CN110346464B - 一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法 - Google Patents

一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110346464B
CN110346464B CN201910491370.2A CN201910491370A CN110346464B CN 110346464 B CN110346464 B CN 110346464B CN 201910491370 A CN201910491370 A CN 201910491370A CN 110346464 B CN110346464 B CN 110346464B
Authority
CN
China
Prior art keywords
spleen
metabonomics
black porgy
aminopolysaccharide
biomarkers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910491370.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110346464A (zh
Inventor
周秀锦
邵宏宏
张静
晁铎源
宋立玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhoushan Customs Comprehensive Technical Service Center
Original Assignee
COMPREHENSIVE TECHNOLOGY SERVICE CENTER OF ZHOUSHAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by COMPREHENSIVE TECHNOLOGY SERVICE CENTER OF ZHOUSHAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU filed Critical COMPREHENSIVE TECHNOLOGY SERVICE CENTER OF ZHOUSHAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority to CN201910491370.2A priority Critical patent/CN110346464B/zh
Publication of CN110346464A publication Critical patent/CN110346464A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110346464B publication Critical patent/CN110346464B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G01N2030/146—Preparation by elimination of some components using membranes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8818—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，涉及生物医药分析领域，包括以下步骤：1）将黑鲷幼鱼分为实验组和空白组；2）在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；3）饲喂结束后幼鱼进行饥饿处理，麻醉后取出脾脏组织，保存备用；4）制备脾脏组织样品和制备质控样品，并使用超高效液相色谱‑飞行时间质谱联用技术进行处理；5）对收集到的代谢组学数据进行处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的脾脏代谢组学生物标志物，并对脾脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析，相比于其他硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制模型构建方法或评价方法，本发明系统性好，准确性高，成本低，操作简单。

Description

一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增 强模型的构建方法
技术领域
本发明涉及生物医药分析领域，尤其涉及一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法。
背景技术
硒作为机体必需微量元素，通过硒蛋白、硒依赖酶的辅助因子等形式，在机体生长和维持机体健康方面起着重要的作用。目前研究较多的是生物毒性相对较小和易于被吸收利用的有机硒，如硒化氨基多糖。硒化氨基多糖是通过化学修饰方法将多糖与无机硒结合获得，硒和多糖的生理活性和药理功能得到优化，生物活性普遍高于多糖和硒，更易于为机体吸收和利用。硒化氨基多糖可以作为增强适应性免疫性能的潜力含硒膳食补充剂。
黑鲷(Acathopagrus schlegelii)是我国东南沿海地区及太平洋西岸海水养殖的经济鱼类。脾脏是黑鲷非特异性免疫和特异性免疫的重要器官，内含丰富的各类免疫因子，目前关于黑鲷对硒的利用已有初步研究，但关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节作用的研究较少，且现有的研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制的评价方法存在系统性差，准确性低，成本高，操作复杂等技术问题。
