CN110361494B - 异丙托溴铵气雾剂中杂质g的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法。该检测方法采用双流动相和三段以上梯度洗脱程序，用液相色谱法测定异丙托溴铵及其杂质G的含量，针对本领域长期缺乏杂质G的有效检测手段的不足，提供了一种准确、高效的解决方案。
Description
技术领域
本发明属于药物质量控制技术领域，具体涉及异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法。
背景技术
异丙托溴铵，分子式：C20H30BrNO3，分子量412.4，CAS号：22254-24-6，医药上以其一水合物使用。异丙托溴铵气雾剂，由德国勃林格殷格翰制药公司研发，主要用于缓解慢性阻塞性肺病引起的支气管痉挛、喘息症状；慢性阻塞性气管炎伴或不伴有肺气肿；轻到中度支气管哮喘。
异丙托溴铵气雾剂是由原料药异丙托溴铵作为活性成分通过制剂工艺制备得到。相比于原料药，异丙托溴铵气雾剂额外添加了柠檬酸、乙醇、水等辅料，并采用特定的包材进行包装，例如德国勃林格殷格翰制药公司的产品采用的钢罐包材和华润双鹤公司采用的铝合金包材。这些额外的辅料添加以及包材的接触都会对杂质的产生造成影响。因此，通常情况下，原料药的分析检测方法无法直接转用于具体剂型药物的有关物质检测。
现有的异丙托溴铵气雾剂成药剂型的有关物质检测公开文献较少。《中国药典》2015版、EP9.0、USP41均尚未收载异丙托溴铵气雾剂，进口药品注册标准(标准号：JX20150036)采用HPLC法控制有关物质A、F、托品酸乙酯；BP2017采用薄层色谱法控制有关物质A以及其他未知杂质。
然而，医药行业长期缺乏针对杂质G的准确有效的定量检测方法，使得异丙托溴铵气雾剂的质量不能得到全面的控制。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法。该方法能够实现对杂质G的准确有效检测，进而使异丙托溴铵气雾剂的质量控制得以完善。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，包括用液相色谱法测定异丙托溴铵及其杂质G的含量的步骤；其中，液相色谱法采用的色谱条件包括，双流动相：流动相A为含有离子对试剂的弱酸性水溶液，流动相B为异丙托溴铵的有机良溶剂；洗脱程序为三段以上的梯度洗脱，起始阶段流动相A的体积占比大于50％且小于100％，中间阶段流动相A的体积占比大于0％且小于50％，结束阶段流动相A的体积占比大于50％且小于100％，
在本发明中，该离子对试剂通常为阴离子型酸性离子对试剂。根据本发明的一些具体实施例，阴离子型酸性离子对试剂包括但不限于四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵、四丁基碘化铵、四丁基磷酸二氢铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基硫酸氢铵、七氟丁酸、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基硫酸氢等中的一种或多种。在本发明优选的实施例中，选用四丙基氯化铵为离子对试剂。
根据本发明的一些具体实施例，流动相A的pH为4-7，优选为5-6，更优选为5.5。流动相A的弱酸性水溶液可以通过将一种或多种酸性物质溶解于水调节至所需pH获得，这些酸性物质包括但不限于盐酸、硝酸、H2SO4、H3PO4、甲酸、乙酸、三氟乙酸、高氯酸等中的一种或多种；也可以用一组或多组成缓冲对的盐溶解于水获得，一组成缓冲对的盐包括呈酸性的缓冲盐和呈碱性的缓冲盐。这些成缓冲对的盐包括但不限于NaH2PO4-Na2HPO4、NH3·H2O-NH4Cl、KH2PO4-K2HPO4等中的一种或多种。在本发明优选的实施例中，用NaH2PO4-Na2HPO4为配制酸性水溶液流动相A的缓冲对盐。
