具体地，本发明涉及一种治疗有效的外用制剂，其具有改善稳定性和生物活性的Tβ4。
背景技术
由SEQ ID NO：3表示的胸腺素β4(Tβ4)是一种具有四十三(43)个氨基酸的肽，其在N-末端被乙酰化。它是一种天然存在的肽，存在于各种组织和细胞类型中。Tβ4最初通过柱层析和凝胶过滤从牛胸腺中分离(Low等人，Proc.Nati.Acad.Sci.USA,78:1162-1166(1981))。Tβ4以1×10-5至5.6×10-1的摩尔浓度存在于大多数人组织和细胞类型中，并且尤其是在血小板，巨噬细胞和白细胞中高度存在。
通过圆二色性研究确定，Tβ4分子没有二级结构，其具有高度动态，非结构化和柔性构象。然而，当其LKKTET(氨基酸残基17-22)与G-肌动蛋白相互作用时，这种相互作用诱导结构化的N-和C-末端螺旋的形成。此外，Tβ4分子的其他部分与各种肌动蛋白亚结构域结合。Tβ4以1：1的比例或延伸构象与G-肌动蛋白结合。由于空间位阻，盐诱导的肌动蛋白聚合被阻断。Tβ4是真核细胞中的主要肌动蛋白螯合分子。因此，它通过维持大量的肌动蛋白单体来调节肌动蛋白丝的组装和分解，所述肌动蛋白丝调节肌动蛋白细胞骨架的动力学。
此外，Tβ4具有伤口愈合和抗炎特性。更具体地，预期Tβ4通过促进角质形成细胞和内皮细胞的迁移，胶原沉积和血管发生而表现出其治疗效果。
为了使Tβ4作为治疗剂显示出足够的治疗效果，不仅应该延长其生物活性而且其纯度和同质性也应得到保持。然而，由于Tβ4是多肽，不仅室温下长期储存会发生化学和物理变化，而且在冷藏条件下也会发生化学和物理变化。这会导致其生物活性和治疗效果的降低，以及其分解产物的产生会妨碍含有Tβ4的药物制剂的制备。
就此而言，蛋白质的降解途径可分为化学不稳定性和物理不稳定性两大类。化学不稳定性是指涉及脱氨反应形成新降解产物，或通过肽键的形成或裂解修饰蛋白质结构的过程。物理不稳定性是指不涉及共价修饰的变性，聚集和沉淀等(Manning等，药学研究，6：903-917(1989)；Tallan Stain，生物化学期刊.200:507-514(1953))。
在Tβ4的化学降解途径中，需要注意其组成氨基中的甲硫氨酸在该过程中被氧化形成的杂质亚砜。Tβ4亚砜在文献中(Eur.J.Biochem.223,345-350(1994)，天然药物5(12)，1424(1999))已有报道，Tβ4亚砜在肌动蛋白聚合或抗炎作用中表现出与Tβ4不同的行为。因此，在Tβ4储存期间形成的Tβ4亚砜会引起药理学活性的变化。
发明公开
技术问题
为了提供稳定状态的Tβ4，并将其药理活性长时间保持在恒定水平，本发明人制备了含有Tβ4作为活性成分并且能够使其变性最小化的制剂，基于此完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供包含Tβ4的外用剂，其具有改善的稳定性。
解决方案
为解决上述技术问题，本发明的一个方面提供了一种外用制剂，其包含选自下组的多肽：胸腺素β4(Tβ4)、具有Tβ4生物活性的Tβ4亚型、其类似物、其衍生物、具有Tβ4生物学活性的Tβ4的N-末端变体、具有Tβ4生物学活性的Tβ4的C-末端变体，由SEQ ID NO：1表示的LKKTET或其保守变体、由SEQ ID NO：2表示的LKKTNT或其保守变体，及其组合；作为缓冲剂的磷酸盐；添加剂；和增粘剂，其中添加剂选自下组：二钠-EDTA二水合物、海藻糖、丙二醇及其组合，增粘剂选自下组：聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、卡波姆及其组合。
此外，根据本发明的另一方面，外用制剂可以配制成凝胶、乳膏、糊剂、软膏、搽剂、洗剂、水凝胶或气溶胶的形式。
发明的有益效果
本发明的制剂，包含胸腺素β4，磷酸盐(缓冲剂)，一定浓度的添加剂和增粘剂，通过维持Tβ4的生物活性和最小化Tβ4的氧化成亚砜以及聚合形成多聚体来提供稳定状态的Tβ4。
附图说明
图1显示了本发明Tβ4外用制剂的稳定性随pH的变化图。
本发明的最佳实施方式
以下将更详细地描述本发明。
本发明的一个方面，提供一种外用制剂，包含选自下组的多肽：胸腺素β4(Tβ4)、具有Tβ4生物活性的Tβ4亚型、其类似物、其衍生物、具有Tβ4生物活性的Tβ4的N-末端变体、具有Tβ4生物活性的Tβ4的C-末端变体、由SEQ ID NO：1表示的LKKTET或其保守变体、由SEQ IDNO：2表示的LKKTNT或其保守变体，及其组合；作为缓冲剂的磷酸盐；添加剂；和增粘剂，其中添加剂选自下组：二钠EDTA二水合物、海藻糖、丙二醇及其组合，增粘剂选自：聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、卡波姆和其组合。
