CN110384729A - 樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性中的应用，属于医药技术领域。本发明中，所述糖苷水解酶包括α‑淀粉酶和/或α‑葡萄糖苷酶。基于樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物均具有较好的糖苷水解酶抑制活性，本发明提供了樟树提取物在制备预防和/或治疗与糖苷水解酶活性引起的疾病中的应用，包括治疗糖尿病、高脂血症等药物中的应用。同时本发明提供了樟树提取物在改善血糖、血脂的食品或保健品中的应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性中的应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高，饮食、环境等因素的影响使糖尿病的发病率极高。糖尿病是一种由于体内胰岛素分泌不足引起的以糖代谢紊乱为主的全身性疾病，以高血糖和尿糖为特征，与癌症和心脑血管病并称为世界三大健康杀手。研究发现，降低餐后血糖可有效控制糖尿病及其并发症的发展。
α-淀粉酶既可以作用于直链淀粉，亦可作用于支链淀粉，无差别的切断α-1,4-键，催化水解淀粉会使淀粉黏度迅速下降，主要生成麦芽糖。α-淀粉酶抑制剂是属于糖苷水解酶抑制剂中的一种，它能有效地抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，降低了血糖和血脂含量水平，减少脂肪的合成，进而起到降糖、减肥及预防肥胖的功效。
α-葡萄糖苷酶是小肠绒毛上皮细胞刷状缘膜上存在的寡糖水解酶，可催化α-1,4糖苷键水解释放出葡萄糖。因此，抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以减缓肠道内葡萄糖的生成及吸收，降低餐后血糖峰值，减少高血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素敏感性，从而预防糖尿病及其并发症。
目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂已广泛应用于临床，如，阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等上市药物作为糖尿病患者的临床用药，但这些药物都存在肠胃胀气、腹泻、腹部不适等副作用。寻找新型有效的预防和治疗糖尿病药物仍是药物研究工作者面临的艰巨任务。开发α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶双重抑制的糖苷酶抑制剂具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性中的应用，所述樟树提取物作为糖苷水解酶抑制剂对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。
本发明提供了樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性的应用。
优选的，所述糖苷水解酶包括α-淀粉酶和/或α-葡萄糖苷酶。
优选的，所述樟树提取物的提取方法，包括以下步骤：
1)去除樟树原料破碎物中的油脂，得到脱脂樟树原料粕；
2)将所述脱脂樟树原料粕用体积浓度70～80％乙醇水溶液提取，固液分离，收集液相，去除溶剂，得到樟树提取物。
优选的，所述樟树原料包括化学型樟树原料；所述化学型樟树原料包括来源于化学型樟树的籽仁、枝、叶、茎和根。
优选的，以阿卡波糖为参比，所述樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为7.60～7.81mmoL阿卡波糖/g提取物；所述樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为51.84～56.12μmoL阿卡波糖/g提取物。
优选的，所述樟树提取物还包括经碱消化处理后的樟树提取物；
以阿卡波糖为参比，所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为6.67～6.85mmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-淀粉酶生物活力保存>87％；所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为41.48～45.96μmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-葡萄糖苷酶生物活力保存>80％。
优选的，所述樟树提取物包括胃肠道消化后的樟树提取物；
以阿卡波糖为参比，所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为63.93～77.05mmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-淀粉酶生物活力显著提高，抑制α-淀粉酶生物活力提高>817％；所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为68.98～74.86μmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-葡萄糖苷酶生物活力保存>33％。
