CN110327330A

CN110327330A - 艾曲波帕在制备抗癌血管生成药物及抗癌药物组合物中的应用

Info

Publication number: CN110327330A
Application number: CN201910731220.4A
Authority: CN
Inventors: 张建革; 朱玉莹; 林国强
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2019-10-15

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及艾曲波帕在制备抗癌血管生成药物及抗癌药物组合物中的应用，艾曲波帕靶向结合HuR蛋白，阻断HuR蛋白与血管生成相关因子mRNA的结合，具有抑制血管生成相关因子的表达与分泌活性，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管活性，及抑制癌血管生成、癌细胞生长活性，同时艾曲波帕又具有促血小板生成活性，这与抑制癌细胞生长活性相辅相成，利于抗癌治疗。艾曲波帕可用于制备抗癌血管生成药物及抗癌药物组合物。艾曲波帕新的医药用途，作为抗癌血管生成药物，具有重要的应用价值和意义。

Description

艾曲波帕在制备抗癌血管生成药物及抗癌药物组合物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及艾曲波帕在制备抗癌血管生成药物及抗癌药物组合物中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，统计资料显示，与女性其他恶性肿瘤发病率相比，乳腺癌的发病率高达10％，仅次于子宫癌。目前对乳腺癌的治疗主要采用手术切除，结合放疗、化疗及激素治疗，但手术治疗破坏形体，而化疗、放疗等治疗方案对病人的生理和心理影响巨大，同时复发率高，治疗成本昂贵。因此寻找新型治疗乳腺癌的方案仍然迫在眉睫。

研究表明，肿瘤的生长依赖于血管的生长，抑制肿瘤血管生成可抑制肿瘤的生长。介导肿瘤血管生成的主要细胞类型为癌细胞及癌组织中浸润的巨噬细胞。癌细胞和巨噬细胞通过分泌血管生成相关因子(VEGF、MMP9等)，促进血管内皮细胞的生长，进而促进肿瘤的血管生成。

近年的研究成果表明，在多种恶性肿瘤中，包括乳腺癌，HuR蛋白普遍上调表达，可作为临床肿瘤筛查的标记物及抗肿瘤药物开发的靶点。HuR蛋白作为一种mRNA结合蛋白，可通过结合含有ARE序列的mRNA末端而增强mRNA的稳定性，肿瘤血管生成相关因子VEGF和MMP9等基因的mRNA均含有HuR的结合位点，能够与之结合，mRNA稳定性增强，表达增强。HuR在肿瘤组织中通过癌细胞及巨噬细胞介导的促血管生成作用，促使我们建立了基于HuR-RNA结合的高通量筛选体系，进行肿瘤血管生成抑制剂的筛选。本发明中涉及的化合物艾曲波帕是从建立的HuR-RNA高通量筛选体系中筛选到的抑制剂。

艾曲波帕作为一种血小板生成素受体(TpoR)激动剂，已被批准应用于慢性免疫(特发性)血小板减少性紫癜(ITP)患者血小板减少症的治疗，及慢性丙型肝炎(CHC)患者血小板减少症的治疗。文献资料显示，艾曲波帕还可以作为三价铁离子螯合剂抑制白血病细胞系的增殖。同时也有文献报道，艾曲波帕对多种癌症细胞系(包括乳腺癌细胞系、肺癌细胞系、口腔癌细胞系等)的增殖具有一定的抑制作用，但未见临床应用或动物实验报道，其具体作用机理也尚不明确。

根据检索，现有研究中存在关于艾曲波帕缓解肿瘤患者化疗引起的血小板减少症状的报道，但未见艾曲波帕直接应用的肿瘤治疗的报道，更未见艾曲波帕在抑制乳腺癌血管生成方面的报道。

