CN110308124A - 含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于特异性分子识别材料领域，公开了一种含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c‑di‑GMP含量中的应用。本发明在苯并噻唑的3位N位置引入甲基使其离子化，使结构中的给电子基团和吸电子基团形成了推‑拉电子作用的共轭结构，并通过碳碳双键增加跃迁的共轭体系，使其产生的荧光向近红外区移动，增强荧光化合物的荧光量子产率。该化合物可诱导c‑di‑GMP形成G‑四链体复合物，导致化合物的荧光增强，以此可实现对细菌信号分子c‑di‑GMP的荧光检测，且所检测的数值与传统方法HPLC测定的数值非常接近，同时化合物A18是目前报道的诱导c‑di‑GMP能力最强的化合物，可实现纳摩尔级别的检测。

Description

含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c- di-GMP中的应用
技术领域
本发明属于特异性分子识别材料领域，特别涉及一种含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用。
背景技术
3'-5'环二鸟苷酸(c-di-GMP)是细菌中普遍存在的第二信使，是介导细菌中信号传导的重要途径。在1987年，该分子首先由Benziman及其同事发现。随着几十年的研究发展，已经确定c-di-GMP在细菌的许多生理过程中起着重要作用。例如，基于信号分子3'-5'环二鸟苷(c-di-GMP)的生物膜调控系统是细菌体内广泛存在的一类重要调控通路。研究表明，c-di-GMP通路与细菌生物膜形成具有密切的关系。细菌内的c-di-GMP水平对细菌生物膜形成能力具有直接影响，高c-di-GMP水平会诱使细菌选择群聚生存方式，显著促进生物膜形成。靶向抑制细菌生物膜的形成是抗生物膜感染的潜在新方向。c-di-GMP作为一种重要的细胞内信号分子，也被证实可以影响细菌的许多其他生物表型，包括毒力因子的产生，运动性，细胞外多糖(EPS)和eDNA产生等。然而，关于该信号通路的组成和机制仍存在许多问题。
对细菌内的c-di-GMP进行检测及定量分析对充分探索受c-di-GMP信号通路调控的生理过程的更多细节，以及靶向c-di-GMP信号通路的药物设计十分重要。目前，检测c-di-GMP的方法主要包括串联HPLC-MS，基于FRET的生物传感器，以及基于效应蛋白结构域或核糖开关适配体结合等检测方法。其中HPLC-MS用于细菌内c-di-GMP定量检测的步骤繁琐，且需要专门的仪器设备。而基于FRET的生物传感器，以及基于效应蛋白结构域或核糖开关适配体结合等检测方法，一是检测体系构建十分复杂，并非普遍适用于所有实验室，同时，这类方法大多应用于单个细菌中c-di-GMP与靶蛋白的相互作用变化，而不适用于内源信使分子的定量分析。基于小分子的荧光检测则可避免复杂的操作程序，实现细菌内c-di-GMP的快速定量检测，应用更为普遍，因此，研发对c-di-GMP具有亲和力的荧光分子探针，将具有重要的科学意义和实际价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种含有苯并噻唑类荧光化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，所述的苯并噻唑类荧光化合物结构通式如式I所示：
其中，Ar为取代苯环或者芳香杂环；
当Ar为取代苯环时，R为-H、-F、-Br、-NO2、-NH2、-N(CH3)2、4-甲基哌嗪-1-基、4-吗啉基、-OH或-OCH3，且不限定R在苯环上的取代的个数，当R在苯环上取代的个数超过一个时，取代基R可以相同也可以不同；
当Ar为芳香杂环时，其中的芳香杂环可以为五元含氮杂环、六元含氮杂环、吲哚基或取代吲哚基团；
优选的，所述的苯并噻唑类化合物具有如下所示结构：
更优选的，所述的苯并噻唑类化合物具有如下所示结构：
公知的，化合物的溶剂化形式与盐通常并不影响化合物自身的生物学活性。因此所述的苯并噻唑类化合物也可以以苯并噻唑类化合物的盐形式或苯并噻唑类化合物的溶剂化物形式存在。
所述的荧光探针除了含有苯并噻唑类化合物外，还可以含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，如水、生理盐水、甘油或乙醇等。
所述的苯并噻唑类化合物由以下方法制备得到：2-甲基苯并噻唑(化合物1)与碘甲烷发生甲基化反应得到化合物2，然后将化合物2与Ar-CHO发生亲核反应得到苯并噻唑类荧光化合物，合成路线如下式所示：
优选的，所述的苯并噻唑类化合物由以下方法制备得到：
(1)将2-甲基苯并噻唑溶于溶剂中，加入碘甲烷，然后在氮气气氛下加热回流反应18h～24h，反应结束后即得到化合物2；
(2)将化合物2和Ar-CHO溶于溶剂中，加入吡啶作催化剂，然后加热回流反应8h～16h，反应结束后即得到目标产物苯并噻唑类化合物。
步骤(1)中所述的2-甲基苯并噻唑和碘甲烷的摩尔比为1：2～3；
步骤(1)中所述的溶剂为乙腈、乙醇、DMF、甲苯中的至少一种，溶剂仅仅起到反应介质的作用，因此可以不用限定溶剂的用量；
步骤(1)中反应结束后还包括一个纯化步骤，所述的纯化是指将所得反应液冷却至室温并抽滤，然后用乙腈和乙醚进行洗涤即得化合物2；