最优选地，外用制剂中所述添加剂选自下组：二钠EDTA二水合物、丙二醇及其组合；增粘剂为羧甲基纤维素。
制剂可包含作为载体的蒸馏水或去离子水，并且可优选包含作为载体的蒸馏水。
最优选地，多肽为胸腺素β4，并且胸腺素β4可以是由SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的蛋白质。
本文使用的术语“胸腺素β4”是指一种也称为T称为的蛋白质，其是由43个氨基酸组成的多肽，分子量为4.9kDa，其最初从胸腺中分离并存在于各种类型的组织中。在内皮细胞的体外迁移和分化过程中，蛋白质被上调，并且已经鉴定了多种胸腺素Tβ4亚型。
本文使用的术语“保守变体”是指其中被不同但生物学上相似氨基酸残基取代的变体。保守变体中的取代的实例包括用疏水性残基取代其他残基，例如:异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，以及用极性残基取代其他残基，例如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺。
本发明的Tβ4可与已知的Tβ4氨基酸序列具有约70％，75％或80％或更高的序列同源性。本发明的Tβ4可以应用于野生型Tβ4的N-末端变体和C-末端变体。更具体地，它可以是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽或其保守变体，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或其保守变体。
Tβ4亚型包括，例如：Tβ4ala，Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。与Tβ4一样，Tβ10和Tβ15亚型以及Tβ4剪接变体可以螯合肌动蛋白。Tβ4、Tβ10和Tβ15以及其他亚型共享氨基酸序列LKKTET，其可参与介导肌动蛋白的螯合或结合。
Tβ4亚型的活性与肌动蛋白聚合机制的调节有关。β-胸腺素显示出通过螯合游离的G-肌动蛋白来解聚F-肌动蛋白。因此，Tβ4调节肌动蛋白聚合反应的能力与通过LKKTET序列结合肌动蛋白或螯合肌动蛋白的活性有关。因此，如本申请中所解释的，具有氨基酸序列LKKTET并能够结合或螯合肌动蛋白或调节肌动蛋白聚合反应的其它蛋白(包括Tβ4亚型)，与Tβ4一样，可单独使用或与Tβ4组合使用。
外用制剂可包含浓度为0.001至100mg/ml，0.01至10mg/ml，或优选0.1至5mg/ml的此类多肽。
而且，外用制剂可包含磷酸盐作为缓冲剂。为了使制剂的化学性质在即使暴露于外部环境或添加酸或碱的情况下尽可能一致，可以包含缓冲剂。特别是，在外部制剂中，通过使用磷酸盐作为缓冲剂，使氧化的Tβ4和其他杂质的生成最小化。同时，可以另外包括乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、碳酸氢盐、葡糖酸盐、丙酸盐或氨丁三醇(TRIS)缓冲剂等作为缓冲剂。
此外，外用制剂可包含Tβ4和缓冲剂的重量比为1:30至2：1或1:15至1：1。
为了进一步提高外用制剂的保存稳定性，可以加入二钠-EDTA二水合物或EDTA、海藻糖、丙二醇等添加剂，优选丙二醇或丙二醇和EDTA二水合二钠的混合物。
外用制剂可以包含浓度为0.01至100mg/ml的上述添加剂，并且浓度可以根据添加剂物质的类型而变化。
具体地，二钠-EDTA二水合物的浓度可以为0.05至2.00mg/ml，0.07至1.0mg/ml，或优选0.1至0.5mg/ml。此外，海藻糖的含量可以是1至50mg/ml，2至30mg/ml，或优选5至20mg/ml。此外，丙二醇的浓度可以是1至100mg/ml，2至50mg/ml，或优选5至20mg/ml。
此外，在上述添加剂中，外用制剂可以包含丙二醇和二钠-EDTA二水合物的重量比为500：1至1：1、300：1至2：1、250：1至20：1或100：1到50：1。此外，外用制剂可包含丙二醇和海藻糖的重量比为20：1至1:20，10：1至1:10或3：1至1：3。此外，外用制剂可包含海藻糖和二钠-EDTA二水合物的重量比为100：1至1：1，50：1至2：1，25：1至5：1或20：1至10：1。
同时，可以包含增粘剂以调节外用制剂的粘度并使氧化的Tβ4和其他杂质的生成最小化。增粘剂的实例可包括聚乙烯醇、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素)和卡波姆等，其中最优选羧甲基纤维素。
