CN110392830A - 用于改进的精度、鉴定和定量的iroa代谢组学工作流程 - Google Patents
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Abstract
公开了代谢物化合物的IROA基质。其化合物中的每一种的分子量为2000 AMU或更少，并且作为第一和第二同位素异构体存在，所述第一和第二同位素异构体以两种预定的同位素异构平衡同等存在，并且分别含有2‑10%的第一同位素和90‑98%的第二同位素。还公开了用于将天然丰度质谱分析代谢物样品转化为IROA样品的试剂对，其包含两种组成第一和第二同位素异构体的反应性同等试剂，所述第一和第二同位素异构体分别含有2‑10%的第一同位素和90‑98%的第二同位素。试剂对的每一种含有相同的反应性基团，该反应性基团与存在于通过生物学产生的代谢物化合物的组合物中的一种或多种化合物的官能团反应和键合。还公开了制备和使用上述和相关材料的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年2月24日提交的题为"Implementing IMS-assisted IROA forMetabolomics(实施IMS-辅助IROA用于代谢组学)"的临时专利申请号62/463153的权益，其公开的内容通过引用结合。
背景技术
代谢物为小分子量化合物(小于约2000 Da，更通常小于约1000 Da)，其在生物系统中在各种代谢途径和细胞调节过程中用作构建模块或作为终产物生产。在生物系统中代谢物的完全集合，无论是在细胞、途径还是生物体水平，称为“代谢组”。在代谢组中这些代谢物的水平由生物系统的基因组、蛋白质组和/或转录组规定，或被环境干扰影响，并且导致表型变化。因此，代谢组学可应用于映射或鉴定表型改变的起因并且理解“组学(omics)”之间的相互关系。Dwivedi等人，Int J Mass Spectrom 2010 298:78-90。
已开发同位素比率异常值分析(IROA)，使得能够表征在给定的代谢物或碎片中的碳信息。与其他稳定的同位素标记方法不同，不是利用具有天然丰度(1.1%的13C同位素异构体(isotopomer)在自然界中在碳原子中见到)和98-99%富集的基质分别用于对照和实验群体，利用原养型酵母的IROA使用随机的95% 12C葡萄糖(5% 13C)和95%随机的13C葡萄糖(5% 12C)作为碳来源。该策略导致在质谱中对于可观察的同位素峰更加可预测和诊断的图案。[Qiu等人，Metabolite 2018 8:9]。
在模型生物体研究中已证明IROA用于代谢表型分析的前景。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，一种在CEN.PK背景中的原养型野生型菌株[Brauer等人，Mol. Biol. Cell2005，16:2503-2517]，在含有随机的95% 12C或95% 13C葡萄糖作为主要碳来源的最小酵母氮基(YNB)培养基中生长，以使所有代谢物的同位素异构体图案反映标记的葡萄糖[Qiu等人，Anal. Chem. 2016，88:2747-2754]，这是一种可容易适应微生物种类研究的方案。
在产生的代谢物产物中，基于初始基质富集，在95% 13C样品(Mn-1，Mn-2等，13C外壳)中轻质同位素体(isotopologue)或在95% 12C样品(M0+1，M0+2等，12C外壳)中重质同位素体的丰度遵循对于13C的二项式分布。12C (M0)同位素峰和13C (Mn)同位素峰之间的质量差异指示在代谢物的碳骨架中碳的数量(n)。这使得对照(13C)和处理(12C)的组之间的标准化和化学式产生(CFG)的可能性变窄。[Qiu等人，Metabolite 2018 8:9]。
可使用代谢组学技术，诸如IROA基础或IROA表型方案(最佳)[de Jong和Beecher，C. Bioanalysis2012，4 (18):2303-2314]或标准代谢组学技术以鉴定和粗略定量生物样品中的几百或甚至数千种化合物。然而，为了进行这样的测量和从任意两个或更多个样品比较测量，所有样品需要在单批次中分析，理想地在一天期间，因为日日之间的变化太大而不能以其它方式克服，和不能确保绝对定量(即，相对于已知的标准)。
比较在相同的仪表装置上间隔几天运行的样品当前在定量上是不可接受的，并且不能比较在不同的仪器上产生或基于不同的方法的数据。仪器漂移、色谱漂移、甚至环境条件可充分改变结果，以至于甚至在相同的仪器上难以得到再现性。除了定量的这些问题以外，横跨许多单独的质谱技术鉴定任何化合物不太可能成功，除非已进行非常仔细的校准和运行可信的标准。这是因为，不仅存在多种可混淆的生物化合物(因为它们具有相同的精确质量)，而且甚至更有问题的是，通常存在更多与生物同重元素等价物在结构上不同，但是可共享正确的质量或甚至分子式的假象或碎片化合物。
下文公开的发明延伸了在以下美国专利中描述的方法：2010年10月26日授权的基础IROA专利第7,820,963号，下文中称为IROA963；2010年10月26日授权的第7,820,964号，下文中称为IROA964；2012年5月1日授权的第8,168,945号，下文中称为IROA945；2013年9月17日授权的第8,536,520号，下文中称为IROA520；和2015年3月3日授权的第8,969,251号，下文中称为IROA251。这些专利和其中引用的技术通过引用结合到本文中。
IROA方案依赖于同位素图案的产生，所述图案在数学上提供有用信息以在生物样品中插入信息，以当样品经历质谱分析时，提供单个化学组分的更好鉴定和定量。传统的方法需要在色谱上清晰的(即，“基线”)分离，以实现最佳定量精度，IROA方案不是如此，因此可用于定量在化学上非常复杂的样品(其中这样的分离不是一致可能的)。
所研究的示例性样品均匀和普遍地被适当的同位素标记。优选使用其中存在两种通过酶或活的系统不能显著区分的稳定的同位素的元素。碳(具体而言，12 C和13C)在本文中用于说明的目的，因为其普遍适用性。然而，另外的实例是普通技术人员周知的。
使用呈现最小生物学同位素影响的同位素是重要的。例如，使用氢的同位素诸如氘(D)不合适，因为其通常引起对代谢的显著影响(由于氘同位素的质量是氢质量的两倍，因此引起一些酶机理的动力学降低的事实)。氚(T)为放射性的，因此对衰变不稳定。
在许多这些方案中，产生IROA图案依赖于产生其中在分子中所有碳的概率小心地约束于同位素概率的接近范围的分子。用作说明地，对于使用碳的稳定的同位素[碳-12(12C)和碳-13 (13C)]的系统，在该实例中，同位素比率具体而言包括5-10 %的一种碳同位素在另一种中的稀释；即，一种样品在可为95%碳-12 (12C)和5%碳-13 (13C)的碳来源(在培养基中的营养物)(下文中称为"C-12培养基")上生长，在这种情况下，另一种样品在含有营养物的镜像培养基中生长，该营养物在培养基中含有95%碳-13和5%碳-12，下文中称为"C-13培养基"。在这些情况的每一种下，生物系统吸收培养基中的营养物，并且在其上以以下方式生长，所述方式使得自身转化，使得所有其各部分与它们的来源可区分地鉴定。其他信息有时可通过在营养物组合物中掺入第二组以两种不同的预定同位素比率存在的第二原子的两种同位素而得到。
当将两种样品混合、掺杂或以其他方式复合时，复合样品含有来自"对照" (由实质多数(例如，90%-95%)的12C组成)和"实验" (由实质多数(例如，90%-95%)的13C组成)二者的分子。显著偏离该方法教导的90%-95%比率降低如在IROA963中教导的解释的潜力，尽管已成功地使用98%和2%的碳同位素。
再更具体而言，在一种说明性IROA标准样品中，概率可设定为95% C-13。在这样的标准中，包含在其中的所有分子呈现其碳的概率将如可实现的接近95% 13C的性质。这样的IROA分子具有许多特别的性质，即：
1) 12C与13C的同位素平衡比约1.1%的天然丰度概率大得多，但明确地没有接近100%，因此，每一种分子自身作为该分子的同位素异构组的集合呈现，其中每一组的质量相差精确一个碳中子的质量或约1.00335 AMU。这些组比天然丰度等价物显著更大且更复杂，并且可容易鉴定。
2) 横跨以上组的同位素异构体的分布随着分子中碳的数量和在每一个这样的位置中13C的概率而变。由氢、氧、氮等的其他天然丰度来源贡献的同位素异构组的存在如此小，以至于它们的图案同等分布于C13同位素异构组中并且对C13同位素异构组无关紧要。
3) 在质谱仪中作为峰的高度可推理每一种IROA分子的同位素异构体的量，因此，所有同位素异构组的相对浓度产生对于每一种分子的峰的图案。该图案有效定义为二项式分布百分数(x)和碳的数量(n)，因此可计算为概率，((1-x) + (x))n。