将离子对试剂加入弱酸性水溶液中制备流动相A有多种具体方案。例如，在本发明优选的一些具体实施方式中，流动相A包括5-15g/L的NaH2PO4和0.5-2.5g/L的四丙基氯化铵，再用0.5-1.5mol/L的Na2HPO4调节pH至4-7。在更优选的实施例中，流动相A包括7-14.5g/L的NaH2PO4和1-2g/L的四丙基氯化铵，再用1.0mol/LNa2HPO4调节pH至5-6，最优的pH为5.5。
采用本发明的色谱条件时，异丙托溴铵及其杂质G能与其它的杂质较好地分离开，得到准确的含量检测结果。然而，发明人在研究过程中发现，这些具体方案中，溶解于流动相A中的溶质(包括离子对试剂和酸性物质/缓冲盐)对色谱柱的使用寿命会产生较大影响。溶质含量越高，流动相对色谱柱的损害越大。色谱柱价格昂贵，如果检测过程对其造成损害过大，将严重缩短使用寿命，增加检测成本。出于保护色谱柱的考虑，对于用酸性物质配置的流动相A，优选流动相A中酸性物质的浓度为5-9g/L，更优选为6-8g/L，进一步优选为7.2g/L；离子对试剂的浓度为0.5-1.5g/L，更优选为0.8-1.2g/L，进一步优选为1.0g/L。对于用成缓冲对的盐配置的流动相A，优选流动相A中含有酸性的缓冲盐的的浓度为5-9g/L，更优选为6-8g/L，进一步优选为7.2g/L；离子对试剂的浓度为0.5-1.5g/L，更优选为0.8-1.2g/L，进一步优选为1.0g/L；用于调节pH的碱性的缓冲盐的浓度为0.5-1.2mol/L，更优选为0.6-1.0mol/L，最优选为1.0mol/L。
本发明所述的有机良溶剂是指对异丙托溴铵具有良好溶解性且能与水互溶的有机溶剂，例如溶解度大于0.5mg/mL的有机溶剂，优选为溶解度大于0.8mg/mL的有机溶剂，更优选为溶解度大于1.0mg/mL的有机溶剂。所述有机良溶剂包括但不限于醇类溶剂、腈类溶剂、酰胺类溶剂、酮类溶剂的一种或多种。进一步地，所述有机良溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈、丙腈、二甲基甲酰胺、丙酮等中的一种或多种。在本发明一些优选的实施例中，流动相B为甲醇。
根据研究发现，采用等度洗脱的方式不能将待测物质与可能存在的其他物质很好的分离并检出。本发明采用三段以上梯度洗脱程序，能够使待测组分在适宜的时间内全部出峰，并且保证待测组分与相邻峰之间的分离度大于1.5以实现基线分离。
在本发明的一些优选实施例中，液相色谱的梯度洗脱包含四个阶段：第一阶段，水相流动相A占比应高于有机溶剂流动相B，优选的，水相流动相A的体积占比为60-95％，更优的，水相流动相A的体积占比为70-90％，持续时间为20-40min，优选为32min；第二阶段，流动相A的体积占比为70-90％，持续时间为20-40min，优选为31min；第三阶段，水相流动相A占比低于有机溶剂流动相B，优选的，水相流动相A的体积占比为10-45％，更优的，水相流动相A的体积占比为30-40％，第三阶段持续时间为3-8min，优选为5min；第四阶段，流动相A的体积占比为70-90％，持续时间为5-10min，优选为7min。
色谱柱采用C18反相色谱柱。例如，在本发明的一些实施例中，C18色谱柱的具体型号为ZORBAX4.6×150mm，5μm或Phenomenex GEMINI C18 4.6×250mm，5μm。但是，能够用于本发明的C18色谱柱并不限于此。
流速、检测波长、柱温、进样量等参数设置是本领域的常规手段，这些参数也已经在一些现有技术中公开，本领域技术人员可以根据这些技术进行设定并适当做出调整。根据本发明的一些具体实施例，流动相流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温为30℃，进样量为20μL。
本发明的方法还包括在液相色谱检测前的配制供试品溶液和对照溶液的步骤。在本发明的一些实施例中，供试品溶液配制：取异丙托溴铵气雾剂，置冰箱冷冻10min以上，控制释放速度使异丙托溴铵气雾剂中的抛射剂气化挥尽，然后转移剩余内容物至容器中，使用稀释剂稀释后摇匀，即为供试品溶液；对照溶液配制：精密量取供试品溶液，并用稀释剂稀释若干倍，摇匀，作为对照溶液。在本发明的一些实施例中，稀释剂是pH＝2-3的磷酸水溶液。
