CN110373490A - 一种快速鉴定刺苍耳的引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速鉴定刺苍耳的引物及试剂盒，所述鉴定刺苍耳的引物包含正向引物和反向引物，所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。采用本发明的引物、试剂盒可以准确、高效地鉴定刺苍耳。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定刺苍耳的引物及试剂盒。
背景技术
我国与周边重要国家、地区的贸易往来大幅度增加，潜在入侵生物不断传入 突发，新入侵生物肆意扩散危害，形势严峻。亟待发展入侵生物精准识别及快速 检测的新技术、新产品、新方法，打造国门生物安全新防线。
外来苍耳属植物为农田重要杂草，且可黏附于动物毛皮上，进行远距离传播，且极大降 低毛坯的品质。苍耳属(非中国种)植物是我国的高度关注的检疫性、恶性杂草，其适应能 力强，繁殖速度快，传播途径广，一旦传入即可成为当地的优势种群，对当地的生态、农业 及生物多样性带来威胁。传统的检疫性杂草的鉴定，根据种子外部特征、形态，编制了种子 检索表，通过查阅资料，对比检索表，对检疫性杂草进行检索鉴别。但是在杂草的鉴定中， 形态学鉴定具有一定的局限性。一方面，在进出口货物中，杂草常常以种子的形态存在，体 型微小，形态学特征不明显，需要有长期鉴定经验的鉴定专家才可能给出准确的判定；另一 方面，部分种子常发生磨损，破坏了其形态特征，给检疫鉴定工作增加了难度，难以进行有 效的鉴定。因此，需要更为高效的分子鉴定手段对检疫性杂草进行快速鉴定，帮助口岸形成 较为完善的检疫性杂草的快速检测技术体系。
本发明利用刺苍耳(Xanthium spinosum)及实验室已获得的转录组数据，通过比较转录 组学，寻找刺苍耳物种特异性序列，并进行特异性引物的设计及筛选。本发明以刺苍耳cDNA 为模板，采用特异性引物经PCR扩增后，得到特定片段的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳 条带进行初步判断，再结合测序结果则可准确得出检测结果。
发明内容
本发明的目的是利用刺苍耳的转录组测序数据，通过比较转录组技术，与实验室获得其 他苍耳属的转录组序列进行转录组比较，得到特异性序列，并以此筛选刺苍耳特异性引物以 区分出刺苍耳。
本发明的又一目的是提供一种基于物种转录组特异性序列位点设计引物进行PCR的分子 鉴定方法。
本发明旨在获得可以用于快速鉴定刺苍耳的特异性序列及引物。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种快速鉴定刺苍耳的引物，其特征在于，所述鉴定刺苍耳的引物包含正向引物和反向 引物，所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。
一种采用权利要求1所述的快速鉴定刺苍耳的引物构建获得的刺苍耳的特异性识别序列， 其特征在于，所述特异性识别序列如SEQ ID NO.3所示。
一种快速鉴定刺苍耳的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含快速鉴定刺苍耳的引物SEQ ID NO:1-2，以及特异性识别序列SEQ ID NO.3。
本发明还提供了上述快速鉴定刺苍耳的引物在鉴定刺苍耳中的应用。
本发明还提供了上述快速鉴定刺苍耳的试剂盒在鉴定刺苍耳中的应用。
有益效果：
采用本发明的引物或试剂盒可以快速、方便、高效地鉴定刺苍耳，准确度高、成本低。
附图说明
图1本发明的引物用于鉴定刺苍耳的PCR扩增效果图。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一、本发明用于鉴定灰茶尺蛾的引物详见表1
表1刺苍耳的特异性识别序列及引物序列
二、实验方法
(1)利用软件Primer Premier 5.0设计引物，设计好的引物通过NCBI primer-blast工具在 各苍耳转录组组间进行筛选获得特异性的引物；
(2)分别收集白苍耳、北美苍耳、宾州苍耳、苍耳、刺苍耳、蝟实苍耳、意大利苍耳、直刺苍耳、柱果苍耳9种检疫性苍耳种子，利用Vazyme的植物RNA提取试剂盒提取RNA， 并通过紫外分光光度计确定浓度，利用Vazyme的反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；
(3)以上述9种检疫性苍耳cDNA作为模板，利用ExTaq酶(Takara)进行PCR扩增反应；
PCR扩增的体系为20μL，其中包括2×Premix Ex Taq(Takara)10μL，DNA模板1μL，10μM浓度的正向引物、反向引物各1μL，余量为灭菌蒸馏水；
PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸45s，35 个循环后72℃延伸10min。扩增反应在VeritiTM 96孔美国ABI基因扩增仪上进行；
(4)对PCR产物运用3％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，UVP紫外凝胶成像系统观察结果， 并拍照保存(见图1)。
PCR结果显示：只有刺苍耳样品检测到与特异性识别序列大小一致的条带，其他品种的 苍耳无条带。经测序后，PCR产物的序列与特异性识别序列一致，可确定该检测样品为刺苍 耳。因此，本发明引物可快速、准确的鉴定刺苍耳，具有商业化价值。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本 发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人 员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于 本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心
<120> 一种快速鉴定刺苍耳的引物及试剂盒
<130> 2019
<141> 2019-08-05
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 423
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att 423
Claims (5)
1.一种快速鉴定刺苍耳的引物，其特征在于，所述鉴定刺苍耳的引物包含正向引物和反向引物，所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种采用权利要求1所述的快速鉴定刺苍耳的引物构建获得的刺苍耳的特异性识别序列，其特征在于，所述特异性识别序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种快速鉴定刺苍耳的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1中所述的快速鉴定刺苍耳的引物，以及权利要求2中所述的特异性识别序列。
4.权利要求1所述的快速鉴定刺苍耳的引物在鉴定刺苍耳中的应用。
5.权利要求3所述的快速鉴定刺苍耳的试剂盒在鉴定刺苍耳中的应用。
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2019
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