CN110292178A - 一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法及其制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种动物卵细胞提取物及其提取方法，尤指一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法及其制剂，包括步骤：1)收集新鲜或冷冻的动物卵细胞并在室温下用纯化水洗净；2)对动物卵细胞进行超声破碎后进行冻融，形成匀浆；3)匀浆离心并去除沉淀，然后过滤上清液；4)将冻融的匀浆离心后，去除沉淀；5)去除病毒并鉴定原液；6)除菌过滤以制得半成品；7)依次鉴定半成品和检测评价成品功能；本发明采用动物卵细胞提取有效成分，动物卵细胞含有丰富的高价值营养成分，且取材较方便、来源丰富、价格低廉，满足民众对物美价廉的保健品的需求，不仅有益于增强人体体质，亦可促进相关产业的经济发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物卵细胞提取物及其提取方法，尤指一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法及其制剂。
背景技术
中国传统的古代医学上就有食疗和药膳，延续至今，已有数千年之久，然而，随着日益发达的工业发展，在促进社会经济的进步的同时带来了负面影响，体现在生存环境的恶化，空气与水源污染的加剧等问题中，而紧张快节奏的现代化生活方式，无形间促进了恶性肿瘤、高脂血症、高血压、动脉硬化、糖尿病、肥胖症等病症的发生，以及引发大量亚健康人群的存在。显然，工业发展与生活方式正在刺激着人们更加关注自身的健康与生存，为增强人体免疫力、增强对疾病的抵抗力，现常用功能食品调节机体功能，即保健食品，保健食品是一种新型的食品，在国内外兴起是近20年的新事物。然而在短短的20年内，保健食品的发展非常迅猛，既营养，还能防病抗病，也成为人们日益关注的热点，研究有效的保健产品，可以减少社会巨大的医药费用，并能预防疾病，调节人体功能，是利国利民的有效研究领域。
虽然保健品的发展速度迅猛，但是并非所有的保健品都能让常人接受，一方面需要考虑保健品的用药温和性，需要根据人的体质选择合适的保健品，另一方面需要考虑保健品的价格，尤其是维持年轻身体素质的保健品，目前保健品为迎合大众对全面功效的追求，特意采用名贵珍贵药材，其销售价格昂贵，无法使广大消费者接受，而低价格的保健品则使人忧虑其功效，因此目前的保健品很难做到物美价廉并使广大民众接受的发展要求。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在公开一种动物卵细胞提取物及其提取方法，尤指一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法及其制剂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述的制备方法主要包括以下步骤：
1)收集新鲜或冷冻的动物卵细胞并在室温下用纯化水洗净；
2)对动物卵细胞进行超声破碎后进行冻融，形成匀浆；
3)匀浆离心并去除沉淀，然后过滤上清液；
4)将冻融的匀浆离心后，去除沉淀；
5)去除病毒并鉴定原液；
6)除菌过滤以制得半成品；
7)依次鉴定半成品和检测评价成品功能。
优选地，所述步骤1)的动物卵细胞为鱼卵细胞或青蛙卵细胞。
优选地，所述步骤2)中，冻融条件为-20℃，反复冻融的次数为2～3次。
优选地，所述步骤3)中过滤上清液后还需要进行超滤。
优选地，所述步骤3)中，采用0.45μm的微孔滤膜过滤上清液，然后采用截留分子量5000道尔顿超滤膜进行超滤。
优选地，所述步骤4)的离心温度为4℃。
优选地，所述步骤6)除菌时，加入甘露醇作为稳定剂，然后采用0.22μm微孔滤膜除菌过滤。
优选地，所述步骤7)的检测评价包括免疫学、抗衰老、抗应激、抗疲劳及促进干细胞增殖功能的检测。
本发明还提供一种采用从动物卵细胞提取青春素的制备方法得到青春素制剂。
本发明的有益效果体现在：本发明采用动物卵细胞为原料，提取其中有效成分，以进行青春素提取，动物卵细胞含有丰富的高价值营养成分，且取材较方便、来源丰富、价格低廉，并可通过人工大规模养殖获得原材料，从而满足民众对物美价廉的保健品的需求，形成有规模的供求关系，由此不仅有益于增强人体体质，亦可促进相关产业的经济发展。
