CN110305053A - 一种盐酸超声波提取大蒜素的方法及大蒜粉 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物有效成分提取领域,具体是涉及一种盐酸超声波提取大蒜素的方法及大蒜粉。本发明盐酸超声波提取大蒜素的方法包括以下步骤:(1)将浓盐酸与超纯水混合制得盐酸溶液;(2)大蒜去皮、洗净、捣碎,加入到步骤(1)制作的盐酸溶液中,避光酶解;(3)酶解后转入超声波避光破碎;(4)用纱布过滤,离心,弃沉淀取上清,即得大蒜素提取液,避光密封保存。本发明的优点在于:成本低,操作简单,能实现工业化批量生产并保持可观的提取率,极大地降低了大蒜素提取成本,可进一步提高大蒜素大规模应用的前景,改善水产养殖业因水体环境污染导致产业下滑的现状。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取领域,具体是涉及一种盐酸超声波提取大蒜素的方法及大蒜粉。
背景技术
随着近年来我国经济和科技的高速发展,各种各样的环境问题也层出。其中,水体污染导致了水体有害菌的大量滋生,近年来许多研究都指出,海水和淡水养殖区鱼病频发,且越来越严重,病原菌呈耐药性,水产产量持续下降,甚至因食用含有毒素的鱼、贝类而使人致病、死亡的事件也越来越多。而治疗弧菌引起的鱼病主要采用抗生素等化学药物,但其药物抗菌效果不持久,更严重的是抗生素的滥用不仅加剧了耐药菌株的产生,还造成了水产品中有害药物残留等重大食品安全问题,进而会导致近海生态环境不断恶化。
大蒜素又称大蒜油,是大蒜破碎以后,由蒜氨酸在蒜氨酸酶作用下形成的一种油状有机硫化物,廉价,具有抗病毒,抗菌,抗肿瘤,降脂降糖,提高机体免疫力等作用,其对预防和治疗水产鱼病的研究和应用也已比较成熟,并有显著的成效。此外李娜等人(大蒜的功效成分及其应用的研究进展)也曾指出了大蒜素的多种生物学功能(其中强调了大蒜素添加在饲料中能延长贮藏期替代防腐剂及增加风味提高食欲且无残留,不易产生耐药性等特点)、优良的保健作用和显著医疗效果,具有广阔发展和应用前景。从目前全球在水产养殖方面的研究来看,大蒜素对水产病菌和水产疾病都有较强的抑制和治疗作用,其作为食品添加剂有良好的应用效果具有代替化学食品添加剂的潜力,可减少化学污染,增加产品品质,改善抗生素滥用导致的耐药性细菌的产生和化学残留等问题。这些都足以说明大蒜素在水产病菌的抑制和农业饲料添加剂等方面都有极强的发展潜力。
目前,大蒜素的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、有机溶剂提取法和超临界萃取法3种。水蒸气蒸馏法所需设备简单且操作方便,但其大蒜素提取率很低。超临界萃取法提取率高且品质好,但生产成本高、设备复杂且操作技术难度大。当前较常用乙醇作为提取剂提取,曾哲灵等试验(大蒜素研究应用进展,浙江大学饲料科学研究所)得出,用乙醇提取大蒜素的最佳工艺参数,即采用体积分数95%乙醇作为提取剂,在40℃下酶解0.5h,按料液比1g:4mL加入95%乙醇于30℃下萃取1.5h,然后控制蒸馏温度在50℃,压强在0.01MPa,旋转蒸发仪转速在75r/s进行减压浓缩,大蒜素的提取率可达0.24%。
总的来说,当今的大蒜素提取工艺中并没有廉价、简单又能保持较高提取率的方法,再者大蒜素的性质很不稳定,容易产生褐变,所以很难用工业的方法有效提取,这也是限制大蒜素应用发展的重要因素之一。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足,在已有的超声波提取工艺的基础上利用大蒜素在酸性条件下更稳定的性质改善大蒜素提取液的制备工艺,探究出一种高效的大蒜素盐酸超声波提取工艺,提供了一种盐酸超声波提取大蒜素的方法及大蒜粉。
为达到本发明的目的,本发明盐酸超声波提取大蒜素的方法包括以下步骤:
(1)将浓盐酸与超纯水混合制得盐酸溶液;
(2)大蒜去皮、洗净、捣碎,加入到步骤(1)制作的盐酸溶液中,避光酶解;
(3)酶解后转入超声波避光破碎;
(4)用纱布过滤,离心,弃沉淀取上清,即得大蒜素提取液,避光密封保存。
优选地,本发明中,所述步骤(1)中浓盐酸的质量百分比为25-35%,例如30%,浓盐酸与超纯水以3:7的体积比例混合。
优选地,本发明中,所述步骤(2)中,按大蒜和盐酸溶液质量体积比为1:70-80加入大蒜,例如1:80。(大蒜和盐酸溶液质量体积比以下均表述为盐酸倍量)
优选地,本发明中,所述步骤(2)中,避光酶解是用锡箔纸包裹避光酶解25-35min,例如30min。
