CN110387429A - 用于大肠杆菌o157:h7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

用于大肠杆菌o157:h7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用。所述检测试剂包括：主要由第一引物和第二引物组成的引物对，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。本发明通过G‑四链体核酸拟酶催化底物氧化还原反应产生的颜色变化，能够以肉眼直接同时判断待测样品中是否含有大肠杆菌O157:H7，提高了检测食源性致病菌的灵敏度，使用G‑四链体核酸拟酶通过引入酶循环信号放大及PCR产物放大双重策略实现最终信号的放大，从而实现对大肠杆菌O157:H7的可视化检测。

Description

用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及 应用
技术领域
本发明特别涉及一种用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用，属于分子生物学方法的检测技术领域。
背景技术
食源性病原微生物引起的公共卫生问题是世界上的一大难题，其漏检率高达95％以上。根据WHO估计，全球每年因食源性微生物感染性腹泻导致的死亡人口不少于200万人，其中大部分是由于饮食和饮水受到了微生物的污染，肠出血性大肠杆菌(EHEC)在食源性病原微生物污染中占有重要的卫生学地位。
EHEC大肠杆菌O157:H7主要长期存在于家畜家禽的肠道中，世界范围内的人类均有发病报道。大肠杆菌O157:H7感染能引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis,HC)，阑尾炎，食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症，在儿童和老年人中还可引起溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少性紫癜(ThromboticThrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症，重者可引起死亡。据估计，美国每年大肠杆菌O157:H7暴发感染超过73,500人，在1999年江苏、安徽等地爆发了食源性污染大肠杆菌卫生事件，导致199人死亡，大肠杆菌O157:H7的感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情，导致这种病原体不仅成为一个重要的食品安全问题，而且是一个严重的医疗和公共卫生问题。
核酸拟酶是核酸的过氧化物酶样复合物，其通常为单链的DNA/RNA，核酸拟酶可以折叠成稳定和催化活性的G-四链体，在氯化血红素存在下与之结合可以催化一些化学反应产生颜色变化，可用于裸眼检测，将核酸拟酶结合传统PCR不仅可以避免核酸染料的污染，降低对实验器材的要求，简化传统PCR检测的操作步骤，提高检测方法的灵敏度，重要的是使检测肉眼可见也可以结合其他仪器进行定量的检测。
大肠杆菌O157:H7的检测通常使用传统的选择性培养基或变色琼脂。然而该方法的主要局限性在于数天的培养周期才能提供关于菌株性质或分离自身的准确信息，PCR已广泛用于检测来自食品和环境样品的大肠杆菌O157:H7，最近，实时PCR因其增强的灵敏度和特异性以及快速的周转时间而越来越受欢迎，现有检测大肠杆菌O157:H7的荧光定量方法，检测灵敏度达到80CFU/ml，但是使用的荧光定量PCR仪价值昂贵，使用成本高，在基层仍然不能满足监控的要求。传统的PCR仪需结合凝胶电泳的方法分析条带的大小和亮度来判断，不仅检测的灵敏度不及荧光定量PCR，且存在凝胶电泳操作步骤繁琐和实验室核酸染料的污染问题。随着传统PCR技术的普及以及便携仪器的开发，使得田间检测成为可能，但是凝胶电泳来观察结果费时费力且有一定的生物危害对实验操作者要求高，因此亟需一种基于传统PCR的便携、快速、灵敏、安全、可视化的检测方法，以及时有效地应对未来的爆发，必须有足够的敏感，特异和可靠的方法，用于快速便捷的检测大肠杆菌O157:H7。