发明内容

本发明旨在提供艾曲波帕在制备抗癌血管生成药物中的应用。

本发明还提供艾曲波帕在制备抗癌药物组合物中的应用。

本发明研究表明，艾曲波帕通过靶向作用于乳腺癌细胞和巨噬细胞，抑制血管生成相关因子(VEGF-A与MMP9)的表达及抑制血管内皮细胞(HUVEC)的增殖、迁移和成管作用，显著抑制癌血管生成，阻碍癌细胞生长。艾曲波帕通过抑制癌血管生成阻碍癌细胞生长的同时，还可促血小板生成，两者相辅相成，有助于抗癌治疗。

艾曲波帕靶向作用于乳腺癌细胞，通过缩短血管生成相关因子mRNA的半衰期降低血管生成相关因子mRNA水平，及阻断HuR蛋白与血管生成相关因子mRNA的结合，抑制乳腺癌细胞内血管生成相关因子的表达。

艾曲波帕靶向作用于巨噬细胞，通过缩短血管生成相关因子mRNA的半衰期降低血管生成相关因子mRNA水平，及阻断HuR蛋白与血管生成相关因子mRNA的结合，抑制巨噬细胞内血管生成相关因子的表达及分泌，并进一步抑制血管内皮细胞(HUVEC)的增殖、迁移和成管作用。

艾曲波帕通过抑制血管生成相关因子的表达与分泌，及抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管作用，抑制癌血管生成，抑制癌细胞(乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞及口腔癌细胞等)生长，通过抑制血管生成抑制乳腺癌细胞生长的效果尤其显著，并辅以艾曲波帕的促血小板生成功能，更利于癌细胞生长与转移的治疗。

艾曲波帕可用于制备抗癌血管生成药物。艾曲波帕具有抑制血管生成相关因子的表达与分泌活性、和/或抑制血管内皮细胞增殖、迁移与成管活性、和/或促血小板生成，抑制癌血管的生成。

艾曲波帕通过降低血管生成相关因子mRNA水平、和/或阻断HuR蛋白与血管生成相关因子mRNA的结合，抑制血管生成相关因子的表达与分泌。

艾曲波帕通过缩短血管生成相关因子mRNA的半衰期，降低血管生成相关因子mRNA水平。

艾曲波帕通过靶向结合HuR蛋白，阻断HuR蛋白与血管生成相关因子mRNA的结合。

艾曲波帕通过抑制血管生成相关因子的表达与分泌，抑制抑制血管内皮细胞增殖、迁移与成管。

所述血管生成相关因子包括血管内皮生长因子(VEGF)和/或MMP9蛋白，血管内皮生长因子尤指血管内皮生长因子A(VEGF-A)。

所述血管生成相关因子包括癌细胞和/或巨噬细胞内的血管生成相关因子，所述癌细胞包括乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞及口腔癌细胞等，尤指乳腺癌细胞。

一种抗癌血管生成的药物，含有活性成分艾曲波帕。其中艾曲波帕的重量百分比为0.01％～99.99％。艾曲波帕通过抑制癌血管生成，抑制癌细胞生长，并辅以促血小板生成活性，用于治疗癌细胞的生长与转移。

该抗癌血管生成的药物可制备成具有预防和/或治疗作用的药学上可接受的任意剂型，包括固体制剂、液体制剂、半固体制剂或者气体制剂。固体制剂包括但不限于丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉剂等；液体制剂包括但不限于口服液、注射液、混悬液、冲剂等；半固体制剂包括但不限于贴膏剂、糊剂等，气体制剂包括但不限于气雾剂、喷雾等。

该抗癌血管生成的药物还含有药学上可接受的载体和/或辅助活性成分，所述辅助活性成分包括辅助抑制血管生成活性成分、和/或辅助促血小板生成活性成分等。所述药学上可接受的载体由崩解剂、增溶剂、增塑剂、溶剂、缓冲剂、填充剂、分散剂、助溶剂、稳定剂、赋形剂、释放阻滞剂等辅料中的一种或多种混合而成。