例如，文献“不同类型硒对黑鲷幼鱼生长及血清免疫指标的影响[J].水产科学,2018(5):577-583.”，其通过对黑鲷投喂含蛋白41.57％、脂肪13.63％等氮等能基础饲料(对照组)及在其中添加2.35mg/kg硒化多糖和0.88mg/kg的亚硒酸钠(使外源硒添加量均为0.4mg/kg)的试验饲料8周，研究了不同类型的外源硒对黑鲷幼鱼生长性能、体组成和血清免疫指标的影响。且得到了添加适量的外源硒能显著提高黑鲷幼鱼的生长性能和血清免疫活性,且有机硒的生物利用率显著高于无机硒的试验结果，但该评价方法存在系统性差，准确性低，成本高，操作复杂等技术问题。
发明内容
本发明是为了克服目前现有的研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制的评价方法存在系统性差，准确性低，成本高，操作复杂等技术问题，一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：
1)将用于动物实验的黑鲷幼鱼随机均分为实验组和空白组；
2)采用相同的饲料饲喂实验组和空白组，并在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；
3)饲喂结束后将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，并用麻醉剂麻醉后，取出脾脏组织，保存备用；
4)制备脾脏组织样品和质控样品，随后使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理，进样时质控样品穿插于脾脏组织样品之间；
5)对超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术所收集得到的黑鲷脾脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的脾脏代谢组学生物标志物，并对脾脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析。
代谢组学能够将原始的反映样品信息的复杂数据经过一系列降维处理，直接反映体内生物化学过程和状态的变化，在系统研究生物内源性小分子代谢物整体和动态改变规律上具有独特优势。本发明结合利用高通量、高灵敏度、高分辨质谱检测技术和非靶向代谢组学方法，阐释硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节潜在的机制和靶标途径，为黑鲷免疫增强剂的开发提供参考。
作为优选，所述步骤1)中黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将黑鲷幼鱼进行停饲处理，随后放入玻璃纤维缸内微流水式饲养。
步骤2)中实验组和空白组饲喂具体方法为：将实验组和空白组采用普通饲料进行饲喂，并在实验组普通饲料中添加0.5～0.7mg Se/kg的硒化氨基多糖，连续饲喂8-10周。
步骤3)中饲喂结束后黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将实验组和空白组的黑鲷幼鱼饥饿20-30h后，用麻醉剂麻醉，取出脾脏组织，实验组和空白组各取数量相同的平行样，随后进行称重，并用液氮快速冷冻，最后放置于-80℃的超低温冰箱中保存，备用。
步骤4)中所述脾脏组织样品制备方法为：取备用脾脏组织于离心管，加入-10～-30℃冷冻的5-15倍体积的甲醇，10000-14000rpm下均质0.5-1.5min后，在4℃下超声2-5min，随后，在4℃、12000-14000rpm下离心10-20min，取上清液在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶；质控样品制备方法为：取上述各个脾脏组织样品制备中的上清液混合均匀，在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶。
步骤4)中使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理的具体方法为：将脾脏组织样品经微孔滤膜过滤之后，在固定的色谱条件和质谱条件下，进入超高效液相色谱-质谱联用仪分析，其中，在液相色谱中C18和HILLIC两种色谱柱结合使用，并且，在检测过程中，每隔相同数量的脾脏组织样品插入一个质控样品进行检测分析，以监控检测稳定性。
步骤5)中黑鲷脾脏代谢组学数据进行分析处理的具体方法为：利用XCMSplus对采集的黑鲷脾脏代谢组学数据进行全面的非靶向代谢组学分析，采用Centwave特征检测算法(峰值宽度从5到20s，质量允差为5ppm)进行峰的发现和匹配，找到有差异的生物标志物，XCMS Plus软件会自动链接到METLIN数据谱库(超过24万个代谢物信息，其中12127个代谢物有高分辨二级图谱)，并结合内源性代谢物二级谱库(包含550多个常见的内源性代谢化合物，包括分子式、分子量、CAS编号、化学名、结构图)，根据与谱库中化合物的精确一级m/z、同位素丰度比一级和二级质谱信息，鉴定得出有差异的生物标志物，并把这些生物标志物通过聚类分析，找出代谢通路。
在步骤4)中，由于脾脏是黑鲷非特异性免疫和特异性免疫的重要器官，内含丰富的各类免疫因子，脾脏样品前处理过程采取低温萃取技术，保持了脾脏中各物质含量相对稳定；其次采用高速快速均质方法，目的是将脾脏样品和冷冻甲醇提取液快速充分混合，加快了甲醇提取脾脏中潜在标志物的速度；再次，采用低温超声技术，目的是加快脾脏中潜在标志物溶入到甲醇提取液中，在有效时间内实现潜在标志物提取的最大化；采用提取液氮吹后，残渣复溶后再检测的步骤，目的是将提取液中微量的潜在标志物经过浓缩后再经超高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪检测，增大了该类潜在标志物的检测灵敏度，客观反映了脾脏中潜在标志物；整个脾脏组织样品制备提取过程高效，即降低了人为操作带来的误差，又实现了最大限度地提取脾脏中的潜在标志物，保障了质谱数据采集和分析的准确性和精确性。