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种能够更加灵敏、快速便捷、可视化的用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌早期检测的核酸拟酶比色试剂、试剂盒及应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例一方提供了一种检测试剂，其包括：主要由第一引物和第二引物组成的引物对，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。
进一步的，所述第一引物、第二引物的5’端具有串联重复鸟嘌呤(G)且能形成核酸拟酶的互补序列。
进一步的，所述的检测试剂还包括DNA聚合酶和PCR常规组件。
进一步的，所述的检测试剂还包括氯化血红素溶液、氯化钾溶液、HEPES缓冲溶液、显色A液、显色B液和终止液。
优选的，显色A液和显色B液的用量比为1：1。
进一步的，所述HEPES缓冲溶液按照25m M Hepes、20m M KCl、200m M NaCl、0.025％(w/v)Triton X-100、1％(v/v)DMSO配置成50ml的试剂备用，所述HEPES缓冲溶液的pH为7.4左右。
进一步的，所述显色A液的制作方法包括：将13.6g的醋酸钠、1.6g的柠檬酸、0.05g的亚硫酸钠、30％的双氧水0.3ml、5μl的吐温20混合并定容至500ml，将配好的溶液于121℃条件下高压灭菌30min，并采用0.22μm的滤膜过滤，之后置于深色塑料瓶中于4℃条件下保存。
进一步的，所述显色B液的制作方法包括：将0.2g的EDTA二钠盐、0.95g的柠檬酸、50ml的甘油、0.05g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.15g TMB溶于3ml DMSO中，加入ddH2O定容至500ml(所有操作要避光进行)，将配好后的显色B液置于深色玻璃瓶中并于4℃条件下保存。
进一步的，所述的检测试剂还包括：二甲基亚岚、L-半胱氨酸盐酸盐、柠檬酸、浓硫酸、亚硫酸钠、甘油、过氧化氢、乙酸钠、EDTA二钠盐；其主要用于提高显色试剂的稳定性以及显色效果的灵敏度。
本发明另一方面还提供了一种试剂盒，其包括所述的检测试剂。
本发明另一方面还提供了一种应用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测方法的产品，所述产品包括所述检测试剂或所述试剂盒，并且，所述检测方法包括：
利用所述引物对，通过PCR扩增反应对从待测样品内提取到的核酸进行扩增；
将PCR扩增后的产物与氯化血红素溶液、氯化钾溶液、HEPES缓冲溶液混合形成第一混合体系，加热解链后恒温孵育；
将孵育后的第一混合体系与所述显色A液和显色B液混合形成第二混合体系，并通过观察第二混合体系的颜色或检测第二混合体系的OD值实现对待测样品内大肠杆菌O157:H7血清型致病菌的定性或定量检测。
进一步的，所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，扩增30个循环，充分延伸72℃ 10min。
进一步的，所述检测方法包括：将所述第一混合体系于95℃左右条件下加热解链，之后快速降温至4℃以下孵育。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明通过G-四链体核酸拟酶催化底物氧化还原反应产生的颜色变化，能够以肉眼直接同时判断待测样品中是否含有大肠杆菌O157:H7，提高了检测食源性致病菌的灵敏度，使用G-四链体核酸拟酶通过引入酶循环信号放大及PCR产物放大双重策略实现最终信号的放大，从而实现对大肠杆菌O157:H7的可视化检测；
2)本发明提供的方法具有快速、可视化、超灵敏等优点；对于提高食源性致病菌的检测灵敏度、降低成本和便捷性的实现具有重要意义，对于在实验环境较为不足的实验室进行普及或开展大肠杆菌O157:H7的快速检测有巨大帮助；