本发明提供了樟树提取物在制备预防和/或治疗糖尿病或高血脂症药物中的应用；所述樟树提取物为所述应用中的樟树提取物。
本发明提供了樟树提取物在改善血糖或血脂的食品或保健品中的应用；所述樟树提取物为所述应用中的樟树提取物。
本发明还提供了一种α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的双重抑制剂，包括所述应用中的樟树提取物；所述樟树提取物包括以下质量百分含量的活性成分：多酚≥12.2％、黄酮≥20％和皂苷≥12.7％。
本发明提供了樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性中的应用。以樟树籽仁提取物为例验证在抑制糖苷水解酶酶活测试中应用，实验表明，樟树籽仁提取物具有较强的α-淀粉酶抑制活性，以阿卡波糖为参比，所述樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为7.60～7.81mmoL阿卡波糖/g提取物，说明樟树籽仁提取物作为α-淀粉酶抑制剂在抑制α-淀粉酶酶活性方面具有较好的应用前景。同时樟树籽仁提取物具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，以阿卡波糖为参比，所述樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为51.84～56.12μmoL阿卡波糖/g提取物，说明樟树籽仁提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂在抑制α-葡萄糖苷酶酶活性方面具有较好的应用前景。
进一步的，本发明提供的应用，进一步限定了樟树提取物包括经碱液或胃肠消化液消化后的樟树提取物。以樟树籽仁提取物为例验证在抑制糖苷水解酶酶活测试中应用，实验表明，樟树籽仁提取物经碱液消化后α-淀粉酶抑制活力保留87.7％，经胃肠消化液消化后活α-淀粉酶抑制活力显著提高，α-淀粉酶抑制活力提高了817.3％。经碱液和胃肠消化液消化后α-葡萄糖苷酶抑制活力分别保留81％和33.2％，表明樟树籽仁提取物对碱和胃肠消化液具有较强的耐受性。
附图说明
图1为樟树籽提取物紫外扫描图谱；
图2为樟树籽提取物HPLC图谱；
图3为黄酮标准曲线；
图4为多酚标准曲线；
图5为皂苷标准曲线；
图6为Trolox DPPH自由基清除曲线。
具体实施方式
本发明提供了樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性中的应用。所述糖苷水解酶优选包括α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶。
在本发明中，所述樟树提取物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的樟树提取物即可。在本发明实施例中，所述樟树提取物的提取方法，优选包括以下步骤：
1)去除樟树原料破碎物中的油脂，得到脱脂樟树原料粕；
2)将所述脱脂樟树原料粕用体积浓度70～80％乙醇水溶液提取，固液分离，收集液相，去除溶剂，得到樟树提取物。
本发明去除樟树原料破碎物中的油脂，得到脱脂樟树原料粕。
在本发明中，所述樟树原料优选包括化学型樟树原料；所述化学型樟树原料优选包括来源于化学型樟树的籽仁、枝、叶、茎和根。本发明以化学型樟树的籽仁、枝、叶、茎和根为原料进行提取，均能够得到具有抑制糖苷水解酶活性的提取物。本发明实施例中，以化学型樟树籽仁为例加以说明樟树提取物的性能。
在本发明中，所述去除樟树原料破碎物中的油脂的方法优选包括以下步骤：以正己烷或石油醚为溶剂室温条件下搅拌提取樟树原料破碎物中油脂，提取后悬浊液经抽滤，得到的滤饼用所述溶剂淋洗3～5次，滤饼自然风干至无溶剂气味，干燥粉过40目筛，得到脱脂樟树原料粕。
在本发明中，所述樟树原料破碎物和所述溶剂的料液比为1:3(w/v)。所述搅拌的速度优选为60～100rpm，更优选为80rpm。所述提取的时间优选为8h，所述提取的次数优选为3次。所述樟树原料破碎物的粒径优选为50～100目，更优选为70～90目，更优选为80目。
得到所述脱脂樟树原料粕后，本发明将所述脱脂樟树原料粕用体积浓度70～80％乙醇水溶液提取，固液分离，收集液相，去除溶剂，得到樟树提取物。
在本发明中，所述脱脂樟树原料粕和体积浓度70～80％乙醇水溶液的料液比1:20(w/v)。所述提取优选伴随搅拌。所述搅拌的转速优选为60-100rpm，更优选为80rpm。所述提取的次数优选3次，每次提取的时间优选为8h。所述固液分离优选为离心。所述离心的转速优选为5000rpm。所述离心的时间优选为10min。所述去除溶剂的方法优选于45～55℃减压浓缩去除溶剂。去除溶剂后得到的残留物优选用超纯水复溶，复溶液以5000rpm离心10分钟，离心上清液经低温冷冻干燥得到樟树籽仁提取物phi，收集冻干物储存于-20℃。樟树提取物用超纯水配制成2mg/mL浓度，用全波长紫外分光光度计在190～900nm波长范围内扫描，以超纯水校零。樟树籽仁提取物的UV光谱在210～250nm和260～300nm处显示最大吸收。
