CN110423743A - 一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法，制备方法为：将环状DNA模板一，phi 29DNA聚合酶，phi 29DNA聚合酶缓冲液，BSA，dNTPs，NaCl，加无菌水；震荡，得到RCA产物1；将环状DNA模板二，phi29DNA聚合酶，phi 29DNA聚合酶缓冲液，BSA，dNTPs，NaCl，加无菌水；震荡，得到与RCA产物1序列互补的RCA产物2；将RCA产物1、2灭活、混合，震荡，得到双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。本发明的方法合成时间短。其水凝胶，生物相容性好，可设计性强，通过对模板的设计可赋予该材料更多的功能特性。可应用于药物递送，细胞培养，组织工程等。

Description

一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种利用双滚环扩增技术合成脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法。
背景技术
DNA水凝胶是一种基于DNA的宏观功能性材料，它不仅结合了水凝胶高水量，一定的机械强度等特征，同时具备了DNA的独特生物功能：序列可设计性，生物相容性，可修饰性，可降解性等。因此，作为一种新型的生物材料，DNA水凝胶在药物递送、生物传感器、靶向基因治疗、蛋白质工程、组织工程、3D打印、细胞培养等方面有很大的发展潜力。
综合目前DNA水凝胶的研究，主要由以下几种方式合成DNA水凝胶：以分支状DNA作为构建模块，通过酶连接、自组装等方式合成，杂交链式反应和滚环扩增。2006年，Luo等人利用DNA构建了三种不同形状(X，Y，T)的DNA纳米结构，通过T4DNA酶连接粘性末端形成DNA水凝胶，并初步探索了其在药物释放和细胞包封方面的应用1。2017年，Fan等人通过钳式杂交链反应指导DNA自组装形成图案可控的DNA水凝胶2。此外，滚环扩增(RCA)技术是以从环状DNA为模板，通过phi29酶进行高效等温核酸扩增的技术，按照扩增效率的不同分为线性扩增和指数扩增。Luo等人在2012年利用滚环扩增技术，得到周期性重复片段的DNA单链，而后加入两种引物进行多步引发链式扩增，通过控制两个扩增过程的时间比得到了一种具有特殊性质的DNA水凝胶3。这种水凝胶在没有水存在时表现为液体状态，再将其置于水中，放在不同形状的模具中时就可以得到不同形状的凝胶。通过设计环状DNA模板，可以赋予RCA产物多个重复性的功能性序列，比如DNA适配体、G四连体、限制性酶切位点等。此外，通过将RCA产物与包含荧光团，生物素等功能部分的互补DNA链杂交，可以制备具有多种性质的多功能材料。2017年，Yang等人利用RCA技术，通过连接银纳米团簇，制备了一种多功能脱氧核糖核酸荧光水凝胶，能够用于药物缓释，免疫医疗等多个领域4。
滚环扩增是制备DNA水凝胶的重要方式，在现有研究的基础上，开发新的滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶平台，对于滚环扩增的理论研究和应用前景具有重要意义。
参考文献
1.Um,S.H.；Lee,J.B.；Park,N.；Kwon,S.Y.；Umbach,C.C.；Luo,D.,Enzyme-catalysed assembly of DNA hydrogel.NatMater2006,5(10),797-801.
2.Wang,J.；Chao,J.；Liu,H.；Su,S.；Wang,L.；Huang,W.；Willner,I.；Fan,C.,Clamped Hybridization Chain Reactionsforthe Self-AssemblyofPatternedDNAHydrogels.AngewChemIntEdEngl2017,56(8),2171-2175.
3.Lee,J.B.；Peng,S.；Yang,D.；Roh,Y.H.；Funabashi,H.；Park,N.；Rice,E.J.；Chen,L.；Long,R.；Wu,M.；Luo,D.,Amechanicalmetamaterial madefromaDNAhydrogel.NatNanotechnol2012,7(12),816-20.
4.Geng,J.；Yao,C.；Kou,X.；Tang,J.；Luo,D.；Yang,D.,AFluorescentBiofunctional DNAHydrogel Prepared by EnzymaticPolymerization.AdvHealthcMater2018,7(5).