3)本发明的方法及其试剂盒可广泛用于农牧业和食品工业，食源性致病菌临床检测，海关检验检验，环境监测，传染性疾病防控等领域。
附图说明
图1是本发明一典型实施案例中显示核酸拟酶比色检测试剂盒的检测原理及步骤示意图；
图2a是本发明实施例1中不同G-四链体对检测结果影响的比色分析图；
图2b是本发明实施例1中不同G-四链体对检测结果影响的吸光度对比分析图；
图3a是本发明实施例2中大肠杆菌O157:H7不同菌种间特异性鉴定电泳结果分析图；
图3b是本发明实施例2中大肠杆菌O157:H7不同菌种间特异性鉴定比色分析图；
图3c是本发明实施例2中大肠杆菌O157:H7不同菌种间比色反应吸光度对比分析图；
图4a是本发明实施例3中大肠杆菌的不同血清型的电泳结果对比分析图；
图4b是本发明实施例3中大肠杆菌的不同血清型的比色对比分析图；
图4c是本发明实施例3中大肠杆菌的不同血清型的比色反应吸光度对比分析图；
图5a是本发明实施例4中级联检测大肠杆菌O157:H7灵敏度的比色对比分析图；
图5b是本发明实施例4中级联检测大肠杆菌O157:H7灵敏度的吸光度对比分析图；
图5c是本发明实施例4中级联检测大肠杆菌O157:H7灵敏度的电泳结果对比分析图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明说明书中所使用的技术术语解释：
引物：DNA合成的起始物。一般为一对单链寡核苷酸，在与模板杂交后，DNA合成从其3’末端开始。
PCR：聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
G-四链体：G-四链体(G-quadruplex)是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四分体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四分体通过π-π堆积形成四链体。
核酸：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。
核酸拟酶：在G-四链体核酸和Hemin存在下形成的结构化的G-四链体/血红素复合物，具有过氧化物酶活性，其通过催化氧化TMB产生蓝色。
展开：经扩增反应的PCR产物在高温状态下解链为单链的核酸并保持单链的状态。
碱基互补配对原则：碱基互补配对原则是指在DNA或某些双链RNA分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是A(腺嘌呤)一定与T(胸腺嘧啶)配对，在RNA中与U(尿嘧啶)配对，G(鸟嘌呤)一定与C(胞嘧啶)配对，反之亦然。碱基间的这种一一对应的关系叫做碱基互补配对原则。
催化反应：在催化剂作用下进行的化学反应称为催化反应。
氧化还原反应：氧化还原反应(oxidation-reduction reaction,也作redoxreaction)是化学反应前后，元素的氧化数有变化的一类反应。氧化还原反应的实质是电子的得失或共用电子对的偏移。
复合体：由两种或两种以上分子特异性结成的结合物。
引物二聚体：在聚合酶链式反应(PCR)过程中，因引物对间、或单条引物相互退火形成的二聚体分子，由两条不同引物构成的二聚体为异二聚体，因带有G-四链体核酸拟酶链而可能引起与种抗体的结合而造成假阳性。
Hepes：4-羟乙基哌嗪乙磺酸或N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(hepes)是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。
酶活性：酶催化化学反应的能力叫酶活性或酶活力(active unit)。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，在1min内能转化1μmol底物的酶量，或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量。
核酸聚合酶：合成核酸长链的酶类；分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。