优选地,本发明中,所述步骤(3)中,超声波避光破碎是360w超声波避光破碎25min。
优选地,本发明中,所述步骤(4)中,离心条件为转速为3500r/min,温度为4℃,时间为10min。
本发明还提供了一种大蒜素粉末,所述大蒜素粉末的制备方法包括:
(a)调制NaOH溶液,将前述盐酸超声波法提取的大蒜素提取液pH调节至6.5-7,例如6.82;
(b)将步骤(a)所得大蒜素提取液旋转蒸发浓缩至体积为原先的1/6-1/8,离心取上清液,得到初步浓缩液;
(c)将初步浓缩液与乙醇混合,摇匀,静止萃取,取上方液相为萃取液;
(d)将萃取液旋转蒸发浓缩至原体积1/2后加入等体积的乙醇,离心,重复此步骤2-3次,析出NaCl;
(e)步骤(d)结束后将萃取液旋转蒸发浓缩至粘稠,得到萃取浓缩液;
(g)将萃取浓缩液分装在培养皿中,锡箔纸包裹后,在顶部打15-25个小孔,放入超低温冰箱-80℃预冷;
(h)将预冷的萃取浓缩液放入冷冻干燥机,在-50℃,152*102Pa条件下干燥2-3天即得到大蒜素粉末。
优选地,本发明中,所述步骤(c)中,浓缩液与乙醇以2:1的体积比例混合,摇匀,静止萃取10min。
优选地,本发明中,所述步骤(b)和(d)中,蒸发浓缩条件为:水浴温度50℃,旋转转速150r/min,冷凝水温度4℃。
优选地,本发明中,所述步骤(d)中,离心条件为转速为3500r/min,温度为4℃,时间为10min。
与现有技术相比,本发明的方法成本低,操作简单,能实现工业化批量生产并保持可观的提取率,极大地降低了大蒜素提取成本,可进一步提高大蒜素大规模应用的前景,改善水产养殖业因水体环境污染导致产业下滑的现状。
附图说明
图1是大蒜素标样曲线;
图2是本发明稀释50倍的酸提大蒜液色谱峰面积在标样线性方程的显示结果;
图3是大蒜素标准品160ug/mL的高效液相色谱图;
图4是单因子实验最佳盐酸浓度的高效液相色谱图;
图5是单因子实验最佳盐酸倍量的高效液相色谱图;
图6是单因子实验最佳超声波功率的高效液相色谱图;
图7是单因子实验最佳超声波时间的高效液相色谱图;
图8是正交实验最佳条件下酸提大蒜素稀释50倍的高效液相色谱图;
图9是盐酸超声波法提取大蒜素制备大蒜粉的工艺流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。应当理解,以下描述仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。例如,包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素,而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开了范围“1至5”时,所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量,表示本发明并不限定于该具体数量,还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的,用“大约”、“约”等修饰一个数值,意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中,近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中,范围限定可以组合和/或互换,如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个,并且单数形式的要素或组分也包括复数形式,除非所述数量明显只指单数形式。
而且,本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的研究方法包括以下步骤:
(一)大蒜素的超声法提取工艺:研究超声法提取大蒜有效成分,选择出该法的最佳提取工艺;利用超声波加速植物有效成分溶出,加速提取成分的扩散、释放并与溶剂充分混合而利于提取。
(二)单因子实验设计:以盐酸浓度、超声波时间、超声波功率和料液比为单因子水平开展提取实验,在单因子试验的基础上,对大蒜素提取率影响最大的四个因素盐酸浓度、超声波时间、超声波功率和料液比进行了正交优化。
(三)正交实验设计:试验采用正交表进行优选,选用盐酸浓度、超声波时间、超声波功率和料液比4个因素,在3个水平进行正交实验设计。
(四)采用抑菌圈法探究盐酸超声波法提取的大蒜素粉末的最低抑菌浓度,以此验证此方法制备的大蒜素粉末的抑菌效果。