作为优选，关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的脾脏代谢组学生物标志物共有36个，分别为：鸟氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、二甲基甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甜菜碱、肌酸、L-脯氨酸、甘油酸、4-胍基丁酸、腺嘌呤、尿嘧啶、L-蛋氨酸、尿苷、L-酪氨酸、肌苷、鸟苷、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、脱氧鸟苷、胸腺嘧啶、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、琥珀酸、腺苷、脱氧胞苷、L-苏氨酸、L-丝氨酸、腺苷一磷酸、γ-氨基丁酸、脱氧腺苷一磷酸、尿苷5'-一磷酸、D-核糖5-磷酸、鸟苷一磷酸、精氨基琥珀酸。
作为优选，生物标志物主要指向9条代谢通路，分别为：氨酰基-tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、氮代谢、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、嘌呤代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、嘧啶代谢。
作为优选，所述C18色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：40℃，流动相A为2mmol/L甲酸铵和0.05％甲酸水溶液，流动相B为乙腈和间苯二甲酸混合液，且乙腈和间苯二甲酸的体积比为1:1，进样量：2μL，流动相梯度洗脱如下表所示。
Figure BDA0002087145410000041
HILLIC色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：45℃，流动相C为10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸水溶液，流动相D为乙腈水溶液，其中乙腈和水体积比为95:5，且水中含有10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸，进样量：1μL，流动相梯度洗脱如下表所示。
Figure BDA0002087145410000042
作为优选，所述质谱条件为：采用电喷雾离子化(ESI)源正、负离子扫描模式，喷雾电压(IS)：正离子5500V，负离子-4500V；离子化温度(TEM)：550℃；雾化气(GS1)：60psi；辅助加热气(GS2)：60psi；气帘气(CUR)：35psi。一级质谱采集范围为m/z 100～1250，累积时间0.10s；DP：80V。采用IDA模式采集二级质谱，采集范围为m/z 50～1250，累积时间0.05000s，DP：80V；CE:40±20eV。IDA转换标准为：信号强度＞100cps，分子量误差50mDa，在4Da内排除同位素。
在处理脾脏这种复杂基质时，使用不同的色谱技术是实现检测特征最大化的关键问题。用于代谢组学实验的液相条件，包括所采用的溶剂和洗脱梯度并不是为了加强或针对任何特定代谢物的分离，而应该具有广适性。本发明采用了两种不同的流动相，并结合两种不同的色谱柱对脾脏组织样品进行了分析，其中C18色谱柱中，流动相A为2mmol/L甲酸铵和0.05％甲酸水溶液，流动相B为乙腈和间苯二甲酸混合液，且乙腈和间苯二甲酸的体积比为1:1，该流动相主要是针对一些极性比较小的化合物，可以使其在C18色谱柱上洗脱下来，同时保证其色谱峰型，因此更好地分离了极性小的小分子代谢物；HILIC色谱柱中，流动相C为10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸水溶液，流动相D中乙腈水溶液，其中乙腈和水体积比为95:5，且水中含有10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸，其主要是针对一些在C18体系中保留较差的极性比较大的化合物，因此对极性大的小分子代谢物分离效果最好，结合飞行时间质谱技术，分别在正、负离子模式下对脾脏样本进行分离和数据采集，实现尽可能多地检测到小分子代谢物，提高代谢组学分析的准确性和正确性。
但飞行时间(TOF)质谱仪对温度波动很敏感，需要定期校准保障代谢组学实验数据的准确性。代谢物是根据测量的质量数来确定，因此，准确的质量测量对于代谢组学实验的成功至关重要。本发明使用了TripleTOFTM 5600+系统采用外部校准方法，测量的质量误差控制在5ppm以内，确保了采集数据过程中获得的数据准确有效。在IDA模式下，在触发TOFMS/MS时，需要监控TOF MS/MS的最大数，这会影响数据采集的信息量。虽然希望通过最大限度地增加TOF MS/MS事件数来提高子离子的采集量，但也要确保色谱峰有足够的采集数据点数。本发明采用的IDA方法为：扫描时间0.15秒和10个MS/MS事件，每个事件的子离子累积时间为0.05秒，循环时间为0.7秒，可以实现每个色谱峰都具有10-12个采集数据点，为质谱的统计评价和同时进行代谢物鉴定提供了高质量的TOF MS和TOF MS/MS数据。
作为优选，步骤1)中所述用于动物实验的黑鲷幼鱼体质健康、大小均匀，且初始体重为12.8～13.2g。
作为优选，所述硒化氨基多糖的硒含量为27.3mg/g。
作为优选，所述麻醉剂为MS-222，浓度为60mg/L。
作为优选，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为4:1。