步骤(2)中所述的溶剂为甲醇、乙醇中的至少一种；溶剂仅仅起到反应介质的作用，因此可以不用限定溶剂的用量；
步骤(2)中所述的化合物2、吡啶和Ar-CHO的摩尔比为1：0.2～0.5：1～1.5；
步骤(2)中反应结束后还包括一个纯化步骤，所述的纯化是指将所得反应液冷却至室温并抽滤，然后用甲醇或乙醇、乙醚洗涤，如需进一步纯化，再用甲醇或乙醚重结晶。
一种利用苯并噻唑类化合物检测细菌信使分子c-di-GMP的含量的方法，具体包括以下步骤：
(1)将c-di-GMP标准品的水溶液先加热至95℃并在95℃保持5min，然后自然冷却至室温并在室温下保持10min后，加入苯并噻唑类化合物的DMSO溶液，形成混合溶液1，将混合溶液1在-20℃冰箱中孵育4-12h，然后进行荧光测试，用546nm处的荧光值对样品浓度绘制标准曲线；
(2)将待测样品先于100℃加热10分钟，然后13000g离心10分钟除去沉淀的蛋白后，取上清液加入苯并噻唑类化合物的DMSO溶液，形成混合溶液2，将混合溶液2在-20℃冰箱中孵育4-12h，然后进行荧光测试，根据546nm处的荧光值对照标准曲线得出待测样品中c-di-GMP的浓度。
步骤(1)中所述的混合溶液1中c-di-GMP标准品的浓度为0～10μM；所述的混合溶液1中苯并噻唑类化合物的浓度为2.5～10μM；
步骤(2)中所述的混合溶液2中苯并噻唑类化合物的浓度为2.5～10μM；
步骤(1)和步骤(2)中所述的荧光检测的条件均为：Ex.485nm,Em.500-700nm。
步骤(2)中所述的待测样品可为细胞裂解液样品或酶反应体系样品。
本发明的苯并噻唑类荧光化合物可诱导c-di-GMP形成G-四链体复合物，从而导致化合物的荧光增强，以此原理可实现对细菌信号分子c-di-GMP的荧光检测，其中A18化合物是目前报道的诱导c-di-GMP能力最强的化合物，可实现纳摩尔级别的检测。因此可用于信号分子c-di-GMP体内外检测试剂的制备。
c-di-GMP合成酶可将GTP催化环合得到c-di-GMP，通过检测c-di-GMP的生成量即可反应c-di-GMP合成酶的活力。同样，c-di-GMP降解酶可将c-di-GMP水解成GTP，通过检测c-di-GMP的减少量也可反应c-di-GMP降解酶的活力。因此，含有苯并噻唑类荧光化合物的荧光探针可通过对反应体系中的c-di-GMP含量进行检测，从而实现对c-di-GMP合成酶以及c-di-GMP降解酶活力的检测。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明的荧光化合物，在苯并噻唑的3位N位置引入甲基使其离子化，使其结构中的给电子基团和吸电子基团形成了推-拉电子作用的共轭结构，并通过碳碳双键增加跃迁的共轭体系，使化合物分子产生的荧光向近红外区移动，增强荧光化合物的荧光量子产率，使其具备高荧光量子产率。该化合物是目前报道的诱导c-di-GMP能力最强的化合物，可实现纳摩尔级别的检测，具有灵敏度高、安全无放射性、成本低廉、背景荧光干扰较低等优点。
利用含有本发明的苯并噻唑类化合物的荧光探针检测细菌信使分子c-di-GMP含量，其测定值与利用传统方法HPLC测定的数值非常接近，趋势也相吻合，且我们的基于荧光的检测方法操作步骤简单，可用于快速及高通量酶活力检测。
附图说明
图1为苯并噻唑类化合物A18与不同浓度c-di-GMP的剂量反应荧光光谱图。
图2为苯并噻唑类化合物A18特异性检测c-di-GMP的荧光光谱图。
图3为利用传统的HPLC方法测定的标准样品c-di-GMP的浓度与峰面积的标准曲线。
图4为利用本发明的苯并噻唑类化合物A18测定的标准样品c-di-GMP的浓度与荧光值的标准曲线。
图5为利用荧光分析以及HPLC分析测定的不同酶催化时间下的c-di-GMP的浓度值的对照图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
实施例1：2,3-二甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的合成(化合物2的合成)
将0.76ml(6mmol)2-甲基苯并噻唑溶于10ml乙腈溶液中，加入0.94ml(15mmol)碘甲烷，混合物在氮气气氛下加热回流反应24h，冷却至室温，抽滤，用少量乙腈和乙醚洗涤，得到白色固体1.42g。产率为83％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.49(d,J＝8.1Hz,1H),8.28(d,J＝8.4Hz,1H),7.85(t,J＝7.8Hz,1H),7.77(t,J＝7.7Hz,1H),4.23(s,3H),3.23(s,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO)δ177.45,141.98,129.70,129.07,128.45,125.02,117.26,37.29,18.40.ESI-MS(m/z):164[M-I]+.
实施例2：(E)-2-(4-氨基苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A1)