在本发明中，所述樟树提取物还包括经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物。
所述经碱消化处理后的樟树提取物的制备方法优选为将上述方法提取得到的樟树提取物和4M NaOH溶液混合，在37℃150rpm震荡消化30min得到。所述樟树提取物和NaOH溶液的料液比优选为1:20(w/v)。
所述胃肠道消化后的樟树提取物的制备方法优选为将上述方法提取得到的樟树提取物与pH 2.0的人工模拟胃液在37℃150rpm震荡下消化2h；得到的胃液消化液调节pH至6.8，37℃150rpm震荡消化15min；得到的混悬液中加入胰蛋白酶，用1M NaHCO3溶液调节pH至6.8，37℃150rpm震荡消化2小时；90℃10min灭活酶，12000g离心10min取上清得到胃肠道消化后的樟树提取物。
在本发明中，人工模拟胃液为包含以下含量的水溶液：35mM NaCl，250units/mg胃蛋白酶和4M HCl。所述樟树提取物和人工模拟胃液的料液比为1:10(w/v)。所述樟树提取物和胰蛋白酶的料液比为1:10(w/v)。所述调节胃液消化液的pH用溶液为包含以下组分的水溶液：1M NaHCO3，1M CaCl2和9mg/mL胆汁盐。
测定上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物中总黄酮含量，分别为196.92±1.42mg RE/g提取物、131.65±0.50mgRE/g提取物和173.67±0.66mg RE/g提取物。测定上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物中自由基清除率，2.40±0.042mmoLTE/g提取物、1.92±0.010mmoL TE/g提取物和2.41±0.025mmoL TE/g提取物。测定上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物中多酚含量，分别为122.30±0.87mg GAE/g提取物、84.82±0.48mg GAE/g提取物和120.98±1.28mg GAE/g提取物。测定上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物中皂苷含量，分别为127.14±1.62mg Rb1/g提取物、105.42±1.10mg Rb1/g提取物和188.33±1.95mg Rb1/g提取物。
抑制糖苷水解酶酶活测试结果，以阿卡波糖为参比，所述樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为7.60～7.81mmoL阿卡波糖/g提取物；所述樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为51.84～56.12μmoL阿卡波糖/g提取物。
以阿卡波糖为参比，所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为6.67～6.85mmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-淀粉酶生物活力保存>87％；所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为41.48～45.96μmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-葡萄糖苷酶生物活力保存>80％。
以阿卡波糖为参比，所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为63.93～77.05mmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-淀粉酶生物活力显著提高，抑制α-淀粉酶生物活力提高>817％；所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为68.98～74.86μmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-葡萄糖苷酶生物活力保存>33％。
基于上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物均具有较好的糖苷水解酶抑制活性，本发明提供了樟树提取物在制备预防和/或治疗与糖苷水解酶活性引起的疾病中的应用，所述疾病包括糖尿病或高脂血症药物中的应用。同时本发明提供了樟树提取物在改善血糖或血脂的食品或保健品中的应用。
在本发明中，所述药物优选为片剂。所述药物的服用方法为口服，每次1～2g提取物，一日2次，早餐及晚餐同服。
本发明还提供了一种α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的双重抑制剂，包括所述应用中的樟树提取物；所述樟树提取物包括以下质量百分含量的活性成分：多酚≥12.2％、黄酮≥20％和皂苷≥12.7％。所述抑制剂还包括可以接受的辅料。所述双重抑制剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的抑制剂的制备方法即可。所述双重抑制剂用于抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的酶活力。