4) 这些IROA图案是IROA样品的任何质谱分析的显著特征。因为图案本身可相当复杂，由于随机峰噪声导致的它们的出现实际上不存在。开发了以高精度鉴定这些图案的软件。
5) 不能看到这样的分子的C12和C13单同位素质量，但是可通过检查看到的图案的形状而确定所述质量。受碳的数量有效约束的单同位素质量为分子的分子式的独特的决定因素，比试图解决天然丰度分子所需的多项式等式显著更精确。
6) 除了分子的同位素异构组的质量差异以外，分子以其他方式不能区分，因此贯穿几乎所有处理表现非常类似，并且通常具有相同的物理特性。IROA峰的该特性是IROA鉴定技术的基础。
存在许多基于这些性质的IROA方案。以下两种IROA方案与本发明相关。
基础IROA方案
基础IROA方案(其描述于IROA963，并且在IROA945和IROA520中继续)产生含有宽泛不同量的第一同位素和第二同位素的IROA分子的两个群体，量通常分别90-95%的第一同位素与10-5%的第二同位素，以及10-5%的第一同位素与90-95%的第二同位素。优选不同于氢和氘的同位素，诸如特别优选的约5% C13和约95% C12与约5% C12和约95% C13一起使用。
在两种群体中，C13在每一种化合物中的分布是随机和普遍的，并且作为C12或C13的碳的概率为所述值，此处为约5%或95%。分子的实验“基础”群体(C12-B)具有约5% C13，剩余的碳(95%)为C12。对照“内标”群体(C13-IS)样品由约95% C13和5% C12组成。
由于C12-B和C13-IS二者由IROA分子组成：
1) 对于任何给定的分子，它们相应的峰图案不同，但是均解至相同的分子式。C12-B单同位素峰具有明显的M+1、M+2峰以及可能另外的M+n峰。C13-IS单同位素峰具有明显的M-1、M-2峰以及可能的另外的M-n峰。
2) 与基于氘的同位素异构体不同，这些同位素异构体产生共色层分离，并且除了质量，呈现非常类似的物理性质。
3) IROA化合物峰仅可在大多数实验系统中通过生物手段(IROA520)产生，但是也可制备和加入故意的合成的IROA化合物(IROA964)。在该工作流程中，IROA信号的存在确保所有IROA图案仅可来自C13-IS或C12-B，并且与总是基于天然丰度同位素特征的假象、电子噪声或任何假的信号立即可区分。
4) 当在相同的样品中发现来自C12-B样品和C13-IS二者的相同分子的图案时，成对的信号为三重冗余信息系统，其中：
a) 对于来自实验样品的IROA分子，可通过M+1与C12-B单同位素的高度的比率，确定分子中碳的数量，
b) 对于来自C13-IS样品的IROA分子，可通过M-1与C13-IS单同位素峰的高度的比率，确定分子中碳的数量，和
c) 可通过来自实验样品的分子的单同位素质量和来自C13-IS的单同位素的质量之间的质量差异，确定分子中碳的数量。
当所有这三种计算指示相同的碳的数量时，极其可能图案已被正确地发现，并且误差的概率极低。因为这些图案的发现可完全受软件驱动，这样的峰的发现为完全可自动化的任务(IROA945)。
基础IROA方案允许实验样品的完全无偏倚的(或非针对性的)分析，其中可制备C12-B以根据实验设计改变，用于发现这样的实验设计的生物效果的目的。在这样的样品中，C12-B群体衍生自实验样品，并且如果分子不恰巧是在C13-IS或C12-B样品中，该分子的存在和可能鉴定仍是可能的，并且在另一种中该分子的不存在为可建立的事实。
尽管没有三重冗余，随机产生的(即，假象) IROA峰的存在如此低，以至于单一IROA峰容易原样鉴定，并且可定量。因此，该基础IROA方案适合其中能发现和表征在C12-Bl或C13-IS中生物起源的所有峰的实验情形，从而鉴定其中分子在一种中存在但是在另一种中缺少的那些情形。
基础IROA方案的三重冗余为如此强的算法，以至于通过简单地执行峰形状要求就可发现非常弱的信号，即使在存在非常强的噪声下。
在其中C12-B和C13-IS侧均具有同等化学组成并且匹配同位素平衡的基质的情况下，通过设计，对称性的要求使得在深度噪声情形下以小几率的误差容易发现许多非常小的峰。因此，基质代表IROA基础方案的特殊情况，其中其特性如此可预测，以至于使得由其衍生的信息特别可再现，并且能在极低水平的检测下被发现。
IROA工作流程基于该独特的性质。用于基质的材料的来源可为生物或合成的。IROA鉴定技术可施用于任何IROA峰，以进一步加强鉴定潜在的化合物。
表型IROA方案
表型IROA方案为用于这样的情形的方案，所述情形中标记实验样品本身不可行或不实用，但是共同的和一致的95% (+/- 3%) IROA内标(诸如上述C13-IS)用于确保精确鉴定分子和精确定量。表型方案可用于分析人(临床)样品、农业样品、工业样品或其中实验样品的尺寸或来源使得标记它们完全不可行的其他情形。然而，通过提供共同的严格的IROA内标，表型方案提供更加精确的路线用于鉴定和定量在样品天然丰度分离物中发现的大量化合物。
与基础IROA的“无偏倚的”或“非针对性的”分析不同，表型IROA为基于在化学上非常复杂的IROA内标(IS)的非常大量化合物的针对性定量分析。C13-IS可含有大大超过1000种化合物(可能无限的)，但是较早概述的IROA性质不需要完全色谱分离以确保包含在IS中的所有化合物的身份和定量二者。
表型方案将IROA内标放入每一个天然丰度样品中，并且使用来自C13-IS双重信息碳的13C-单同位素质量和数量，以定位相同化合物的天然丰度同位素异构体。发现的峰的天然丰度时间分辨色谱谱与其天然丰度同位素形式的相互关系随后用于支持基于IROA的鉴定。
因为IROA峰在信息学上是自包含的，可正确地鉴定和定量多个共洗脱峰。在表型方案的情况下，通过工人可产生IS，以提供实验系统的独特的定量需求的支持。因此，小麦研究员可产生可使用的小麦C13-IS，因为其含有更多反映小麦生物化学的化学谱，但是该C13-IS主要用于发现和鉴定在小麦中的IROA峰，并且定量它们的天然丰度配对物。虽然基础IROA方案的三重冗余在表型方案中不存在，信号仍冗余，因为95% C13-IS提供碳的质量和数量，以精确确定在哪发现天然丰度单同位素信号(参见图10F)。
在IROA工作流程中，相同的C13-IS用于基质和临床或实验样品二者，而衍生自基质样品的化学信息用于核实和验证在临床或实验(表型)样品中发现的化合物。可分析表型样品的化学信息至与基质样品相同的程度，但是这并不是必需的。例如，虽然需要分析基质样品以完全表征存在于其中的每一种化合物，可为足够的是使用衍生自基质的分析的质量和保留信息，以在实验或临床样品中发现相同的化合物，并且使用比在基质样品中可能的更高的获取率，以实现更高的定量精度。
发明内容
在一方面，本发明预期一种通过生物学产生的代谢物化合物的IROA基质组合物。每一种那些代谢物化合物的分子量为约2000 AMU或更少。每一种代谢物化合物作为第一和第二同位素异构体存在，所述同位素异构体以两种预定的同位素异构平衡同等存在。第一同位素异构体含有约2-约10%的第一同位素，而第二同位素异构体含有约90-约98%的相同原子的第二同位素。第一和第二同位素对放射性衰变稳定，并且不同于氢和氘。
通过生物学产生的代谢物化合物由细胞溶解产物制备物得到，所述细胞溶解产物制备物由单细胞或多细胞生物体的培养得到，并且所述分子随机和普遍地被选自由以下的同位素组成的组的一种或多种元素的同位素对标记：碳(12C和13C)、氮(14N和15N)、氧(16O、17O或18O)、硫(32S、33S、34S或36S)、氯(35Cl和37Cl)、镁(24Mg、25Mg和26Mg)、硅(27Si、28Si和29Si)、钙(40Ca、42Ca、43Ca和44Ca)和溴(79Br和81Br)。
本发明的另一个预期的方面是一种产生在如上所述的IROA基质中化合物的身份数据的参考文库的方法，所述方法包括以下步骤：1) 通过质谱确定在设备的分辨率和灵敏度内的IROA基质的化合物的身份，以提供其对称的IROA峰图案，并且另外确定以下的一种或多种：a) 存在的化合物的气相色谱和/或液相色谱性质，b) 存在的化合物的碰撞横截面，和c) 存在的化合物的碎片化图案。保持如此确定的化合物身份数据，用于在后来分析的样品中鉴定一种或多种相同的化合物。还预期在IROA基质中化合物的身份数据的参考文库自身。使用化合物碰撞横截面和碎片化图案中的一种或二者优选与质谱鉴定结合。
进一步预期的发明是一种使用内标在天然丰度样品中定量和鉴定化合物的方法，所述内标与含有约90-约98%的IROA基质组合物的含有较重分子量同位素的化合物的同位素异构体具有相同的化学组成，并且在该天然丰度样品中插入。将在所述内标中的每一种化合物自身鉴定于前述身份数据的参考文库中。优选确定天然丰度样品的每一种可鉴定化合物的量，更优选，相对于内标，确定每一种天然丰度样品化合物的量。
