CN110314251A - 一种复合骨修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合骨修复材料，其包括多孔人工骨材料、自体骨颗粒以及自体血液混匀形成，其中，自体骨颗粒的粒径为20～200μm。本发明还提供了所述复合骨修复材料的制备方法。本发明将自体骨破碎至细微颗粒与自体血液、多孔人工骨材料共同形成复合骨修复材料，自体骨颗粒和血液均匀分布于多孔人工骨材料的孔隙中，制备方法简便，可在保持良好的骨修复效果的同时大幅减少自体骨组织的用量，提高了自体骨的利用效率。使用本发明的复合骨修复材料可明显缩短骨修复治疗时间，具有非常大的临床应用价值。

Description

一种复合骨修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用植入材料领域，具体涉及一种复合骨修复材料及其制备方法。
背景技术
创伤性骨折、骨组织坏死、骨肿瘤等疾病的患者每年达数百万之多，且有日益增多的趋势。尽管骨组织本身具有较强的再生能力，但其自身修复往往只能在缺损较小的情形下进行。对于无法自我修复的缺损，选用自体骨移植是疗效最好的修复方式，但自体骨移植的骨源十分有限，且会对患者造成二次损伤，临床应用中受到很大的限制。
为此，诞生了多种人工骨材料，如纳米磷灰石陶瓷、生物活性玻璃等，在临床已获得较广泛的应用。以纳米磷灰石陶瓷为例，其组成和结构与人体骨组织的无机成分非常相似，可依靠化学键与骨组织结合，因此它具有好的生物相容性，对人体组织无毒、无刺激、无致敏性、无致突变性和致癌性。为提高人工骨材料的修复效果，添加各种骨生长因子成为一种选择。但是，采用生物合成或生物提取技术获得的骨生长因子常因活性不高、缓释周期短及存在免疫方面的问题等原因，在临床应用中受到很大限制。
目前的临床应用中，手术医生常将术区剔除的碎骨块及血凝块与人工骨材料混合植入缺损区，甚或采集部分髂骨与人工骨材料混合植入缺损区。大量的临床治疗表明，血管的长入速度、新骨的生长速度及修复效果均优于单纯的人工骨植入材料。但在手术治疗中，自体骨组织往往非常稀缺。因此，寻求性能优异的新型人工骨修复材料有着巨大的临床需求。
发明内容
为克服现有人工骨修复材料中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种复合骨修复材料，可有效减少自体骨组织的用量，并明显提高骨修复效果。
本发明提供的复合骨修复材料包括多孔人工骨材料、自体骨颗粒以及自体血液混匀形成，其中，所述自体骨颗粒的粒径为20～200μm。
本发明提供的复合骨修复材料中，所述自体骨颗粒与所述自体血液均匀分布于所述多孔人工骨材料的孔隙中。
本发明提供的复合骨修复材料中，所述自体骨颗粒与所述自体血液的总体积与所述多孔人工骨材料的体积比为3.5～6﹕1。
本发明提供的复合骨修复材料中，所述复合骨修复材料中还包括血液抗凝剂。
本发明提供的复合骨修复材料中，所述血液抗凝剂选自枸橼酸或枸橼酸的碱金属盐。
本发明提供的复合骨修复材料中，所述多孔人工骨材料的孔隙尺寸为100～500μm，孔隙率为50～80％。
本发明提供的复合骨修复材料中，所述多孔人工骨材料选自羟基磷灰石、磷酸三钙、羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷、氟磷灰石、碳酸磷灰石、氧磷灰石、复合磷灰石、生物活性玻璃、生物活性玻璃陶瓷、金属钛中的一种或多种。
本发明提供的复合骨修复材料中，所述自体骨颗粒与所述自体血液的体积比为1﹕20～25。
本发明还提供了以上技术方案任一项所述复合骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
S1：取自体骨破碎成颗粒，与自体血液混匀形成浆体；以及
S2：将多孔人工骨材料加入至步骤S1所得的浆体中即得。