外用制剂可以包含浓度为1至100mg/ml的上述增粘剂，浓度可以根据增粘剂的种类而变化。
具体地，聚乙烯醇的含量可以为1至40mg/ml，2至30mg/ml，或优选5至20mg/ml。此外，羧甲基纤维素的含量可以是1至50mg/ml，5至40mg/ml，或优选10至30mg/ml。此外，羟丙基甲基纤维素的含量可以是1至100mg/ml，10至100mg/ml，或优选50至100mg/ml。此外，卡波姆的含量可以为2至35mg/ml，5至30mg/ml，或优选10至30mg/ml。
此外，添加剂和增粘剂可以是单独的或两者的组合，添加剂和增粘剂可以以1：500至1：1、1：300至2：1或1：250至3：1的重量比的组合包含。
此外，为了增加Tβ4稳定性，优选地，外用制剂含有丙二醇和二钠-EDTA二水合物的混合作为添加剂，和羧甲基纤维素作为增粘剂。本发明中，优选的添加剂和增粘剂的重量比为1：300至1：2。
同时，外用制剂可含有少量的防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)，醇(如氯丁醇或苄醇)，或胍衍生物，优选对羟基苯甲酸酯。
外用制剂的pH可以在4至7，4.5至6.5或5至6的范围内。为了使Tβ4亚砜的形成最小化，pH优选在5至6的范围内，或最优选在5.5至6.0的范围内。
此外，在25℃时，外用制剂的粘度(cP)可以在3至100,000的范围内，并且可以根据剂型在该范围内调节，同时保持Tβ4的稳定性。
外用制剂的剂型可以是凝胶、乳膏、糊剂、软膏、搽剂、洗剂、水凝胶或气溶胶。
本发明的外用制剂可适用于需要治疗皮肤创伤(如表皮损伤等)的受试者，例如哺乳动物，更具体地地为人，但不限于此。
此外，本发明可提供治疗皮肤炎症或溃疡的方法，包括将外用制剂施用于受试者的皮肤。炎症或溃疡的具体实例可包括但不限于压疮、足溃疡、大疱性表皮松解症、口腔粘膜炎、化脓性汗腺炎等。
本发明可提供治疗皮肤炎症或溃疡的方法，包括将外用制剂接触受试者的皮肤组织。具体地，本发明的治疗方法包括用凝胶、乳膏、糊剂、软膏、搽剂、洗剂、水凝胶或气溶胶，其包括可直接施用的外用制剂，接触皮肤组织。
外用制剂可以与另一种治疗剂同时或相继给药，并在一定时间内，以适当的剂量分几次给药。具体地，外用制剂可以每周一次至一天两次的剂量频率给药。
本发明的外用制剂优选透皮给药，并且可以通过肠胃外或鼻内途径给药，或通过粘膜给药，但不限于此。
此外，本发明可提供通过伤口闭合和组织再生治疗皮肤损伤的方法，包括将外用制剂施用于受试者的皮肤。
皮肤损伤治疗方法的具体给药方法和途径与上述皮肤炎症或溃疡的治疗方法相同。
此外，本发明可提供包含胸腺素β4作为活性成分的外用制剂在预防或治疗皮肤炎症和溃疡中的用途。
此外，本发明可提供包含胸腺素β4作为活性成分的外用制剂在预防或治疗皮肤损伤中的用途。
具体实施方式
在下文中，提供优选实施例以进一步说明本发明。但是，以下实施例仅用于说明的目的，并不用于限制本发明的范围。
实验例1：根据pH验证Tβ4的稳定性
用于验证随着pH变化的稳定性实验，在60℃下反应6天。对于pH值为2，3，6，7和8，使用50mM磷酸盐作为缓冲液。对于pH为4和5，使用乙酸盐作为缓冲液，对于pH为9，使用碳酸氢钠作为缓冲液。准备每种缓冲液中包含约0.2mg/mL的Tβ4的样品，并且其中一些是经过高压灭菌的。在每个样品中测量残留的Tβ4，结果如图1所示。如图1所示，可以发现Tβ4稳定性最好的pH范围是pH5至6。
实验例2：根据缓冲液的种类比较Tβ4的稳定性
将Tβ4以1mg/ml的浓度溶解于下表1中所示的30mM缓冲液中，然后在40℃下储存1周。然后使用反相HPLC测量Tβ4含量的变化和杂质峰的总量。Tβ4含量是通过比较初始样品和在40℃下储存7天的样品的标准峰面积来测量的，并且减少率用(初始含量-1周后含量)÷初始含量的百分比(％)表示。
通过比较基于HPLC分析期间显示的所有峰面积中甲硫氨酸氧化物的峰面积所占百分比(％)来测量Tβ4氧化物(甲硫氨酸氧化的化合物)。增加率用(1周后的氧化物面积％-氧化物的初始面积％)÷氧化物的初始面积％的比率表示。
通过比较基于除Tβ4之外的HPLC分析期间显示的所有峰面积的百分比(％)来测量总杂质。增加率用(1周后总杂质的面积％-总杂质的初始面积％)÷总杂质的初始面积％的比率表示。
【表1】
Figure BDA0002190196340000061
Figure BDA0002190196340000071
*各实验中使用的试剂的来源如下。