下面结合实施例对本发明提供的樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
樟树籽仁提取物的制备方法
(1)樟树籽去皮肉脱壳获得樟树籽仁，樟树籽仁用高速多功能粉碎机破碎成50目，破碎物以正己烷为溶剂室温搅拌提取樟树籽仁中油脂，料液比1:3(w/v，单位g/ml)，搅拌速度60rpm，提取时间8h，提取3次。第3次提取后悬浊液经真空泵抽滤，滤饼用正己烷淋洗3次，滤饼平铺于洁净托盘中置于阴凉通风处自然风干至无溶剂气味，干燥粉过40目筛，得脱脂樟树籽仁粕。
(2)室温下脱脂樟树籽仁粕分散于80％乙醇溶液中，料液比1:20(w/v)，搅拌速度60rpm，提取时间8h，提取次数3次。每次提取后的悬浊液以5000rpm离心10分钟。合并3次离心上清液，用旋转蒸发器于45℃减压浓缩去除溶剂，残留物用适量超纯水复溶，复溶液以5000rpm离心10分钟，离心上清液经低温冷冻干燥得到樟树籽仁提取物phi，收集冻干物储存于-20℃。
实施例2
樟树籽仁提取物的制备方法
(1)樟树籽去皮肉脱壳获得樟树籽仁，樟树籽仁用高速多功能粉碎机破碎成100目，破碎物以石油醚为溶剂室温搅拌提取樟树籽仁中油脂，料液比1:3(w/v)，搅拌速度100rpm，提取时间8h，提取3次。第3次提取后悬浊液经真空泵抽滤，滤饼用正己烷淋洗5次，滤饼平铺于洁净托盘中置于阴凉通风处自然风干至无溶剂气味，干燥粉过40目筛，得脱脂樟树籽仁粕。
(2)室温下脱脂樟树籽仁粕分散于70％乙醇溶液中，料液比1:20(w/v)，搅拌速度100rpm，提取时间8h，提取次数3次。每次提取后的悬浊液以5000rpm离心10分钟。合并3次离心上清液，用旋转蒸发器于55℃减压浓缩去除溶剂，残留物用适量超纯水复溶，复溶液以5000rpm离心10分钟，离心上清液经低温冷冻干燥得到樟树籽仁提取物phi，收集冻干物储存于-20℃。
实施例3
樟树籽仁提取物的制备方法
(1)樟树籽去皮肉脱壳获得樟树籽仁，樟树籽仁用高速多功能粉碎机破碎成80目，破碎物以正己烷为溶剂室温搅拌提取樟树籽仁中油脂，料液比1:3(w/v)，搅拌速度80rpm，提取时间8h，提取3次。第3次提取后悬浊液经真空泵抽滤，滤饼用正己烷淋洗4次，滤饼平铺于洁净托盘中置于阴凉通风处自然风干至无溶剂气味，干燥粉过40目筛，得脱脂樟树籽仁粕。
(2)室温下脱脂樟树籽仁粕分散于75％乙醇溶液中，料液比1:20(w/v)，搅拌速度80rpm，提取时间8h，提取次数3次。每次提取后的悬浊液以5000rpm离心10分钟。合并3次离心上清液，用旋转蒸发器于50℃减压浓缩去除溶剂，残留物用适量超纯水复溶，复溶液以5000rpm离心10分钟，离心上清液经低温冷冻干燥得到樟树籽仁提取物phi，收集冻干物储存于-20℃。
将实施例1～3制备的樟树籽仁提取物phi用超纯水配制成2mg/mL浓度，用全波长紫外分光光度计在190～900nm波长范围内扫描，以超纯水校零。樟树籽仁提取物的UV光谱在210～250nm和260～300nm处显示最大吸收，见图1。
将樟树籽仁提取物phi用超纯水配制成2mg/mL浓度，用Agilent Technologies6120HPLC色谱仪进行色谱分离：
色谱柱：Amethyst C18-H(4.6ⅹ250mm,5μm)；
柱温：25℃；
流动相：0.1％甲酸-水溶液(A)，甲醇(B)；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
紫外检测波长：280nm；
梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
色谱分离结果见图2。
根据色谱分离结果进一步质谱分析，用电喷雾离子源(ESI)在负离子模式下进行质谱扫描。主要参数如下：离子源电压，-4500V；离子源温度，550℃；气帘气，35PSI；辅助气1，60PSI；辅助气2，60PSI；碰撞能量，-30eV；离子扫描范围，100～1500IDA。初步鉴定樟树籽仁提取物中的化合物见表2。
表2初步鉴定樟树籽仁提取物中的化合物信息
实施例4
碱消化樟树籽仁提取物的制备方法
将实施例1～3制备的樟树籽仁提取物phi与4M NaOH溶液1:20(w/v)在37℃150rpm震荡消化30min，得到碱消化樟树籽仁提取物phh。
实施例5
将实施例1～3制备的樟树籽仁提取物phi与pH 2.0的人工模拟胃液(35mM NaCl，250units/mg胃蛋白酶，4M HCl)按照1:10(w/v)的比例混合，在37℃150rpm震荡下消化2h；用溶液(1M NaHCO3，1M CaCl2，9mg/mL胆汁盐)调节pH至6.8，37℃150rpm震荡消化15min；混悬液中加入胰蛋白酶1:10(w/v)，用1M NaHCO3溶液调节pH至6.8，37℃150rpm震荡消化2小时；90℃10min灭活酶，12000g离心10min取上清，得到胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi。
实施例6