将150mg(0.52mmol)的化合物2和75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛溶于甲醇中，滴加21μl(0.26mmol)吡啶，加热回流反应12h，冷却至室温，抽滤，用甲醇和少量乙醚洗涤，得到紫色固体178mg。产率为87％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.29(d,J＝8.0Hz,1H),8.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.99(d,J＝15.3Hz,1H),7.81-7.75(m,3H),7.67(t,J＝7.6Hz,1H),7.55(d,J＝15.3Hz,1H),6.68(d,J＝8.7Hz,4H),4.21(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.85,155.20,150.95,142.39,133.92,129.29,127.84,127.17,124.25,122.03,116.35,114.32,106.04,36.02.ESI-MS(m/z):267.1[M-I]+.
实施例3：(E)-2-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A2)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为92mg(0.62mmol)的4-(二甲氨基)苯甲醛，得到紫色固体A2，产率为83％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.30(d,J＝8.0Hz,1H),8.08(dd,J＝14.5,12.0Hz,2H),7.91(d,J＝8.9Hz,2H),7.79(t,J＝7.8Hz,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),7.62(d,J＝15.3Hz,1H),6.83(d,J＝8.9Hz,2H),4.23(s,3H),3.11(s,6H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.80,153.96,150.57,142.41,133.29,129.32,127.89,127.27,124.27,121.93,116.40,112.42,106.73,100.00,36.07.ESI-MS(m/z):295.1[M-I]+.
实施例4：(E)-3-甲基-2-(4-(4-甲基哌嗪基)苯乙烯基)苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A3)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为127mg(0.62mmol)的4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲醛，得到紫色固体A3，产率为78％.1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.33(d,J＝7.7Hz,1H),8.11(d,J＝8.3Hz,1H),8.03(d,J＝15.4Hz,1H),7.90(d,J＝8.9Hz,2H),7.68(m,2H,HAr,CH＝),7.02(d,J＝9.0Hz,2H),4.26(s,3H),3.47-3.37(m,4H),2.48-2.40(m,4H),2.25(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ171.92,153.96,149.92,142.35,133.02,129.42,128.09,127.46,124.38,123.52,116.62,114.08,108.21,54.67,46.57,46.06,36.42.ESI-MS(m/z):350.2[M-I]+.
实施例5：(E)-3-甲基-2-(4-(吗啉基)苯乙烯基)苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A4)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为118mg(0.62mmol)的4-吗啉苯甲醛，得到紫色固体A4，产率为88％.1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.34(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),8.13(d,J＝8.2Hz,1H),8.06(d,J＝15.5Hz,1H),7.93(d,J＝9.0Hz,2H),7.84-7.76(m,1H),7.75-7.66(m,2H,HAr,CH＝),7.04(d,J＝9.0Hz,2H),4.27(s,3H),3.78-3.70(m,4H),3.41-3.36(m,4H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.03,154.17,149.87,142.37,132.88,129.47,128.17,127.54,124.40,123.98,116.69,113.98,108.62,66.28,46.93,36.46.ESI-MS(m/z):337.2[M-I]+.