因此，本发明具有如下有益效果：本发明采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术对饲喂硒化氨基多糖的黑鲷脾脏进行了代谢组学研究，采用C18和HILLIC两种色谱柱结合XCMSplus软件进行分析，共筛选出36个有差异的生物标志物，利用生物标志物含量的回调变化来实现对免疫作用机制的识别和高通量分析，随后使用MetaboAnalyst3.0对有差异的生物标志物进行代谢通路分析，从整体水平综合评价了硒化氨基多糖免疫增强作用，因此基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建为深入探讨硒化氨基多糖的免疫增强机制奠定了一定的实验基础，且相比于其他硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制模型构建方法或评价方法，本发明系统性好，准确性高，成本低，操作简单。
附图说明
图1是本发明质控样品在不同离子扫描模式下样品总离子流色谱图(a)为C18色谱柱、正离子扫描模式，b)为C18色谱柱、负离子扫描模式，c)为HILIC色谱柱、正离子扫描模式，d)为HILIC色谱柱、负离子扫描模式)。
图2是本发明实验组和空白组样品在不同离子扫描模式下样品总离子流色谱图(a)为C18色谱柱、正离子扫描模式，b)为C18色谱柱、负离子扫描模式，c)为HILIC色谱柱、正离子扫描模式，d)为HILIC色谱柱、负离子扫描模式)。
图3是本发明不同离子扫描模式下脾脏代谢轮廓分析的PCA图(a)为C18色谱柱、负离子扫描模式，b)为C18色谱柱、正离子扫描模式，c)为HILIC色谱柱、负离子扫描模式，d)为HILIC色谱柱、正离子扫描模式，黑色为实验组，灰色为空白组)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1：一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：
1)将黑鲷幼鱼停饲1天，随后，选取体质健康、大小均匀、初始体重为12.8～13.2g的黑鲷幼鱼随机分实验组和空白组，其中，空白组饲喂普通饲料，实验组在普通饲料中，添加0.6mgSe/kg硒化氨基多糖，饲喂8周，结束后，将黑鲷幼鱼饥饿24h，并用60mg/L的MS-222将其麻醉，取出脾脏组织，其中实验组和空白组各挑选10个平行样，称重后用液氮快速冷冻，然后放于-80℃的超低温冰箱中保存，备用；
2)取上述备用的20个脾脏组织于离心管，加入-2℃冷冻的10倍体积的甲醇，12000rpm下均质1min后，在4℃下超声3min，随后，在4℃、13000rpm下离心15min，取上清液在40℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为4:1)复溶制备得到脾脏组织样品；取上述各个脾脏组织样品制备中的上清液混合均匀，在40℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶，制备得到质控样品；
3)将脾脏组织样品和质控样品经微孔滤膜过滤之后，进入超高效液相色谱-质谱联用仪分析，在检测时，先进2个质控样品，随后陆续进20个脾脏组织样品，且每5个脾脏组织样品之间插入一个质控样品，在脾脏组织样品进完之后，再进2个质控样品。其中液相色谱中C18和HILLIC两种色谱柱结合使用，C18色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：40℃，流动相A为2mmol/L甲酸铵和0.05％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相梯度洗脱如下表所示：
Figure BDA0002087145410000071
HILLIC色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：45℃，流动相C为10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸水溶液，流动相D为乙腈水溶液，其中乙腈和水体积比为95:5，且水中含有10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸，进样量：1μL，流动相梯度洗脱如下表所示：
Figure BDA0002087145410000072
质谱条件为：采用电喷雾离子化(ESI)源正、负离子扫描模式，喷雾电压(IS)：正离子5500V，负离子-4500V；离子化温度(TEM)：550℃；雾化气(GS1)：60psi；辅助加热气(GS2)：60psi；气帘气(CUR)：35psi。一级质谱采集范围为m/z 100～1250，累积时间0.10s；DP：80V。采用IDA模式采集二级质谱，采集范围为m/z 50～1250，累积时间0.05000s，DP：80V；CE:40±20eV。IDA转换标准为：信号强度＞100cps，分子量误差50mDa，在4Da内排除同位素；
4)对超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术所收集得到的黑鲷脾脏代谢组学数据进行分析处理，利用XCMSplus对采集的黑鲷脾脏代谢组学数据进行全面的非靶向代谢组学分析，采用Centwave特征检测算法(峰值宽度从5到20s，质量允差为5ppm)进行峰的发现和匹配，找到有差异的生物标志物，XCMS Plus软件会自动链接到METLIN数据谱库(超过24万个代谢物信息，其中12127个代谢物有高分辨二级图谱)，并结合内源性代谢物二级谱库(包含550多个常见的内源性代谢化合物，包括分子式、分子量、CAS编号、化学名、结构图)，根据与谱库中化合物的精确一级m/z、同位素丰度比一级和二级质谱信息，鉴定得出有差异的生物标志物，并把这些生物标志物通过聚类分析，找出代谢通路。