本发明的又一方面是一种关于质谱设备和关联的离子迁移率通道和色谱设备(在存在时)的操作稳定性测量品质保证和/或品质控制的方法。该方法包括以下步骤：测定如上所述的IROA基质组合物的样品，和确定在每一种分析中是否存在相同组和振幅的对称的IROA质谱峰。此处重复关于IROA基质组合物以上陈述的优选，并且每一次在本文使用基质组合物或其组分。
本发明的再其他方面预期能将天然丰度质谱分析代谢物样品转化为IROA样品的试剂对。该试剂对包含组成第一和第二同位素异构体的两种反应性同等试剂。第一同位素异构体含有约2-约10%的第一同位素，而第二同位素异构体含有约90-约98%的相同原子的第二同位素。第一和第二同位素对放射性衰变稳定，并且不同于氢和氘。每一种试剂对含有相同的反应性基团，该反应性基团与存在于通过生物学产生的代谢物化合物的组合物中的一种或多种化合物的官能团反应和键合。天然丰度质谱分析样品的每一种通过生物学产生的代谢物化合物的分子量为约2000 AMU或更少。
试剂对反应性基团与选自由以下一种或多种组成的组的通过生物学产生的代谢物官能团反应和键合：胺、醛或酮、羟基、硫醇和羧酸。优选，反应性基团与胺官能团反应和键合。优选的反应性基团为异硫氰酸酯反应性基团，并且试剂对为异硫氰酸苯基酯的同位素异构体，其第一同位素异构体含有约2-约10%的第一同位素，并且其第二同位素异构体含有约90-约98%的第二同位素。备选的试剂对为肼或氨基脲的IROA同位素异构体，其与存在于天然丰度质谱分析代谢物样品的醛和酮基团的羰基反应和键合。
附图简述
在形成本公开的一部分的附图中，
图1A显示对含有天然丰度量的12C和13C的乳糖的分析得到的质谱峰，图1B显示对含有95% 12C和5% 13C的乳糖的分析得到的质谱峰，图1C显示对含有5% 12C和95% 13C的乳糖的分析得到的质谱峰，而图1D显示对乳糖的分析得到的质谱峰，所述乳糖含有等量的含5%13C和95% 12C以及95% 13C和5% 12C的乳糖；
图2说明含有天然丰度的12C和13C二者的乳糖的谱图以及由含有95% 13C的乳糖得到的峰，并且通过两种基峰的m/z值的差异为12 AMU说明在测定的分子中碳原子的数量；
图3说明IROA峰的对称的排列，其中两种基峰的m/z值之间的差异限定存在于测定的化合物中的碳原子的数量。参见，例如，de Jong，F. A.；Beecher，C. Bioanalysis 2012，4(18)，2303-2314；
图4宽泛地说明在制备IROA样品中的步骤，该样品由在培养基中生长的酿酒酵母单独制备，该培养基含有5% 13C或95% 13C作为主要来源，从该主要来源中制备溶剂可溶性(通常为水)细胞溶解产物，提供两种含有相同量的存在并且含有5% 13C或95% 13C的每一种酵母代谢物化合物的溶液，随后将其合并，以形成合并的提取物，将其冻干，以形成可重构的IROA标准，本文中称为“基质”。参见，例如，Qiu等人，J. Anal. Chem.2016，88 (5)，2747-2754；
图5上面的部分显示具有在虚线矩形内的分析物离子和在该虚线矩形外部的未知起源的离子的IM设备漂移管的示意图和模拟的离子迁移率光谱-(IMS-)辅助IROA质谱，所述质谱含有其上加有X以指示由于未知起源的那些离子所致的峰的峰，并且其中干扰检测的IROA质量但是已通过离子迁移率分开的未知起源的离子用黑色圆圈表示；
图6与图5类似，不同之处在于该图为其中检测两种异构体的模拟，并且如在上面的示意性IM漂移管中可见，其已分离的分析物在两个虚线矩形中显示，那些虚线矩形外部的未知起源的离子具有与图5相同的含义，并且因为存在用于它们的IROA内标，它们可独立地定量，若没有IROA内标和离子迁移率二者，这是不可能的。参见，例如，Dwivedi等人，Int. Jounal Mass Spectrom.2010，298 (1-3):78-90，其讨论了IMS辅助质谱法的使用；
图7A说明如在图4中并且在下文中更详细地讨论所制备的合并的酵母提取物(IROA基质)的一部分的LC-IM-MS分析，其中在框(box)内的LC分离的部分是通过质谱分析的部分，并且在加框的线下面的线说明洗脱溶剂梯度，图7B说明对于与LC痕迹相邻的11碳化合物，使用所得到的质谱分析(加框的峰)的LC分离的部分，图7C说明在上面的部分中分离和MS分析的进一步的细节例如保留时间、质量范围和漂移时间，以及容易显示IROA峰图案、具体的漂移时间和在分析的化合物中碳的数量的IM分析；
图8A说明来自LC分离的另一个峰(加框的)的LC-IM-MS分析，其中5碳化合物为分析物，图8B说明具有进一步细节的使用LC-MS分离的一个IROA公认的图案，所述细节从IM数据指示存在两种化合物；
图9A说明由在图的左侧加框的LC峰得到的化合物的重叠MS峰图案，图9B说明去卷积谱图，其中IM数据指示两种9碳化合物具有相同的化学式，并且漂移时间与身份数据参考文库匹配，并且还存在10碳化合物，图9C显示鉴定的三种化合物中的每一种的质谱；
图10A为精氨酸的质谱，其中C12和C13以天然丰度存在，而图10B显示使用含有95% C12和5% C13的精氨酸的类似的光谱，图10C显示含有95% C13和5% C12的精氨酸的质谱，图10D显示当存在等量的含有95% C12和5% C13的化合物以及含有95% C13和5% C12的化合物时，精氨酸的基础IROA光谱，图10E说明精氨酸天然丰度噪声的三重冗余IROA峰图案，其中当C12 M+1、C13 M-1的高度以及在两种单同位素峰之间的质量差异均指示在分子中存在相同数量的碳时，确保单同位素峰之间的关系，图10F说明表型"冗余"，其中天然丰度峰的身份通过13C单同位素峰的分子式和通过其M-1的高度指示的碳的数量二者来确认，该M-1的高度通过C13-IS样品与用于分析的样品的混合物提供。在图10A-D的每一个光谱中，与精氨酸关联的峰打星号(*)；
图11A显示当使用含有等量的含有95% C12和5% C13的化合物和含有95% C13和5% C12的化合物的样品测定腺苷时存在的质谱峰，图11B显示当使用含有等量的含有95% C12和5%C13的化合物和含有95% C13和5% C12的化合物的样品测定苯基丙氨酸时存在的质谱峰。注意到在每一个光谱中，对于基峰，通过m/z值的差异提供存在的碳原子的数量；
图12A说明基于使用等量的5% C12和95% C13苯基丙氨酸和95% C12和5% C13苯基丙氨酸的混合物，苯基丙氨酸的质谱IROA峰图案；图12B说明在SWATH碎片化之后，该相同的苯基丙氨酸样品的质谱IROA峰图案；图12C提供经由自图12B的峰碎片解释的IROA诊断结构信息；
图13A和图13B说明当使用同位素标记的IROA化合物(图13A)或被同位素标记的试剂诸如95% C13苯基硫代氨基甲酰基(PITC)基团衍生的天然丰度化合物(图13B)衍生时，精氨酸的衍生的峰在离子迁移率方面保持它们的IROA特性[具有和不具有差分迁移率光谱(DMS)]。同位素异构体的集合在离子迁移率(此处为Sciex SelexIon™)方面作为一个单位出现。
图14A和图14B说明对于类似制备和测定的酪氨酸衍生物，IROA特性的类似保持；
图15A、图15B、图15C和图15D说明IROA的能力，特别是与离子迁移率结合，以将复杂的谱图分离成为它们的组分单个谱图。因此，IROA峰的同位素异构集合保留IM中的IROA峰，此处使用Agilent 6560 (离子迁移率飞行时间) IM-QTOF机器，其使用漂移管IM (DT-IM)。虽然ClusterFinder™软件在预先-IM质谱中基于质量差异分离出重叠IROA峰(图15A)，此处在IM中清晰地分离两个共洗脱IROA峰(图15B)用于基于它们的IROA特性的完全化合物谱图鉴定(图15C和图15D)。
定义：
本文使用的缩写“13C”、“C13”和“13C”均指原子重量为13 AMU的元素碳的同位素。类似地，缩写“12C”、“C12”和“12C”均指原子重量为12 AMU的元素碳的同位素。
色谱法可意指任何形式的化学分离，包括不限于所有形式的液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳(CE)、离子迁移率(IM)、固相萃取(SPE)等。
化合物鉴定意指确定化合物的物理特性的任何方法，包括不限于质谱法(ms)、碎片化(msms)、电荷和电子性质(ms、IM等)、形状(IM、漂移等)、键合和振动性质(各种光谱方法)及其IROA形式(基础质量和碳的数量)。
基质为化合物诸如代谢物(包括合成代谢产物和分解代谢产物分子)或在给定的研究中利用或存在的其他化合物的标准充分限定的基础IROA混合物，并且含有至少一种一对相同元素的稳定的同位素的化合物，该同位素的分子量(AMU)差异至少1 AMU。在该至少一种化合物的分子中，以预定的比率存在该两种同位素，该预定的比率不同于那些同位素的天然存在的比率。
存在各种基质，但是每一种基质支持具体的分析系统，诸如血浆、人活组织检查、小麦、尿等。此外，可制备多个基质用于相同的具体的分析系统。