实施例6：(E)-2-(4-羟基苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A5)
将100mg(0.34mmol)化合物2和51mg(0.41mmol)4-羟基苯甲醛溶于甲醇溶液中，滴加14μl(0.17mmol)吡啶，加热回流反应16h，冷却至室温，抽滤，用甲醇和少量乙醚洗涤，甲醇/乙醚重结晶得到黄色固体98mg。产率为72％.1H NMR(300MHz,DMSO)δ10.59(s,1H),8.40(d,J＝7.4Hz,1H),8.20(d,J＝8.3Hz,1H),8.13(d,J＝15.7Hz,1H),7.96(d,J＝8.7Hz,2H),7.88-7.71(m,3H),6.93(d,J＝8.6Hz,2H),4.32(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.52,162.57,149.71,142.43,133.07,129.65,128.53,127.86,125.87,124.58,117.05,116.74,110.57,36.76.ESI-MS(m/z):268.1[M-I]+.
实施例7：(E)-2-(3,4-二羟基苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A6)
将145mg(0.50mmol)的化合物2和82mg(0.60mmol)3,4-二羟基苯甲醛溶于乙醇溶液中，滴加20μl(0.25mmol)的吡啶，加热回流反应10h，冷却至室温，抽滤，用乙醇和少量乙醚洗涤，得到褐色固体156mg。产率为76％.1H NMR(300MHz,DMSO)δ10.24(s,1H),9.56(s,1H),8.38(d,J＝7.9Hz,1H),8.19(d,J＝8.2Hz,1H),8.06(d,J＝15.6Hz,1H),7.84(t,J＝7.6Hz,1H),7.73(m,2H),7.54-7.38(m,2H),6.90(d,J＝8.1Hz,1H),4.30(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.41,151.58,150.20,146.44,142.43,129.62,128.48,127.82,126.43,124.82,124.53,116.99,116.94,116.42,110.43,100.00,36.59.ESI-MS(m/z):284.1[M-I]+.
实施例8：(E)-2-(4-甲氧基苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A7)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为85mg(0.62mmol)的对甲氧基苯甲醛，得到黄色固体A7，产率为82％.1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.45-8.39(m,1H),8.20(m,2H),8.06(d,J＝8.8Hz,2H),7.94-7.82(m,2H),7.81-7.72(m,1H),7.11(d,J＝8.8Hz,2H),4.34(s,3H),3.86(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.47,163.35,149.11,142.43,132.64,129.72,128.65,128.01,127.26,124.65,117.17,115.29,111.70,56.22,36.88.ESI-MS(m/z):282.1[M-I]+.
实施例9：(E)-2-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A8)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为95mg(0.62mmol)的3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，得到黄色固体A8，产率为79％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.27(s,1H),8.40(d,J＝8.0Hz,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),8.13(d,J＝15.6Hz,1H),7.89-7.79(m,2H),7.76(t,J＝7.6Hz,1H),7.68(s,1H),7.54(dd,J＝8.2,1.3Hz,1H),6.94(d,J＝8.2Hz,1H),4.34(s,3H),3.92(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.53,152.46,150.08,148.75,142.48,129.65,128.53,127.86,126.73,126.31,124.57,117.03,116.38,112.97,110.64,56.58,36.75.ESI-MS(m/z):298.1[M-I]+.
实施例10：(E)-2-(3-氟-4-羟基苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A9)
以化合物2为原料，制备方法同实施例6，区别仅仅在于将其中的51mg(0.41mmol)的4-羟基苯甲醛替换为58mg(0.41mmol)的3-氟-4-羟基苯甲醛，得到黄色固体A9，产率为76％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.06(d,J＝8.4Hz,1H),7.94(m,2H),7.76(t,J＝7.6Hz,1H),7.70-7.52(m,3H),6.85(t,J＝8.8Hz,1H),4.21(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ170.58,156.74,154.12,151.70,148.67,142.43,130.95,129.34,127.78,127.28,124.27,123.61,123.54,120.03,119.98,116.82,116.63,116.24,107.87,49.08,36.08.ESI-MS(m/z):286.1[M-I]+.
实施例11：(E)-2-(3,5-二溴-4-羟基苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A10)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为174mg(0.62mmol)的3,5-二溴-4-羟基苯甲醛，得到棕色固体A10，产率为74％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.44(d,J＝7.9Hz,1H),8.36(s,2H),8.24(d,J＝8.2Hz,1H),8.10(d,J＝15.8Hz,1H),7.97(d,J＝15.8Hz,1H),7.87(t,J＝7.5Hz,1H),7.79(t,J＝7.4Hz,1H),4.36(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.09,154.77,146.05,142.47,134.24,129.87,128.86,128.78,128.29,124.78,117.29,113.68,112.79,37.03.ESI-MS(m/z):425.9[M-I]+.