实施例2：与实施例1的区别在于，步骤1)中，实验组在普通饲料中添加0.5mg Se/kg硒化氨基多糖，饲喂10周；步骤2)为取上述备用的20个脾脏组织于离心管，加入-10℃冷冻的15倍体积的甲醇，10000rpm下均质0.5min后，在4℃下超声2min，随后，在4℃、12000rpm下离心20min，取上清液在30℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为4:1)复溶制备得到脾脏组织样品；取上述各个脾脏组织样品制备中的上清液混合均匀，在50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶，制备得到质控样品。
实施例3：与实施例1的区别在于，步骤1)中，实验组在普通饲料中添加0.7mg Se/kg硒化氨基多糖，饲喂9周；步骤2)为取上述备用的20个脾脏组织于离心管，加入-30℃冷冻的5倍体积的甲醇，14000rpm下均质0.5min后，在4℃下超声5min，随后，在4℃、14000rpm下离心10min，取上清液在50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为4:1)复溶制备得到脾脏组织样品；取上述各个脾脏组织样品制备中的上清液混合均匀，在30℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶，制备得到质控样品。
在对分析数据进行预处理前，首先对所获得的分析数据质量和有效性进行验证。质控样品在不同离子扫描模式下样品总离子流色谱图如图1所示，数据有效性验证结果表明，质控样品中分布于不同保留时间的代表性离子色谱峰强度的RSD<5％，tR的漂移<0.1min，m/z波动范围不超过5ppm，系统稳定性好。
将空白组和实验组样品总离子流色谱图如图2所示，由图可知，空白组和实验组的样品的小分子代谢物存在一定的差异。
将实验组和空白组的黑鲷脾脏在正负离子扫描模式下的代谢组学数据由XCMSplusSW软件分析质谱采集数据，给出的黑鲷脾脏代谢物主成分轮廓分析结果如图3所示，从图中可以看出实验组与空白组相比，HILIC柱和C18柱正负离子模式下两组均可明显区分，没有交叉和重叠现象，表明饲喂硒化氨基多糖后，黑鲷脾脏代谢产物指纹图谱均发生了显著的变化。
潜在生物标志物的鉴定方法为通过一级质谱信息确定相对分子量，利用二级质谱信息获得其结构碎片信息。将本实验C18质谱柱和HILIC质谱柱在正、负离子模式下的质谱检测结果通过检索Metabolite HR MS2library数据库(SCIEX)，共准确鉴定出36个有差异的生物标志物，与空白组相比，实验组代谢生物标志物水平升高的有27种，降低的有9种，说明硒化氨基多糖对黑鲷脾脏代谢水平具有显著的调节作用。具体结果如下表1。
表1：非靶向代谢组学分析的差异生物标志物。
Figure BDA0002087145410000091
Figure BDA0002087145410000101
根据准确鉴定出的潜在生物标志物，利用MetaboAnalyst3.0网站，选用鱼为分析模型，进行相关的代谢通路分析；经过软件分析，有显著性差异的36种潜在生物标志物主要指向了9条代谢通路(P<0.05)，主要涵盖了氨酰-tRNA合成、氨基酸代谢、核苷酸代谢、氮代谢等，具体见表2。
表2：代谢通路分析结果。
Figure BDA0002087145410000102
氨基酸是构成机体免疫系统的基本结构物质，氨基酸与免疫系统的形成、器官发育以及功能的发挥有着密切的关系。经代谢通路分析，结果发现实验组与空白组相比，在氨基酸合成或代谢、氨酰tRNA生物合成、嘌呤代谢、氮代谢上存在比较显著的差异(P<0.05)，潜在生物标志物(表1)结果表明，共有27个生物标志物在给予硒化氨基多糖后浓度水平显著上调。代谢通路(表2)结果表明有13个氨基酸代谢产物参与到黑鲷脾脏的氨酰-tRNA生物合成通路，每种tRNA分子都需要与相应的氨基酸结合，将氨基酸运送到核糖体进行蛋白质合成，如果氨酰-tRNA合成通路发生障碍，蛋白质的合成必然受到影响，降低脾脏的免疫代谢能力。有3个生物标志物参与了缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，亮氨酸和异亮氨酸属于支链氨基酸，具有促进蛋白质合成、抑制蛋白质分解的多种生理功能，其合成所需的碳骨架来源于糖无氧代谢和有氧代谢的中间产物，上调可能是通过参与机体能量代谢来促进乳酸－葡萄糖的循环和通过促进糖异生来维持糖原水平、缓解肌肉酸痛并延缓疲劳的发生发展，结果显示黑鲷脾脏的免疫功能与氨基酸代谢有密切关系。
在精氨酸和脯氨酸代谢通路中，与空白组相比，实验组中精氨酸的含量呈下降趋势。精氨酸是鱼类的必须氨基酸之一，促进免疫系统分泌自然杀手细胞、吞噬细胞、白血球内烯素等内生性物质，通过作用于mTOR复合体Ⅰ参与对抗癌细胞及预防病毒感染，提高机体免疫力。精氨酸代谢在调节先天免疫和适应性免疫中同样具有重要作用。精氨酸及其代谢产物一氧化氮(NO)、鸟氨酸和瓜氨酸可以通过生长激素等内分泌激素起到增强细胞吞噬和杀菌、促进免疫球蛋白的合成等免疫调节作用。在机体中精氨酸主要通过2个代谢途径参与免疫调控，第一个代谢途径是精氨酸酶途径，即精氨酸转化成鸟氨酸并进一步生成多胺，鸟氨酸和多胺在动物的免疫调节中发挥着重要的作用；另一条途径为精氨酸代谢成NO的途径，NO不仅对巨噬细胞发挥吞噬效应有重要作用，还对巨噬细胞和淋巴细胞的连接和激活有影响，有助于提高免疫细胞的呼吸爆发活性、吞噬作用和溶菌酶的活力，本实验中精氨酸含量的降低可能是由于硒化氨基多糖调节精氨酸酶解为鸟氨酸和更多代谢为NO，从而增强机体的免疫调节作用。谷氨酰胺可以促进巨噬细胞和淋巴细胞的有丝分裂和分化增值，增加机体的免疫功能。本实验中添加实验组和空白组中黑鲷脾脏多种代谢生物标志物的含量存在显著的差别，表明饲喂硒化氨基多糖在氨基酸影响免疫调节上具有一定的增强作用。

Claims (8)

1.一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将用于动物实验的黑鲷幼鱼随机均分为实验组和空白组；