文库为已知存在于基质的化合物的组。
内标(IS)为可代表IROA化合物诸如代谢物的较轻或较重组、基质样品的其亚组的化合物或在给定的研究的基质样品中存在或利用的其他化合物的化学混合物，并且外源地插入待分析的每一种样品中。与基质一样，IS为化合物的标准充分限定的混合物。基质和IS二者的化学组成理想地相同。
本文使用的预定的第一和第二稳定的同位素量优选以彼此的"反向比率"诸如刚刚以上讨论的那些存在，其中第一比率的分子的数量是第二比率的分母的数量，而第一比率的分母的数量是第二比率的分子的数量。
采用95%和5%的以上比率，在C-12培养基中，第一比率将为95/5的12C/13C，而在C-13培养基中，第二反向比率将为5/95的12C/13C。应理解的是，比率的预期的组不必是95/5和5/95，虽然特别优选那些量，本文使用它们是为了方便起见。
应理解的是，在基质或任何其他外源地提供的组合物诸如内标中存在的第一和第二稳定的同位素是预定的，并且每一种同位素的它们相应量亦是如此。因此，词语“预定的”和“稳定的”在本文中很少使用，它们的存在暗示冗长最小化。
优选实施方式的详细说明
本发明的第一方面预期一种通过生物学产生的代谢物(包括合成代谢产物和分解代谢产物分子)的IROA基质组合物，其通常在室温下为固体，在含水培养基(如下文定义的)中可分散或可溶。单个代谢物的分子量小于约2000 AMU，优选约1500 AMU或更少，更优选小于约1000 AMU。对于预期的代谢物，重量下限为约60-75 AMU，如在乙酸和甘氨酸中。
每一种化合物以两种预定的同位素异构平衡同等存在，使得每一种同位素异构体以约2-约10%的同位素1和约90-约98%的同位素2存在。相同原子的说明性可用的第一和第二同位素为包括以下的同位素的一种或多种元素：碳(12C和13C)、氮(14N和15N)、氧(16O、17O或18O)、硫(32S、33S、34S或36S)、氯(35Cl和37Cl)、镁(24Mg、25Mg和26Mg)、硅(27Si、28Si和29Si)、钙(40Ca、42Ca、43Ca和44Ca)和溴(79Br和81Br)。第一和第二同位素对放射性衰变稳定(可在实验室中使用，而无需加入保护免于可能的辐射损害)，并且不同于氢和氘。
以特别优选的同位素C12和C13更明确地表达，一组同位素异构体含有约2-约10%C13，而另一组含有约90-约98% C13。优选，第一组含有约5-约10% C13，而第二组含有约90-约95% C13，在每一种情况下，剩余的碳原子为C12。特别优选第一组含有约5% C13，而第二组含有约95% C13，剩余的碳原子为C12。这意味着，对于每一种化合物，将IROA峰形状理想地包含为完美平衡的对称的峰集合，其中每一半是另一半的镜像。
应理解的是，上述百分数旨在可鉴定地不同于使用的两种同位素的天然丰度量。因此，在碳同位素(其天然丰度为98.89%的C12和1.11%的C13的情况下)，使用约90-约98%的一种同位素和约2-约10%的另一种同位素允许分析设备容易在天然丰度峰和由IROA基质提供的那些之间区分。对于存在的一种或另一种同位素异构体的百分数，使用术语“约”意味着在所述量的 ± 3%内。因此，以上同位素百分数为已知和预定的，但是使用在所述范围内的具体的量主要是为了方便起见。
还应理解的是，用于IROA研究的元素(此处为碳)的痕量的杂质量也可在该元素的原子中存在。这样的痕量通常对研究无关紧要。例如，Handbook of Chemistry and Physics (物理化学手册)，第54版，CRC Press，Cleveland，OH，第B251页，1973-1974，列举了C12和C13的天然丰度分别为98.89%和1.11%，报道了存在C14，但是未报道其百分数量。
仍进一步应理解的是，关于同位素和可含有同位素的若干组合物，使用词语“第一”和“第二”仅用于清楚地区分同位素的目的，而不意味着暗示关于进行任何操作的顺序的任何事情。
优选IROA基质以相对大量制备，诸如对于工业规模约10-约100 g，对于实验室规模约10-约1000 mg，以至于对许多谱图分析，可利用每一批次。得到的基质组合物优选保持冷冻，诸如在-80℃下，直至用于使其化学稳定性和分析再现性最大化。
本发明的另一个预期的方面是一种产生在如上所述的IROA基质中化合物的身份数据的参考文库的方法，所述方法包括以下步骤：1) 通过质谱确定在设备的分辨率和灵敏度内的IROA基质的化合物的身份，以提供其对称的IROA峰图案，并且另外确定以下的一种或多种：a) 存在的化合物的气相色谱和/或液相色谱性质，b) 存在的化合物的碰撞横截面，和c) 存在的化合物的碎片化图案。保持如此确定的化合物身份数据，用于在后来分析的样品中鉴定一种或多种相同的化合物。还预期在IROA基质中化合物的身份数据的参考文库自身。使用化合物碰撞横截面和碎片化图案中的一种或二者优选与质谱鉴定结合。
进一步预期的发明是一种使用内标在天然丰度样品中定量和鉴定化合物的方法，所述内标与含有约90-约98%的IROA基质组合物的含有较重分子量同位素的化合物的同位素异构体具有相同的化学组成，并且在该天然丰度样品中插入。将在所述内标中的每一种化合物自身鉴定于前述身份数据的参考文库中。优选确定天然丰度样品的每一种可鉴定化合物的量，更优选，相对于内标，确定每一种天然丰度样品化合物的量。
本发明的另一方面预期一种关于质谱设备和关联的离子迁移率通道和色谱设备(在存在时)的操作稳定性的品质保证和/或品质控制方法。该方法预期在进行不同样品的分析的过程中，对多个基质样品进行质谱分析，和确定在每一种分析中是否存在相同组的对称的IROA质谱峰。用作说明地，可在分析实验样品之前，在分析实验样品之后，在分析接下来的实验样品之后，分析基质样品。这些基质分析的解释在本文的别处讨论。
使用以上技术允许使用者同时验证和定量存在于复杂混合物中的化合物，而无需先前的基线分离。该技术受益于以下事实，即任何化合物的同位素异构离子的集合(例如基于C-13的同位素比率异常值分析(IROA)峰、IROA合并的峰或相同分子的同位素异构形式的任何其他组合，直到并且包括与C-13单同位素峰成对的C-12单同位素同位素异构体的双重集合或甚至基于其他元素(诸如氮、氧、硫或其他)的同位素异构体的同位素异构体)共享相同的碰撞横截面(CCS)。因此，同位素异构体离子通过离子迁移率(IM)通道，例如高场不对称波形离子迁移率光谱(FAIMS)、差分迁移率光谱(DMS)、用于无损离子操纵的结构(SLIM)、捕获的离子迁移率光谱法(TIMS)和其他漂移管和/或离子迁移率光谱(IMS)技术，以在与当其离开时进入的相同集合相同的时间或以自其可预测的方式出现。
整个这样的离子集合可随后经历碎片化，其得到碎片离子，均携带与原始集合相同数量的同位素异构体。通过所得到的碎片化图案证实原始化合物的身份，并且其获得的迁移率信息可有助于该证实。
如果集合的任何亚组的量为已知的，通过比较，可确定任何化合物的绝对量。在离子集合进入之前使用液相色谱(LC)分离降低在任何给定的时间进入IM通道的离子集合的数量，这可能有帮助，但是不需要这一点。该技术可用于定量分析极其复杂的混合物，例如组织、细胞、活组织检查或生物流体，人或非人的。
在这样的情况下，可将以固定的或已知的浓度含有大量相同化合物的适当的同位素异构内标(IS)、IROA或其他加入到生物材料中。可使用身份的完整确认分析和定量所得到的合并的混合物，并且，而无需如现行实践需要的材料的色谱基线分离。
该方法的优选的实施方式可包括制备生物样品，加入同位素异构混合物，分离合并的材料；首先通过高效LC (HPLC)分离，通常为与质谱法偶联的LC (LC/MS)，接着IM通道，最后通过MS/MS碎片化。其他分离方法也可用于辅助但是不是必需的，所述其他分离方法例如气相色谱法(GC)、超临界流体色谱法(SFC)、毛细管电泳(CE)、或类似的，或非色谱系统诸如固相萃取(SPE)或在线方法。存在于IS中的任何化合物可以MS或MS/MS的水平定量。通过MS/MS确认身份。参见，例如，Stupp等人，Anal. Chem.2013，85 (24)，11858-11865。
预期的发明的另一方面提供对于先前讨论的表型IROA方案新的方面。该方面预期能将天然丰度质谱分析样品的通过生物学产生的代谢物化合物转化为IROA样品的试剂对。该试剂对包含组成第一和第二同位素异构体的两种反应性同等试剂。
第一同位素异构体含有约2-约10%的第一同位素，而第二同位素异构体含有约90-约98%的相同原子的第二同位素。第一和第二同位素对放射性衰变稳定，并且不同于氢和氘。
优选试剂分子含有4个或更多个原子，该原子可为所选同位素的一种或另一种。这样的原子的上限通常为了方便起见，其中优选可含有6-10个所选可能变体同位素的原子的试剂。