本发明提供的制备方法中，所述步骤S1包括以下过程：取自体骨首先破碎成3～5mm的颗粒，液氮冷却3～15分钟，然后再破碎成20～200μm的颗粒。
本发明将自体骨破碎至细微颗粒与自体血液、多孔人工骨材料共同形成复合骨修复材料，自体骨颗粒和血液均匀分布于多孔人工骨材料的孔隙中，制备方法简便，可在保持良好的骨修复效果的同时大幅减少自体骨组织的用量，提高了自体骨的利用效率。使用本发明的复合骨修复材料可明显缩短骨修复治疗时间，具有非常大的临床应用价值。
附图说明
图1A-1D为不同倍数下的多孔磷灰石材料的SEM图像；
图2为含有自体骨颗粒、自体血液的复合多孔磷灰石材料的SEM图像；
图3A-3B为不同倍数下的复合多孔磷灰石材料体外成骨细胞培养3天后的SEM图像；
图4A-4B为实验例2术后不同时间的骨缺损区域的X射线图像；
图5A-5F为实验例2术后不同时间的骨缺损区域的染色细胞图像；
图6为实验例2术后的骨缺损区域的新生骨的SEM图像；
图7A-7B为实验例3术后8周的骨缺损区域的新生骨照片。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了一种复合骨修复材料，其包括多孔人工骨材料、自体骨颗粒以及自体血液混匀形成，其中，所述自体骨颗粒的粒径为20～200μm。
自体骨组织在骨移植中具有优异的特性，非血管化自体骨移植常因缺乏供血，仅表面0.1-0.3mm范围的少数细胞依赖受区组织液的弥散得以存活，组织内大多数细胞因死亡而成为死骨。基于此缺陷，本发明的复合骨修复材料将自体骨破碎至细微颗粒与自体血液、多孔人工骨材料共同形成复合骨修复材料，自体血液可在一段时间内维持自体骨组织的成骨细胞的活性，而且还含有游离的骨生长因子以及多种营养物质，多孔人工骨材料具有优良的生物相容性，其彼此联通的多孔结构也有利于引导新生血管的长入和新生骨组织的生长。本发明的复合骨修复材料植入后，可保持自体骨组织的活性，自体骨及血液中的各种诱导新骨形成的生长因子及营养成分将缓慢释放，均匀分布的细微自体骨颗粒成为孕育新生骨组织的发育点，从而可有效促进新生骨组织的增长，促进骨缺损的修复与愈合，由此可减少自体骨用量，提高自体骨的利用效率。
一般而言，骨愈合的过程主要分为诱导期、炎症期、骨痴期、塑形与改建期，本发明的复合骨修复材料植入宿区后伴随血管长入，使成骨速度加快，实现骨缺损的修复与整合，经观察，可明显加速促进骨痴期、塑形与改建期进程。
在根据本发明的复合骨修复材料的一个实施方式中，自体骨颗粒与自体血液均匀分布于多孔人工骨材料的孔隙中，由此可使新生骨组织的发育点更多、更均匀地分布于修复材料上。
在根据本发明的复合骨修复材料的一个实施方式中，所述复合骨修复材料中还包括血液抗凝剂。可用于本发明的血液抗凝剂可选用常见的抗凝剂或抗凝物质，如天然抗凝剂肝素、水蛭素、Ca2+鳌合剂(柠檬酸钠、氟化钾)、乙二胺四乙酸(EDTA)钠、钾盐等，阻止血液凝固。在一个优选的实施方式中，血液抗凝剂选自枸橼酸或枸橼酸的碱金属盐，如枸橼酸钾、枸橼酸钠等。在一个更优选的实施方式中，血液抗凝剂选自枸橼酸钾或枸橼酸钠，枸橼酸盐可与人工骨表面的钙离子形成螯合物，可改善人工骨材料表面的ζ电位，人工骨表面被活化，从而提高材料的分散性及亲水性。血液抗凝剂的添加量取决于复合骨修复材料于手术中的等待时间，可由本领域普通技术人员根据实际情况调节。
在根据本发明的复合骨修复材料的一个实施方式中，所述多孔人工骨材料可以选用临床现有的所有种类人工骨材料，其孔隙尺寸可以为100～500μm，孔隙率可以为50～80％，由此能更好地分散自体骨颗粒和血液，达到优异的骨修复效果。所述多孔人工骨材料可以为颗粒状，也可以为块状，其种类包括但不限于：羟基磷灰石、磷酸三钙、羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷、氟磷灰石、碳酸磷灰石、氧磷灰石、有机成分-复合磷灰石(例如胶原复合的磷灰石)、无机成分-复合磷灰石、生物活性玻璃、生物活性玻璃陶瓷、金属钛等等。