实施例12：(E)-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A11)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为113mg(0.62mmol)的丁香醛，得到褐色固体A11，产率为77％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.47(dd,J＝12.0,3.7Hz,2H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),8.04(d,J＝15.8Hz,1H),7.93(t,J＝7.7Hz,1H),7.84(t,J＝7.6Hz,1H),7.77(s,1H),7.66(s,1H),4.44(s,3H),4.07(s,3H),3.97(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.12,153.30,151.33,143.90,142.68,130.11,129.20,128.69,124.95,123.44,117.65,116.95,111.48,108.85,57.38,57.02,37.32.ESI-MS(m/z):328.1[M-I]+.
实施例13：(E)-2-苯乙烯基-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A12)
以化合物2为原料，制备方法同实施例6，区别仅仅在于将其中的51mg(0.41mmol)的4-羟基苯甲醛替换为44mg(0.41mmol)的苯甲醛，得到黄色固体A12，产率为72％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.48(d,J＝8.1Hz,1H),8.29-8.21(m,2H),8.09-8.05(m,3H),7.93-7.86(m,1H),7.83-7.79(m,1H),7.60-7.53(m,3H),4.40(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.41,148.85,142.52,134.50,132.75,130.20,129.94,129.68,128.98,128.42,124.82,117.48,114.64,37.17.ESI-MS(m/z):252.1[M-I]+.
实施例14：(E)-2-(4-氟苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A13)
以化合物2为原料，制备方法同实施例6，区别仅仅在于将其中的51mg(0.41mmol)的4-羟基苯甲醛替换为51mg(0.41mmol)的对氟苯甲醛，得到黄色固体A13，产率为80％.1HNMR(300MHz,DMSO)δ8.51-8.45(m,1H),8.31-8.14(m,4H),8.03(d,J＝15.9Hz,1H),7.88(tt,J＝6.0,2.9Hz,1H),7.84-7.77(m,1H),7.43(t,J＝8.8Hz,2H),4.39(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.33,166.43,163.09,147.52,142.48,132.89,132.77,131.25,131.21,129.92,128.96,128.37,124.82,117.46,117.03,116.73,114.46,114.43,37.19.ESI-MS(m/z):270.1[M-I]+.
实施例15：(E)-2-(4-溴苯乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A14)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为115mg(0.62mmol)的对溴苯甲醛，得到橙色固体A14，产率为80％.1HNMR(300MHz,DMSO)δ8.48(d,J＝7.4Hz,1H),8.29(d,J＝8.3Hz,1H),8.23(d,J＝16.0Hz,1H),8.11(d,J＝16.0Hz,1H),8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.95-7.87(m,1H),7.85-7.79(m,3H),4.39(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.22,147.36,142.54,133.75,132.74,131.94,130.00,129.06,128.54,126.43,124.86,117.52,115.35,37.15.ESI-MS(m/z):330.0[M-I]+.
实施例16：(E)-3-甲基-2-(4-硝基苯乙烯基)苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A15)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为94mg(0.62mmol)的对硝基苯甲醛，得到红色固体A15，产率为82％.1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.55-8.50(m,1H),8.43-8.31(m,6H),8.28(d,J＝16.1Hz,1H),7.97-7.90(m,1H),7.89-7.82(m,1H),4.44(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ171.67,149.16,145.42,142.57,140.50,131.04,130.19,129.33,128.91,125.00,124.62,118.50,117.74,49.08,37.50.ESI-MS(m/z):297.1[M-I]+.
实施例17：(E)-2-(2-(1H-吡咯-3-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A16)
以化合物2为原料，制备方法同实施例6，区别仅仅在于将其中的51mg(0.41mmol)的4-羟基苯甲醛替换为39mg(0.41mmol)的吡咯-3-甲醛，得到黄色固体A16，产率为56％.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.72(s,1H),8.32(d,J＝8.0Hz,1H),8.18(d,J＝15.2Hz,1H),8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(t,J＝7.8Hz,1H),7.73-7.65(m,2H),7.47(d,J＝15.2Hz,1H),7.02(d,J＝1.6Hz,1H),6.91(s,1H),4.22(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.63,146.10,142.33,129.32,128.69,127.95,127.15,124.35,122.78,122.07,116.51,108.17,107.55,36.21.ESI-MS(m/z):241.1[M-I]+.