樟树籽仁提取物phi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi中总黄酮含量测定。
①芦丁(RE,rutin)标准溶液配制：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标准品10mg，用30％乙醇溶解，用30％乙醇定容至100mL，得0.1mg/ml的对照品标准溶液。
②黄酮标准曲线绘制：准确吸取0.l mg/mL的芦丁对照品溶液0.0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置于10mL具塞刻度试管中，用30％乙醇补充至5mL，先加5％NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min；再加10％Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加1mol/LNaOH溶液4mL，用30％乙醇定容至10mL，摇匀，静置15min。依次编号为0、1、2、3、4、5，以0为空白对照。在510nm波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，芦丁标准品溶液浓度为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，得到黄酮标准曲线。
③phi、phh、dphi样品中黄酮测定：phi、phh、dphi样品分别用超纯水溶解成2mg/mL溶液，将phi、phh、dphi溶液5000rpm离心10min，精确移取0.5mL上清于10mL带刻度试管中，按照黄酮标准曲线绘制方法测定phi、phh、dphi样品吸光度，代入黄酮标准曲线，得到phi、phh、dphi样品溶液中总黄酮含量。
由上述方法绘制黄酮标准曲线如图3。
由上述方法测得phi、phh、dphi样品中黄酮含量如表3。
表3 phi、phh、dphi中黄酮含量
实施例7
樟树籽仁提取物phi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi多酚含量测定。
①没食子酸(gallic acid,GA)标准溶液配制：精确称取经105℃干燥恒重的没食子酸标准品10mg，用双蒸水溶解并定容到100ml，得0.1mg/ml的对照品标准溶液。
②多酚标准曲线绘制：准确吸取0.l mg/mL对照样品溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于10mL具塞刻度试管中，再加入1mL Folin-Ciocalteau试剂，摇匀室温下静置6分钟；后加入3mL 15％Na2CO3溶液，用双蒸水定容到10mL，室温下反映2h，以0为空白对照，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，没食子酸标准品溶液浓度为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，得到多酚标准曲线。
③phi、phh、dphi样品中多酚测定：phi、phh、dphi样品分别用超纯水溶解成2mg/mL溶液，将phi、phh、dphi溶液5000rpm离心10min，精确移取0.2mL上清于10mL带刻度试管中，按照多酚标准曲线绘制方法测定phi、phh、dphi样品吸光度，代入多酚标准曲线，得到phi、phh、dphi样品溶液中总多酚含量。
由上述方法绘制多酚标准曲线如图4。
由上述方法测得phi、phh、dphi样品中总多酚含量如表4。
表4 phi、phh、dphi中总多酚含量
实施例8
樟树籽仁提取物phi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi皂苷含量测定。
①人参皂苷Rb1(ginsenoside-Rb1)标准溶液配制：精确称取人参皂苷Rb1标准品0.010g，用甲醇溶解并定容至10.0mL，得1.0mg/mL的对照品标准溶液。
②总皂苷标准曲线绘制：准确吸取1.0mg/mL对照样品溶液0、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL于10mL具塞刻度试管中，于60℃水浴挥干溶剂，加入0.2mL 5％香草醛-冰醋酸溶液(新鲜)，加入0.8mL高氯酸，混匀，于60℃水浴中显色15min，水浴后立即用冰水冷却5min，加入5mL冰醋酸，充分振荡，静置10min，以0为空白对照，在560nm波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，人参皂苷Rb1标准品溶液浓度为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，得到皂苷标准曲线。
③phi、phh、dphi样品中皂苷测定：phi、phh、dphi样品分别用超纯水溶解成2mg/mL溶液，将phi、phh、dphi溶液5000rpm离心10min，精确移取0.2mL上清于10mL带刻度试管中，按照皂苷标准曲线绘制方法测定phi、phh、dphi样品吸光度，代入皂苷标准曲线，得到phi、phh、dphi样品溶液中总皂苷含量。
由上述方法绘制皂苷标准曲线如图5。