用于本发明的多孔人工骨材料可选用商业化产品，也可参照文献制备。在一个优选的实施方式中，本发明的多孔人工骨材料采用以下过程制备：
选用高纯氧化钙及含量为85％的磷酸(重量％)为原料，首先定量称取氧化钙及磷酸，以纯净水为溶剂，分别配制成0.1mol/L的Ca(OH)2桨体及磷酸水溶液。按照生成体中Ca/P Mol比为1.5-1.67比例在不断搅拌下进行滴定，由于羟基磷灰石及磷酸三钙在水中溶解度低，生成胶体均以无定形的方式沉淀。合成过程中需加入海藻酸钠及聚乙烯醇胶体，加入量为生成体质量的1％-1.5％，在胶体的高分散作用下，无定形沉淀保持纳米分散状态。滴定完毕后，生成的胶体于80℃-90℃保温2小时，再陈化48-72小时，经过滤、烘干，获得纳米磷灰石粉体。
将所得的纳米粉体与水按重量比0.3:0.7的比例配成桨体，并加入发泡剂(例如可以为十二烷基硫酸钠)以及泡沫稳定剂(例如可以为有机酸、聚乙烯醇、海藻酸钠、聚丙烯酰胺等)，其加入总量为粉体重量的1.5％-2.5％，经高速搅拌发泡成膏体状，浇于模型中制作成多孔湿坯体，室温放置干燥24小时，再50℃烘干。高温烧成中，升温速度2℃-3℃/min，500℃-800℃区间通氧气，使有机物充分氧化，在950℃-1050℃保温1-2小时，随炉冷却至室温。
通过控制浆体的粉液比、发泡剂及泡沫稳定剂的比例，可制得孔隙率50％-80％的多孔磷灰石块体，孔隙尺寸为100μm-500μm，孔隙彼此联通，孔壁为亚微米及纳米级微孔，形成类松质骨结构。如图1A-1D所示。
在根据本发明的复合骨修复材料的一个实施方式中，自体血液不仅提供营养物质、骨生长因子等成分维持自体骨组织的活性，还可调节自体骨颗粒的流动性，使之更好地与多孔人工骨材料形成复合结构，本发明中自体骨颗粒与自体血液的体积比可以为1﹕20～25。
在根据本发明的复合骨修复材料的一个实施方式中，自体骨颗粒与多孔人工骨材料的用量比也可灵活调整，即使自体骨采集量较少的情况下，也可明显改善植入材料的骨修复效果。在根据本发明的复合骨修复材料的一个优选实施方式中，自体骨颗粒与自体血液的总体积与多孔人工骨材料的体积比可以为3.5～6﹕1。
本发明的复合骨修复材料呈膏状，通过控制自体骨颗粒、自体血液和多孔人工骨材料的体积比，使其达到理想的填充效果和骨修复效果。
本发明的另一个方面提供本发明所述的复合骨修复材料的制备方法，其包括以下步骤：
S1：取自体骨破碎成颗粒，与自体血液混匀形成浆体；以及
S2：将多孔人工骨材料加入至步骤S1所得的浆体中即得。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述步骤S1可以包括以下过程：取自体骨首先破碎成3～5mm的颗粒，液氮冷却3～15分钟，然后再破碎成20～200μm的颗粒。经过破碎处理，按d50计，所得自体骨颗粒的表面积增加了40倍。所述处理方法能够在将自体骨进行破碎的同时保持细胞活性。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将进一步描述本发明的示例性实施例的技术方案。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例
将自体骨块用组织剪剪成尺度3mm-5mm左右的颗粒，液氮冷冻10-15分钟，即刻采用高速破碎机破碎至20μm-200μm的细微骨颗粒，按d50计，细微骨颗粒的表面积增加了40倍。
选用枸橼酸钠作为血液抗凝剂。配制枸橼酸钠水溶液，浓度为0.129mol/L，当操作时间只需8-15分钟时，与血液按1:8-12体积的比例使用，制得抗凝血液。
将抗凝血液与自体骨颗粒调合成桨体状，其加入体积比例为：自体骨颗粒:抗凝血液＝1:20-25，自体骨颗粒均匀分散于血液中，保持自体骨颗粒的组织活性，备用。