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
本发明的第二个目的是提供一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a.按比例，将3×10-3～1×10-2nmol的环状DNA模板一，3～8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05～0.1nmol的dNTPs，终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于200～450rpm转速下震荡5～20h，得到RCA产物1；
b.按比例，将3×10-3～1×10-2nmol的环状DNA模板二，3～8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05～0.1nmol的dNTPs，终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于200～450rpm转速下震荡5～20h，得到与RCA产物1序列互补的RCA产物2；
c.将所述RCA产物1和RCA产物2分别在65℃下灭活10min后进行等体积混合，200～450rpm震荡5～20h，得到双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
环状DNA模板一用下述方法制成：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为30～150，设计ssDNA-1的引物1，所述引物1的碱基数为7～37，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；
b.将所述ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入2U的T4DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应3～8h，得到环状DNA模板一；
环状DNA模板二用下述方法制成：
d.设计合成与ssDNA-1完全互补的5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为30～150，设计ssDNA-2的引物2，所述引物2的碱基数为7～37，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
e.将模板ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
f.向200ng的e步骤得到的产物中加入2U的T4DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应3～8h，得到环状DNA模板二。
步骤b中ssDNA-1的摩尔数为100μmol。
步骤e中ssDNA-2的摩尔数为100μmol。
上述方法制备的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
本发明的优点：
本发明的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的方法，是基于滚环扩增技术合成脱氧核糖核酸水凝胶的方法，相比于单滚环扩增合成的脱氧核糖核酸水凝胶，明显地缩短了合成的时间。用本发明的方法制备的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶，生物相容性好，可设计性强，通过对模板的设计可赋予该材料更多的功能特性。可以应用于药物递送，细胞培养，组织工程等方面。
附图说明
图1为验证合成环状DNA模板一和环状DNA模板二的电泳图，其中图1A为环状DNA模板一，图1B为环状DNA模板二。
图2为合成的单、双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的照片，其中图2A为单滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶，图2B为单滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
图3为合成的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的扫描电镜照片。
图4为双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的流变学测试图。
图5为双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶进行细胞培养的共聚焦荧光显微镜照片。
具体实施方式
BSA是牛血清白蛋白的简称。
ssDNA是线性单链DNA的简称。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1
环状DNA模板一用下述方法制成：
5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1、引物1、5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2、引物2的序列如表1所示：
表1.脱氧核糖核酸序列
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为92，设计ssDNA-1的引物1，引物1的碱基数为22，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；
ssDNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，见表1。
引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，见表1。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
退火程序：
95℃ 2min
65℃ 2min
60℃ 5min30s 每30s降温0.5℃，进行80次循环
20℃ 30s
4℃ 10min
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入2U的T4DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应5h，得到环状DNA模板一。见图1
实施例2
环状DNA模板一用下述方法制成：
5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1、引物1、5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2、引物2的序列如表2所示：
表2.脱氧核糖核酸序列
环状DNA模板一的制备：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为30，设计ssDNA-1的引物1，引物1的碱基数为7，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；
ssDNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，见表2。
引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，见表2。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
退火程序：
95℃ 2min
65℃ 2min
60℃ 5min30s 每30s降温0.5℃，进行80次循环
20℃ 30s
4℃ 10min
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入2U的T4DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应3h，得到环状DNA模板一；
实施例3
环状DNA模板一用下述方法制成：
5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1、引物1、5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2、引物2的序列如表3所示：
表3.脱氧核糖核酸序列
环状DNA模板一的制备：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为150，设计ssDNA-1的引物1，引物1的碱基数为37，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对。
ssDNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，见表3。
引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，见表3。
b.将5’端经过磷酸化修饰的所述ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
退火程序：
95℃ 2min
65℃ 2min
60℃ 5min30s 每30s降温0.5℃，进行80次循环
20℃ 30s
4℃ 10min
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入2U的T4DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应8h，得到环状DNA模板一。
实施例4
环状DNA模板二用下述方法制成：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为92，设计ssDNA-2的引物2，引物2的碱基数为22，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
ssDNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，见表1。
引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，见表1。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
退火程序：
95℃ 2min
65℃ 2min
60℃ 5min30s 每30s降温0.5℃，进行80次循环
20℃ 30s
4℃ 10min
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入2U的T4DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应5h，得到环状DNA模板二，见图1。
实施例5
环状DNA模板二用下述方法制成：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为30，设计ssDNA-2的引物2，引物2的碱基数为7，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
ssDNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，见表2。
引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，见表2。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
退火程序：
95℃ 2min
65℃ 2min
60℃ 5min30s 每30s降温0.5℃，进行80次循环
20℃ 30s
4℃ 10min
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入2U的T4DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应3h，得到环状DNA模板二；
实施例6