每一种试剂对含有相同的反应性基团，该反应性基团与存在于通过生物学产生的天然丰度代谢物化合物的组合物中的一种或多种化合物的官能团反应和键合。每一种那些代谢物化合物的分子量为约2000 AMU或更少，优选约1500 AMU或更少，更优选约1000 AMU或更少。
注意到短语“与官能团反应和键合的反应性基团”在化学上不精确，因为一旦彼此反应，则反应性基团和官能团不再存在，因此它们不能彼此键合。而是每一种基团的残基彼此键合。认为后面的短语累赘，因此，使用前面的引用的短语，应理解旨在在化学上更精确的后面的短语。
试剂对的反应性基团与选自由以下的一种或多种组成的组的官能团反应和键合：胺、醛或酮、羟基、硫醇和羧酸。那些反应性官能团存在于蛋白质代谢物和含有糖的化合物，以及多数氧化的碳质缩合产物，诸如萜类，诸如柠檬烯、香芹酮和香叶醇。
特别优选的反应性基团与胺基反应和键合，因为其作为寡肽的氨基-末端、氨基酸和具有环外氮原子的化合物诸如墨斯卡灵、血清素和多巴胺存在。
一种这样的特别优选的反应性基团为异硫氰酸酯基。异硫氰酸酯合成为本领域周知的，使得含有期望百分数的13C的异硫氰酸根基团可与碳质基团连接，可制备该碳质基团自身以含有期望百分数的13C，以至于可容易制备期望的同位素异构体对。特别优选的异硫氰酸酯为异硫氰酸苯基酯 (PITC)。
在另一个优选的试剂对中，反应性基团与酮或醛基反应和键合。此处，反应性基团为与代谢物的酮或醛形成腙或氨基脲的肼或氨基脲(semicarbazine)。含有这些反应性基团的化合物的合成也是周知的，以至于它们也可与含有期望量的13C的碳质部分连接。
问题和解决的问题
可使用代谢组学技术，诸如IROA基础或IROA表型方案(最佳)或标准代谢组学技术来鉴定和粗略定量生物样品中的几百或甚至数千化合物。然而，直到本发明，为了进行这样的测量和从任意两个或更多个样品比较测量，所有样品需要在单批次中分析，理想地在一天期间，因为日日之间的变化太大而不能以其它方式克服，并且不能确保绝对定量；即，相对于已知的标准。
当比较在相同的仪表装置上间隔几天测定的样品当前在定量上是不可接受的，并且不能比较在不同的仪器上产生或基于不同的方法的数据。仪器漂移、色谱漂移、甚至环境条件可充分改变结果，以至于甚至在相同的仪器上难以得到再现性。
除了定量的这些问题以外，横跨许多单独的质谱技术鉴定任何化合物不太可能成功，除非已进行非常仔细的校准和运行可信的标准。这是因为，不仅存在多种可混淆的生物化合物(因为它们具有相同的精确质量)，而且甚至更有问题的是，通常存在更多与生物同重元素等价物在结构上不同，但是可共享正确的质量或甚至分子式的假象或碎片化合物。IROA工作流程在许多水平上直接致力于这些问题和其他问题，并且克服这些问题。
IROA工作流程提供“标准样品”，称为“基质样品”，其在分析期间深度多次分析。基质样品随机掺杂有实验或临床样品。基于其共享的IROA图案，在该基质样品中化合物的身份和行为用于鉴定在实验样品中所有的相同的化合物。对于不同的分析情形，可存在不同的基质样品类型；即，用于血浆的“基质”，用于人肝脏的“基质”或甚至用于小麦的“基质”。在如IROA963、IROA964和IROA251所描述的情形下，基质样品可含有合成的IROA图案。
基质样品总是组成为相同的小心控制的化合物的混合物。不同的化合物可以不同的浓度存在；然而，在任何给定的“基质”批次中，在所有等分基质样品中，每一种单个化合物总是以相同的浓度存在。高度限定存在于基质样品中的所有化合物。
基质样品为基础IROA样品，因此，每一种化合物以两种预定的同位素异构平衡诸如优选的5% C13和95% C13同等存在。这意味着，对于每一种化合物，将IROA峰形状理想地包含为完美平衡的对称的峰集合，其中每一半是另一半的镜像。
因为在基质中IROA峰的对称性，基质样品可完全分类；甚至可鉴定和表征以远低于以其他方式可能辨别的水平的极低水平深入质谱噪声中的峰。在每一种分析中，基础IROA峰的三重冗余保证一致的解释和鉴定。
因为存在于基质样品中的所有化合物可分类，并且因为它们在给定的基质中一致，可评价它们的色谱行为、电离效率、离子迁移率(IM)特性、碎片化行为等，并且当分析系统类似时或即使其非常不类似，这些值用于校正任何日日之间的变化。
因为甚至横跨非常不同的分析平台(即，具有不同的色谱、电离或检测系统)，发现多数这些化合物，IROA初级扫描的IROA特性和IROA次级化学特性(如在离子迁移率、SWATH[参见Gillet等人，Mol Cell Proteomics，11：011.016717 (2012年6月1日)]或其他碎片化系统中可见的)确保基质中的每一种化合物可从任何分析系统映射至任何其他分析系统，从而提供用于直接比较任何两种基质样品和它们通过它们所支持的任何临床或实验样品的完整基质化学组成的机理。
说明使所有期望的IROA化合物峰通过其的SWATH组的窗口宽度的表如下所示。
如以上显示的窗口方案诸如SWATH窗口组允许所有IROA峰通过其，以提供完整的IROA峰组图案的分离，如在图12A中显示的。其基于在具有中心质量的质量的任何已知代谢物中碳的最大数量，并设定窗口(最小值和最大值)，并因此重叠。图12B说明提供诊断结构信息的苯基丙氨酸碎片化图案，如由图12C所见。
因为基质样品的化学组成并因此色谱行为与施用于实验样品并且在相同的批次内分析的内标相同，可使用由基质样品得到的深入的、信息强的、三重冗余的化学鉴定信息，并将其施用于实验样品。
可分析基质样品，以以极致的精度和灵敏度发现、鉴定和收集包含在其内的所有化合物的所有鉴定物理特性。对于每一个三重冗余IROA峰，物理信息可包括但不限于来自初级ms扫描的信息：
保留时间(RT)、12C单同位素质量、13C单同位素质量、包含在分子中的碳的数量；
来源内和来源后碎片化特性；
由施用于流出流的其他方法例如IR、UV收集的任何物理特性；
各种来源后碎片化方法，包括例如碰撞-诱导的解离(CID)、电子-捕获解离(ECD)、SWATH等，无论是直接的(数据依赖性获得-DA)、独立的(数据独立获得(DIA)，诸如MSe、SWATH等，离子迁移率(IM)；
或可提供信息以支持鉴定该IROA峰的任何其他技术。
实验或临床样品在生物化学上是复杂的，并且含有不同分类的化合物；然而，这些化合物的碳同位素平衡仅以天然丰度C13水平存在；即，约1.1% C1。
将在浓度和化学组成上与基质样品的95% C13 (或其他合适的)同位素异构部分相同的内标(IS)加入到每一种临床样品。该加入意味着每一种实验样品可作为表型IROA样品分析，因为其现在符合表型IROA方案。
因为相同的C13同位素异构IROA信号在基质和实验样品二者中存在，并且色谱法横跨二者一致，在基质中看到和证实的化合物鉴定和物理特性可直接映射到实验样品。因为放入冗余表型样品中的IS的IROA信号的独特性，映射不需要实验样品也具有次级物理特性，而是基于对一致分析的基质样品的参考，使用者可推断那些次级物理特性。
将基质和实验样品随机散置在单一样品组中(例如，使得对于每约10次实验注射，存在一次基质注射)，并且分析整个样品组。
因为在分析过程中样品已完全和随机混杂，所有峰对的目录，它们的RT、碳的数量、IM和碎片化特性提供其中在实验样品中发现这些相同IROA峰的每一种的信息。天然丰度峰容易定位和定量，因为其在以下质量处与其IROA峰搭配，所述质量为IROA 13C单同位素峰的质量减去其含有的碳的数量乘以中子质量。
确保根据IROA工作流程分析的所有样品的品质控制、再现性和精度，因为：
基质样品为“标准”样品，其总是相同，在每日基质分析中发现的所有IROA峰的目录提供定量用于每日分析的仪表装置的性能特性的方式，并且提供用于校正任何仪器误差或确定在给定的天误差不可接受的机理；
引入到每一种样品的IS的量与在基质中的相同，并且横跨所有样品相同，IS中的所有信号的总和恒定，并且如果它们不以其他方式标准化，可用于标准化样品。
在包括正交的第二阶段分析和详述另外的物理特性(诸如离子迁移率、碎片化诸如SWATH、UV或IR等)的数据的集合时，在已在非常不同的分析条件下分析的两组基质样品中发现的化合物可明确地从一个映射到另一个，因此，提供与它们相应的基质样品关联的临床或实验样品的定量比较。
由于在基质样品中化合物的三重冗余以及临床样品的冗余和等价，该工作流程可全部自动化。
因此，IROA工作流程组合两种基于IROA的方案的优势，以1)提供一种用于定量待在单一分析运行中测量的非常大量化合物的方法，2) 提供一种机理，以校正定量的任何误差，而不论所用的分析系统，和3) 提供一种机理，以确保横跨时间和分析平台，所有化合物的鉴定一致。
表型IROA方案
表型IROA方案为用于这样的情形的方案，所述情形中标记实验样品本身不可行或不实用，但是共同的和一致的95% (+/- 3%) IROA内标(诸如上述C13-IS)用于确保精确鉴定分子和精确定量。表型方案可用于分析人(临床)样品、农业样品、工业样品或其中实验样品的尺寸或来源使得标记它们完全不可行的其他情形。然而，通过提供共同的严格的IROA内标，表型方案提供更加精确的路线用于鉴定和定量在样品天然丰度分离物中发现的大量化合物。