磷酸氢二钠二水合物：西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，Cat#：71662
磷酸二氢钠一水合物：西格玛(Sigma)，Cat#：S3522
组氨酸：VWR，Cat#：JT2080-5
柠檬酸一水合物：西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，Cat#：C1909
柠檬酸三钠二水合物：西格-玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，Cat#：S4641
如表1所示，Tβ4氧化物在较低pH(酸)下更易增多。证实磷酸盐作为缓冲液可以维持Tβ4的稳定性。
实验例3：根据添加剂的种类比较Tβ4稳定性
将浓度为1mg/ml的Tβ4溶于pH5.5的10mM磷酸盐缓冲液中，然后将表2中所示含量的添加剂溶解于其中。使用反相HPLC测量每种溶液中初始状态(第0天)的杂质，然后使用反相HPLC测量每种溶液在40℃下储存1周后的杂质。
使用的添加剂在通常用于外用制剂的浓度范围内具有尽可能低的浓度，以研究在最低添加剂浓度下对Tβ4的影响。
通过比较基于除Tβ4之外的HPLC分析期间显示的所有峰面积的百分比(％)来测量总杂质。增加率用(1周后总杂质的面积％-总杂质的初始面积％)÷总杂质的初始面积％的比率表示。
【表2】
Figure BDA0002190196340000072
Figure BDA0002190196340000081
*各实验中使用的试剂的来源如下。
丙二醇：奥德里奇(Aldrich)，Cat#：W294004
海藻糖：西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，Cat#：T9449
PEG(聚乙二醇)40-硬脂酸酯：TCI，Cat#：P0721
PEG 400：默克(Merck),Cat#:807485
HPβCD:(2-羟丙基)-β-环糊精：奥德里奇(Aldrich)，Cat#：332607
吐温20：禾大国际公司(Croda International Plc.)产品代码：SD40271
EDTA 2Na：乙二胺四乙酸二钠二水合物：西格玛(Sigma)，Cat#：E6635
如表2所示，当加入丙二醇，海藻糖和EDTA 2Na时，Tβ4杂质和氧化物的生成较少。其组合也表现出类似的稳定作用。同时作为肽稳定剂的HPβCD，没有效果，并且证实存在PEG类添加剂(PEG 40-硬脂酸酯、PEG 400)时，氧化的Tβ4急剧增加，而存在吐温20时，杂质的总量显着增加。
实验例4：根据增粘剂的种类比较Tβ4的稳定性
将浓度为1mg/ml的Tβ4溶于pH5.5的10mM磷酸盐缓冲液中，然后将表3中所示含量的增粘剂溶解于其中。使用反相HPLC测量每种溶液中初始状态(第0天)的杂质，然后使用反相HPLC测量每种溶液在40℃下储存1周后的杂质。
通过比较基于除Tβ4之外的HPLC分析期间显示的所有峰面积的百分比(％)来测量总杂质。增加率用(1周后总杂质的面积％-总杂质的初始面积％)÷总杂质的初始面积％的比率表示。
【表3】
Figure BDA0002190196340000082
Figure BDA0002190196340000091
*各实验中使用的试剂的来源如下。
PVA(聚乙烯醇)：西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，Cat#：81365
HPMC(羟丙基甲基纤维素)：信越(Shin-Etsu)，产品编号：羟丙甲纤维素90SH-100000SR
CMC(羧甲基纤维素钠)：亚什兰(Ashland),Cat#:414483
卡波姆均聚物B型：Mutchler公司产品代码：羧乙烯聚合物(carbopol)Mutchle
透明质酸钠：华熙生物科技股份有限公司(Bloomage Freda BiopharmaCo.Ltd.,)，产品代码：HA-EP1
黄原胶：斯比凯可(美国)(CP Kelco U.S.Inc)，材料#：10054521
聚乙烯吡咯烷酮：阿法埃莎(Alfa Aesar)，Cat#：A14315
甲基纤维素：西格玛(Sigma)，Cat#：M0512
聚卡波菲：Mutchler公司产品代码：Noveonhler I
结冷胶：西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，Cat#：G1910