本发明提出的核酸拟酶是核酸的过氧化物酶样复合物，其通常为单链DNA/RNA的形式，在血红素结合存在下，富G序列可以折叠成稳定和催化活性的G-四链体；具体而言，在H2O2存在下产生的核酸拟酶催化TMB(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)或ABTS(2,2-偶氮双(3-乙基苯并噻唑)-6-磺酸)的氧化，H2O2和鲁米诺的氧化还原反应导致在420nm的最大吸收和肉眼可见的蓝色或绿色变化，该技术导致同时产生核酸拟酶与传统PCR扩增的结合应用，使用针对大肠杆菌O157:H7的特异性基因Z3276序列设计包括互补的G-四链体核酸拟酶序列的引物，产生的双链产物包括扩增的G-四链体核酸拟酶序列；在G-四链体核酸和氯化血红素的存在下形成G-四链体/血红素复合物，使扩增的G-四链体核酸结构化具有过氧化物酶的活性，其通过氧化的TMB产生蓝色，实现对大肠杆菌O157:H7的灵敏特异、快速便捷、可视化的检测。
本发明还提供的试剂盒包括检测试剂：TaqDNA酶，mix缓冲液，带有G-四链体核酸拟酶互补序列的特异性上下游引物，HEPES缓冲液，氯化钾溶液，氯化血红素，TMB，显色A液和B液，终止液。
本发明提供的检测方法通过特异性引物设计，核酸PCR扩增同时复制出核酸拟酶序列，通过核酸PCR扩增和核酸拟酶催化底物显色的双重放大效果，可以通过裸眼观测检测大肠杆菌O157:H7。
与常规的生化培养鉴定方法相比，聚合酶链式反应(PCR)在核酸的分子诊断方面提供了革命性的进步，因为该过程可用于以指数方式扩增痕量的DNA靶标；通常使用凝胶电泳或使用荧光染料的实时方法检测扩增的PCR产物，但是，这些技术非常耗时，并且通常需要使用昂贵且复杂的仪器。由于这些限制，开发可用于快速和简单鉴定PCR产物的替代方法是当前非常重要的，针对这一目标的努力已经产生了基于分子信标和纳米颗粒标记探针的新型DNA传感平台；然而，这些技术需要使用荧光共轭或探针硫醇化程序，两者都是昂贵和耗时的；因此，用于鉴定DNA PCR产物的简单方法仍然非常需要，该方法可以在不使用仪器的情况下快速进行鉴定。因此，本发明提供的检测方法是一种理想的大肠杆菌O157:H7的检测手段。
可视化检测具有无需复杂操作、无需大型仪器设备、灵敏度高、便捷、高效、低成本的特点，不仅能够解决目前在广大基层、乡村、农贸市场及不发达地区等急需食源性致病菌检测的地方难以大面积开展食源性致病菌检测的问题，还能开发、使用手机直接判读的软件，让大肠杆菌O157:H7的检测更加简单、直观。
本发明通过G-四链体核酸拟酶催化底物氧化还原反应产生的颜色变化，能够以肉眼直接同时判断待测食品中是否含有大肠杆菌O157:H7；为了提高检测食源性致病菌的灵敏度，使用G-四链体核酸拟酶通过引入酶循环信号放大及PCR产物放大双重策略实现最终信号的放大，从而实现对大肠杆菌O157:H7的可视化检测；相比以往的各类方法，本发明提供的检测方法具有快速、可视化、超灵敏等优点，对于提高食源性致病菌的检测灵敏度、降低成本和便捷性的实现具有重要意义，对于在实验环境较为不足的实验室进行普及或开展大肠杆菌O157:H7的快速检测有巨大帮助。
作为一个核酸扩增产物检测的通用技术平台，本发明的方法及其试剂盒可广泛用于农牧业和食品工业，食源性致病菌临床检测，海关检验检验，环境监测，传染性疾病防控等领域。如猪瘟病毒、口蹄疫病毒、流感病毒等传染性强、存在爆发风险、需重点监控病毒；金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌等常见食源性致病菌，这些都是本发明的核酸拟酶比色试剂盒的检测对象
本发明提供的基于核酸拟酶比色的检测方法将大大简化核酸扩增后的检测程序，节约检测成本，结果判读简单明了、直观。
本发明实施例提供的大肠杆菌O157:H7核酸拟酶比色快速检测方法作为一种新型的核酸扩增后检测技术，具有以下优点：
操作简单：只需要把核酸扩增后的样品直接按步骤添加孵育即可，不需要专业人员操作，不仅实验室可用，也可用于一线防控机构及养殖场；
快速：检测最快20分钟内判读结果；
便捷：无需电泳也无需凝胶成像系统，可通过肉眼直接观察；