由上述方法测得phi、phh、dphi样品中总皂苷含量如表5。
表5 phi、phh、dphi中总皂苷含量
实施例8
樟树籽仁提取物dphi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi抗氧化性测定。
①DPPH溶液的配制：精密称取DPPH试剂8.0mg，用无水甲醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004％的DPPH溶液，避光保存，备用。
②DPPH自由基清除标准曲线绘制：用无水甲醇配制不同浓度的trolox的溶液，精确吸取0.5mL不同浓度的trolox的溶液，置10mL具塞刻度试管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水甲醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。以Trolox为阳性对照。按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率(％)＝(1-As/A0)×100％
公式中，A0—无水甲醇+3.0mlDPPH溶液的吸光度值
As—样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值
③phi、phh、dphi样品中黄酮测定：phi、phh、dphi样品分别用超纯水溶解成2mg/mL溶液，将phi、phh、dphi溶液5000rpm离心10min，精确移取0.5mL上清于10mL带刻度试管中，按照DPPH自由基清除标准曲线绘制方法测定phi、phh、dphi样品自由基清除率。
由上述方法测得Trolox DPPH自由基清除标准曲线如图6。
由上述方法测得phi、phh、dphi样品DPPH自由基清除率如表6。
表6 phi、phh、dphi DPPH自由基清除
实施例10
樟树籽仁提取物dphi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi抑制ɑ-淀粉酶酶活测试。
在10mL具塞玻璃试管中，加入100μL适宜浓度的样品溶液，加入100μLα-淀粉酶溶液(100U/mL，用pH 6.90.02M PBS配制)，充分混合后，于65℃水浴反应5min，添加200μL 1％的淀粉溶液(用pH 6.90.02M PBS配制)，于65℃水浴精确反应5min，加入100μL DNS溶液终止，并置于沸水中反应5min，冰水冷却至室温后，加入1mL超纯水，于540nm下测吸光值。以不加底物和样品的反应体系为空白，以阿卡波糖作为阳性对照。ɑ-淀粉酶酶酶活抑制率(I)按式(1)计算。每克测试样品抑制ɑ-淀粉酶酶活力等价于阿卡波糖量按式(2)换算。
抑制率(I)＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％ 式(1)
A—未加样品的加酶的混合液所测的吸光度；
B—未加样品未加底物的混合液所测的吸光度；
C—加样品加酶的混合液所测的吸光度；
D—加样品未加底物的混合液所测的吸光度；
mmoLACEs/g extract＝[X×1500/(100×C×645.6)]×103 式(2)
ACEs-阿卡波糖；
X—样品测得的抑制率代入阿卡波糖抑制率曲线得到的阿卡波糖浓度(mg/mL)；
1500—ɑ-淀粉酶抑制反应总体积(μL)；
100—样品体积；
645.6—阿卡波糖分子量；
由上述方法测得phi、phh、dphi抑制ɑ-淀粉酶活力如表7。
表7 phi、phh、dphi抑制ɑ-淀粉酶活力
由表7可知，樟树籽仁提取物具有较强的ɑ-淀粉酶抑制活性。樟树籽仁提取物经碱液液消化后ɑ-淀粉酶抑制活力保留87.7％，表明樟树籽仁提取物对碱具有较强的耐受性。樟树籽仁提取物经胃肠消化液消化后对ɑ-淀粉酶抑制活力急剧增加，ɑ-淀粉酶抑制活力增加了817.3％，表明胃肠道消化有利于樟树籽仁提取物对ɑ-淀粉酶抑制，樟树籽仁提取物在ɑ-淀粉酶抑制剂中具有较好的应用前景，樟树籽仁提取物在治疗和预防糖尿病或高血脂症等药物中具有潜在的巨大应用前景。
实施例11
(10)樟树籽仁提取物dphi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi抑制ɑ-葡萄糖苷酶酶活测试。
在96孔板中加入70μL适宜浓度的样品(0.1moL/LpH6.8 PBS稀释)和20μL的700U/mLα-葡萄糖苷酶，混匀后置于37℃温浴30min，加入20μL的10mmol/L的pNPG，37℃孵育20min。加入90μL的0.2mol/LNa2CO3溶液终止反应，用酶标仪405nm检测吸光值。以不加酶和样品的反应体系为空白，以阿卡波糖作为阳性对照。ɑ-葡萄糖苷酶酶活抑制率(I)按式(3)计算。每克测试样品抑制ɑ-葡萄糖苷酶酶活力等价于阿卡波糖量按式(4)换算。
抑制率(I)＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％ 式(3)
A—未加样品的加酶的混合液所测的吸光度；
B—未加样品未加底物的混合液所测的吸光度；
C—加样品加酶的混合液所测的吸光度；
D—加样品未加底物的混合液所测的吸光度；