如表3所示，当样品含有添加剂如聚乙烯醇、卡波姆均聚物B类和纤维素类(如HPMC和CMC)时，Tβ4趋于稳定。同时，含有聚乙烯吡咯烷酮的样品中，Tβ4氧化物急剧增加，而含有黄原胶和聚卡波菲的样品中的杂质总量显著高于添加其他添加剂的情况。对于结冷胶，生成了通过HPLC分析无法找到的沉淀物。
制备实施例1至4：外用制剂的制备
将磷酸氢二钠、氯化钠、羧甲基纤维素钠(或HPMC，卡波姆)和蒸馏水置于不锈钢容器中，并搅拌直至完全溶解。向其中缓慢加入EDTA 2Na、海藻糖或丙二醇并搅拌。然后，使用稀释10倍的盐酸溶液将pH调节至5.7。将Tβ4加入到溶液中，测量pH以确认其在5至6.0的范围内。通过减压容器除去制备的凝胶中的气泡，以制备根据具有表4中所示组成的实施例的外用制剂。
【表4】
Figure BDA0002190196340000101
测量根据实施例1至4的外用制剂的Tβ4含量和粘度，如表5所示。
【表5】
物质 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
含量(％) 106.2 80.3 76.3 102.1
总杂质(％) 没有检测 0.64 0.78 0.37
pH值 5.71 5.78 5.84 5.74
粘度(cP) 3394 3621 3745 2516
尽管在所有浓度的粘度均适合用作实施例的外用制剂，但含量测量的结果表明实施例2和3的制剂的含量低于实施例1和4。这可能是由于Tβ4未从制备的制剂中有效洗脱。
实施例5：外用制剂的稳定性的验证
为了验证实施例1和4的外用制剂的稳定性，在2-8℃/环境相对湿度和25℃，60％相对湿度的条件下进行12个月稳定性试验。结果如表6至9所示。
【表6】
Figure BDA0002190196340000102
Figure BDA0002190196340000111
【表7】
Figure BDA0002190196340000112
【表8】
Figure BDA0002190196340000113
【表9】
Figure BDA0002190196340000114
如表6和表7所示，实施例1和4的外用制剂在2至8℃储存时保持稳定，足以供医疗使用2年。特别是，发现实施例4的制剂即使在25℃，60％的相对湿度的苛刻的条件下也具有优异的稳定性。
以上已经描述了本发明的实施例，但是本领域普通技术人员将能够在不脱离所附权利要求中指出的本发明的精神的情况下对本发明进行各种修改和变化。通过包括，修改，删除或添加要素，这些应被认为包括在本发明的范围内。
序列表
<110> GTREEBNT科技有限公司
<120> 含有胸腺素β-4作为有效成分的稳定外用剂
<130> P2019-1097
<150> KR 10-2017-0027706
<151> 2017-03-03
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens)
<400> 1
Leu Lys Lys Thr Glu Thr
1               5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（ Homo sapiens）
<400> 2
Leu Lys Lys Thr Asn Thr
1               5
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<400> 3
Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys
1               5                   10                  15
Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu
            20                  25                  30
Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser
        35                  40

Claims (1)

1.一种外用制剂，包含：
0.0314wt％胸腺素β4(Tβ4)；
0.147wt％磷酸二氢钠作为缓冲剂；1.05wt％丙二醇作为添加剂；
2.63wt％羧甲基纤维素钠作为增粘剂；0.735wt％氯化钠；
95.4wt％蒸馏水；和
盐酸溶液调节制剂的pH值至5.7±0.1。
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