本发明的方法还包括在液相色谱检测后的含量计算步骤，计算异丙托溴铵及其有关物质的含量时，可以采用分析领域常用的那些方法，比如面积归一化法、主成分外标法、主成分自身对照法和对照品外标法等。在本发明的一些具体实施例中，采用的是加校正因子的主成分自身对照法。
更具体地，本发明的一些实施例提供的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法：
包括以下步骤：
(1)制备备用溶液
稀释剂：pH＝2-3的磷酸水溶液
供试品溶液：将待测异丙托溴铵气雾剂去除抛射剂后，使用稀释剂稀释得到；
对照溶液：取供试品溶液适量，添加稀释剂稀释X倍后得到；
(2)使用液相色谱法检测，色谱条件如下：
色谱柱：C18柱
流动相：
流动相A：称取7-14.5g磷酸二氢钠和1-2g四丙基氯化铵，加水1000ml溶解，用0.5-1.0mol/L磷酸氢二钠调pH至5-6；
流动相B：甲醇；
梯度洗脱：起始阶段，流动相A的体积占比控制在70-90％，中间阶段，流动相A的体积占比逐渐由70-90％降低至10-45％，结束阶段，流动相A的体积占比逐渐由10-45％升高至70-90％；
(3)采用带校正因子的主成分自身对照法，计算杂质G的含量：
计算公式：
其中：f—校正因子；
As—供试品溶液中已知杂质或未知杂质的峰面积；
AR—对照溶液中异丙托溴铵的峰面积；
X—对照溶液的稀释倍数。
根据本发明的一些优选实施例中介绍，本发明所提供的检测方法还能够实现杂质G与异丙托溴铵气雾剂中多达7种杂质的同步检测，这给异丙托溴铵气雾剂的杂质控制研究带来极大的便利，在异丙托溴铵气雾剂的药学研究和杂质控制研究中具有重要的意义。基于此，本发明还提供了前述检测方法在异丙托溴铵气雾剂的药学研究尤其是杂质控制研究中的应用。其具体应用的方式和场景，包括但不限制于采用前述方法同步进行异丙托溴铵气雾剂多种杂质尤其是7种以上杂质的分析检测，以进行异丙托溴铵气雾剂的药学研究或杂质控制的策略研究。
本发明的有益效果在于：异丙托溴铵气雾剂中的杂质G是现有方法尚不能准确检测的，而本发明为这一长期缺乏有效检测手段的杂质提供了一种检测手段，弥补了本行业不能对异丙托溴铵气雾剂进行更为全面的质量控制的不足。
附图说明
图1是实施例1方法检测杂质混合对照溶液的HPLC图；
图2是实施例2方法检测杂质混合对照溶液的HPLC图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的发明内容做进一步的阐释，但不应理解为本发明的范围仅限于以下的实例，根据本发明的发明思路和全文内容，可以将以下实例中的各个技术特征做适当的组合/替换/调整/修改等，这对于本领域技术人员而言是显而易见的，仍属于本发明保护的范畴。
本发明的有关物质检测方法，根据色谱图计算异丙托溴铵和各杂质含量时，采用加校正因子的主成分自身对照法：
其中：f—校正因子；
As—供试品溶液中已知杂质或未知杂质的峰面积；
AR—对照溶液中异丙托溴铵的峰面积；
X—对照溶液的稀释倍数；
在具体的未知样品测定实验进行前，先进行校正因子的实验测定。具体的，先采用异丙托溴铵和杂质G的标准品按照同样的色谱条件进行实验，取杂质G以及异丙托溴铵适量，制成系列浓度的混合溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到异丙托溴铵及杂质G的回归方程，其斜率为K和Ki，按公式(f＝K/Ki，K为主成分斜率，Ki为已知杂质斜率)计算校正因子。
以下实施例中的试剂、杂质和实验材料均可商购获得。各个实施例所用的供试品和对照溶液采用如下方法配制：
稀释剂：pH 2.6磷酸水溶液。
供试品溶液：取本品2瓶，置冰箱冷冻10min以上，取出，在铝盖上钻一小孔，插入注射针头，待抛射剂气化挥尽后，将瓶与阀分离，将内容物转移至25ml量瓶中，用pH 2.6磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取1ml供试品溶液，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度(即稀释100倍)，摇匀，作为对照溶液。