以上述研究为基础的盐酸超声波制作大蒜素提取液及制粉的方法,包括以下步骤:
a.将浓盐酸(质量百分数为35.5%,这里的浓盐酸是指纯盐酸,其质量百分数是35.5%,因为这是纯的浓盐酸所能达到的极限,即HCl的摩尔质量,而后面所提到的盐酸浓度30%则是指盐酸溶液浓盐酸与超纯水的比混合)与超纯水以3:7的比例混合制得盐酸溶液;
b.大蒜去皮、洗净、捣碎,以1g大蒜:80ml液体的比例加入到a步骤制作的盐酸溶液中,用锡箔纸包裹避光酶解30min;
c.酶解后转入360w超声波避光破碎25min;
d.之后两层纱布过滤一次,装入离心管离心(本方法所有离心条件均为3500r/min,4℃,10min),弃沉淀取上清,即得大蒜素提取液,避光密封保存。
e.调制适当浓度的NaOH溶液,将大蒜素提取液pH调节至6.82;
f.其次将大蒜素提取液旋转蒸发浓缩1/6-1/8(本方法所有蒸发浓缩条件均为:水浴温度50℃,旋转转速150r/min,冷凝水温度4℃,)离心取上清液,得到初步浓缩液;
g.再将初步浓缩液与乙醇以2:1的比例混合,摇匀,静止萃取10min,取上方液相为萃取液;
h.将萃取液旋转蒸发浓缩至1/2后加入等体积的乙醇,离心,重复此步骤2-3次,至NaCl基本析出。
i.然后将萃取液旋转蒸发浓缩至粘稠,得到萃取浓缩液;
j.接下来将萃取浓缩液分装在培养皿中(液面高度不超过5mm),锡箔纸包裹后,在顶部打20个左右的小孔,放入超低温冰箱-80℃预冷
k.最后将预冷的萃取浓缩液放入冷冻干燥机,-50℃,152*102Pa干燥2-3天即可得到大蒜素粉末,密封4℃冰箱保存。
实施例1:外标法测定提取率
1)大蒜素标样与相关试剂的制备:
a.制备流动相:以甲醇:乙酸:超纯水=75:0.1:25的比例配置1200mL的流动相用于色谱等梯度洗脱大蒜素分离分析;
b.称取20mg大蒜素,用流动相溶解并定容至100mL制得200ug/mL的大蒜素标样液;
c.将大蒜素标样配置成200ug/mL、160ug/mL、120ug/mL、80ug/mL、40ug/mL、0ug/mL的梯度标准液,分别测得不同浓度下大蒜素的色谱峰面积。
2)以下为色谱分析大蒜素标样测得的不同大蒜素浓度下的峰面积(表1),再以大蒜素标准液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标制作大蒜素标样曲线(图1),在之后的实验中,将样品的LC峰面积代入图1的公式便可算出其中大蒜素含量。
本方法所有LC测定大蒜素含量步骤的条件如下:
柱子:C185um 4.6mm×150mm
柱子温度:25℃
移动项:甲醇/超纯水/乙酸=75:25:1
流量:1.0mL/min
检出波长:UV 256nm
注入量:10uL)
表1大蒜素标样色谱峰面积
3)在最佳条件下(盐酸浓度30%的体积比,盐酸倍量1:80,超声波功率360w,超声波时间25min)制备酸提大蒜液,稀释50倍后色谱分析得到大蒜液的峰面积(图8);
4)将3)步骤的酸提稀释液的峰面积代入大蒜素标样曲线图和公式得出稀释液浓度,然后计算出最终的提取率为6.84%(图3)。
实施例2:大蒜素的酸提工艺优选方法
选用影响此方法最关键的四个影响因素进行单因子和正交实验:盐酸浓度、盐酸倍量、超声波功率和超声波时间。
1)单因子实验:我们将以上每个变量以四个梯度变化共16组进行实验并通过色谱分析每个组的大蒜素提取液的大蒜素含量来讨论此因素单独变化的最佳提取条件,结果见表2-5。
表2以盐酸浓度为变量的单因子实验
表3以盐酸倍量为变量的单因子实验
表4以超声波功率为变量的单因子实验
表5以超声波时间为变量的单因子实验
由表1-4可以得出盐酸超声波提取大蒜素的最佳盐酸浓度为30%,最佳盐酸倍量为1:32,最佳超声波功率为320W,最佳超声波时长为30min。
2)正交实验:
在单因子试验的基础上,设计正交试验(表6、7),测出每组的峰面积后比较同一变量下不同水平的K值(K值越大,条件越佳),最终得出盐酸超声波提取工艺的最佳条件。(如表7所示,K值为相对应的实验组的浓度总和,LC所测的峰面积与浓度的换算见实例1第(2)步)
表6正交试验设计
表7正交实验设计表
用液相色谱分析各正交条件下的峰面积,用标准曲线计算各大蒜素含量,并进行K值计算(表8、9),结果显示,K3值最大,即大蒜素含量最高,对应的提取工艺条件为盐酸浓度30%、盐酸倍量1:80、超声波360W、超声波时长25min,此条件为最佳提取条件。
表8酸提工艺正交实验原始数据