μmoLACEs/g extract＝[X×200/(70×C×645.6)]×106 式(4)
ACEs-阿卡波糖；
X—样品测得的抑制率代入阿卡波糖抑制率曲线得到的阿卡波糖浓度(mg/mL)；
200—ɑ-葡萄糖苷酶抑制反应总体积(μL)；
70—样品体积；
645.6—阿卡波糖分子量；
由上述方法测得phi、phh、dphi抑制α-葡萄糖苷酶活力如表8。
表8 phi、phh、dphi抑制ɑ-葡萄糖苷酶活力
由表8可知，樟树籽仁提取物具有较强的ɑ-葡萄糖苷酶抑制活性。樟树籽仁提取物经碱液液消化后ɑ-葡萄糖苷酶抑制活力保留81％，表明樟树籽仁提取物对碱具有较强的耐受性。樟树籽仁提取物经胃肠消化液消化后对ɑ-葡萄糖苷酶抑制活力急剧增加，ɑ-葡萄糖苷酶抑制活力增加了33.2％，表明胃肠道消化有利于樟树籽仁提取物对ɑ-葡萄糖苷酶抑制，樟树籽仁提取物在ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂中具有较好的应用前景，樟树籽仁提取物在治疗和预防糖尿病或高血脂症等药物中具有潜在的巨大应用前景。
由上述实施例可知，樟树籽仁提取物对ɑ-淀粉酶和ɑ-葡萄糖苷酶具有双重的抑制作用，樟树籽仁提取物在糖苷酶抑制剂中具有较好的应用前景，樟树籽仁提取物在治疗和预防糖尿病或高脂血症等药物中具有潜在的巨大应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.樟树提取物在抑制糖苷水解酶活性中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述糖苷水解酶包括α-淀粉酶和/或α-葡萄糖苷酶。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述樟树提取物的提取方法，包括以下步骤：
1)去除樟树原料破碎物中的油脂，得到脱脂樟树原料粕；
2)将所述脱脂樟树原料粕用体积浓度70～80％乙醇水溶液提取，固液分离，收集液相，去除溶剂，得到樟树提取物。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述樟树原料包括化学型樟树原料；所述化学型樟树原料包括来源于化学型樟树的籽仁、枝、叶、茎和根。
5.根据权利要求1～4任意一项所述应用，其特征在于，以阿卡波糖为参比，所述樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为7.60～7.81mmoL阿卡波糖/g提取物；所述樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为51.84～56.12μmoL阿卡波糖/g提取物。
6.根据权利要求1～4任意一项所述应用，其特征在于，所述樟树提取物还包括经碱消化处理后的樟树提取物；
以阿卡波糖为参比，所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为6.67～6.85mmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-淀粉酶生物活力保存>87％；
所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为41.48～45.96μmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-葡萄糖苷酶生物活力保存>80％。
7.根据权利要求1～4任意一项所述应用，其特征在于，所述樟树提取物包括胃肠道消化后的樟树提取物；
以阿卡波糖为参比，所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制α-淀粉酶活力为63.93～77.05mmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-淀粉酶生物活力显著提高，抑制α-淀粉酶生物活力提高>817％；
所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制α-葡萄糖苷酶活力为68.98～74.86μmoL阿卡波糖/g提取物，抑制α-葡萄糖苷酶生物活力保存>33％。
8.樟树提取物在制备预防和/或治疗糖尿病或高脂血症药物中的应用；所述樟树提取物为权利要求1～7任意一项所述应用中的樟树提取物。
9.樟树提取物在制备改善血糖或血脂的食品或保健品中的应用；所述樟树提取物为权利要求1～7任意一项所述应用中的樟树提取物。
10.一种α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的双重抑制剂，其特征在于，包括权利要求1～7任意一项所述应用中的樟树提取物；所述樟树提取物包括以下质量百分含量的活性成分：多酚≥12.2％、黄酮≥20％和皂苷≥12.7％。
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| JP2005068128A (ja) * | 2003-08-01 | 2005-03-17 | Soda Aromatic Co Ltd | α−グルコシダーゼ阻害剤 |
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