实施例1
运用液相色谱法检测杂质混合对照溶液，色谱条件如表1和表2：
表1
表2梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 32 | 80 | 20 |
| 63 | 40 | 60 |
| 68 | 80 | 20 |
| 75 | 80 | 20 |
色谱图如图1所示，在该条件下，异丙托溴铵和杂质G都可检出，且分离度显著大于1.5。
额外的问题是，异丙托溴铵气雾剂中可能存在的杂质多达十余种，通常情况下常规检测方法无法实现杂质G与其他多种杂质的同步分离检测。而在本发明中，进一步的研究验证试验证实，本发明所提供的检测方法可以实现杂质G与至少7种异丙托溴铵气雾剂杂质的同步分离与检测，这给异丙托溴铵气雾剂的杂质控制研究带来极大的便利，在异丙托溴铵气雾剂的药学研究和杂质控制研究中具有重要的意义。
实施例2
进一步优化缓冲盐和离子对试剂浓度，以减小其对色谱柱的损害，延长色谱柱使用寿命。按照下表4的色谱条件检测杂质混合对照溶液：
表3
梯度洗脱程序同实施例1。
色谱图如图2所示，在该条件下，依然能够实现杂质G和异丙托溴铵的检出，并且具有较好的分离度。
如实施例1的进一步研究，实施例2的优化方案也进一步考量了其对多种杂质同步检测的检测效果。进一步的验证实验证实，实施例2的的优化方案在降低了对色谱柱伤害的同时，依然能够保持实现杂质G与多种异丙托溴铵气雾剂同步分离检测。尤其是，杂质G与前后相邻杂质的分离度为2.63和3.25，均明显大于1.5。基于此，本发明所提供检测方法还可便利的应用于异丙托溴铵气雾剂的药学研究尤其是杂质控制研究。
流动相的离子对试剂与固定相结合影响色谱柱的键合作用，这种结合一方面达到分离分析样品的效果，另一方面将导致固定相发生不可逆吸附，对色谱柱造成不可逆的伤害。本实施例2的色谱条件在保证分离度的基础上，降低了离子对试剂和缓冲盐的浓度，因而有利于延长色谱柱的寿命。
实施例2的进一步效果验证(如无特别指明，进行效果验证所采用的方法均为异丙托溴铵气雾剂检测行业通用方法)：
检测限和定量限：
进一步的方法验证实验证实，采用本发明所提供的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法进行杂质G的检测具有良好的灵敏度，具体的，杂质的检测限和定量限如下表4所示：
表4
线性：
进一步的方法验证实验证实，本发明所提供的的检测方法对应检测结果显示，杂质G在LOQ～200％范围内与其峰响应值均成显著线性关系，r＝0.9999。
加标回收率：
进一步的方法验证实验证实，本发明所提供的的检测方法对应检测结果显示，杂质G加标回收率在90.0％～108.0％之间，加标回收率的RSD小于8.0％。也即本发明所提供的检测方法杂质G的检测具有较高的准确性。
Claims (10)
1.一种异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，其特征在于，包括用液相色谱法测定异丙托溴铵及其杂质G的含量，色谱柱采用C18柱；
所述液相色谱法采用的色谱条件包括，双流动相：流动相A为含有离子对试剂的弱酸性水溶液，所述离子对试剂为阴离子型酸性离子对试剂，所述弱酸性水溶液的pH为5-6；
流动相B为异丙托溴铵的有机良溶剂；所述有机良溶剂为选自醇类溶剂、腈类溶剂、酰胺类溶剂、酮类溶剂的一种或多种；
洗脱程序为三段以上的梯度洗脱，其中，第一阶段，流动相A的体积占比控制在70-90％，第二阶段，流动相A的体积占比逐渐由70-90％降低至10-45％，第三阶段，流动相A的体积占比逐渐由10-45％升高至70-90％，