与基础IROA的“无偏倚的”或“非针对性的”分析不同，表型IROA为基于在化学上非常复杂的IROA内标(IS)的非常大量化合物的针对性定量分析。C13-IS可含有大大超过1000种化合物(可能无限的)，但是较早概述的IROA性质不需要完全色谱分离以确保包含在IS中的所有化合物的身份和定量二者。
表型方案将IROA内标放入每一个天然丰度样品中，并且使用来自C13-IS双重信息碳的13C-单同位素质量和数量，以定位相同化合物的天然丰度同位素异构体。发现的峰的天然丰度时间分辨色谱谱与其天然丰度同位素形式的相互关系随后用于支持基于IROA的鉴定。
因为IROA峰在信息学上是自包含的，可正确地鉴定和定量多个共洗脱峰。在表型方案的情况下，通过工人可产生IS，以提供实验系统的独特的定量需求的支持。因此，小麦研究员可产生可使用的小麦C13-IS，因为其含有更多反映小麦生物化学的化学谱，但是该C13-IS主要用于发现和鉴定在小麦中的IROA峰，并且定量它们的天然丰度配对物。虽然基础IROA方案的三重冗余在表型方案中不存在，信号仍冗余，因为95% C13-IS提供碳的质量和数量，以精确确定在哪发现天然丰度单同位素信号(参见图5和6)。
在IROA工作流程中相同的C13-IS用于基质和临床或实验样品二者，而衍生自基质样品的化学信息用于核实和验证在临床或实验(表型)样品中发现的化合物。可分析表型样品的化学信息至与基质样品相同的程度，但是这并不是必需的。例如，虽然需要分析基质样品以完全表征存在于其中的每一种化合物，可为足够的是使用衍生自基质的分析的质量和保留信息，以在实验或临床样品中发现相同的化合物，并且使用比在基质样品中可能的更高的获取率，以实现更高的定量精度。
IROA工作流程
IROA工作流程组合并利用两个先前的IROA方案(基础IROA和表型IROA)的优势，并且增加另外的能力，以解析化学身份，标准化数据，并增强样品之间和横跨类似或不类似平台的再现性。
IROA工作流程最佳利用基础IROA信号来目录化、验证和表征基质以及因此C13-IS(其为共同的，并且与基础和表型样品二者一致)中的所有化合物。通过在表型临床或实验样品中使用相同的C13-IS，基质样品(基础IROA样品)的所有化学鉴定和确认可施用于作为表型样品的实验或临床样品。
此外，IROA工作流程将另外的正交鉴定第二阶段诸如离子迁移率、来源内或来源后碎片化、UV、IR或其他化学特性的集合施用于基质中的每一个IROA峰，以对基质样品中的每一种化合物提供另外的独特的物理属性。如果将基质中的每一种化合物独特鉴定并且可映射至每一个临床或实验样品，则该系统支持完全可再现化合物鉴定，而不论分析平台。
因此，实验样品中的C13-IS能提供完全鉴定和定量方案二者，而无需基线色谱方案，并且对这些样品无需使用相同的正交鉴定系统。这是重要的，因为次级系统可降低时间分辨率，从而降低分析测量的精度，但是对于化学属性映射和鉴定目的需要在基质中的测量。仅在较低水平的精度下需要基质的定量。
另一方面，对于临床或实验样品，定量精度应尽可能高。该总体方案具有：
1) 在由于存在IS而在实验样品中发现并且映射到基质中的相应化合物的化合物的鉴定和定量上非常高水平的精度，
2) 基质样品中的所有化合物的高度准确和精确鉴定，和
3) 施用于临床或实验样品的所有仪表装置参数(同样衍生自基质样品)的丰富和连续的品质保证/品质控制(QA/QC)，这是进行与人相关的临床生物化学测量所需要的。
衍生自次级分析流(诸如离子迁移率、碎片化或其他UV/vis等)的在每一种基质注射中的化合物的化学鉴定提供足够的表征，以至于可基于这些次级特征独特鉴定每一种化合物。因此，IROA图案加上该次级数据(其中的大多数也是基于IROA的)的组合提供了一种方法，以提供横跨极其不同分析平台比较样品或调节仪表装置的日日之间变化所需的再现性(定量和定性)，以及确保横跨不同平台的化合物身份和定量。
该工作流程使用基础IROA方案的方面和一致的基质样品，以提供独立于仪器或色谱系统的(新的) (QA/QC)。
当这两个方案中的每一种的益处合并为单一方案时，它们带来三重冗余基础IROA方案的优势，以从高度标准化的“基质”样品构建针对性文库，其随后用于临床样品的双重冗余表型分析。
基质和临床样品均含有相同浓度的相同的95% C13-IS。因为基质样品另外含有具有相同化学谱的匹配的C12-B，它们的组合的同位素信号为对称的，在数学上平衡并且明白地被发现。可使用在较高水平的严格性下在基础IROA样品中产生的这些文库(发现的所有化合物的目录)，使得更宽得多的化合物分类能够甚至在质谱噪声深处中被发现。因为表型样品依赖相同的95% C13内标，这些文库可施用于一致运行的样品，具有预期的完美匹配，并且通过它们的共同的基质参考，可与非一致的样品比较。
该方法的新颖性衍生自IROA峰的先前提及的属性，即，具体化合物的所有同位素异构体将共享除质量以外的实际上同等的化学物理属性(包括UV以及在一定程度上包括IR)，因为另外的中子对电场、电荷分布或电子构型具有很少的影响。因此，IROA峰将产生共色层分离，并且在MS扫描中看作IROA峰，并且还将通过离子迁移率、SWATH碎片化以及其他过程作为完整的单位移动。超过MS水平发现它们的能力就这一点而言是新的观察，其允许IROA工作流程在分析和鉴定过程的所有阶段使用这些IROA属性来匹配和解释IROA峰，并且使得IROA工作流程有可能。
基质和C13-IS总是在相同的浓度下相同的化学混合物，因此，这些文库提供新的交叉平台、交叉仪器、时间独立性QA/QC的基础， 使得可比较使用不同的方法在不同的实验室中制备的样品。基质和C13-IS可通过生物学或化学方法生产。
基质化合物的鉴定
当其首先制备时，每一种基质具有与其关联的文库。文库为当将基质样品通过色谱分离，并且检查在其中的基础IROA峰时可可再现地看见的化合物。鉴于可能的化学结构的极端多样性，仅由色谱分离产生的质谱数据不足以鉴定大多数化合物，并且甚至不足以鉴定大多数分子的独特的分子式。
基础IROA峰将分子中碳的精确数量加入到单同位素质量，以及对于大多数利用的文库，诸如代谢物文库，这足以提供独特的分子式。然而，对于许多分子式，给定的分子式可被大量化合物共享，因此，虽然IROA提供确保的分子式，但是其就其自身而言不能提供确保鉴定。
IROA工作流程定期分析基质。除了每一种IROA峰的分子式以外，如果我们可以增加基质中的每一种化合物和已知包含在其中的化合物的文库的碰撞横截面(来自IM的CCS)、碎片化数据(来自SWATH或其他技术的ms/ms)、UV、IR或任何其他物理特性，则确保的分子式和这些物理属性的组合变为每一种化合物的独特的标识符。
IROA工作流程每日分析基质样品，以确定基质和IS中的所有文库化合物的色谱行为。因为基质和IS中化合物的浓度和它们的色谱行为相同，在基质中进行的任何鉴定可映射到IS。使用基质的关键在于清楚的IROA-格式化的峰通过msms (其中所有碎片将显示为IROA碎片化)和类似地通过IM (其中所有IROA峰共享共同的CCS)保持它们的完整性。
基质和IS的说明性制备
虽然可产生基质(和IS)以与任何样品完美匹配，大多数生物共享共同的核心代谢，因此，可生产适用于在宽泛的样品类型中鉴定和定量宽泛的化合物的“通用”基质。例如，几乎所有的生物使用相同的20种氨基酸和相同的核苷酸，并且共享大多数相同的生物化学途径。因此，出于良好的经济原因，对于给定的样品类型，人们可选择不产生特定的基质(和IS)，而是使用通用基质(和IS)。可由单细胞或多细胞生物体产生合理的基质(和IS)。优选单细胞生物体，诸如可发酵酵母、细菌或藻类，其中可小心控制发酵过程的效率。
此处说明特别优选的基质(和IS)的制备，但是可遵循类似的过程，以产生更具体的基质：
1) 在基本培养基(诸如S288C或类似的)上良好生长的酿酒酵母的菌株在生物化学上最胜任的，经选择和测试，以确保其在作为主要的碳来源的95% 13C U-葡萄糖上生长。如果其通过该测试，并且在发酵专家的眼里其接近正常生长习性，则视为合适的；
2) 所选的菌株可在序贯较大的容器中连续生长，直至足够的细胞可以用于引发大规模发酵，如例如20升发酵罐或更大。用于这些早期发酵的培养基为富含同位素的葡萄糖，具有加入的矿物质(包括硝酸盐或其他氮来源)和维生素。当实现足够的细胞时(诸如50 ml生长后期)，将该材料转移至20 L发酵罐中，其中用于生长的主要的碳来源为同位素标记的葡萄糖、硝酸盐或其他氮来源、矿物质和维生素。将发酵罐有氧喷洒不含二氧化碳的空气持续发酵的持续时间，以降低乙醇生产，并且确保唯一可得的CO2由同位素标记的葡萄糖生产。在发酵过程中，连续加入另外的同位素标记的葡萄糖，以替代消耗的葡萄糖。贯穿发酵过程，取出发酵流体的等分试样用于分析，确定细胞密度，并且控制培养基化学。当发酵实现最佳密度时(对数生长期后期)，但是在其进入衰老之前，收获整个细胞群。从培养基回收过滤的细胞(酵母)群，并且在-80℃下冷冻。