艾曲波帕还可用于制备抗癌药物组合物，艾曲波帕具有显著的血管生成抑制活性，并辅以血小板生成活性，显著阻碍癌细胞生长与扩散。

艾曲波帕通过抑制血管生成相关因子的表达与分泌、和/或抑制血管内皮细胞增殖、迁移与成管、和/或促血小板生成，显著抑制血管生成。

一种抗癌的药物组合物，含有艾曲波帕及至少一种抗肿瘤药物活性成分。

所述抗肿瘤药物为化疗药物，包括但不限于吉西他滨、卡培他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、多柔比星、表柔比星或吡柔比星等。

该药物组合物可制备成具有预防和/或治疗作用的药学上可接受的任意剂型，包括固体制剂、液体制剂、半固体制剂或者气体制剂。固体制剂包括但不限于丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉剂等；液体制剂包括但不限于口服液、注射液、混悬液、冲剂等；半固体制剂包括但不限于贴膏剂、糊剂等，气体制剂包括但不限于气雾剂、喷雾等。

该药物组合物还含有药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体由崩解剂、增溶剂、增塑剂、溶剂、缓冲剂、填充剂、分散剂、助溶剂、稳定剂、赋形剂、释放阻滞剂等辅料中的一种或多种混合而成。

相对于现有技术，本发明的优点在于：

本发明在对基于HuR-RNA相互作用的抗癌药物的筛选过程中，发现了艾曲波帕能够通过抑制HuR蛋白的稳定mRNA功能而抑制肿瘤细胞的增殖。

本发明通过细胞增殖活性分析，发现艾曲波帕可以抑制多种肿瘤细胞系的增殖，具有广谱抗肿瘤效应，这些肿瘤细胞系包括乳腺癌细胞系4T-1，肺癌细胞系LLC，肺癌细胞系A549和H1299，肝癌细胞系SMMC-7721，并确定了其在这些肿瘤细胞系中的IC₅₀值。在这些肿瘤细胞中，艾曲波帕对乳腺癌细胞系4T-1的敏感性最强。

在随后的研究中验证了艾曲波帕在4T-1细胞中，通过靶向HuR蛋白，降低细胞中血管生成相关基因VEGF-A和MMP9基因的mRNA稳定性，确认了艾曲波帕作用的新靶点。同时艾曲波帕还可以通过靶向巨噬细胞RAW264.7中的HuR蛋白，进一步降低VEGF-A和MMP9基因的mRNA水平，从而下调巨噬细胞分泌的VEGF和MMP9蛋白，最终抑制其下游内皮细胞HUVEC的血管生成相关功能。

在对小鼠移植瘤的研究中发现，艾曲波帕对乳腺癌细胞系4T-1的移植瘤也具有较好的抑制作用，能够显著抑制4T1细胞移植瘤的生长及血管生成。

本发明发现了艾曲波帕的新用途——作为抗癌血管生成药物，尤其是作为抗乳腺癌血管生成药物，以及其新作用机制——阻断HuR的mRNA结合功能，老药新用，具有重要的应用价值和意义。

附图说明

图1为实施例1艾曲波帕体外抑制HuR蛋白与VEGF-A mRNA序列结合的示意图。其中，A为阳性化合物DHTS-I的凝胶滞缓实验验证；B为荧光偏振反应中HuR蛋白浓度的优化；C为荧光偏振反应中DMSO的影响；D为荧光偏振筛选体系稳定性的评价；E为化合物初筛；F为筛选到的化合物艾曲波帕的化学结构；G为艾曲波帕体外抑制HuR-RNA互作的IC50；H为凝胶滞缓实验验证艾曲波帕的抑制活性。图中ELB代表艾曲波帕。

图2为实施例2艾曲波帕对不同肿瘤细胞系增殖的抑制作用。其中ELB代表艾曲波帕。

图3为实施例3艾曲波帕通过靶向HuR蛋白抑制4T1细胞中血管生成相关因子mRNA的稳定性。图中A为艾曲波帕对4T1细胞中VEGF-A和MMP9 mRNA水平的影响；B和C分别为艾曲波帕对VEGF-A和MMP9 mRNA稳定性的影响；D为免疫沉淀试验；E为构建的荧光素酶载体结构图；F为荧光素酶试验。图中ELB代表艾曲波帕。