实施例18：(E)-2-(2-(1H-吲哚-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A17)
以化合物2为原料，制备方法同实施例6，区别仅仅在于将其中的51mg(0.41mmol)的4-羟基苯甲醛替换为60mg(0.41mmol)的吲哚-2-甲醛，得到红色固体A16，产率为81％.1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.99(s,1H),8.43(d,J＝7.3Hz,1H),8.27-8.21(m,2H),7.93-7.74(m,3H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.52(d,J＝8.3Hz,1H),7.34(dd,J＝11.2,4.0Hz,2H),7.11(t,J＝7.5Hz,1H),4.29(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ171.42,142.34,139.91,138.25,134.78,129.76,128.59,128.40,128.01,126.65,124.69,122.61,121.09,116.99,113.90,112.35,111.25,36.64.ESI-MS(m/z):291.1[M-I]+.
实施例19：(E)-2-(2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A18)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为90mg(0.62mmol)的吲哚-3-甲醛，得到橙色固体A18，产率为74％.1HNMR(300MHz,DMSO)δ12.50(s,1H),8.51-8.38(m,2H),8.33(d,J＝7.7Hz,1H),8.29-8.23(m,1H),8.13(d,J＝8.3Hz,1H),7.79(t,J＝7.3Hz,1H),7.69(t,J＝7.5Hz,1H),7.61-7.54(m,1H),7.50(d,J＝15.4Hz,1H),7.38-7.30(m,2H),4.27(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.30,144.64,142.31,138.31,138.00,129.27,127.79,127.03,125.19,124.36,124.26,122.89,121.43,116.34,114.69,113.55,106.14,36.16.ESI-MS(m/z):291.1[M-I]+.
实施例20：(E)-3-甲基-2-(2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙烯基)苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A19)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为99mg(0.62mmol)的1-甲基吲哚-3-甲醛，得到棕色固体A19，产率为89％.1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.44(s,1H),8.37(d,J＝15.4Hz,1H),8.33-8.24(m,2H),8.11(d,J＝8.2Hz,1H),7.81-7.74(m,1H),7.71-7.60(m,2H),7.46(d,J＝15.4Hz,1H),7.42-7.35(m,2H),4.25(s,3H),3.93(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.15,143.96,142.29,141.00,138.92,129.25,127.77,127.01,125.57,124.43,124.23,123.24,121.57,116.29,113.63,112.09,105.97,36.03,34.19.ESI-MS(m/z):305.1[M-I]+.
实施例21：(E)-3-甲基-2-(2-(吡嗪-2-基)乙烯基)苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A20)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为67mg(0.62mmol)的吡嗪-2-甲醛，得到橙色固体A20，产率为83％.1HNMR(300MHz,DMSO)δ9.20(d,J＝1.4Hz,1H),8.88(dd,J＝2.3,1.5Hz,1H),8.81(d,J＝2.4Hz,1H),8.57-8.50(m,1H),8.42-8.31(m,3H),7.99-7.83(m,2H),4.41(s,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO)δ171.20,147.67,147.09,145.91,143.28,142.60,130.30,129.43,129.03,125.12,119.01,117.85,37.44.ESI-MS(m/z):254.1[M-I]+.
实施例22：(E)-3-甲基-2-(2-(吡啶-4-基)乙烯基)苯并[d]噻唑-3-碘化物(化合物A21)
以化合物2为原料，制备方法同实施例2，区别仅仅在于将其中的75mg(0.62mmol)的4-氨基苯甲醛替换为67mg(0.62mmol)的吡啶-4-甲醛，得到橙色固体A21，产率为85％.1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.95(d,J＝6.3Hz,2H),8.56(d,J＝7.8Hz,1H),8.43(d,J＝16.1Hz,1H),8.37(d,J＝8.4Hz,1H),8.31-8.27(m,3H),7.99-7.92(m,1H),7.88(t,J＝7.4Hz,1H),4.47(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.12,147.65,145.26,143.53,142.65,130.38,129.54,129.26,125.13,124.53,121.20,117.93,37.74.ESI-MS(m/z):253.1[M-I]+.