灵敏：双重信号放大系统提高检测灵敏度，与琼脂糖凝胶电泳相比，检测灵敏度提高近10～100倍；
特异性高：检测过程中使用大肠杆菌特异性基因Z3276序列设计的引物，使结果更加准确；
成本低：检测费用大大低于凝胶电泳和ELISA检测。
具体的，一种快速检测大肠杆菌O157:H7核酸拟酶比色法检测技术，主要包括；
1)采用两条独特设计的引物进行PCR扩增反应，其中上游引物Z3276-AHG6-46bp-F的序列为5’-CCCATCCCGCCCAACCCAAAAAACCCATCCCGCCCAACCCAAGCGTAAATGTATC-3’，下游引物Z3276-AHG6-46bp-R的序列为5’–CCCATCCCGCCCAACCCAAAAAACCCATCCCGCCCAACCCAATTATCTCACCAGCAAAC-3’，上游引物和下游引物的5’端具有核酸拟酶的反向序列(即前述具有串联重复鸟嘌呤(G)且能形成核酸拟酶的互补序列)，其中，上游引物5’端的互补序列为：CCCATCCCGCCCAACCCAAAAAACCCATCCCGCCC、下游引物5’端的互补序列为CCCATCCCGCCCAACCCAAAAAACCCATCCCGCCCAACCC；在适宜的扩增条件下，可扩增一段长度为122bps的DNA片段；当无被检核酸模板存在时，无特异性核酸片段扩增产物；
2)氯化血红素(Hemin)的配制：称取Hemin 0.04g粉末加入到1ml的DMSO中，配置成67.5mM的储存液，放置于-20℃条件下避光保存，使用ddH2O稀释成67.5μm的工作浓度备用；
3)氯化钾溶液的配制：称取氯化钾2.61g加入到ddH20中定容至100ml，浓度为350mM，采用0.22μm的滤膜过滤备用；
4)HEPES缓冲溶液的配制：HEPES缓冲溶液主要按照25m M Hepes，20m M KCl，200mM Na Cl，0.025％(w/v)Triton X-100，1％(v/v)DMSO配置成50ml的试剂，调节HEPES缓冲溶液的pH值到7.4左右备用；
5)显色液的配制包括显色A液和显色B液的配制：显色A液：将13.6g的醋酸钠、1.6g的柠檬酸、0.05g的亚硫酸钠、30％的双氧水0.3ml、5μl的吐温20混合并定容至500ml，将配好的溶液于121℃条件下高压灭菌30min，并采用0.22μm的滤膜过滤，之后置于深色塑料瓶中于4℃条件下保存；显色B液：将0.2g的EDTA二钠盐、0.95g的柠檬酸、50ml的甘油、0.05g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.15g TMB溶于3ml DMSO中，加入ddH2O定容至500ml(所有操作要避光进行)，江配好后的显色B液置于深色玻璃瓶中并于4℃条件下保存；
6)终止液的配制：取浓硫酸10.9ml，用水稀释至100ml即可配置成2M的浓硫酸终止液；
7)取10μl步骤1)中的PCR产物加入步骤2)、步骤3)和步骤4)配制的试剂中混匀形成第一混合体系，将第一混合体系在98℃下加热解链，之后快速降温至4℃并恒温孵育；
8)各取90μl显色A液、显色B液混匀后加入到步骤6)中孵育后的第一混合体系中混匀形成第二混合体系，并在显色5分钟后，使用照相机拍摄记录第二混合体系的显色；使用酶标仪测量420nm下吸收值；与空白对照(不含有大肠杆菌O157:H7目的基因)对比样品组(含有大肠杆菌O157:H7目的基因)出现明显的蓝色变化判断为阳性，或者，在420nm下测量的吸收值比空白组的吸收值高，则判断为大肠杆菌O157:H7阳性，检测示意结果如图1所示；
9)当特异性扩增产物不存在时，在步骤6)中的孵育过程中不能形成G-四链体核酸拟酶复合物，不能催化显色液产生蓝色变化，也就不能产生肉眼可见的蓝色变化与空白组无法区分，或者，在420nm下测量的吸收值与空白组的吸收值没有差异，则判断为大肠杆菌O157:H7阴性；
10)向第二混合体系中加入步骤6)配制的终止液即可终止反应。
如下将结合附图以及具体实施例对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
实施例1
测试不同G-四链体核酸序列形成的G-四链体核酸拟酶复合物的酶活性及显色效果。