图4为实施例4艾曲波帕在巨噬细胞RAW 264.7中靶向HuR并通过抑制血管生成相关因子的分泌进而抑制血管内皮细胞HUVEC细胞的功能。其中图A为艾曲波帕对巨噬细胞RAW264.7中VEGF-A和MMP9 mRNA水平的影响；B和C分别为艾曲波帕对RAW 264.7细胞中VEGF-A 和MMP9 mRNA稳定性的影响；D为RAW 264.7细胞中的免疫沉淀试验；E为艾曲波帕对巨噬细胞分泌的VEGF和MMP9蛋白量的影响；F为ELB处理的RAW 264.7细胞上清对HUVEC细胞增殖的影响；G为ELB处理的RAW 264.7细胞上清对HUVEC细胞迁移的影响；H为ELB处理的RAW264.7细胞上清对HUVEC细胞成管作用的影响。图中ELB代表艾曲波帕，s-ELB代表ELB处理的巨噬细胞的上清，s-Ctrl代表未用ELB处理的巨噬细胞的上清。

图5为实施例5艾曲波帕对乳腺癌细胞系4T-1的小鼠移植瘤生长以血管生成的抑制作用。其中图A和B为艾曲波帕对肿瘤生长的抑制作用；C为肿瘤组织中CD31的免疫荧光；D为肿瘤组织中VEGF蛋白的免疫荧光。图中ELB75代表75mg/kg体重的艾曲波帕剂量，ELB150代表150mg/kg体重的艾曲波帕剂量。

图6为实施例6艾曲波帕治疗小鼠4T1移植瘤时小鼠的血小板水平。其中Normal代表未种瘤的正常小鼠，Gem代表吉西他滨治疗的4T1荷瘤小鼠，ELB75和ELB150分别代表75mg/kg和150mg/kg剂量的艾曲波帕治疗的4T1荷瘤小鼠。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步示例性地详细说明本发明。需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

本发明所用细胞系4T1(CRL-2539^TM)、A549(CCL-185^TM)、NCI-H1299(CRL-5803^TM)、SMMC7721、LLC1(CRL-1642^TM)、RAW 264.7(TIB-71)和HUVEC(CRL-1730)均来自中国科学院上海细胞库。

下述方法中，未详尽描述的试剂、实验操作、方法等，若无特别说明，均为现有技术中的常规试剂、实验操作、方法等。

实施例1.艾曲波帕体外抑制HuR蛋白与mRNA的互作

采用荧光偏振技术，构建HuR蛋白与ARE^VEGF-A序列相互作用的高通量筛选模型进行初筛，对初筛获得的阳性化合物，采用凝胶滞缓实验方法进行验证。所筛选的化合物包含临床药物及其衍生物。

首先将全长HuR序列克隆至表达载体pET30a(+)中，将构建好的HuR表达载体转化到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，并用0.2mMIPTG于16℃进行诱导表达16-18h，收集菌体进行裂解，离心收集上清，并依次经过HisTrap FF预装柱和Sephacryl S-200分子筛纯化，获得纯化的HuR蛋白。由于HuR蛋白结合于VEGF-A mRNA的3’末端序列中的ARE结构，所以本实施例中截取VEGF-A mRNA的3’末端中的45 bp序列(5’-AAUUC UACAU ACUAA AUCUCUCUCC UUUUU UAAUU UUAAU AUUUG-3’)进行化学合成，并在其5’末端标记FAM荧光，获得5’FAM-ARE^VEGF-A用于荧光偏振实验和凝胶滞缓实验。