2)采用相同的饲料饲喂实验组和空白组，并在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；
3)饲喂结束后将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，并用麻醉剂麻醉后，取出脾脏组织，保存备用；
4)制备脾脏组织样品和质控样品，随后使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理，其中，在液相色谱中C18和HILIC两种色谱柱结合使用，进样时质控样品穿插于脾脏组织样品之间；
C18色谱柱色谱条件为：流动相A为2mmol/L甲酸铵和0.05％甲酸水溶液，流动相B为乙腈和间苯二甲酸混合液，且乙腈和间苯二甲酸的体积比为1:1，流动相梯度洗脱如下表所示：
Figure FDA0003233448770000011
HILIC色谱柱色谱条件为：流动相C为10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸水溶液，流动相D为乙腈水溶液，其中乙腈和水体积比为95:5，且水中含有10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸，流动相梯度洗脱如下表所示：
Figure FDA0003233448770000021
5)对超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术所收集得到的黑鲷脾脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的脾脏代谢组学生物标志物，并对脾脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析；
所述生物标志物共有36个，分别为：鸟氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、二甲基甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甜菜碱、肌酸、L-脯氨酸、甘油酸、4-胍基丁酸、腺嘌呤、尿嘧啶、L-蛋氨酸、尿苷、L-酪氨酸、肌苷、鸟苷、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、脱氧鸟苷、胸腺嘧啶、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、琥珀酸、腺苷、脱氧胞苷、L-苏氨酸、L-丝氨酸、腺苷一磷酸、γ-氨基丁酸、脱氧腺苷一磷酸、尿苷5'-一磷酸、D-核糖5-磷酸、鸟苷一磷酸、精氨基琥珀酸；
生物标志物主要指向9条代谢通路，分别为：氨酰基-tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、氮代谢、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、嘌呤代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、嘧啶代谢。
2.根据权利要求1所述的一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将黑鲷幼鱼进行停饲处理，随后放入玻璃纤维缸内微流水式饲养；
步骤2)中实验组和空白组饲喂具体方法为：将实验组和空白组采用普通饲料进行饲喂，并在实验组普通饲料中添加0.5～0.7mg Se/kg的硒化氨基多糖，连续饲喂8-10周；
步骤3)中饲喂结束后黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将实验组和空白组的黑鲷幼鱼饥饿20-30h后，用麻醉剂麻醉，取出脾脏组织，实验组和空白组各取数量相同的平行样，随后进行称重，并用液氮快速冷冻，最后放置于-80℃的超低温冰箱中保存，备用；
步骤4)中所述脾脏组织样品制备方法为：取备用脾脏组织于离心管，加入-10～-30℃冷冻的5-15倍体积的甲醇，10000-14000rpm下均质0.5-1.5min后，在4℃下超声2-5min，随后，在4℃、12000-14000rpm下离心10-20min，取上清液在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶；质控样品制备方法为：取上述各个脾脏组织样品制备中的上清液混合均匀，在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶；
步骤4)中使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理的具体方法为：将脾脏组织样品经微孔滤膜过滤之后，在固定的色谱条件和质谱条件下，进入超高效液相色谱-质谱联用仪分析，其中，在检测过程中，每隔相同数量的脾脏组织样品插入一个质控样品进行检测分析，以监控检测稳定性；
步骤5)中黑鲷脾脏代谢组学数据进行分析处理的具体方法为：利用XCMSplus对采集的黑鲷脾脏代谢组学数据进行全面的非靶向代谢组学分析，采用Centwave特征检测算法进行峰的发现和匹配，找到有差异的生物标志物，XCMS Plus软件会自动链接到METLIN数据谱库，并结合内源性代谢物二级谱库，根据与谱库中化合物的精确一级m/z、同位素丰度比一级和二级质谱信息，鉴定得出有差异的生物标志物，并把这些生物标志物通过聚类分析，找出代谢通路。
3.根据权利要求2所述的一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，C18色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：40℃，进样量：2μL；HILIC色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：45℃，进样量：1μL。