将已灭菌处理的的多孔磷灰石块即刻加入到上述桨体之中，桨体进入多孔磷灰石块的孔隙中，加入体积比例为：多孔磷灰石块:桨体＝1:3.5-6。SEM图像如图2所示。本发明采用的多孔磷灰石形态和成分都与人骨比较接近，且降解速度与骨生成速度相匹配。
实验例1人成骨细胞增殖实验
制作φ10*1多孔磷灰石陶瓷圆片及生物活性玻璃陶瓷圆片各20片，每种材料分为2组，为实验组及对照组。实验组为按照本发明制得的复合骨材料，对照组为不含有自体骨颗粒和血液的人工骨材料。在体外按5×103/孔密度接种人成骨细胞，各组分别在24h、48h、72h、96h时用MTT法在490nm波长下测定各孔的光密度值(A值)，每孔反复测定三次取其平均值作为最终的测定值。
MTT比色结果：在不含自体骨颗粒和血液的对照组中，人成骨细胞在72h内表现为缓慢增殖趋势，到72h时达到增殖的峰值，此后增殖速度减慢，细胞数量下降。在实验组中，人成骨细胞24h后快速增殖，细胞数量持续增加，其细胞增殖速度明显高于对照组，并维持在较高水平，至96h时，尚未出现下降趋势，两组间差异均有统计学意义(p<0.05)，参见表1。
表1
以上结果说明：自体骨颗粒及血液含有营养物质和高浓度的生长因子，这些营养物质和生长因子对维持成骨细胞正常新陈代谢、促进细胞增殖均有十分重要的作用。
如图3A、3B所示，本发明的复合骨材料体外成骨细胞培养3d，可见大量增殖的成骨细胞。
实验例2动物实验
取15只健康雄性新西兰兔，8-10月龄，平均体质量2kg，由四川大学华西医学实验动物中心提供。每只动物手术建立4个颅骨全层骨缺损，分别随机进行以下4种材料植入：多孔磷灰石材料(A组)、多孔生物活性玻璃(B组)、含自体骨颗粒和自体血液的多孔磷灰石复合材料(C组)、含自体骨颗粒和自体血液的多孔生物活性玻璃复合材料(D组)。15只新西兰兔分别于术后2w、4w、8w各处死5只，常规取材，固定脱钙后制作石蜡组织切片，观察骨缺损修复过程中新骨形成情况。
X线检查结果如图4A和4B所示：
A组：术后2周，圆形骨缺损内离散布满材料颗粒的阻射影像，颗粒边缘清晰，颗粒之间低密度阴影清晰，未见明显密度增高的影像；术后8周材料颗粒间密度明显增高，骨缺损边界变得模糊。
B组：与A组类似。
C组：术后2周所见与A组相似，颗粒状高密度影像间散在密度增高影像，缺损周围骨密度增高；术后8周X线所见缺损内整体密度与周围正常骨密度无明显差异，不易区分骨缺损边界。
D组：与C组类似。
组织学研究结果如图5A-5F所示：
术后2周：如图5A、5D所示，A组(图5A左图)显示破骨细胞参与材料的吸收，围绕材料颗粒的细胞密集，成骨活跃；C组(图5A右图)显示材料周围细胞增生明显，局部细胞密集，形成成骨中心。B组(图5D)与A组类似。
术后4周：如图5B、5E所示，A组(图5B左图)显示骨缺损中央区有纤维组织侵入到材料颗粒之间为嗜伊红染色的胶原，成骨细胞胞浆丰富，胞核大而深染；C组(图5B右图)显示材料颗粒中形成多数新骨岛，新骨多以血管为中心向四周生长。
B组(图5E左图)显示材料颗粒周围的成骨细胞密集，局部新骨形成，并有破骨细胞参与材料吸收，材料的孔隙中已有细胞长入；D组(图5E右图)显示材料多处呈“虫蚀样”改变，箭头处为多核破骨细胞，破骨细胞胞浆丰富，功能旺盛，可见细胞突起伸入材料。
术后8周：如图5C、5F所示，A组(图5C左图)显示骨断端封闭，结缔组织侵入骨缺损区，大量新骨形成，将材料颗粒包绕其中；C组(图5C右图)显示成骨细胞逐步包埋进蓝染的新骨基质中，可见刚被包埋入骨陷窝的成骨细胞。
B组(图5F左图)显示大量新骨形成，将材料颗粒包绕其中；D组(图5F右图)显示材料颗粒空隙中成骨活跃，材料逐渐被吸收崩解，破骨细胞参与材料吸收。
组间差异分析
对新三色染色结果进行新骨量的图像分析，在图像分析软件ImagePro Plus5.0.1中对采集的图像进行新骨定量分析，所得数据以均数和标准差表示，自身对照设计，并对各组新骨形成量随时间变化进行统计描述，统计分析软件为SPSS 12.0，检验水准α＝0.05。