进一步构建荧光偏振筛选体系。采用凝胶滞缓实验验证纯化的HuR蛋白与5’FAM-ARE^VEGF-A的结合活性，选取文献中报道的HuR抑制剂DHTS-I作为阳性化合物，结果如图1A所示，HuR蛋白能够减缓5’FAM-ARE^VEGF-A在琼脂糖凝胶中的迁移速率，使其条带在电泳孔附近，而抑制剂DHTS-I的加入则能够完全抑制这种作用效果，说明我们纯化的HuR蛋白和合成的5’FAM-ARE^VEGF-A能够用于荧光偏振筛选体系的构建。应用HuR蛋白和5’FAM-ARE^VEGF-A进行高通量筛选体系的构建与评价，荧光偏振的检测波长为λ_ex＝470nm和λ_em＝518nm。图1B所示为不同HuR蛋白浓度对荧光偏振值的影响，在蛋白浓度500nM时mP值达到最大，因此选取这一浓度进行反应。图1C为检测的DMSO对反应体系的影响，结果表明体系中DMSO浓度低于2％时，对反应无明显影响，因此在进行化合物筛选时，据此控制溶解化合物的DMSO用量。图1D为检测了一系列的阳性对照与阴性对照反应，并据此计算筛选体系的Z’值，本体系中Z’＝0.83，在0.5-1之间，说明我们构建的筛选体系比较稳定，能够用于高通量筛选。

应用以上构建的荧光偏振筛选体系，对化合物进行初步筛选。筛选体系为50μL，其中包含20nM 5’FAM-ARE^VEGF-A，500nM HuR，20mM Tris(pH8.0)，80μM化合物，应用96孔板进行检测。筛选结果如图1E所示，其中艾曲波帕(如图1F结构式)抑制率较高，因此进行进一步的实验验证。

应用荧光偏振实验测定艾曲波帕抑制HuR和5’FAM-ARE^VEGF-A相互作用的IC₅₀，结果如图1G所示，IC₅₀＝2.2μM。进一步采用凝胶滞缓实验验证艾曲波帕的抑制活性，凝胶滞缓实验反应体系与荧光偏振反应体系相同，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为4℃，50V，50min，0.5×TBE缓冲液，验证结果如图1H所示，艾曲波帕打断了HuR和5’FAM-ARE^VEGF-A的结合。

实施例2.艾曲波帕抑制多种肿瘤细胞系的增殖。

为研究艾曲波帕对癌细胞生长的影响，本发明采用MTT方法检测了艾曲波帕对多个肿瘤细胞系的毒性作用，图2为艾曲波帕作用于各个细胞系48小时的IC₅₀值，结果表明艾曲波帕对所检测的肿瘤细胞系的生长均有一定的抑制作用，其中对小鼠乳腺癌细胞4T1的抑制作用最好。

实施例3.艾曲波帕通过靶向HuR蛋白抑制4T1细胞中血管生成相关基因的mRNA水平。

体外分子试验结果表明艾曲波帕能够抑制HuR蛋白与VEGF-A mRNA末端序列的结合，而文献研究表明HuR所结合的mRNA序列具有高度的相似性。因此本发明中不仅验证了艾曲波帕对4T1细胞中VEGF-A mRNA的影响，还探究了艾曲波帕对4T1细胞中另一血管生成因子MMP9 mRNA的影响，结果如图3所示。

首先，10μM艾曲波帕处理4T1细胞后，能够显著降低VEGF-A和MMP9基因的mRNA水平(图3A)。其次，mRNA稳定性实验表明，艾曲波帕能够显著降低4T1细胞内VEGF-A和MMP9基因mRNA的稳定性，与未经艾曲波帕处理的4T1细胞相比，艾曲波帕作用后，VEGF-A mRNA的半衰期由3.74小时下降为2.50小时(图3B)，MMP9 mRNA的半衰期由3.56小时下降为1.17小时(图3C)，均显著降低。为进一步验证艾曲波帕在细胞内通过HuR调节相关mRNA的作用机制，采用了免疫沉淀的方法，检测艾曲波帕在4T1细胞内对HuR结合mRNA的影响，结果表明艾曲波帕能够显著降低HuR蛋白结合的VEGF-A和MMP9 mRNA的量(图3D)。同时，我们将VEGF-A mRNA末端的ARE序列构建到萤火虫荧光素酶基因的末端(图3E)，将构建的质粒转染到4T1细胞中进行表达，用艾曲波帕处理细胞，结果表明艾曲波帕能够显著降低萤火虫荧光素酶的表达水平(图3F)。以上研究结果验证了艾曲波帕在4T1细胞内通过打断HuR与mRNA末端ARE的结合，从而影响相关基因的表达水平，进而抑制4T1细胞中血管生成相关因子的表达并促进细胞凋亡的分子作用机制。

