CN110326477A - 一种提高小麦对白粉病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高小麦对白粉病抗性的方法，涉及植物生长调节控制技术领域，针对目前白粉病绿色防控技术缺乏的问题而提出的。本发明包括以下步骤：(1)将褪黑素与溶剂混合后，加入水配制成褪黑素水溶液，所述褪黑素水溶液中褪黑素的浓度为50‑1000μM；(2)将配制好的褪黑素水溶液喷施于小麦。本发明的有益效果在于：可以显著降低小麦的白粉病发病，同时促进小麦植株的生长，提高生物量的积累达10％以上。

Description

一种提高小麦对白粉病抗性的方法

技术领域

本发明涉及植物生长调节控制技术领域，具体涉及一种提高小麦对白粉病抗性的方法。

背景技术

小麦是世界上第一大粮食作物，也是我国种植面积仅次于水稻的重要粮食作物。由布氏白粉菌Blumeria graminis引起的小麦白粉病几乎在所有小麦产区都有发生，是造成小麦减产最严重的病害之一。白粉菌可以侵染小麦植株地上部分各器官，主要以叶片和叶鞘为主，也可引起颖壳枯死，使麦粒不饱满、甚至腐烂。近年来，小麦白粉病已广泛分布于我国小麦的主产区，小麦因白粉病危害可导致减产10％左右，严重的可达20％以上。因此白粉病已经是我国小麦高产、稳产的主要限制因素之一。

目前防治白粉病主要依赖于化学药剂、田间栽培模式的优化以及含有白粉病抗性基因或位点的小麦新品种选育。专利CN201410191243.8公开一种提高小麦白粉病抗性的方法，通过转基因技术获得小麦TaSSI2基因的RNAi转基因株系，从而提高转基因株系对白粉病的抗性；专利CN200610011129.8公开一种防治植物白粉病的复配杀菌剂，其特征在于它由活性成分、填料和助剂组成，其中活性成分由三唑类杀菌剂与保护剂组成。喷施杀菌剂是化学药剂防控的主要手段，然而杀菌剂的使用存在很大的安全风险，目前市面上常规杀菌剂容易在农产品中残留和在水体中富集，对人畜健康以及环境造成危害。许多国家已经对农药展开重新登记审查，并且禁止使用某些杀菌剂或者限制其在某些作物上使用。因此急需研发新型绿色高效的防控技术产品。

发明内容

本发明解决的技术问题在于目前白粉病绿色防控技术缺乏。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供一种提高小麦对白粉病抗性的方法，包括以下步骤：

(1)将褪黑素与溶剂混合后，加入水配制成褪黑素水溶液，所述褪黑素水溶液中褪黑素的浓度为50-1000μM；

(2)将配制好的褪黑素水溶液喷施于小麦。

优选的，所述溶剂为乙醇。

优选的，所述褪黑素水溶液中还加入终浓度为0.5‰的表面活性剂。

优选的，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。

优选的，所述喷施方法包括以下步骤：将配制好的褪黑素水溶液对小麦植株叶面进行喷施。

优选的，在小麦的幼苗期-灌浆期的发育阶段对小麦叶面进行喷施。

优选的，喷施量为以叶片出现液滴直至有液滴滴下为准。

优选的，喷施时间为在阴天或晴天；当喷施时间在晴天时，在太阳落山之后喷施，每隔一天喷施1次，喷施次数为2次。

优选的，若喷施后12h内下雨，重复喷施步骤。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明对小麦的白粉病抗性具有显著的提高和促进作用，可以显著降低小麦的白粉病发病情况，使发病指数降低70％，同时促进小麦植株的生长，提高生物量的积累达10％以上；

(2)本发明中使用的褪黑素具有稳定，高效、廉价、环保以及易于使用的特点；本发明操作简单、成本低廉，可广泛用于小麦的生产。

附图说明

图1为本发明实施例5中褪黑素水溶液和对照溶液处理后小麦白粉病的发病情况比较图；

图2为本发明实施例5中褪黑素水溶液和对照溶液处理后小麦白粉病的发病指数测定结果图；

图3为本发明实施例5中1000μM浓度的褪黑素水溶液和对照溶液处理后小麦白粉病的发病指数测定结果图；

图4为本发明对照组处理24h后白粉菌的生长情况图；

图5为本发明对照组处理48h后白粉菌的生长情况图；

图6为本发明对照组处理72h后白粉菌的生长情况图；

图7为本发明实施例1处理24h后白粉菌的生长情况图；

图8为本发明实施例1处理48h后白粉菌的生长情况图；

图9为本发明实施例1处理72h后白粉菌的生长情况图；

图10为本发明实施例2处理24h后白粉菌的生长情况图；

图11为本发明实施例2处理48h后白粉菌的生长情况图；

图12为本发明实施例2处理72h后白粉菌的生长情况图；

图13为本发明实施例3处理24h后白粉菌的生长情况图；

图14为本发明实施例3处理48h后白粉菌的生长情况图；

图15为本发明实施例3处理72h后白粉菌的生长情况图；

图16为本发明实施例6中白粉菌的孢子萌发率结果图；

图17为本发明实施例6中白粉菌的孢子克隆形成率结果图；

图18为本发明实施例7中小麦抗病基因的表达图；

图19为本发明对照组中小麦的发病情况图；

图20为本发明实施例3中小麦的发病情况图；

图21为本发明对照组中小麦叶片的发病情况图；

图22为本发明实施例9中小麦的生物量测定结果图。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

(1)小麦植株准备：

选用处理小麦幼苗期-灌浆期的生长状况良好的小麦白粉病易感品种Yangmai158植株(公知公用材料，Two members of TaRLK family confer powdery mildewresistance in common wheat.BMC Plant Biology(2016)16:27)，按照小麦常规种植进行栽培管理；

(2)配制褪黑素水溶液

将褪黑素(购自SIGMA试剂公司)与乙醇混合后，配制成50mM母液，加入去离子水，配制成褪黑素水溶液，褪黑素水溶液中褪黑素的浓度为50μM，加入吐温20，使吐温20的终浓度为0.5‰。

(3)喷施方法

实验组：于小麦的幼苗期，将配制好的褪黑素水溶液对小麦植株进行整株喷施，喷施量为以叶片出现液滴直至有液滴滴下为准，喷施时间为在阴天或晴天傍晚太阳落山后；喷施后12h内若下雨，需要重新补喷。一共需要做喷施处理2次，每次间隔一天。

实施例2

本实施例与实施例1的区别之处在于：褪黑素水溶液中褪黑素的浓度为200μM。

实施例3

本实施例与实施例1的区别之处在于：褪黑素水溶液中褪黑素的浓度为500μM。

实施例4

本实施例与实施例1的区别之处在于：褪黑素水溶液中褪黑素的浓度为1000μM。

对比例1

对比例1为对照组，与实施例1的区别之处在于：喷施的溶液为含有0.5‰吐温20的水溶液。

对比例2

对比例2与实施例1的区别之处在于：喷施的溶液为水杨酸水溶液(20μM)，含有0.5‰的吐温20。

实施例5

接种白粉菌：白粉菌为Blumeria graminis f.sp.Tritici(bgt)，为本实验室保存菌种(原始菌种由南京农业大学王秀娥教授实验室提供，公知公用材料Two members ofTaRLK family confer powdery mildew resistance in common wheat.BMC PlantBiology(2016)16:27)。本实施例中以Blumeria graminis f.sp.Tritici(bgt)白粉菌为例使小麦产生白粉病，但并不限于此菌株。

在实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对照组、对比例2处理小麦叶片7天后，将小麦白粉病孢子直接悬浮于12mg/L的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中，孢子浓度调整到约5×10⁵个/mL^-1，直接用喷雾器进行喷洒接种，直到有液滴从叶片流下为止。

实施例6

对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4接种白粉菌后小麦发病情况和发病指数测定实验

发病指数(disease severity)测定：对不同处理组白粉菌接种7天后的叶片发病面积进行测定，从而确定叶片的发病情况，发病指数(％)＝叶片发病面积/叶片总面积，测定方法参考(Pessina et al.,2016)The knock-down of the expression ofMdMLO19reduces susceptibility to powdery mildew(Podospharera leucotricha)inapple(Malus domestica).Plant biotechnology Journal(2016)14,2033-2044。相关实验重复五次以上。

实验结果：从图1可以看出，随褪黑素水溶液浓度的增加，小麦叶片上的斑点逐渐减少，能够显著增强小麦对白粉病的抗性，从图2可以看出，随着褪黑色水溶液浓度的增加，小麦对白粉病的抗性增强，小麦白粉病发病指数降低，对照组中小麦发病指数达到90％，经500μM浓度的褪黑素水溶液处理后，小麦发病指数低至10％；由图3可以看出，经1000μM浓度的褪黑素水溶液处理后，小麦发病指数低为9％。

实施例7

对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4接种白粉菌后克隆的形成率的测定

白粉菌在不同处理的小麦叶片上的生长情况的测定方法：在接种白粉菌孢子24h、48h、72h后，对白粉菌的生长情况进行测定，通过考马斯亮蓝染色，在显微镜下观察不同处理对白粉菌孢子的萌发和生长的影响。每个实验组包含3个生物学重复。

孢子萌发率：在喷施褪黑素水溶液后，对小麦叶片上白粉菌的孢子萌发率进行测定，测定方法采用Hu et al.,2018(A palgorskite-based nanocomposite effectivelyreducing the incidence of powdery mildew).Applied Clay Science(2018)166,113-122.中公开的方法。

白粉菌孢子克隆的形成率：在接种白粉菌孢子后，对小麦叶片上白粉菌孢子克隆的形成率进行测定，测定方法采用Hu et al.,2018(A palgorskite-based nanocompositeeffectively reducing the incidence of powdery mildew).Applied Clay Science(2018)166,113-122.中公开的方法。

实验结果：从图4-图15可以看出，Sp代表附着胞；App代表萌发管；SH代表初级菌丝，从图4至图6可以看出，经过对照组处理后，白粉菌孢子能够正常形成附着胞和萌发管，以及最终克隆的形成；从图7至图9可以看出，在接种白粉菌孢子24h后，孢子也能够形成附着胞和萌发管，接种白粉菌孢子48h后，褪黑素能够显著抑制孢子次级菌丝的生长，接种白粉菌孢子72h后，褪黑素能够抑制克隆的形成。随着褪黑素水溶液浓度的增加，白粉病的孢子萌发率、附着胞以及萌发管的形成并不受影响，然而孢子菌丝(包括初期菌丝)的生长显著受到抑制。

从图16和图17可以看出，随褪黑素水溶液浓度的增加，小麦叶片上白粉病孢子的萌发率基本不变，在90％处波动；而孢子克隆形成率迅速降低，当喷施的褪黑素水溶液浓度为50μM时，孢子克隆形成率降低至15％，当喷施的褪黑素水溶液浓度为500μM时，孢子克隆形成率降低至2％，表明褪黑素不影响白粉病孢子的萌发率，影响孢子克隆形成率。

实施例8

对照组、对比例2、实施例3接种白粉菌后小麦抗病基因表达水平的测定：通过实时荧光定量PCR的方法对白粉病的抗病基因的相对表达量进行测定，其中实时荧光定量PCR法为现有技术。

实验结果：基因PR1-10，JA2以及GPL2a是目前已知的小麦中参与调控白粉病抗性的重要靶基因。从图18可以看出，褪黑素和传统抗病激素水杨酸一样，都能够促进小麦抗病基因的表达，但是对抗病基因PR1-10表达水平的提高，褪黑素要弱于水杨酸，但是褪黑素对于抗病基因GPL2a的表达水平的提高要显著高于水杨酸。尤其，褪黑素能够显著促进PR3的表达水平。

实施例9

对照组、实施例3接种白粉菌后小麦对白粉病抗性的效果测定

实验结果：如图19-图21可以看出，小麦白粉菌接种7天后，小麦叶片在褪黑素处理有表现出显著降低的白粉病发病情况；同时对照组小麦叶片因白粉病侵染导致变黄衰老，褪黑素处理的小麦叶片较绿，植株能够正常生长。

实施例10

对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4处理后对小麦生物量的影响测定

测定方法：在褪黑素处理2周以后，分别将不同处理组小麦植株整株在65℃进行烘干至恒重，然后测定小麦的干重，每个处理包含三个生物学重复。

测定结果：结果显示，如图22所示，200μM和500μM褪黑素处理能够显著促进小麦生物量的积累，干重分别增加了15％和16％左右。然而高浓度褪黑素(1000μM)具有一定的副作用，能够抑制小麦生物量积累，但其影响不大，随着褪黑色水溶液浓度的增加，小麦对白粉病的抗性增强，小麦白粉病发病指数降低。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将褪黑素与溶剂混合后，加入水配制成褪黑素水溶液，所述褪黑素水溶液中褪黑素的浓度为50-1000μM；

(2)将配制好的褪黑素水溶液喷施于小麦。

2.根据权利要求1所述的提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：所述溶剂为乙醇。

3.根据权利要求1所述的提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：所述褪黑素水溶液中还加入终浓度为0.5‰的表面活性剂。

4.根据权利要求1所述的提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：所述表面活性剂为吐温20或吐温80。

5.根据权利要求1所述的提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：所述喷施方法包括以下步骤：将配制好的褪黑素水溶液对小麦植株叶面进行喷施。

6.根据权利要求1所述的提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：在小麦的幼苗期-灌浆期的发育阶段对小麦叶面进行喷施。

7.根据权利要求1所述的提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：喷施量为以叶片出现液滴直至有液滴滴下为准。

8.根据权利要求1所述的提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：喷施时间为在阴天或晴天；当喷施时间在晴天时，在太阳落山之后喷施。

9.根据权利要求1所述的提高小麦对白粉病抗性的方法，其特征在于：若喷施后12h内下雨，重复喷施步骤。