注:此表中采用的药敏圆纸片直径11mm。
表9酸提工艺正交实验数据处理结果
注:将表10中的峰面积用标准曲线计算算成浓度后的K值
据此,本方法所提供的盐酸超声波提取法条件为,盐酸浓度25-35%、盐酸倍量1:60-80、超声波300-400W、超声波时长20-30min。其中,考虑到实用性和经济效益,盐酸倍量可波动性较大。而在不考虑其他因素,仅考虑最大提取率时,优选最佳条件为:盐酸浓度30%、盐酸倍量1:80、超声波360W、超声波时长25min
实施例3:酸提大蒜素粉末的最低抑菌浓度
我们通过抑菌圈法进行了酸提大蒜素对溶藻弧菌和创伤弧菌的最低抑菌效果的实验,直观的体现出了酸提大蒜素的抑菌效果。
大蒜素对溶藻弧菌和创伤弧菌的最低抑菌浓度见表10,由表可以看出,大蒜素在浓度为0.0020g/mL时,对两种菌的抑菌圈直径为6.77-7.74mm,抑菌环为0.38-0.87mm,即此时抑菌效果已达到最低值,其最低抑菌浓度为0.002g/mL,说明酸提大蒜素的抑菌作用非常明显。
表10大蒜素对溶藻弧菌和创伤弧菌的最低抑菌浓度的确定
注:此表中采用的药敏圆纸片直径为6mm。注药量为7uL
本发明中,溶藻弧菌和创伤弧菌的培养和抑菌圈法的固体培养基分别用LB液体和固体培养基,培养温度均为35℃)
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种盐酸超声波提取大蒜素的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)将浓盐酸与超纯水混合制得盐酸溶液;
(2)大蒜去皮、洗净、捣碎,加入到步骤(1)制作的盐酸溶液中,避光酶解;
(3)酶解后转入超声波避光破碎;
(4)用纱布过滤,离心,弃沉淀取上清,即得大蒜素提取液,避光密封保存。
2.根据权利要求1所述的盐酸超声波提取大蒜素的方法,其特征在于,所述步骤(1)中浓盐酸的质量百分比为25-35%,例如30%,浓盐酸与超纯水以3:7的体积比例混合。
3.根据权利要求1所述的盐酸超声波提取大蒜素的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,按大蒜和盐酸溶液质量体积比为1:70-80加入大蒜,例如1:80。
4.根据权利要求1所述的盐酸超声波提取大蒜素的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,避光酶解是用锡箔纸包裹避光酶解25-35min,例如30min。
5.根据权利要求1所述的盐酸超声波提取大蒜素的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,超声波避光破碎是360w超声波避光破碎25min。
6.根据权利要求1所述的盐酸超声波提取大蒜素的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,离心条件为转速为3500r/min,温度为4℃,时间为10min。
7.一种大蒜素粉末,其特征在于,所述大蒜素粉末的制备方法包括:
(a)调制NaOH溶液,将权利要求1-6任一项所述的盐酸超声波法提取的大蒜素提取液pH调节至6.5-7,例如6.82;
(b)将步骤(a)所得大蒜素提取液旋转蒸发浓缩至体积为原先的1/6-1/8,离心取上清液,得到初步浓缩液;
(c)将初步浓缩液与乙醇混合,摇匀,静止萃取,取上方液相为萃取液;
(d)将萃取液旋转蒸发浓缩至原体积1/2后加入等体积的乙醇,离心,重复此步骤2-3次,析出NaCl;
(e)步骤(d)结束后将萃取液旋转蒸发浓缩至粘稠,得到萃取浓缩液;
(g)将萃取浓缩液分装在培养皿中,锡箔纸包裹后,在顶部打15-25个小孔,放入超低温冰箱-80℃预冷;
(h)将预冷的萃取浓缩液放入冷冻干燥机,在-50℃,152*102Pa条件下干燥2-3天即得到大蒜素粉末。
8.根据权利要求7所述的大蒜素粉末,其特征在于,所述步骤(c)中,浓缩液与乙醇以2:1的体积比例混合,摇匀,静止萃取10min。
9.根据权利要求7所述的大蒜素粉末,其特征在于,所述步骤(b)和(d)中,蒸发浓缩条件为:水浴温度50℃,旋转转速150r/min,冷凝水温度4℃。
10.根据权利要求7所述的大蒜素粉末,其特征在于,所述步骤(d)中,离心条件为转速3500r/min,温度4℃,时间10min。
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