实施例4.艾曲波帕通过靶向巨噬细胞RAW 264.7中HuR蛋白抑制血管生成相关蛋白分泌并抑制下游血管内皮细胞HUVEC功能。

在多种恶性肿瘤中，巨噬细胞都与肿瘤血管生成密切相关，且文献研究成果表明在巨噬细胞中，HuR参与调节的血管生成相关因子在肿瘤血管新生中起重要作用，因此本发明进一步验证化合物艾曲波帕对巨噬细胞血管生成相关因子的调节作用，结果见图4。

巨噬细胞是血管生成相关因子VEGF-A的主要来源，同时巨噬细胞产生的MMP9又能够促进VEGF从其细胞存储库中释放，且VEGF-A和MMP9的mRNA均是HuR蛋白的调控靶标，因此我们检测了艾曲波帕对巨噬细胞RAW264.7中这两个基因mRNA水平的影响，结果如图4A所示，10μM的艾曲波帕能够显著降低RAW264.7中VEGF-A mRNA和MMP9 mRNA水平。进一步通过mRNA半衰期试验和免疫沉淀试验，我们验证了艾曲波帕在巨噬细胞中，通过HuR调控VEGF-AmRNA和MMP9 mRNA水平的作用机制。图4B和C分别为VEGF-A mRNA和MMP9 mRNA的半衰期，正常RAW264.7细胞中VEGF-A和MMP9 mRNA的半衰期分别为1.72小时和2.90小时，而当10μM的艾曲波帕作用于细胞时，其mRNA半衰期分别下降至1.01小时和1.12小时，均显著下降，说明艾曲波帕是通过降低巨噬细胞内mRNA的半衰期而降低对应的mRNA水平。进一步我们采用免疫沉淀的方法，分析了艾曲波帕对RAW264.7细胞内HuR蛋白结合mRNA能力的影响，结果如图4D，10μM的艾曲波帕作用于细胞后，HuR所结合的VEGF-A mRNA和MMP9 mRNA均显著降低，由此验证了艾曲波帕在巨噬细胞内通过打断HuR和靶标mRNAs的结合，降低mRNAs稳定性，进而降低mRNAs水平的作用机制。

为进一步验证艾曲波帕通过巨噬细胞调节肿瘤血管生成的假设，本发明还进行了巨噬细胞上清对内皮细胞增殖、迁移及成管作用的试验，结果如图4所示。首先采用ELISA方法检测了10μM艾曲波帕处理巨噬细胞后，巨噬细胞分泌VEGF和MMP9蛋白含量的变化，如图4E所示，艾曲波帕作用巨噬细胞24小时后，巨噬细胞上清中的VEGF和MMP9蛋白明显降低。进一步检测了艾曲波帕处理的巨噬细胞上清作用于内皮细胞HUVEC后，对HUVEC增殖、迁移和成管作用的影响，结果表明用艾曲波帕处理过的巨噬细胞RAW264.7上清作用于HUVEC细胞时，与未用艾曲波帕处理的RAW264.7细胞上清相比，均能够显著抑制HUVEC细胞的增殖、迁移和成管作用(图4F、G和H)。以上试验结果均表明，艾曲波帕能够通过作用于巨噬细胞调节血管生成。