如表2所示，结果表明：术后2周、4周及术后8周时，C组新骨量显著性高于A组，组间(p<0.05)，D组新骨量亦显著高于B组，组间(p<0.05)；但A组与B组间的差异无统计学意义(p>0.05)。
表2
电镜观察
如图6所示，C组显示在术后第2周时新生骨中已有微细血管的长入。
实验例3
取6只健康雄性新西兰兔，8-10月龄，平均体质量2.5kg，由四川大学华西医学实验动物中心提供。每只动物手术建立1个颅骨全层骨缺损，随机将动物分为6组，分别为：(1)多孔磷灰石组；(2)含自体骨块的多孔磷灰石组；(3)含自体骨颗粒的多孔磷灰石组；(4)多孔生物活性玻璃组；(5)含自体骨块的多孔生物活性玻璃组；(6)含自体骨颗粒的多孔生物活性玻璃组。
每组植入相同重量的植入材料，其中，自体骨块的粒径为3-5mm，自体骨颗粒的粒径小于200μm，第(2)、(5)组中自体骨块与自体血液的总体积与人工骨的体积比为4:1和5:1，自体骨块和血液体积比为1:15和1:12；第(3)、(6)组中自体骨颗粒与自体血液总体积与多孔人工骨材料的体积比分别4:1和5:1，自体骨颗粒与血液体积比为1:24和1:20。
植入手术后8周将动物处死，观察骨缺损修复过程中新骨形成情况，如图7A、7B中(1)-(6)组所示，添加自体骨颗粒的第(3)、(6)组的骨整合效果明显优于其他两组，且自体骨的用量少于第(2)、(5)组。
虽然为了说明本发明，已经公开了本发明的优选实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离权利要求书所限定的本发明构思和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改、添加和替换。

Claims (10)

1.一种复合骨修复材料，其特征在于，包括多孔人工骨材料、自体骨颗粒以及自体血液混匀形成，其中，所述自体骨颗粒的粒径为20～200μm。
2.根据权利要求1所述的复合骨修复材料，其特征在于，所述自体骨颗粒与所述自体血液均匀分布于所述多孔人工骨材料的孔隙中。
3.根据权利要求1所述的复合骨修复材料，其特征在于，所述自体骨颗粒与所述自体血液的总体积与所述多孔人工骨材料的体积比为3.5～6﹕1。
4.根据权利要求1所述的复合骨修复材料，其特征在于，所述复合骨修复材料中还包括血液抗凝剂。
5.根据权利要求4所述的复合骨修复材料，其特征在于，所述血液抗凝剂选自枸橼酸或枸橼酸的碱金属盐。
6.根据权利要求1所述的复合骨修复材料，其特征在于，所述多孔人工骨材料的孔隙尺寸为100～500μm，孔隙率为50～80％。
7.根据权利要求6所述的复合骨修复材料，其特征在于，所述多孔人工骨材料选自羟基磷灰石、磷酸三钙、羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷、氟磷灰石、碳酸磷灰石、氧磷灰石、复合磷灰石、生物活性玻璃、生物活性玻璃陶瓷、金属钛中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的复合骨修复材料，其特征在于，所述自体骨颗粒与所述自体血液的体积比为1﹕20～25。
9.权利要求1-8任一项所述复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取自体骨破碎成颗粒，与自体血液混匀形成浆体；以及
S2：将多孔人工骨材料加入至步骤S1所得的浆体中即得。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下过程：取自体骨首先破碎成3～5mm的颗粒，液氮冷却3～15分钟，然后再破碎成20～200μm的颗粒。
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