环状DNA模板二用下述方法制成：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为150，设计ssDNA-2的引物2，引物2的碱基数为37，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对。
ssDNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，见表3。
引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，见表3。
b.将所述ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
退火程序：
95℃ 2min
65℃ 2min
60℃ 5min30s 每30s降温0.5℃，进行80次循环
20℃ 30s
4℃ 10min
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入2U的T4DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应8h，得到环状DNA模板二；
实施例7
一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a.将5×10-3nmol的由实施例1得到的环状DNA模板一，5U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于400rpm转速下震荡15h，得到RCA产物1；
b.将5×10-3nmol的由实施例4得到的环状DNA模板二，5U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于400rpm转速下震荡15h，得到与RCA产物1序列互补的RCA产物2；
c.将述RCA产物1和RCA产物2分别在65℃下灭活10min后进行等体积混合，400rpm震荡10h，得到双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。见图2B、3和4。
实施例8
一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a.将3×10-3nmol的由实施例2得到的环状DNA模板一，3U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05nmol的dNTPs，终浓度40mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于200rpm转速下震荡20h，得到RCA产物1；
b.将3×10-3nmol的实施例5得到的环状DNA模板二，3U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05nmol的dNTPs，终浓度40mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于200rpm转速下震荡20h，得到与RCA产物1序列互补的RCA产物2；
c.将所述RCA产物1和RCA产物2分别在65℃下灭活10min后进行等体积混合，450rpm震荡5h，得到双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
实施例9
一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a.将1×10-2nmol的由实施例3得到的环状DNA模板一，8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于450rpm转速下震荡5h，得到RCA产物1；
b.将1×10-2nmol的由实施例6得到的环状DNA模板二，8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于450rpm转速下震荡5h，得到与RCA产物1序列互补的RCA产物2；
c.将所述RCA产物1和RCA产物2分别在65℃下灭活10min后进行等体积混合，200rpm震荡20h，得到双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
实施例10
一种单滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
将5×10-3nmol的由实施例1得到的环状DNA模板一，5U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于400rpm转速下震荡25h，得到单滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶，见图2A。
实施例11
双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶用于细胞培养，包括如下步骤：
将含有5×104个Hela细胞的细胞悬浮液加入由实施例7得到的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶中，在37℃，含5％CO2的细胞培养箱中共孵育12h，在共聚焦显微镜下观察。见图5。
实验证明，分别将含有5×104个Hela细胞的细胞悬浮液加入由实施例8、9制备得到的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶在37℃，含5％CO2的细胞培养箱中共孵育12h，在共聚焦显微镜下观察，其效果与实施例7的效果相似。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtttgatg ttcctaacgt accaacgcac acgcagtatt atggactggt aaaagctttc 60
cgaggtagcc tggagcatag aggcattggc tg 92
<210> 2
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagccaatgc ctctatgctc caggctacct cggaaagctt ttaccagtcc ataatactgc 60
gtgtgcgttg gtacgttagg aacatcaaac ga 92
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taggaacatc aaacgacagc ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggctgtcgt ttgatgttcc ta 22
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgtttgatg ttcctaagag gcattggctg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagccaatgc ctcttaggaa catcaaacga 30
<210> 7
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgagac 7
<210> 8
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctggct 7
<210> 9
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgtttgatg ttcctaacgt accaacgcac acgcagtatt atggactggt aaaagctttc 60
cgaggtagcc tggagcatag agcacacgca gtattatgga ctggtaaaag ctttccgagg 120
tagcctggag catagatatg gcattggctg 150
<210> 10
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagccaatgc ctctatgctc caggctacct cggaaagctt ttaccagtcc ataatactgc 60
gtgtgcgttg gtacgttagg aacctcggaa agcttttacc agtccataat actgcgtgtg 120
cgttggtacg ttaggaataa catcaaacga 150
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttggtacgt taggaacatc aaacgaccgt aaccgac 37
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agcctggagc atagaggcat tggctgtgta gtttgct 37

Claims (4)

1.一种双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，其特征是包括如下步骤：
a.按比例，将3×10-3～1×10-2nmol的环状DNA模板一，3～8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05～0.1nmol的dNTPs，终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于200～450rpm转速下震荡5～20h，得到RCA产物1；
b.按比例，将3×10-3～1×10-2nmol的环状DNA模板二，3～8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05～0.1nmol的dNTPs，终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μl；于200～450rpm转速下震荡5～20h，得到与RCA产物1序列互补的RCA产物2；
c.将所述RCA产物1和RCA产物2分别在65℃下灭活后进行等体积混合，200～450rpm震荡5～20h，得到双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述环状DNA模板一用下述方法制成：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为30～150，设计ssDNA-1的引物1，所述引物1的碱基数为7～37，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；
b.将所述5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入2U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4buffer，22℃下恒温反应3～8h，得到环状DNA模板一；
所述环状DNA模板二用下述方法制成：
d.设计合成与ssDNA-1完全互补的5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为30～150，设计ssDNA-2的引物2，所述引物2的碱基数为7～37，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
e.将模板ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
f.向200ng的e步骤得到的产物中加入2U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4buffer，22℃下恒温反应3～8h，得到环状DNA模板二。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤b中ssDNA-1的摩尔数为100μmol；所述步骤e中ssDNA-2的摩尔数为100μmol。
4.权利要求1-3之一的方法制备的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
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