实施例23：荧光化合物A18与不同浓度c-di-GMP的剂量反应实验
(1)样品处理：分别将0μL、1μL、2μL、6μL、10μL及20μL的c-di-GMP溶液(1000μM，溶剂为H2O)加入到2mL 10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5，含1M KCl)溶液中混合，得到浓度分别为0、500nM、1μM、3μM、5μM和10μM的c-di-GMP溶液，加热至95℃并在95℃保持5分钟，然后缓慢冷却至室温并在室温下保持10分钟。再加入0.5μL的A18溶液(10mM，溶剂为DMSO)形成A18的终浓度为2.5μM的混合溶液，将混合溶液在冰箱中于-20℃孵育过夜(12小时)，形成测试液。
(2)荧光测定：Ex.485nm,Em.500-700nm。荧光光谱图如图1所示。
从图1可以看出荧光化合物A18对不同浓度的c-di-GMP均有良好的荧光反应，最低检测限可达到500nM。
实施例24：荧光化合物A18的特异性研究
(1)样品处理：将20μL c-di-GMP、GMP(鸟嘌呤核苷酸)、cGMP(环磷酸鸟苷)、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)和rNTP(核糖核苷三磷酸)的混合溶液(c-di-GMP，GMP，cGMP，dNTP和rNTP的浓度均为1000μM，溶剂为H2O)、20μL c-di-GMP溶液(1000μM，溶剂为H2O)、20μL GMP(1000μM，溶剂为H2O)、20μL cGMP(1000μM，溶剂为H2O)、20μL dNTP(1000μM，溶剂为H2O)、20μL rNTP(1000μM，溶剂为H2O)分别加入到2mL 10mMTris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5，含1M KCl)溶液中混合，加热至95℃并在95℃保持5分钟，然后缓慢冷却至室温并在室温下保持10分钟。再加入0.5μL的A18溶液(10mM，溶剂为DMSO)形成A18的终浓度为2.5μM的混合溶液，将混合溶液在冰箱中于-20℃培育过夜(12小时)，形成测试液。
(2)荧光测定：Ex.485nm,em.500-700nm，荧光光谱图如图2所示。
在细菌中还含有其他种类的核苷酸(如GMP，cGMP，dNTP，rNTP等)因此，检测方法必须能够特异性地检测c-di-GMP而不受其他核苷酸的干扰。从图2中可以看出，含有c-di-GMP和其他核苷酸(GMP，cGMP，dNTP和rNTP)的混合物可以通过A18检测，但是当仅存在其他核苷酸(GMP，cGMP，dNTP和rNTP)时荧光则均没有响应，说明如所预期的一样，用A18荧光检测c-di-GMP是特异性的。
实施例25：荧光化合物A18测定c-di-GMP合成酶和降解酶活性
c-di-GMP合成酶可将GTP催化环合得到c-di-GMP，通过检测c-di-GMP的生成量即可反应c-di-GMP合成酶的活力。同样，c-di-GMP降解酶可将c-di-GMP水解成GTP，通过检测c-di-GMP的减少量也可反应c-di-GMP降解酶的活力。因此，利用荧光探针对反应体系中的c-di-GMP含量进行检测，即可实现酶活力的检测。
样品处理：将1μL浓度为1000μM的分离纯化的c-di-GMP合成酶(WspR酶，大肠杆菌E.coli BL21(DE3)重组表达纯化(PLoS Biology,2008，6(3):e67)，溶剂为10mM Tris,100mM NaCl,10％glycerol,pH 8.0)加入到含100μM的GTP(三磷酸鸟苷)，1mM的BeCl2，10mMNaF，2.5mM MnCl2，1M KCl，10mM MgCl2的20mM Tris-HCl(PH＝7.5)溶液中混合启动酶催化反应，总体积为2ml，酶的终浓度为0.5μM。分别于第5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟，30分钟取两份样，样品于100℃加热10分钟，然后13000g离心10分钟除去沉淀的蛋白后，取上清液进行检测；
其中一份用HPLC在波长为252nm处进行检测，结果用HPLC测定的标准样品c-di-GMP的标准曲线(用c-di-GMP标准样品配制成浓度分别为20μM、15μM、12.5μM、10μM、6.25μM、3.125μM、1.0325μM、0μM的标准系列，在与待测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量峰面积，用峰面积对样品浓度绘制标准曲线，如图3)拟合定量分析所产生的c-di-GMP的含量；另一份加入0.5μL的A18溶液(10mM，溶剂为DMSO)形成A18的终浓度为2.5μM的混合溶液，在冰箱中于-20℃孵育4小时，进行荧光测定，选用的Ex.485nm,Em.500-700nm，结果用c-di-GMP与A18的特异性结合荧光标准曲线(用c-di-GMP标准样品配制成浓度分别为10μM、8μM、6μM、4μM、2μM、1.5μM、1μM、0.75μM、0.5μM、0μM的标准系列，在相同处理和检测条件下，测量各标准样品的荧光，用546nm处的荧光值对样品浓度绘制标准曲线，如图4)拟合定量分析。两种分析方法在不同时间下测定的c-di-GMP的浓度值如图5所示。从图5中可以看出，利用荧光测定的c-di-GMP的含量与利用传统方法HPLC测定的数值非常接近，趋势也相吻合，且我们的基于荧光的检测方法操作步骤简单，可用于快速及高通量酶活力检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，及应用领域均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于所述的苯并噻唑类化合物结构通式如式I所示：