3) 从冰箱取出冷冻的酵母群，再悬浮于双重蒸馏的不含离子的水中，并通过French压机或细胞破坏的其他方法挤出至少三次；即，直至看起来基本上所有的酵母细胞破裂。让该破裂的溶解产物自溶；即，通过其自己的酶消化，在45℃下持续24小时，以形成“酵母提取物制备物”。
4) 将所得到的酵母提取物制备物的固体部分离心分离作为一个级分。将上清液过滤，以除去细颗粒，随后将其冻干为“酵母提取物”。所得到的酵母提取物为非常丰富的生物化学混合物，其含有大多数稳定的生物化学物和它们的中间体。因为这意味着是通用提取物，使不稳定的生物化学中间体的存在最小化。如果寻求这些相对不稳定的生物化学物，诸如ATP等，则需要专门的基质。
对于基质，使以上过程运行，以生产95%酵母提取物(由使用95% 13C U-葡萄糖作为主要的碳来源生长的酵母生产)，并在单独的运行中，以生产5%酵母提取物(由使用5%13C U-葡萄糖作为主要的碳来源生长的酵母生产)。95%酵母提取物用作基质的C13一半，该基质也是IS；即，这两种组合物由精确相同的均质材料得到，以在化学上相同。(注意：在基质和实验样品二者中，它们均以精确相同的浓度(20 mg/40 ml)存在)。将5%酵母提取物(5%YE)以同等比例加入到95%酵母提取物(95% YE)中，以提供基质。因此，进行质谱分析的基质提供完美对称组的峰。内标在化学上相同，并且其组分以与基质中的那些相同的浓度存在，但是IS仅含有5% C12材料。加入实验样品提供待测量的C12材料的来源。
配制基质和IS的方法如下。
1) 称出精确量的95% YE，例如90 mg。通过加入适量的50/50水/乙醇，将其溶解，以产生10 mg/ml溶液，对于该实例，制备精确地9 ml 95% YE。
2) 称出精确量的5% YE，例如30 mg。通过加入适量的50/50水/乙醇，将其溶解，以产生10 mg/ml溶液，对于该实例，制备精确地3 ml 5% YE。
3) 为了制备基质，加入同等体积的95% YE溶液和5% YE溶液。因此，在该实例中，将3 ml 95% YE加入到3 ml 5% YE，以形成基质前体。
a) 向每一个注射小瓶中等分4 ml基质前体，干燥和密封(在氮气下)，在-80℃下储存。
4) 为了制备IS，向2 ml小瓶中等分50 μl 95% YE，干燥和密封(在氮气下)，在-80℃下储存。
在基质的情况下，已干燥的基质注射小瓶含有20 μl 95% YE和20 μl 5% YE。当将其溶解用于注射（例如通过加入40 μl dH2O）并通过质谱分析时，所得到的光谱具有非常对称的和非常可鉴定的IROA峰。
在IS的情况下，2 ml小瓶含有0.5 mg (或0.500 mg) 95% YE。当将其溶解于1.2ml (1200 μl)，并将40 μl该溶液加入到干燥的制备的实验样品中时，每一种所得到的实验样品含有20 mg 95% YE，与在基质中的量相同的量。实验样品还将含有与基质和IS相同的化合物，但是它们以天然丰度C13水平(约1.1%)存在。因为基质的质谱分析提供所有基质化合物以及因此IS的那些的身份，天然丰度峰的精确定位对于每一种化合物是已知的。使用其身份的完整知识并且相对于其95%同位素异构体的标准量，测量天然丰度化合物的高度或面积。
说明的情况1
在医院/临床实验中的血液后处理
在过去的10年中，质谱法已强有力地移入临床测量领域，因为灵活性、灵敏度和成本通常比传统的方法更有利。然而，为了进行测量，通常需要使用内标和在待测量的化合物和可影响电离效率或因偶然出现在并不预期它们的地方而引起混淆的其他化合物之间得到清晰的基线分离，即在测量期间。
其原因是简单的。内标是关键的，因为质谱离子来源潜在可变，质谱信号对调谐、离子抑制、溶剂可变性或甚至大气条件敏感。具有单峰的内标，诸如几乎所有非IROA标准，可具有被具有非常类似质量的假象混淆或污染的其单峰。
当测量天然丰度分析物时，该风险通常通过以下的双重方法而减轻：a) 通过色谱从所有其他化合物分离分析物，和b) 包括内标。只要内标与分析物产生共色层分离并且从潜在的干扰因子分离，认为错误测量的风险足够低而能够接受该结果。虽然当测量单一化合物时，这些步骤可降低风险至可接受的水平，但是当需要同时测量数百种化合物，并且基线分离不能确保时，风险极大地增加。
因此需要更安全的系统：
如果内标(IS)携带一个或多个独特的鉴定特性，可确保其为特定的化合物的内标并且不能将其误以为是假象；
如果IS与目标化合物产生共色层分离，其将遭受目标化合物的所有来源和分析方差，并且将提供定量比较的完美点；和
如果IS与其目标产生共色层分离，共享所有分析方差，并且可与其目标独特匹配，则不再需要清晰的基线分离以进行良好的分析测量。
IROA C13-IS满足所有这些标准，1) 对于每一种化合物，IROA簇的形状完全由其分子式确定，2) C13-IS中的化合物与它们的天然丰度(在临床或实验样品的情况下)或它们的C12-B (在基质的情况下)同位素异构体产生共色层分离，和3) 在化学上以其他方式相同。
发现实施例1
用作说明地，假定C13-IS和基质作为干燥的粉末分配。C13-IS为在含有500 µg C13-IS的2 ml小瓶中的干燥粉末，基质为在具有含有20 µg C13-IS和20 µg C12-B的玻璃插入物的玻璃注射小瓶中的干燥的粉末。
进一步假定存在50个待分析的血浆样品，使用标准血浆制备方案，诸如：
将50 µL的50个血浆样品中的每一个放入50个1.8 ml Eppendorf管中。这些组成50个待分析的样品；
使用重复移液管(repeater pipette)加入400 µL冷的沉淀溶液(8:1:1的乙腈:甲醇:丙酮)，以制备1:8 (样品:溶剂)比率的溶液；
涡旋样品以确保混合，在4℃下冷却样品30分钟以进一步沉淀蛋白质；在<10℃下以20,000 rcf离心10分钟，以产生蛋白质沉淀；将375 µL上清液转移至新的标记的管，确保留下蛋白质沉淀；
在所利用的条件下，在Organomation Associates MultiVap®或类似的设备中，使用氮气、氩气或对反应惰性的其他气体干燥液体样品，在-80℃下储存干燥的加盖的样品，直至准备好用以重构。
假定C13-IS和基质作为干燥的粉末分配。C13-IS为在含有500 µg C13-IS的2 ml小瓶中的干燥粉末，基质为在具有含有20 µg C13-IS和20 µg C12-B的玻璃插入物的玻璃注射小瓶中的干燥的粉末。
通过加入1.25 ml冷的80%含水甲醇(即，20 µg/50 µl)，使C13-IS重构，涡旋以确保混合，随后在4℃下静置10分钟。
50 µl重构的C13-IS用于重构每一种干燥的加盖的样品。将样品涡旋，静置1分钟，将40 µl转移至具有玻璃插入物的玻璃注射小瓶。
在50 µl 80%含水甲醇中重构基质，涡旋，静置1分钟。
将基质和50个实验样品转移至质谱仪用于色谱分离和MS分析。所有样品注射将是4 µl注射，因此含有相同浓度的C13-IS。基质样品将被注射至少5次，随机在实验样品的顺序内。
如下分析来自这些分析的数据组：
软件诸如ClusterFinder™软件(IROA Technologies LLC，Ann Arbor，MI)可用于发现和表征可横跨多个基质注射发现的所有IROA峰。对于所有发现的IROA峰，其累积所有关联的鉴定特性，包括保留时间(RT)、C12单同位素质量、C13单同位素质量、分子中碳的数量、离子迁移率特性、碎片化特性(来源内和来源后)、在每一个IROA峰中每一个峰的振幅、在所有IROA峰之间的关系以及记录的任何另外的物理特性。软件利用发现的所有信息来鉴定每一个峰。大多数峰为周知的并且先前良好表征的，但是可能软件需要产生新的标识符。每一个峰的分子式衍生自其IROA特性。
软件提供关于每一种发现的化合物汇总其发现的文件(通常为书面的)。其可包括RT (平均值和范围，峰的开始至峰的结束)、C12单同位素质量(平均值和范围)、C13单同位素质量(平均值和范围)、分子式和身份。在当今可用的标准高分辨率仪器诸如由Agilent、Thermo-Fisher、Sciex等制备的那些上，发现的范围相当紧密。
该文件是每一个实验文件的针对性分析的基础，使得对于在基质样品中发现的每一种化合物，运行详细的针对性分析。因为C13-IS在每一种样品中相同，其在每一种样品中被发现。因为其天然丰度C13单同位素的质量为已知的，可精确定量其存在。
如果看到C13-IS，但是没看到天然丰度，则其可标记为不存在。
如果C13-IS不存在，但是在基质中看到，则其可指示品质控制问题。
在C13-IS和天然丰度簇内的所有峰的总和是数字输出。
因为在每一个小瓶中C13-IS的绝对量相同，在每一个小瓶中所有C13-IS峰的总和如果不相同也相当接近。该总和的偏差指示注射(如果仅一个文件显示其)或仪器(如果其显示趋势)的问题。