实施例5.艾曲波帕在体内抑制小鼠乳腺癌移植瘤的生长。

为了验证艾曲波帕化合物的体内抗肿瘤效果，我们选用六周龄的BALB/c小鼠建立4T1细胞的肿瘤移植模型，并对艾曲波帕化合物的抗肿瘤作用及移植肿瘤血管生成的作用进行了评价，结果如图5所示。

当肿瘤生长到约150mm³时采用腹腔注射的方式对小鼠进行给药，艾曲波帕化合物的给药剂量分别为75mg/kg和150mg/kg，并监测不同时间点肿瘤体积的变化，结果如图5中A和B所示，艾曲波帕给药组的肿瘤体积均明显小于对照组，显著抑制了肿瘤的生长，在实验完成时，75mg/kg的给药剂量使肿瘤体积减小约50％，150mg/kg剂量的肿瘤体积减小了约40％。给药过程中并未发现艾曲波帕对小鼠有明显的毒性作用，且给药过程中小鼠的体重未发生显著的变化。

前期的细胞实验结果表明，艾曲波帕化合物能够通过HuR调节血管生成相关基因的mRNA水平，因此我们进一步对小鼠肿瘤中的血管及VEGF基因的表达情况进行检测，结果如图5所示。其中图5C为CD31染色标记的血管密度，结果表明不同剂量的艾曲波帕均能够显著降低肿瘤内的微血管密度。图5D为VEGF-A蛋白的染色结果，在艾曲波帕给药组中，VEGF-A蛋白的表达情况也显著降低。因此与体外结果一致，艾曲波帕在体内可通过抑制微血管生成而抑制肿瘤的生长。

实施例6.艾曲波帕治疗小鼠乳腺癌过程中维持正常血小板水平。

艾曲波帕为临床上使用的促血小板生成药物，本发明中发现了艾曲波帕的抗乳腺癌血管生成新功能，并阐释了其作用新机制。而临床抗肿瘤治疗过程中，经常伴随病人的血小板减少，因此艾曲波帕促血小板生成的功能与其新发现的抗肿瘤作用能够相辅相成，对肿瘤的治疗大有裨益。本发明在进行小鼠肿瘤试验的过程中也同时检测了小鼠的血小板水平，结果如图6所示，化疗药物吉西他滨治疗组的血小板水平显著低于正常小鼠，而艾曲波帕给药组则能够使血小板维持在正常水平。因此艾曲波帕可成为临床肿瘤治疗的备选药物。

Claims

1.艾曲波帕在制备抗癌血管生成药物中的应用，其特征在于，艾曲波帕具有抑制血管生成相关因子的表达与分泌活性、和/或抑制血管内皮细胞增殖、迁移与成管活性、和/或促血小板生成活性。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，艾曲波帕通过降低血管生成相关因子mRNA水平、和/或阻断HuR蛋白与血管生成相关因子mRNA的结合，抑制血管生成相关因子的表达与分泌；

艾曲波帕通过抑制血管生成相关因子的表达与分泌，抑制血管内皮细胞增殖、迁移与成管。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，艾曲波帕通过缩短血管生成相关因子mRNA的半衰期，降低血管生成相关因子mRNA水平；

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述血管生成相关因子包括癌细胞和/或巨噬细胞内的血管生成相关因子，所述癌细胞包括乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞及口腔癌细胞。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述血管生成相关因子包括血管内皮生长因子和/或MMP9蛋白。

6.一种抗癌血管生成药物，其特征在于，含有活性成分艾曲波帕。

7.根据权利要求6所述的抗癌血管生成药物，其特征在于，还含有药学上可接受的载体和/或辅助活性成分。

8.艾曲波帕在制备抗癌药物组合物中的应用，其特征在于，艾曲波帕为抑制癌血管生成的活性成分和/或促血小板生成的活性成分。

9.一种抗癌药物组合物，其特征在于，含有艾曲波帕及至少一种抗肿瘤药物活性成分。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括吉西他滨、卡培他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、多柔比星、表柔比星或吡柔比星。