本发明通过提取动物卵细胞制备青春素制剂，并通过本发明的制备方法获取动物卵细胞，从而获得蛋白质(精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸)、脂肪(胆固醇、磷质)、维生素(维生素A、维生素B、维生素C、维生素B2、维生素B6、维生素PP、维生素B12)等营养成分，还含有钙、铜、镁、铁和磺等微量元素，另外也含有淋巴糅和维生素B3酸，可补充人体所需的微量元素，具有增强人体体质、提高免疫功能、滋阴增强体力、增加皮肤营养、保持皮肤光滑润洁、安神补脑、缓解焦躁不安、平定情绪等功能，本发明制备所得的青春素还具有较好的抗氧化效果，保持细胞活力，改善人体身体素质，提高免疫能力。
本发明针对青春素制备方法，采用有效的功能学测定方法对其增强免疫力、抗衰老、抗疲劳、抗应激及促进干细胞增殖等功能加以检测评价后制成液体或冻干制剂用于保健，制得的青春素制剂具有提高机体免疫力、抗疲劳、抗应激、促进干细胞增殖、抗衰老、安神补脑、缓解焦躁不安、平定情绪等功能，在市场上有很好的应用前景，为人类的保健事业做出贡献。
具体实施方式
以下详细说明本发明的具体实施方式：
一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，所述的制备方法主要包括以下步骤：
1)收集新鲜或冷冻的动物卵细胞并在室温下用纯化水洗净，动物卵细胞为鱼卵细胞或青蛙卵细胞，需要新鲜采集，并于24小时内放入-30℃环境中保存；
2)对动物卵细胞进行超声破碎后进行冻融，形成匀浆，破碎细胞与反复冻融之前均需要分别加入适量注射用水，以使细胞完全破碎，充分获得其有效成分，而冻融条件为-20℃，反复冻融的次数为2～3次；融化温度不得超过37℃，避免温度过高破坏其有效成分；
3)匀浆离心并去除沉淀，然后过滤上清液，过滤上清液后还需要进行超滤；采用0.45μm的微孔滤膜过滤上清液，然后采用截留分子量5000道尔顿超滤膜进行超滤；由于有效成分的分子量3000-10000道尔顿用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，并用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤可获得得到纯度较高的原液；
4)将冻融的匀浆离心后，离心温度为4℃，去除沉淀；
5)去除病毒并鉴定原液：在冻存温度为-20℃或以下的条件下，进行灭活或去除病毒并鉴定原液；原液的鉴定包括无菌试验、pH值为6.5～7.5、蛋白质反应呈阴性、细菌内毒素小于10EU/支、多肽含量不低于1.0mg/ml、特异活性试验未粘附细胞抑制指数(NAI)不低于30％；由于病毒分子量较小可以通过步骤6)中的滤膜和超滤膜，可以采用经国家药品监督管理部门批准的方法灭活或去除病毒，为了保证原液的质量应对其进行鉴定，按照《生物制品无菌试验规程》及《生物制品细菌内毒素试验规程》进行，应符合规定；由于应用于人体其pH值应接近中性6.5～7.5，避免对人体造成刺激；作为保健品其营养成分应该丰富，而多肽含量应不低于1.0mg/ml；核糖含量应不低于70μg/ml；青春素能够抑制白细胞在玻璃器皿表面的粘附作用，根据未粘附白细胞数计算抑制指数来测定其活性，未粘附细胞抑制指数(NAI)应不低于30％以保证其活性；
6)除菌过滤以制得半成品，加入甘露醇作为稳定剂，还可用木糖醇、季戊四醇等代替，然后采用0.22μm微孔滤膜除菌过滤，然后制得半成品；由于有效成分多为蛋白质和维生素，对热比较敏感，加入稳定剂增强其对热的稳定性，所用甘露醇不产酸，不会引起血糖升高作为稳定剂；
7)依次鉴定半成品和检测评价成品功能，鉴定半成品无误后视为成品并冻干包装，半成品鉴定，要求半成品细菌内毒素小于10EU/支，无菌检查符合《生物制品无菌试验规程》规定，pH值为6.5～7.5；鉴定无误为成品；检测评价包括免疫学、抗衰老、抗应激、抗疲劳及促进干细胞增殖功能的检测；对本发明制备的青春素进行功能评价时用的小鼠可以是正常小鼠，也可以是免疫功能低下模型小鼠，可以选择各种免疫抑制剂(烷化剂、激素制剂、抗生素、射线等)致使正常的小鼠免疫功能低下，然后给予本发明制备的青春素观察其能否促进低下免疫功能的恢复，包括非特异性免疫功能的测定(测定免疫脏器重量法、巨噬细胞吞噬试验、巨噬细胞杀菌试验)；首先，本发明中选用正常的小鼠，分别采用脾脏重量测定，淋巴细胞转化试验测定对其非特异性免疫功能，细胞免疫功能进行测定，评价其增强免疫功能的能力，免疫学即细胞免疫功能的测定包括淋巴细胞转化试验、迟发型超敏反应、NK细胞活性的测定；然后，衰老的发生机制与生理生化改变甚为复杂，故抗衰老功能的评价没有简单的指标，故本发明采用生存试验，测定过氧化脂质含量，