如果需要标准化，可假定天然丰度侧的面积总和大致相同，并且如果C13-IS总和相对恒定，则天然丰度总和可针对C13-IS总和标准化。(注意：仅在极端情况下需要这样。)
该分析的结果是对实验(或临床)样品中存在的所有化合物的标准化的测量。对于每一种样品，存在关联的品质测量。针对一致的基质样品的标准化确保在样品组内、在类似的仪器内横跨数天或甚至横跨宽泛相异的仪器的命名法，虽然由于仪器来源、透镜作用、检测器等，横跨不同仪器的性能差异可能引起一些可充分表征的一致的差异。尽管如此，预期可横跨宽泛不同的平台映射大多数化合物。
说明的情况2
在医院/临床实验中的尿后处理
虽然存在一些类似性，尿的化学与血浆的化学非常不同，因此尿用于说明IROA工作流程1的变化，其中基质为针对尿定制的。
考虑以下作为一个可能的变化：
获得500 (或更多)升尿并干燥。随后将粉末状天然丰度尿分成两个等分试样，一个代表得到的总量的90% (等分试样A)，另一个代表该总量的10% (等分试样B)。使用基于IROA的衍生试剂诸如异硫氰酸苯基酯(PITC)衍生每一种等分试样，但是可使用许多其他衍生试剂。在所得到的苯基硫代氨基甲酰基反应产物中存在7个碳，所以如果使用5% 13C PITC和95% 13C PITC二者进行衍生，可将所得到的产物混合在一起，以得到7碳IROA峰图案。
以类似的方式，各自含有6个碳原子的5% 13C苯肼和95% 13C苯基肼可用于衍生样品诸如尿中的醛和酮，如上对PITC所讨论的。在存在过量苯肼时，一些糖增加两个苯肼基，以形成二苯基脎。含有7个碳原子的苯基氨基脲可类似地用于与存在于待分析的样品中的酮和醛反应。
以上讨论的试剂分别与伯胺和醛/酮反应和键合。普通技术人员可容易查阅常见的教科书诸如Green等人，Protective Groups in Organic Synthesis (有机合成中的保护基团)，第3版，John Wiley & Sons，Inc. New York，1999，或Lundblad，Techniques in Protein Modification (蛋白质修饰技术)，CRC Press，Boca Raton，1995，以鉴定可用于将存在于所有天然丰度样品的化合物中的其他官能团(诸如羟基、硫醇和羧酸)转化为本文讨论的7 IROA样品的其他试剂。
因此，鉴于所需的量，使等分试样A与95% 13C PITC反应和等分试样B与5% 13CPITC反应得到两种混合产物，其中尿中所有含有胺的化合物转化为它们的苯基硫代氨基甲酰基等价物。将来自等分试样A和等分试样B的材料等量混合，以形成尿特异性基质，而当加入到实验样品时，来自等分试样A的另外的材料提供可比较的C13-IS。
一旦这些试剂在手边，可遵循与说明的情况1类似的方案来定量尿中的所有含有胺的化合物，在尿中所述化合物是丰富的。不同的衍生试剂可用于突出其他化学官能团。事实上，如果产物同样稳定并且彼此相对无反应性，则可单个产生两个或更多个，随后合并，以产生更复杂的基质。
本文引用的每一个专利、专利申请和文章通过引用结合。使用冠词"一"或"一个"旨在包括一个或多个。
前述描述和实施例旨在为说明性的，并且不应看作是限制性的。在本发明的精神和范围内的再其他变化是可能的，并且容易将其自身呈现给本领域技术人员。
Claims (27)
1.一种通过生物学产生的代谢物化合物的IROA基质组合物，每一种所述代谢物化合物的分子量为约2000 AMU或更少，并且每一种所述代谢物化合物作为第一和第二同位素异构体存在，所述第一和第二同位素异构体以两种预定的同位素异构平衡同等存在，所述第一同位素异构体含有约2-约10%的第一同位素，和所述第二同位素异构体含有约90-约98%的相同原子的第二同位素，所述第一和第二同位素对放射性衰变稳定，并且不同于氢和氘。
2.权利要求1的IROA基质组合物，其中所述通过生物学产生的代谢物化合物由细胞溶解产物制备物得到，所述细胞溶解产物制备物由单细胞或多细胞生物体的培养得到，并且所述分子随机和普遍地被标记。
3.权利要求2的IROA基质组合物，其中所述细胞溶解产物制备物的细胞由单细胞生物体的培养得到，并且所述分子随机和普遍地被标记。
4.权利要求1的IROA基质组合物，其中相同原子的所述第一和第二同位素为选自由以下的同位素组成的组的一种或多种元素：碳(12C和13C)、氮(14N和15N)、氧(16O、17O或18O)、硫(32S、33S、34S或36S)、氯(35Cl和37Cl)、镁(24Mg、25Mg和26Mg)、硅(27Si、28Si和29Si)、钙(40Ca、42Ca、43Ca和44Ca)和溴(79Br和81Br)。
5.权利要求1的IROA基质组合物，其中相同原子的所述第一和第二同位素为12C和13C。
6.权利要求1的IROA基质组合物，其中每一种所述代谢物化合物的分子量为约1500AMU或更少。
7.一种产生在权利要求1的IROA基质中化合物的身份数据的参考文库的方法，所述方法包括以下步骤：
1) 通过质谱确定在设备的分辨率和灵敏度内的所述IROA基质的化合物的身份，以提供其对称的IROA峰图案，并且另外确定以下的一种或多种：
a) 存在的化合物的气相色谱和/或液相色谱性质，
b) 存在的化合物的离子迁移率，和
c) 存在的化合物的IROA碎片化图案，和
2) 保持如此确定的化合物身份数据，用于在后来分析的样品中鉴定一种或多种相同的化合物。
8.权利要求7的方法，其中所述IROA基质的化合物的身份通过化合物的碰撞横截面另外确定。
9.权利要求7的方法，其中所述IROA基质的化合物的身份通过存在的化合物的IROA碎片化图案另外确定。
10.权利要求7的IROA基质中化合物的身份数据的参考文库。
11.使用内标在天然丰度样品中定量和鉴定化合物的方法，所述内标与含有约90-约98%的IROA基质组合物的含有较重分子量同位素的化合物的同位素异构体具有相同的化学组成，将所述内标插入在所述天然丰度样品中，并且至少通过质谱分析来分析如此组合的样品，其中将在所述内标中的每一种化合物自身鉴定于权利要求10的身份数据的参考文库中。
12.权利要求11的方法，其中在所述内标中的每一种化合物的IROA特性用于支持每一种化合物的身份。
13.权利要求11的方法，其中确定每一种天然丰度样品化合物的量。
14.权利要求11的方法，其中相对于所述内标，确定每一种天然丰度样品化合物的量。
15.关于质谱设备和在存在时关联的离子迁移率通道和色谱设备的操作稳定性测量品质保证和/或品质控制的方法，所述方法包括以下步骤：测定权利要求1的IROA基质组合物的样品，和确定在每一种分析中是否存在相同组和振幅的对称的IROA质谱峰。
16.权利要求15的确定品质保证和/或品质控制的方法，其中所述通过生物学产生的代谢物化合物由细胞溶解产物制备物得到。
17.权利要求15的确定品质保证和/或品质控制的方法，其中所述细胞溶解产物制备物的细胞由单细胞或多细胞生物体的培养得到。
18.权利要求15的确定品质保证和/或品质控制的方法，其中相同原子的所述第一和第二同位素选自由以下的同位素组成的组：碳(12C和13C)、氮(14N和15N)、氧(16O、17O或18O)、硫(32S、33S、34S或36S)、氯(35Cl和37Cl)、镁(24Mg、25Mg和26Mg)、硅(27Si、28Si和29Si)、钙(40Ca、42Ca、43Ca和44Ca)和溴(79Br和81Br)。
19.权利要求15的确定品质保证和/或品质控制的方法，其中相同原子的所述第一和第二同位素为12C和13C。
20.权利要求15的确定品质保证和/或品质控制的方法，其中每一种所述代谢物化合物的分子量为约1500 AMU或更少。
21.能将天然丰度质谱分析样品的通过生物学产生的代谢物化合物转化为IROA样品的试剂对，所述试剂对包含组成第一和第二同位素异构体的两种反应性同等试剂，所述第一同位素异构体含有约2-约10%的第一同位素，和所述第二同位素异构体含有约90-约98%的相同原子的第二同位素，所述第一和第二同位素对放射性衰变稳定，并且不同于氢和氘，所述试剂对的每一个含有相同的反应性基团，该反应性基团与存在于通过生物学产生的代谢物化合物的组合物中的一种或多种化合物的官能团反应和键合，每一种所述代谢物化合物的分子量为约2000 AMU或更少。
22.权利要求21的试剂对，其中所述反应性基团与选自由以下一种或多种组成的组的官能团反应和键合：胺、醛或酮、羟基、硫醇和羧酸。
23.权利要求22的试剂对，其中所述反应性基团与胺官能团反应和键合。
24.权利要求23的试剂对，其中所述反应性基团为异硫氰酸酯。
25.权利要求24的试剂对，其中所述异硫氰酸酯为异硫氰酸苯基酯。
26.权利要求22的试剂对，其中所述反应性基团与酮或醛基团反应和键合。
27.权利要求26的试剂对，其中所述反应性基团为肼或氨基脲。
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