其中，Ar为取代苯环或者芳香杂环；
当Ar为取代苯环时，R为-H、-F、-Br、-NO2、-NH2、-N(CH3)2、4-甲基哌嗪-1-基、4-吗啉基、-OH或-OCH3，且不限定R在苯环上的取代的个数，当R在苯环上取代的个数超过一个时，取代基R可以相同也可以不同；
当Ar为芳香杂环时，其中的芳香杂环可以为五元含氮杂环、六元含氮杂环、吲哚基或取代吲哚基团。
2.根据权利要求1所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于所述的苯并噻唑类化合物具有如下所示结构：
3.根据权利要求1所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于所述的苯并噻唑类化合物具有如下所示结构：
4.根据权利要求1～3任一项所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于：
所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针为含有苯并噻唑类化合物、苯并噻唑类化合物的盐形式、苯并噻唑类化合物的溶剂化物中的至少一种的荧光探针。
5.根据权利要求1～3任一项所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于：
所述的荧光探针还包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
6.根据权利要求1～3任一项所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于：
所述的苯并噻唑类化合物由以下方法制备得到：2-甲基苯并噻唑与碘甲烷发生甲基化反应得到化合物2，然后将化合物2与Ar-CHO发生亲核反应得到苯并噻唑类荧光化合物，合成路线如下式所示：
7.根据权利要求6所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于：
所述的苯并噻唑类化合物具体由以下方法制备得到：
(1)将2-甲基苯并噻唑溶于溶剂中，加入碘甲烷，然后在氮气气氛下加热回流反应18h～24h，反应结束后即得到化合物2；
(2)将化合物2和Ar-CHO溶于溶剂中，加入吡啶作催化剂，然后加热回流反应8h～16h，反应结束后即得到目标产物苯并噻唑类化合物；
步骤(1)中所述的2-甲基苯并噻唑和碘甲烷的摩尔比为1：2～3；
步骤(1)中所述的溶剂为乙腈、乙醇、DMF、甲苯中的至少一种；
步骤(2)中所述的溶剂为甲醇、乙醇中的至少一种；
步骤(2)中所述的化合物2、吡啶和Ar-CHO的摩尔比为1：0.2～0.5：1～1.5。
8.根据权利要求1～3任一项所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于：
所述的利用含有苯并噻唑类化合物的荧光探针检测细菌信使分子c-di-GMP的含量的方法，包括以下步骤：
(1)将c-di-GMP标准品的水溶液先加热至95℃并在95℃保持5min，然后自然冷却至室温并在室温下保持10min后，加入苯并噻唑类化合物的DMSO溶液，形成混合溶液1，将混合溶液1在-20℃冰箱中孵育4-12h，然后进行荧光测试，用546nm处的荧光值对样品浓度绘制标准曲线；
(2)将待测样品先于100℃加热10分钟，然后13000g离心10分钟除去沉淀的蛋白后后，取上清液加入苯并噻唑类化合物的DMSO溶液，形成混合溶液2，将混合溶液2在-20℃冰箱中孵育4-12h，然后进行荧光测试，根据546nm处的荧光值对照标准曲线得出待测样品中c-di-GMP的浓度。
9.根据权利要求8所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于：
步骤(1)中所述的混合溶液1中c-di-GMP标准品的浓度为0～10μM；所述的混合溶液1中苯并噻唑类化合物的浓度为2.5～10μM；
步骤(2)中所述的混合溶液2中苯并噻唑类化合物的浓度为2.5～10μM；
步骤(1)和步骤(2)中所述的荧光检测的条件均为：Ex.485nm,Em.500-700nm。
10.根据权利要求8所述的含有苯并噻唑类化合物的荧光探针在检测细菌信使分子c-di-GMP含量中的应用，其特征在于：通过检测细菌信使分子c-di-GMP的增加量或减少量，含有苯并噻唑类荧光化合物的荧光探针能进一步应用于c-di-GMP合成酶或c-di-GMP降解酶活力的检测。
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