2.根据权利要求1所述的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，其特征在于，所述离子对试剂为四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵、四丁基碘化铵、四丁基磷酸二氢铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基硫酸氢铵、七氟丁酸、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基硫酸氢中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，其特征在于，所述流动相A为含有酸性物质或一组或多组成缓冲对的盐且pH为5-6的水溶液；所述流动相B选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈、丙腈、二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，其特征在于，所述酸性物质为盐酸、硝酸、H2SO4、H3PO4、甲酸、乙酸、三氟乙酸、高氯酸中的一种或多种；所述成缓冲对的盐为NaH2PO4-Na2HPO4、NH3·H2O-NH4Cl、KH2PO4-K2HPO4中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，其特征在于，所述流动相A含有5-15g/L的NaH2PO4和0.5-2.5g/L的四丙基氯化铵，再用0.5-1.5mol/L的Na2HPO4调节pH至5-6。
6.根据权利要求4所述的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，其特征在于，流动相A中酸性物质的浓度为5-9g/L；流动相A中离子对试剂的浓度为0.5-1.5g/L。
7.根据权利要求4所述的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，其特征在于，流动相A中酸性的缓冲盐的浓度为5-9g/L；离子对试剂的浓度为0.5-1.5g/L；用于调节pH的碱性的缓冲盐的浓度为0.5-1.2mol/L。
8.根据权利要求2-7任意一项所述的异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱包含四个阶段，其中，洗脱起始时刻的流动相A的体积占比为80％，流动相B的体积占比为20％；第一阶段终止于洗脱起始后32min，该时刻流动相A的体积占比为80％，流动相B的体积占比为20％；第二阶段终止于洗脱起始后63min，该时刻流动相A的体积占比为40％，流动相B的体积占比为60％；第三阶段终止于洗脱起始后68min，此时流动相A的体积占比为80％，流动相B的体积占比为20％；第四阶段终止于洗脱起始后75min，此时流动相A的体积占比为80％，流动相B的体积占比为20％。
9.一种异丙托溴铵气雾剂中杂质G的检测方法：
其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备备用溶液
稀释剂：pH＝2-3的磷酸水溶液
供试品溶液：将待测异丙托溴铵气雾剂去除抛射剂后，使用稀释剂稀释得到；
对照溶液：取供试品溶液适量，添加稀释剂稀释X倍后得到；
(2)使用液相色谱法检测，色谱条件如下：
色谱柱：C18柱
流动相：
流动相A：称取7-14.5g磷酸二氢钠和1-2g四丙基氯化铵，加水1000ml溶解，用0.5-1.0mol/L磷酸氢二钠调pH至5-6；
流动相B：甲醇；
梯度洗脱：起始阶段，流动相A的体积占比控制在70-90％，中间阶段，流动相A的体积占比逐渐由70-90％降低至10-45％，结束阶段，流动相A的体积占比逐渐由10-45％升高至70-90％；
(3)采用带校正因子的主成分自身对照法，计算杂质G的含量：
计算公式：
其中：f—校正因子；
As—供试品溶液中已知杂质或未知杂质的峰面积；
AR—对照溶液中异丙托溴铵的峰面积；
X—对照溶液的稀释倍数。
10.权利要求1-9任一所述检测方法在异丙托溴铵气雾剂杂质控制中的应用。
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