1材料与方法
1.1材料
G1～G6六条G-四链体核酸序列由南京擎科生物科技有限公司合成。
1.2G-四链体核酸序列表
Table Sequence for assay
1.3操作方法
1)将合成的G-四链体核酸序列稀释成1μM的使用浓度；
2)取10μL的G-四链体核酸序列样品与氯化钾2ul(35mM)，Hemin1.33ul(4.5uM)，HEPES缓冲液6.67ul混匀形成第一混合体系，将第一混合体系在95℃左右条件下加热4分钟解链后快速降温至4℃以下孵育10分钟；
3)向第一混合体系中加入显色A液、显色B液各90ul形成第二混合体系，并在第二混合体系显色5分钟后，使用智能手机或照相机拍摄第二混合体系的显色结果；使用酶标仪和NanoDrop N2000在室温、420nm下测量吸收值。
2结果
不同G-四链体核酸序列其比色结果和吸光度结果分别如图2a、图2b所示，结果显示：不同的G-四链体类型对形成具有辣根挂氧化物酶活性的核酸拟酶具有非常大的影响，相关实验表明分子内G-四链体比分子间的拟酶活性更高，平行的G-四链体必反平行或者混合型的拟酶高；本实施例的结果表明G1～G6六条G-四链体核酸序列中G6的显色效果最强，故选择G6序列应用于本发明方法。
实施例2
测试大肠杆菌0157:H7在不同食源性致病菌污染的特异性鉴定。
1材料与方法
1.1材料
不同菌种的食源性致病菌由南京农业大学动物医学院实验室分离鉴定。
1.2引物设计
1.3PCR扩增体系：
反应条件：
1.4操作方法
将不同菌种复苏培养，使用平板计数菌落数，提取细菌DNA，用上述(1.3)PCR反应体系对大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、单核李斯特菌和超纯水进行PCR扩增后分别用凝胶电泳和G-四链体核酸拟酶比色法验证其不同菌种间的特异性。
1)取10μL PCR产物，与氯化钾2ul(35mM)，Hemin1.33ul(4.5uM)，HEPES缓冲液6.67ul混匀形成第一混合体系，将第一混合体系在95℃左右加热4分钟解链后快速降温至4℃并恒温孵育10分钟；
2)随后向第一混合体系中加入显色A液、显色B液各90ul形成第二混合体系，并在第二混合体系显色5分钟后，使用智能手机或照相机拍摄第二混合体系的显色结果，使用酶标仪和NanoDrop N2000在室温、420nm下测量吸收值；
3)另取5μL PCR产物在含溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳条件为：1×TAE缓冲液，电压110V，电泳时间30min。
2结果
大肠杆菌O157:H7不同菌种间特异性鉴定电泳结果如图3a所示，大肠杆菌O157:H7不同菌种间特异性鉴定比色结果、不同菌种间比色反应吸光度结果分别如图3b、图3c所示，结果显示：本发明建立的PCR扩增后检测方法对大肠杆菌O157:H7具有较好的特异性，在不同菌种间也未发生明显的显色反应，具有很好的辨识度，在未借助其他实验仪器的情况下肉眼便可观察，可以方便基层工作者们的使用，更有助于检出大肠杆菌O157:H7致病菌。
实施例3
大肠杆菌0157:H7在大肠杆菌属不同血清型之间的特异性鉴定。
1材料与方法
1.1材料
大肠杆菌属不同血清型的大肠杆菌致病菌。
1.2引物设计
1.3PCR扩增体系：
反应条件：
1.4操作方法
将不同血清型的大肠杆菌复苏培养，使用平板计数菌落数，提取细菌DNA，用上述(1.3)PCR反应体系对大肠杆菌O157:H7、O2:K1:H7、O132:H7、O141:K85:H4、O55:K54、O125:K67和超纯水分别进行PCR扩增后用凝胶电泳和G-四链体核酸拟酶比色法验证其不同血清型间的特异性。
1)取10μL PCR产物，与氯化钾2ul(35mM)，Hemin1.33ul(4.5uM)，HEPES缓冲液6.67ul混匀形成第一混合体系，将第一混合体系在95℃左右加热4分钟解链后快速降温至4℃以下，并恒温孵育10分钟；
2)随后向第一混合体系中加入显色A液、显色B液各90ul形成第二混合体系，并在显色5分钟后，使用智能手机或照相机拍摄第二混合体系的显色结果，使用酶标仪和NanoDrop N2000在室温、420nm下测量吸收值；