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)和单胺氧化酶活性来综合评价其抗衰老功能，抗衰老功能的测定，采用生存试验，测定过氧化脂质含量，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)和单胺氧化酶活性来综合评价；再然后，观察一种功能性食品是否可提高动物的运动耐力，是它强化抗疲劳功能有力的宏观表现，本发明采用常用的小鼠游泳试验和爬杆试验来评价本产品的抗疲劳能力，同时测定相关的生化指标肌乳酶、血乳酶、血糖、肌糖原、肝糖原、乳酸脱氢同工酶活力等，抗疲劳功能的测定，采用小鼠游泳试验和爬杆试验评价其抗疲劳功能；其次，抗应激功能的测定，通过耐高温试验、耐低温试验和常压耐缺氧试验来评价其抗应激功能；对干细胞的增殖作用的评价：通过往培养的胚胎干细胞和成体干细胞加入提取物或制剂，并设阴性对照组，观察一定时间内干细胞的增殖数量，判断差异是否有统计学意义。
本实施例还提供一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法制得的青春素制剂，包括口服液、保健丸等。
本实施例中，制备方法基于以下原理：动物卵细胞含有丰富的高价值营养成份，包括蛋白质、脂肪、维生素，还含有钙、铜、镁、铁和磺等微量元素,具有补充人体所需的微量元素，能够增强人体体质、提高免疫力等功能，通过现代的工艺方法提取有效成分可以制成保健品用于抗衰老等。根据原理，本实施例收集动物卵细胞，按本实施例中的制备方法“收集→洗净→细胞匀浆→冻融→沉淀→取上清液→截留除杂→分装而得”的过程制得，创新点在于用现代的工艺方法提取动物卵细胞的有效成分以制成口服液等用于人类的保健。
以下结合具体实施过程，进一步说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例，任何依照本发明的基本方法从动物卵细胞中提取有效成分制成的其他剂型和在该提取物的基础上添加其他成分(如中药)制成的其他制剂，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围：
实施例基本要求：
1.设施与生产质量管理：按中国《药品生产质量管理规范》的要求实施；
2.原料及辅料：应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求，未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯；
3.生产用水：生产用水应符合国家饮用水标准；纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准；
4.生产用器具：直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗、去热原质处理或灭菌处理；
5.动物卵细胞要求：新鲜采集，并于24小时内放入-30℃中保存。
实施例1-青春素原液制备
将新鲜或冷冻的动物卵细胞在室温内用纯化水洗净，加入适量注射用水，用超声破碎细胞，制成匀浆，加适量注射用水，混匀，置-20℃反复冻融3次，融化温度不得超过37℃；将冻融的匀浆，于4℃温度离心去沉淀，上清液用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤，采用经国家药品监督管理部门批准的方法灭活或去除病毒，即为青春素原液，原液冻存于-20℃或以下，保存期为2个月。
实施例2-原液检定
按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验，应符合规定；在20℃±2℃测定，pH值应为6.5～7.5；取原液2ml，加20％磺基水杨酸2ml蛋白质反应应呈阴性反应；按《生物制品细菌内毒素试验规程》进行细菌内毒素试验，应小于10EU/支；多肽含量应不低于1.0mg/ml；核糖含量应不低于70μg/ml；特异活性试验，未粘附细胞抑制指数(NAI)应不低于30％。
实施例3-半成品制备
配制时加入适量甘露醇作为稳定剂，用0.22μm微孔滤膜除菌过滤，得半成品；分批应符合《生物制品分批规程》的有关规定。
实施例4-半成品检定
按《生物制品细菌内毒素试验规程》进行细菌内毒素测定，应小于10EU/支；按《生物制品无菌试验规程》进行无菌检查，应符合规定；在20℃±2℃测定，pH值应为6.5～7.5。
实施例5-成品制备
分装应符合《生物制品分装规程》的有关规定；规格每支含多肽2mg；包装应符合《生物制品包装规程》的有关规定。
实施例6-成品检定