4.根据权利要求2所述的一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述质谱条件为：采用电喷雾离子化源正、负离子扫描模式，喷雾电压：正离子5500V，负离子-4500V；离子化温度：550℃；雾化气：60psi；辅助加热气：60psi；气帘气：35psi；一级质谱采集范围为m/z 100～1250，累积时间0.10s；DP：80V；采用IDA模式采集二级质谱，采集范围为m/z 50～1250，累积时间0.05000s，DP：80V；CE:40±20eV；IDA转换标准为：信号强度＞100cps，分子量误差50mDa，在4Da内排除同位素。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述用于动物实验的黑鲷幼鱼体质健康、大小均匀，且初始体重为12.8～13.2g。
6.根据权利要求1或2所述的一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述硒化氨基多糖的硒含量为27.3mg/g。
7.根据权利要求1或2所述的一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述麻醉剂为MS-222，浓度为60mg/L。
8.根据权利要求2所述的一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为4:1。
CN201910491370.2A 2019-06-06 2019-06-06 一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法 Active CN110346464B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910491370.2A CN110346464B (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910491370.2A CN110346464B (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110346464A CN110346464A (zh) 2019-10-18
CN110346464B true CN110346464B (zh) 2021-12-28

Family

ID=68181670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910491370.2A Active CN110346464B (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110346464B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107247095B (zh) * 2017-05-25 2019-08-20 武汉大学 一种基于代谢组学分析的用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建方法
CN107167617B (zh) * 2017-05-26 2018-09-25 山东师范大学 鉴定ic50剂量维生素c对raw264.7和k562细胞差异标志物的方法
CN108042561B (zh) * 2017-12-12 2020-02-04 浙江海洋大学 一种硒化低聚氨基多糖对免疫抑制缺陷小鼠影响模型的建立方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110346464A (zh) 2019-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110346466B (zh) 一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法
Cao et al. Large-scale targeted metabolomics method for metabolite profiling of human samples
Dong et al. Simultaneous quantification of free amino acids and 5′-nucleotides in shiitake mushrooms by stable isotope labeling-LC-MS/MS analysis
Zhou et al. Hydrophilic interaction ultra-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupole tandem mass spectrometry for highly rapid and sensitive analysis of underivatized amino acids in functional foods
Yanshole et al. Metabolomics of the rat lens: A combined LC-MS and NMR study
Li et al. Comparative analysis of nucleosides and nucleobases from different sections of Elaphuri Davidiani Cornu and Cervi Cornu by UHPLC–MS/MS
CN113480599A (zh) 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用
Dong et al. Postmortem nucleotide degradation in turbot mince during chill and partial freezing storage