3)另取5μL PCR产物在含溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳条件为：1×TAE缓冲液，电压110V，电泳时间30min。
2结果
大肠杆菌的不同血清型电泳结果如图4a所示，大肠杆菌的不同血清型的比色结果、大肠杆菌的不同血清型的比色反应吸光度结果分别如图4b、图4c所示；结果显示：本发明建立的PCR扩增后检测方法能很好地检测大肠杆菌O157:H7血清型致病菌，因大肠杆菌属包含的各种血型型繁多，而O157:H7具有特殊的卫生学安全意义。该检测方法能有效的避免不同血清型之间的干扰，准确的鉴定大肠杆菌O157:H7。
实施例4
测试核酸拟酶比色法检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度。
1材料与方法
1.1材料
大肠杆菌O157:H7致病菌。
1.2引物设计
1.3PCR扩增体系：
反应条件：
1.4操作方法
将大肠杆菌O157:H7复苏培养至对数期，取菌液梯度稀释后采用平板计数，同时提取细菌DNA作为PCR模板，采用上述(1.3)PCR反应体系对大肠杆菌O157:H7进行PCR扩增后分别用凝胶电泳和G-四链体核酸拟酶比色法验证灵敏度。
1)取10μL PCR产物，与氯化钾2ul(35mM)，Hemin1.33ul(4.5uM)，HEPES缓冲液6.67ul混匀形成第一混合体系，将第一混合体系在95℃左右加热4分钟解链后快速降温至4℃以下孵育10分钟；
2)随后向第一混合体系中加入显色A液、显色B液各90ul形成第二混合体系，并在显色5分钟后，使用智能手机或照相机拍摄第二混合体系的显色结果，使用酶标仪和NanoDrop N2000在室温、420nm下测量吸收值；
3)另取5μL PCR产物在含溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳条件为：1×TAE缓冲液，电压110V，电泳时间30min。
2结果
级联检测大肠杆菌O157:H7灵敏度的比色结果、级联检测大肠杆菌O157:H7灵敏度的吸光度结果分别如图5a、图5b所示，级联检测大肠杆菌O157:H7灵敏度的电泳结果如图5c所示，可见本发明建立的检测大肠杆菌O157:H7的核酸拟酶比色检测方法检测灵敏度高，可达到最低检测限为56cfu/mL。
本发明实施例以大肠杆菌O157:H7的DNA为模板，经PCR扩增后检测，结果表明，PCR检测以10ul扩增产物进行检测，此时检测结果显示只有以大肠杆菌O157:H7为模板的检测结果判断为阳性，其他菌种及空白对照均判断为阴性。
本发明实施例还以大肠杆菌O157:H7血清型和其他菌种以及相同种属的不同血清型的DNA，经PCR扩增后，取10ul扩增产物经核酸拟酶比色试剂盒和凝胶电泳同时检测，显示大肠杆菌O157:H7 DNA模板检测结果判定为阳性，其他菌株全部判定为阴性。
本发明实施例还将大肠杆菌O157:H7复苏培养至对数期，取菌液梯度稀释后采用平板计数，同时提取细菌DNA作为PCR模板。经PCR扩增后，取10ul扩增产物用试纸条和凝胶电泳同时检测，结果表明本发明所建立的检测大肠杆菌O157:H7核酸拟酶比色法有较高的灵敏度，可达到最低检测限为56cfu/mL。
本发明的方法中使用的特异性核酸序列扩增产物可用于检测其他来源不同种属的细菌和大肠杆菌不同血清型核酸序列的扩增产物，其特异性由扩增引物保证，使用G-四链体核酸拟酶通过引入酶循环信号放大及PCR产物放大双重策略实现最终信号的放大,保证了对大肠杆菌O157:H7检测的灵敏度。
本发明实施例中的Z3276-AHG6-46bp-F序列(即第一引物序列)为：CCCATCCCGCCCAACCCAAA AAACCCATCC CGCCCAACCCAAGCGTAAATGTATCCCCCGCCAGTTTGCTGGTGAGATAA TTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTTTTGGGTTGGGCGGGATGGG；