除水分外，其余项目按制品标示量(2.0ml)加入灭菌注射用水溶解后进行检定；外观应为白色或微黄色疏松体，加入灭菌注射用水后应迅速溶解为澄明液体，不含有肉眼可见异物或摇不散沉淀；在20℃±2℃测定，pH值应为6.5～7.5；水分应不高于3.0％(W/W)；多肽含量应不低于1.0mg/ml；核糖含量应不低于70μg/ml；特异活性试验未粘附细胞抑制指数(NAI)应不低于30％；取制品2ml加20％磺基水杨酸2ml，蛋白质反应应呈阴性反应；按《生物制品无菌试验规程》进行无菌检查，应符合规定；按《生物制品细菌内毒素试验规程》进行细菌内毒素试验，应小于10EU/支；按《生物制品异常毒性试验规程》中小鼠试验项进行异常毒性检查。
鉴别试验：用SEC-HPLC法：色谱柱以适合分离多肽的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/LPB-0.1mol/L硫酸钠-0.05％叠氮钠，pH7.0；上样量20μl，用波长260nm检测，本品色谱峰应与对照品一致。
分子量及组分测定：用SEC-HPLC法：色谱柱以适合分离多肽的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/LPB-0.1mol/L硫酸钠-0.05％叠氮钠，pH7.0；上样量20μl，用波长260nm检测，同时做低分子量标准多肽，不得检出分子量为10KD以上的组分。
外源病毒污染检查：用动物病毒敏感的细胞(如BHK21)，盲传3代，结果应呈阴性。
实施例7-功能鉴定
选用正常的小鼠，分别采用脾脏重量测定，淋巴细胞转化试验分别对其非特异性免疫功能，细胞免疫功能进行测定，评价其增强免疫功能的能力；采用生存试验，测定过氧化脂质含量，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)和单胺氧化酶活性来综合评价其抗衰老功能。采用小鼠游泳试验和爬杆试验评价其抗疲劳功能。通过耐高温试验、耐低温试验和常压耐缺氧试验来评价其抗应激功能。通过往培养的胚胎干细胞和成体干细胞加入该口服液，并设阴性对照组，观察一定时间内两组干细胞的增殖数量差异是否有统计学意义对其对干细胞的增殖作用进行评价。
实施例8-保存、运输及有效期
检测合格后于2～8℃保存和运输，自分装之日起有效期为2年。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述的制备方法主要包括以下步骤：
1)收集新鲜或冷冻的动物卵细胞并在室温下用纯化水洗净；
2)对动物卵细胞进行超声破碎后进行冻融，形成匀浆；
3)匀浆离心并去除沉淀，然后过滤上清液；
4)将冻融的匀浆离心后，去除沉淀；
5)去除病毒并鉴定原液；
6)除菌过滤以制得半成品；
7)依次鉴定半成品和检测评价成品功能。
2.根据权利要求1所述的一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的动物卵细胞为鱼卵细胞或青蛙卵细胞。
3.根据权利要求1所述的一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，冻融条件为-20℃，反复冻融的次数为2～3次。
4.根据权利要求1所述的一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中过滤上清液后还需要进行超滤。
5.根据权利要求4所述的一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，采用0.45μm的微孔滤膜过滤上清液，然后采用截留分子量5000道尔顿超滤膜进行超滤。
6.根据权利要求1所述的一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述步骤4)的离心温度为4℃。
7.根据权利要求1所述的一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述步骤6)除菌时，加入甘露醇作为稳定剂，然后采用0.22μm微孔滤膜除菌过滤。
8.根据权利要求1所述的一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法，其特征在于，所述步骤7)的检测评价包括免疫学、抗衰老、抗应激、抗疲劳及促进干细胞增殖功能的检测。
9.一种采用权利要求1-8任一项所述的一种从动物卵细胞提取青春素的制备方法得到青春素制剂。
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