Liu et al. Characterisation of nucleosides and nucleobases in Mactra veneriformis by high performance liquid chromatography coupled with diode array detector-mass spectrometry (HPLC–DAD–MS)
Chang et al. Determination of ractopamine and salbutamol in pig hair by liquid chromatography tandem mass spectrometry
Qie et al. Direct analysis in real time high-resolution mass spectrometry for authenticity assessment of lamb
Jia et al. Endogenous hydrocortisone caused metabolic perturbation and nutritional deterioration of animal-derived food in a dose-dependent manner
Wang et al. Metabolomics analysis of muscle from piglets fed low protein diets supplemented with branched chain amino acids using HPLC‐high‐resolution MS
Sun et al. Modified EMR-lipid method combined with HPLC-MS/MS to determine folates in egg yolks from laying hens supplemented with different amounts of folic acid
CN112305104A (zh) 一种禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法
Li et al. Comparing the profiles of raw and cooked donkey meat by metabonomics and lipidomics assessment
Wen et al. Sex-dependent changes in the skin mucus metabolome of discus fish (Symphysodon haraldi) during biparental care
Chen et al. Exploring the biomarkers and therapeutic mechanism of kidney-yang deficiency syndrome treated by You-gui pill using systems pharmacology and serum metabonomics
Zhang et al. Molecular insights into quality and authentication of sheep meat from proteomics and metabolomics
Zhang et al. UHPLC‐QTOF/MS‐based comparative metabolomics in pectoralis major of fast‐and slow‐growing chickens at market ages
CN110346464B (zh) 一种基于脾脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法
Zhao et al. Metabolic alterations in dairy cows with subclinical ketosis after treatment with carboxymethyl chitosan‐loaded, reduced glutathione nanoparticles
Sripadi et al. In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry
Chai et al. Contents variation analysis of free amino acids, nucleosides and nucleobases in semen sojae praeparatum fermentation using UFLC‐QTRAP MS
Li et al. Determination of 35 free amino acids in tea using ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 316000 No. 222, Changguo Road, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province

Patentee after: Zhoushan customs comprehensive technical service center

Address before: 316000 No. 222, Changguo Road, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province

Patentee before: COMPREHENSIVE TECHNOLOGY SERVICE CENTER OF ZHOUSHAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU