CN110317741A - 一株耐铬的石油烃降解菌Thp3-45A及其应用 - Google Patents

一株耐铬的石油烃降解菌Thp3-45A及其应用 Download PDF

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Abstract

一株耐铬的石油烃降解菌Thp3‑45A及其应用，涉及石油烃降解菌。已于2018年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2018837。一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A在处理原油及Cr6+复合污染土壤治理中的应用。石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的分离及应用有效填补了该方面研究的空白，并为实际污染环境的治理工作提供了一套可行的实践方案，展现出巨大的实际应用前景。

Description

一株耐铬的石油烃降解菌Thp3-45A及其应用
技术领域
本发明涉及石油烃降解菌，尤其是涉及一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A及其应用。
背景技术
石油及其产品是人类最重要的能源和工业原料，素有“工业血液”和“人类文明社会的血液”之称，作为一种重要的能源，其应用范围还在继续扩展，消耗量也日趋增大，但在石油的开采、炼制、储运和使用过程中，由于工艺水平和处理技术的限制使得大量石油烃类物质的废水、废渣不可避免的排入土壤，引起大面积土壤植被被石油污染，破坏土壤生产力，抑制植物营养物质的吸收和转移，造成植物死亡，并由此进入食物链，危害人类健康(张学佳.石油类污染物对土壤生态环境的危害[J]:化工科技，2008.16(6))。
铬(Cr)是一种广泛应用于工业生产的重金属元素，常被广泛应用于电镀、制革、染色、合金生产、木材保藏等行业(Deflora S,Bagnasco M,Serra D,ZanacchiP.Genotoxicity Of Chromium Compounds-A Review.Mutat Res,1990,238(2):99-172.)。据中华人民共和国环境保护部公布的2015年中国环境统计年报显示，本年度工业废水中六价铬(Cr6+)及总铬的排放量分别为70.4吨和188.6吨。由于Cr在环境中长期存在、不易降解，且具有通过食物链的生物聚集和放大作用，人为活动产生未经处理的Cr不仅对环境造成严重的污染，还可能威胁公众健康(Garg SK,Tripathi M,Srinath T.Strategies forChromium Bioremediation of Tannery Effluent.Rev Environ Contam T,2012,217:75-140.)。具体来看，在自然环境中Cr的主要存在形式是Cr6+和Cr3+。Cr3+的性质较稳定，毒性较小；Cr6+由于具有强氧化性和腐蚀性，同时能够穿过生物膜进入细胞内部，因而，对人体有很强的毒性作用且能够造成人类遗传性基因缺陷(Pajor F,Póti P,Bárdos L.Accumulationof some heavy metals(Pd,Cd and Cr)in milk of grazing sheep in north-eastHungary.Food Sci Biotechnol,2012,2(1):389-394.)。研究表明，Cr6+的毒性是Cr3+毒性的100倍，致突变性是Cr3+的1000倍(ZHAO Ran#*,WANG Bi,CAI Qing Tao,LI Xiao Xia,LIUMin,HU Dong,GUO Dong Bei,WANG Juan,FAN Chun*.Bioremediation of HexavalentChromium Pollution by Sporosarcinasaromensis M52Isolated from OffshoreSediments in Xiamen,China.2016,Biomed Environ Sci,29(2):127-136.)。目前，国际癌症研究机构(IARC)及美国政府工业卫生学家协会(ACGIH)均已经确定Cr6+化合物具有致癌性。因此，研究其处理技术对生态环境保护和人类健康意义重大。
有研究表明：受石油烃污染的土壤，如油田土壤、火力发电厂等，常伴随有严重的重金属类物质污染的现象(Fu,Xiaowen,Zhaojie Cui&Guolong Zang.2014.Migration,speciation and distribution of heavy metals in an oil-polluted soil affectedby crude oil extraction processes.Environmental Science:Processes&Impacts16.1737-44.)，而部分重金属污染物对微生物具有致死作用。因此，大部分高效石油烃降解微生物在上述情况下降解效率大大下降(Dong,Zhi-Yong,Wen-Hui Huang,Ding-FengXing&Hong-Feng Zhang.2013.Remediation of soil co-contaminated with petroleumand heavy metals by the integration of electrokinetics andbiostimulation.Journal of Hazardous Materials 260.399-408.)。目前，分别针对含石油烃与Cr6+污染物土壤治理的物理法、化学法、生物法及不同方法的组合应用已经较为普遍，但关于石油烃污染物-Cr6+复合污染的研究却鲜见报道。现有的技术路线普遍存在成本高、周期长、易造成二次污染等诸多弊病。因此，寻求石油烃污染物-Cr6+复合污染的治理方案，对环境污染问题具有极其重要的实际意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderiacaribensis)Thp3-45A。
本发明的第二目的在于提供一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderiacaribensis)Thp3-45A在处理原油及Cr6+复合污染土壤治理中的应用。
所述石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A，筛选自澳门发电厂内一处石油烃污染区域(E113°55′,N22°20′)，土壤样品在无菌收集后，经低温运送至实验室进行下一阶段研究工作。
在实验室环境中：取250mL锥形瓶，洗净后加注90mL去离子水并添加直径为0.5cm玻璃珠25颗，封口后置于高压灭菌锅内，121℃，20min高温高压灭菌。待体系冷却至室温后，在超净工作台中将10.0g前述土壤样品加入锥形瓶内，重新封口后，置于28℃恒温摇床内震荡约30min，使土壤孔隙中的微生物充分释放。该过程所产生的悬浊液即为梯度稀释的原液。该原液以10倍比例进行等比稀释，以10-4、10-5、10-6为稀释终浓度，均匀涂布于LB固体平板上并倒置于28℃恒温培养箱培养约48h。经反复分离纯化，最终得到单菌石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A。提取石油烃降解菌(Paraburkholderiacaribensis)Thp3-45A的基因组DNA并以此为模板扩增16S rDNA片段，并在Ezbiocloud上选取高相似度序列，用MEGA 7.0计算出序列的系统进化距离，并构建系统发育树。系统发育树显示：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A，其16s rDNA序列与模式菌株ParaburkholderiacaribensisMWAP64(T)相似性为99.86％，且共同形成一枝，因此命名为石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A。石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A已于2018年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2018837。
在LB固体平板上挑取石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A的一个单菌落接种于LB液体培养基中，过夜培养，即为Thp3-45A种子液。将10g原油与90mL无机盐液体培养基分别灭菌后混合，即配制100g/L的原油-无机盐培养基，并在此培养基中加入干燥后至恒重的重铬酸钾粉末，使该体系中的Cr6+浓度为100mg/L。按1％的比例加入菌株种子液，并在28℃，150rpm条件下培养共计15d，每3日取样分析Cr6+及石油烃含量。再以50mg/L Cr6+为梯度，不断增加LB液体培养基中的Cr6+浓度，后接入Thp3-45A种子液，通过监测一定培养周期后培养基中的吸光度值是否变化并加以LB固体平板涂布验证，以确定石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A最高可耐受Cr6+浓度。
经上述实验验证：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A在pH7.0，温度28℃，含Cr6+和原油分别为100mg/L、100g/L的无机盐液体培养基中，150rpm培养15d，对Cr6+去除率达94.6％，同时可以完全降解反应体系中的原油。且石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A最高可在含约300mg/L Cr6+的LB液体培养基中生长。
上述LB固体培养基组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。LB液体培养基组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，去离子水1L，pH6.9～7.1。无机盐液体培养基组分为：氯化钙2.0g，定容至100mL，制成1000×氯化钙溶液；七水合硫酸镁2.0g,定容至100mL，制成100×硫酸镁溶液；硫酸铵0.5g,硝酸钠0.5g,磷酸二氢钾1.0g,水合磷酸二氢钠1.0g,去离子水800mL，调pH至7.0～7.2，高压灭菌后，于无菌环境下按比例加入氯化钙溶液与硫酸镁溶液，并加无菌水补齐至1L。
本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A的分离及应用有效填补了该方面研究的空白，并为实际污染环境的治理工作提供了一套可行的实践方案，展现出巨大的实际应用前景。
附图说明
图1为本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A的系统发育分析树。在图1中，标尺表示差异精度。
图2为本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A不同时间对六价铬及废机油的降解率。在图2中，A为100mg/L Cr(VI)，B为石油烃。
具体实施方式：
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A形态特征
将单菌落划线接种至LB固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱内，28℃培养72h。该菌革兰氏染色呈阴性，专性需氧。菌落呈圆形，米白色半透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径1～1.5mm。
实施例2：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A的筛选与系统发育学鉴定
(1)现场采集澳门发电厂石油烃污染区域(E113°55′,N22°20′)地表下5～20cm深度的土壤样品，初步剔除草根、石块等杂质后，低温寄送至实验室，以供进一步分析筛选目的菌株之用。
(2)在实验室环境中：取250mL锥形瓶，洗净后加注90mL去离子水并添加25颗0.5cm直径的玻璃珠，封口后，121℃，20min高压灭菌。待体系降至室温后，在超净工作台中将10.0g前述土壤样品加入锥形瓶中，重新封口后，置于28℃恒温摇床内震荡约30min。该过程所产生的悬浊液即为梯度稀释的原液。该原液以10倍等比稀释，以10-4、10-5、10-6为稀释终浓度，均匀涂布于LB固体平板上，后将平板倒置于28℃恒温培养箱培养约48h。经反复分离纯化，最终得到纯净单菌石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A。
(3)提取石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A的基因组DNA并以此为模板扩增16SrDNA片段，并在EZBiocloud上选取高相似度序列，用MEGA7.0计算出序列的系统进化距离，并构建系统发育树。系统发育树显示：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A与模式菌株ParaburkholderiacaribensisMWAP64(T)相似性为99.86％，且共同形成一枝，因此可认其属于为Paenarthrobactercaribensis菌属，命名为石油烃降解菌(Paraburkholderiacaribensis)Thp3-45A。
实施例3：本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A对Cr6+及石油烃的去除效果
(1)配制LB液体培养基，并在LB固体平板上挑取石油烃降解菌(Paraburkholderiacaribensis)Thp3-45A的一个单菌落接种于LB液体培养基中，过夜培养，即为Thp3-45A种子液。
(2)将10g原油与90mL无机盐液体培养基分别灭菌后混合，即配制100g/L的原油-无机盐培养基，并加入干燥至恒重的重铬酸钾粉末，使该体系中的Cr6+浓度为100mg/L(此数值经预实验确定)。于28℃，150rpm条件下培养共15d，每3d取样分析石油烃及Cr6+含量。结果显示：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A对Cr6+去除率达94.6％，同时可以完全降解反应体系中的原油。
实施例4：本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A对Cr6+的最高耐受浓度
(1)配制LB液体培养基，并在LB固体平板上挑取石油烃降解菌(Paraburkholderiacaribensis)Thp3-45A的一个单菌落接种于LB液体培养基中，过夜培养，即为Thp3-45A种子液。
(2)以50mg/L Cr6+为梯度间隔配制含不同浓度Cr6+的LB液体培养基，接入Thp3-45A种子液，通过监测一定培养周期后培养基中的吸光度值是否变化并加以LB固体平板涂布验证，以确定其最高可耐受Cr6+浓度。
(3)该实验结果显示：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A最高可在含约300mg/L Cr6+的LB液体培养基中生长。
上述LB固体培养基组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。LB液体培养基组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，去离子水1L，pH6.9～7.1。无机盐液体培养基组分为：氯化钙2.0g，定容至100mL，制成1000×氯化钙溶液；七水合硫酸镁2.0g,定容至100mL，制成100×硫酸镁溶液；硫酸铵0.5g,硝酸钠0.5g,磷酸二氢钾1.0g,水合磷酸二氢钠1.0g,去离子水800mL，调pH至7.0～7.2，高压灭菌后，于无菌环境下按比例加入氯化钙溶液与硫酸镁溶液，并加无菌水补齐至1L。
本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A的系统发育分析树参见图1，本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A不同时间对六价铬及废机油的降解率参见图2。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一株耐铬的石油烃降解菌Thp3-45A及其应用
<141> 2018-09-22
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1401
<212> DNA
<213> Paraburkholderia caribensis Thp3-45A
<400> 2
aacatgcaag tcggacggca gcgcgggggc aaccctggcg gcgagtggcg aacgggtgag 60
taatacatcg gaacgtgtcc tggagtgggg gatagcccgg cgaaagccgg attaataccg 120
catacgctct gtggaggaaa gcgggggatc ttcggacctc gcgctcaagg ggcggccgat 180
ggcagattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatctgt agctggtctg 240
agaggacgac cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaattt tggacaatgg gggcaaccct gatccagcaa tgccgcgtgt gtgaagaagg 360
ccttcgggtt gtaaagcact tttgtccgga aagaaaaccg cttctctaat acaggggcgg 420
gatgacggta ccggaagaat aagcaccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
tagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg tgcgcaggcg gttcgctaag 540
accgatgtga aatccccggg cttaacctgg gaactgcatt ggtgactggc gggctagagt 600
atggcagagg ggggtagaat tccacgtgta gcagtgaaat gcgtagagat gtggaggaat 660
accgatggcg aaggcagccc cctgggccaa tactgacgct catgcacgaa agcgtgggga 720
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccctaaac gatgtcaact agttgtcggg 780
tcttcattga cttggtaacg aagctaacgc gtgaagttga ccgcctgggg agtacggtcg 840
caagattaaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcggtggatg atgtggatta 900
attcgatgca acgcgaaaaa ccttacctac ccttgacatg tacggaacct tgctgagagg 960
tgagggtgcc cgaaagggag ccgtaacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020
gtgagatgtt ggggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtccctagt tgctacgcaa 1080
gagcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtcc 1140
tcatggccct tatgggtagg gcttcacacg tcatacaatg gtcggaacag agggttgcca 1200
agccgcgagg tggagccaat cccagaaaac cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact 1260
cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1320
cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttttacca gaagtggcta 1380
gtctaaccgc aaggaggacg g 1401

Claims (3)

1.一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A，其特征在于已于2018年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2018837。
2.如权利要求1所述一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A在处理原油中应用。
3.如权利要求1所述一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3-45A在Cr6+复合污染土壤治理中应用。
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