Z3276-AHG6-46bp-F/R序列(即第二引物序列)为：CCCATCCCGC CCAACCCAAAAAACCCATCCCGCCCAACCCAAGCGTAAATGTATCCCCCG CCAGTTTGCT GGTGAGATAATTGGGTTGGGCGGGATGGGT TTTTTGGGTT GGGCGGGATG GG。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
cccatcccgc ccaacccaaa aaacccatcc cgcccaaccc aagcgtaaat gtatcccccg 60
ccagtttgct ggtgagataa ttgggttggg cgggatgggt tttttgggtt gggcgggatg 120
gg 122
<210> 2
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
cccatcccgc ccaacccaaa aaacccatcc cgcccaaccc aagcgtaaat gtatcccccg 60
ccagtttgct ggtgagataa ttgggttggg cgggatgggt tttttgggtt gggcgggatg 120
gg 122

Claims (10)

1.一种检测试剂，其特征在于包括：主要由第一引物和第二引物组成的引物对，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述第一引物、第二引物的5’端具有串联重复鸟嘌呤(G)且能形成核酸拟酶的互补序列。
3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于还包括DNA聚合酶和PCR常规组件。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于还包括氯化血红素溶液、氯化钾溶液、HEPES缓冲溶液、显色A液、显色B液和终止液。
5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于：所述HEPES缓冲溶液包含25m MHepes、20m M KCl、200m M NaCl、0.025％(w/v)Triton X-100、1％(v/v)DMSO，所述HEPES缓冲溶液的pH为7.4左右；和/或，所述显色A液包含醋酸钠、柠檬酸、亚硫酸钠和双氧水，和/或，所述显色B液包含EDTA二钠盐、柠檬酸、甘油、L-半胱氨酸盐酸盐和TMB。
6.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于还包括：二甲基亚岚、L-半胱氨酸盐酸盐、柠檬酸、浓硫酸、亚硫酸钠、甘油、过氧化氢、乙酸钠、EDTA二钠盐。
7.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1-6中任一项所述的检测试剂。
8.一种应用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测方法的产品，其特征在于：所述产品包括权利要求1-6中任一项所述检测试剂或权利要求7所述试剂盒，并且，所述检测方法包括：
利用所述引物对，通过PCR扩增反应对从待测样品内提取到的核酸进行扩增；
将PCR扩增后的产物与氯化血红素溶液、氯化钾溶液、HEPES缓冲溶液混合形成第一混合体系，加热解链后恒温孵育；
将孵育后的第一混合体系与所述显色A液和显色B液混合形成第二混合体系，并通过观察第二混合体系的颜色或检测第二混合体系的OD值实现对待测样品内大肠杆菌O157:H7血清型致病菌的定性或定量检测。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，扩增30个循环，充分延伸72℃10min。
10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述检测方法包括：将所述第一混合体系于95℃左右条件下加热解链，之后快速降温至4℃以下孵育。
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